Virosaine A的哌嗪基和咪唑基衍生物的組合物在抗肝纖維化藥物中的應用
【專利摘要】本發(fā)明涉及有機合成和藥物化學領域。本發(fā)明公開并提供了一種由Virosaine A的哌嗪基衍生物和咪唑基衍生物按照質量比為25：75組成的組合物以及將上述化合物按照25：75的質量比進行混合從而制備本發(fā)明組合物的方法。藥理學實驗表明，本發(fā)明提供的這種組合物在20 ug/ml時能夠顯著抑制NIH/3T3增殖以及轉化生長因子?β1誘導的成纖維細胞增殖，具有抗肝纖維化的作用，因此本發(fā)明還提供了Virosaine A的哌嗪基和咪唑基衍生物按照質量比為25：75組成的組合物在制備抗肝纖維化藥物中的用途。
【專利說明】
Vi rosa i ne A的脈瞎基和咪性基衍生物的組合物在抗肝纖維 化藥物中的應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明設及有機合成和藥物化學領域，具體設及組合物、制備方法及其用途。
【背景技術】
[0002] 肝纖維化是慢性肝損傷向肝硬化發(fā)展的動態(tài)過程，表現(xiàn)為細胞外基質化CM)大量 合成、分泌，而降解絕對或相對不足，使ECM在肝臟內彌漫沉積。其起始于肝細胞化C)壞死， 隨之是炎癥反應、纖維生成介質釋放，肝星狀細胞(FSC)激活，最終W肝臟結締組織成分的 合成與降解明顯失去平衡。肝纖維化是多種慢性肝病共同的病理過程，是影響預后的重要 因素。
[0003] 過去的20年間，肝纖維化的研究取得了長足進展，證實肝纖維化與一定程度的肝 硬化都是可逆的。近年來陸續(xù)出現(xiàn)了一些抗肝纖維化治療方法，包括化學藥、生物制劑、中 藥與基因療法等，但是理想的臨床治療手段仍然缺乏巧IJ平.加強抗肝纖維化作用機制的研 究.中華肝病雜志，2005，8( 13): 561)。目前防治肝纖維的關鍵是針對與肝星狀細胞激活相 關的環(huán)節(jié)，主要是:減輕肝損傷;抑制星狀細胞激活，減少細胞外基質產(chǎn)生;調節(jié)細胞因子素 亂，促進活化肝星狀細胞調亡；抑制肝臟成纖維細胞的增殖W及星狀細胞激活大量分泌誘 導肝臟成纖維細胞的增殖。
[0004] 從天然產(chǎn)物中尋找化合物或先導化合物并進行結構修飾獲得其衍生物，從而得到 高效低毒的潛在藥物最有重要價值。
[000引本發(fā)明設及的化合物I是一個2012年發(fā)表（Bing-Xin Zhao et al .， 2012.Virosaines A and B,Two New Birdcage-Shaped Securinega Alkaloids with an Unprecedented Skeleton from Flueggea virosa.Organic Letters 14(2012)3096- 3099)的化合物，我們對化合物I進行了結構修飾，獲得了兩個新的衍生物即化合物HI和化 合物IV，并用化合物ΠΙ和化合物IV制備了組合物并對該組合物抗肝纖維化活性進行了評 價，其具有抗肝纖維化活性。
[0006] 由于肝臟星狀細胞的激活，從而引起了多種生長因子的大量分泌，運些生長因子 會誘導肝臟成纖維細胞的快速增殖，從而加速纖維化，其中最重要的生長因子之一就是 TGF。因此，篩選抗肝纖維化藥物的一個重要思路就是篩選能夠抑制肝臟成纖維細胞增殖的 藥物或者篩選能夠抑制TGF等生長因子誘導的成纖維細胞的增殖，篩選常常在成纖維細胞 上進行，NIH/3T3細胞是最常用的細胞株。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明公開了一個新的組合物，該組合物由化合物ΙΠ 和化合物IV組成，該組合物 中化合物ΠI和化合物IV的質量百分數(shù)分別為25 %和75 %。
[000引
[0009] 本發(fā)明公開的組合物可W制成藥學上可接受的鹽或藥學上可接受的載體。
[0010] 藥效學實驗表明，本發(fā)明的組合物具有較好的抗肝纖維化作用。本發(fā)明的藥學上 可接受的鹽具有同樣的藥效。
[0011] 進一步的，組合物的體外實驗表明，組合物具有很強的抗成纖維細胞增殖的活性， 因此本發(fā)明的組合物有望被用于制備新型抗肝纖維化藥物。
[0012] 進一步的，組合物的體外實驗表明，組合物具有很強的抗生長因子誘導的成纖維 細胞增殖的活性，組合物是一個極具開發(fā)潛力的化合物，它可直接用于相應疾病的治療W 及相關藥物的制備。
[0013] W下通過實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明，但本發(fā)明的保護范圍不受具體實 施例的任何限制，而是由權利要求加 W限定。
【具體實施方式】
[0014] 實施例1化合物Virosaine A的制備
[0015] 化合物Virosaine A(I)的制備方法參照Bing-Xin Zhao等人發(fā)表的文獻(Bing- Xin Zhao et al.,2012.Virosaines A and B, Two New Birdcage-Shaped Securinega Alkaloids with an Unprecedented Skeleton from Flueggea virosa.Organic Letters 14(2012)3096-3099)的方法。
[0016]
[0017]實施例2 Virosaine A的0-漠乙基衍生物（II)的合成
[001引將化合物I (235mg，1. OOmmo 1)溶于20mL苯，向溶液中加入四下基漠化錠（TBAB) (0.08g)，1，2-二漠乙燒(3.760g，20.0 Ommol)和5mL的50%氨氧化鋼溶液。混合物在35攝氏 度攬拌化。她之后將反應液倒入冰水中，立即用二氯甲燒萃取兩次，合并有機相溶液。然后 對有機相溶液依次用水和飽和食鹽水洗涂3次，再用無水硫酸鋼干燥，最后減壓濃縮去除溶 劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為:石油酸/丙酬=100:1.0，v/v)，收 集棟色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物II的棟色粉末(261mg，78%)。
[0019] iHMffi(500MHz，DMS0-d6)S5.91(s，lH)，4.07(s，lH)，3.81(s，2H)，3.59(s，lH)， 3.43(s，2H)，3.33(s，lH)，2.26(s，lH)，1.58(d J = 9.8Hz，3H)，1.41(s，2H).
[0020] 1化醒R(125MHz，DMS0-d6)Sl71.81(s)，106.71(s)，79.95(s)，74.33(s)，69.81 (s),66.68(s),44.21(s),35.56(s),33.28(s),25.85(s),21.88(s).
[00別]HRMS(ESI)m/z[M+扣+calcd for Cm出7BrN04:342.0:341;found 342.0:343.
[0022]
[0023] 實施例3 Virosaine A的0-(贓嗦基）乙基衍生物（III)的合成
[0024] 將化合物II(17Img，0.5mmo 1)溶于20mL乙臘當中，向其中加入無水碳酸鐘(690mg， S.Ommol)，艦化鐘（168mg，1 .Ommol)和無水贓嗦（3446mg，40mmol)，混合物加熱回流化。反應 結束后將反應液倒入冰水中，用等量二氯甲燒萃取2次，合并有機相。依次用水和飽和食鹽 水洗涂合并之后的有機相，再用無水硫酸鋼干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗 品用硅膠柱層析純化(流動相為:石油酸/丙酬= 100: i.o，v/v)，收集棟色集中洗脫帶并揮 去溶劑即得到化合物ΠI的淡棟色固體(123.2mg，71 % )。
[0025] 1h 醒R(500MHz，DMS0-d6)S5.90(s，lH)，4.04(s，lH)，3.59(s，lH)，3.50(s，2H), 3.40(d J = 65.9Hz，lH)，2.64(s，4H)，2.54(s，2H)，2.31(s，4H)，2.22(s，lH)，1.62(s，2H), 1.56(s，lH)，1.43(s，2H)，0.97(s，lH).
[0026] "C NMR(125MHz，DMS0-d6)Sl71.84(s)，106.72(s)，79.94(s)，74.33(s)，66.72(d， J=9.2Hz),54.45(s),54.16(s),45.25(s),44.20(s),35.56(s),25.86(s),21.87(s).
[0027] HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for Cl姐26化〇4:348.1923;found:：M8.1927。
[002引
[00巧]實施例4 Virosaine A的0-(咪挫基）乙基衍生物（IV)的合成 [0030] 將化合物II(17Img，0.5mmo 1)溶于25mL乙臘當中，向其中加入無水碳酸鐘(690mg， 5. Ommo 1)，艦化鐘（2 5 2mg，1.5mmo 1)和咪挫（8 7 Omg，1 Ommo 1)，混合物加熱回流化。反應結束 后將反應液倒入25mL冰水中，用等量二氯甲燒萃取3次，合并有機相。依次用水和飽和食鹽 水洗涂合并之后的有機相，再用無水硫酸鋼干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗 品用硅膠柱層析純化(流動相為:石油酸/丙酬= 100:0.3，v/v)，收集棟色集中洗脫帶并揮 去溶劑即得到化合物IV的淡棟色固體(144. lmg，71%)。
[003。 1h NMR(500MHz，DMS0-d6)S7.86(s，lH)，7.12(s，lH)，6.71(s，lH)，5.99(s，lH), 4.09(s，lH)，3.89(d，J=16.4Hz，2H)，3.80(s，2H)，3.58(s，lH)，3.35(s，lH)，2.31(s，lH)， 1.68(s,lH),1.58(s,2H),1.44(s,2H).
[0032] 13c NMR(125MHz，DMS0-d6)i3c 醒Ra25MHz，Common 醒R Solvents)Sl71.82(s), 139.64(s)，128.67(s)，119.31(s)，106.70(s)，79.92(s)，74.31(s)，67.61(s)，66.66(s), 44.20(s),43.75(s),35.52(s),25.85(s),21.86(s).
[0033] HRMS化SI):m/z[M+H]+calcd for Cl訊20化〇4:330.1454;found:330.1458。
[0034]
[0035] 實施例5組合物抗肝纖維化活性
[0036] 由于肝臟星狀細胞的激活，從而引起了多種生長因子的大量分泌，運些生長因子 會誘導肝臟成纖維細胞的快速增殖，從而加速纖維化，其中最重要的生長因子之一就是 TGF。因此，篩選抗肝纖維化藥物的一個重要思路就是篩選能夠抑制肝臟成纖維細胞增殖的 藥物或者篩選能夠抑制TGF等生長因子誘導的成纖維細胞的增殖，篩選常常在成纖維細胞 上進行，NIH/3T3細胞是最常用的細胞株。
[0037] 組合物的制備：將研磨之后過200目網(wǎng)的25mg化合物III的粉末和研磨之后過200 目網(wǎng)的75mg化合物IV的粉末裝入帶蓋的小管中并用滿輪攬拌儀混合即得到lOOmg組合物， 使用時用水溶解運1 OOmg的組合物即得到組合物的溶液。
[003引實驗例1:組合物對成纖維細胞NIH/3T3增殖的抑制作用
[0039] 一、實驗方法：
[0040] NIH/3T3細胞株購自引自ATCC(American Type Culture Collection)的中科院上 海細胞所細胞庫。
[0041 ] 將對數(shù)生長期的亞融合的NIH/3T3細胞用0.25%膜酶消化，洗涂，離屯、后，用DMEM 培養(yǎng)液(含l〇%FCS)制成lX104cell/ml的細胞懸液，臺吩藍染色鑒定存活率大于95%，按 每孔lOOul加入96孔板中，在37°C、5%C02培養(yǎng)24h同步處理后，棄上清，加入含有藥物的 DMEM培養(yǎng)液（含10%FCS)200ul，培養(yǎng)48h，每孔加入MTT溶液解育4h。棄去培養(yǎng)液，加入 150U1DMS0，振蕩10分鐘，使結晶溶解，酶標儀490nm處讀取0D值，結果WOD490表示。
[00創(chuàng)二、實驗結果：
[0043] 1、形態(tài)學觀察
[0044] NIH/3T3在用藥前伸展良好，折光性較弱，有方向性，呈放射狀，細胞增殖的速度 快;而加組合物24h后，成纖維細胞數(shù)目減少，形狀變得不規(guī)則，突起變短，細胞排列混亂，細 胞內代謝產(chǎn)物增多。化合物ΠI和化合物IV無此作用。
[0045] MTT法檢測組合物對NIH/3T3細胞增殖的抑制作用。
[0046] 表1 :MTT法檢測組合物對NIH/3T3增殖的抑制作用
[0047]
[004引注:*，與細胞陰性對照P<0.05
[0049] 結果:組合物在20ug/ml對成纖維細胞NIH/3T3的細胞增殖有顯著的抑制作用。表 明組合物體外對成纖維細胞的增殖有顯著抑制作用。化合物ΠΙ和化合物IV無此作用。
[0050] 實驗例2:組合物對轉化生長因子-執(zhí)(TGF-βι)誘導的成纖維細胞增殖的抑制作用
[0051] TGF-βι是促進細胞增殖和膠原生成的強活性因子，在細胞中加入TGF-&10ng/ml刺 激細胞增殖，再檢測藥物對TGF-m誘導的細胞增殖的抑制作用，W分析判斷組合物的作用 機理。
[0052] 表2 :MTT法檢測組合物對TGF誘導NIH/3T3增殖的抑制作用 [0化3]
[0化5] 注:*，與細胞+TGF對照P<0.05
[0056] 結果:組合物在20ug/ml對成纖維細胞NIH/3T3在TGF-βι的誘導下的細胞增殖有顯 著的抑制作用，化合物ΠΙ和化合物IV無此作用。表明組合物體外對纖維細胞增殖的抑制作 用可能是通過干預TGF信號通路實現(xiàn)的。
[0057] 結論:組合物對成纖維細胞NIH/3T3在10%小牛血清的刺激下的細胞增殖有顯著 的抑制作用；組合物對成纖維細胞NIH/3T3在TGF-βι的誘導下的細胞增殖有顯著的抑制作 用。組合物可W用來制備抗肝纖維化藥物?；衔颕II和化合物IV對成纖維細胞NIH/3T3在 10%小牛血清的刺激下的細胞增殖無顯著的抑制作用，對成纖維細胞NIH/3T3在TGF-βι的 誘導下的細胞增殖無顯著的抑制作用，不可W用來制備抗肝纖維化藥物。
[005引實施例6本發(fā)明所設及組合物片劑的制備
[0059]取2克組合物，加入制備片劑的常規(guī)輔料18克，混勻，常規(guī)壓片機制成100片。
[0060] 實施例7本發(fā)明所設及組合物膠囊的制備
[0061] 取2克組合物，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉18克，混勻，裝膠囊制成100粒。
【主權項】
1. 一種組合物，其特征為該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物中化合物 III和化合物IV的質量百分數(shù)分別為25%和75%，2. 如權利要求1所述的組合物的制備方法，其特征為:將化合物III的粉末和化合物IV 的粉末按照質量百分數(shù)分別為25 %和75 %充分混合。3. -種如權利要求1所述的組合物在治療肝纖維化藥物中的應用。4. 如權利要求3所述的組合物在治療肝纖維化藥物中的應用，其特征為所述組合物抑 制成纖維細胞增殖。5. 如權利要求3所述的組合物在治療肝纖維化藥物中的應用，其特征為所述組合物抑 制生長因子誘導的成纖維細胞增殖。6. 如權利要求5所述的組合物在治療肝纖維化藥物中的應用，其特征為所述生長因子 為TGF-βΙ。
【文檔編號】C07D498/22GK105920006SQ201610278695
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月28日
【發(fā)明人】王卓婷
【申請人】南京賦海澳賽醫(yī)藥科技有限公司