含薄荷縮酮的脂質(zhì)體pH敏感性修飾劑以及紫杉醇-姜黃素復方脂質(zhì)體制劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于修飾脂質(zhì)體pH敏感性的修飾劑，其特征在于，由在低分子量透明酸上的D?葡萄糖醛酸單元連接薄荷酮甘油縮酮而成，其結構式為其中，n為2?20。本發(fā)明還提供了一種制備所述修飾劑的方法。本發(fā)明還提供了一種包含磷脂、膽固醇、藥物以及所述修飾劑的pH敏感的脂質(zhì)體制劑。通過使用本發(fā)明的修飾劑，可使所得到脂質(zhì)體傾向于在低pH的環(huán)境下釋放內(nèi)儲的藥物，并且還孵育脂質(zhì)體緩釋性。
【專利說明】
含薄荷縮酮的脂質(zhì)體pH敏感性修飾劑以及紫杉醇-姜黃素復 方脂質(zhì)體制劑
技術領域
[0001 ]本發(fā)明涉及藥物制劑，更特別地，涉及一種含薄荷縮酮的脂質(zhì)體pH敏感性修飾劑， 以及包含該修飾劑的紫杉醇-姜黃素復方脂質(zhì)體制劑。
【背景技術】
[0002] 腫瘤是一種嚴重威脅人類健康的疾病，而目前治療腫瘤的有效且常見的手段之一 是藥物治療。然而，多數(shù)抗代謝類抗腫瘤藥物缺乏對細胞的選擇性，在抑制腫瘤細胞的DNA 復制的同時亦會抑制正常細胞的DNA復制，毒性較大。目前臨床使用的多數(shù)傳統(tǒng)劑型的抗腫 瘤藥物生物利用度低，有些具有致敏性和嚴重的毒副作用，難以發(fā)揮治療效果的同時給患 者造成痛苦。
[0003] 脂質(zhì)體是一種與生物膜結構類似的雙層磷脂分子，可以使藥物的體內(nèi)分布發(fā)生改 變，降低抗腫瘤藥物的毒性。腫瘤組織間質(zhì)液會出現(xiàn)異常酸化現(xiàn)象，根據(jù)此特性，制備有特 定pH響應修飾劑修飾的脂質(zhì)體，可以實現(xiàn)脂質(zhì)體的pH敏感性，從而實現(xiàn)抗腫瘤藥的革El向給 藥。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明解決上述技術問題的技術方案如下：
[0005] -種用于修飾脂質(zhì)體pH敏感性的修飾劑，其由在低分子量透明酸上的D-葡萄糖醛 酸單元連接薄荷酮甘油縮酮而成，其結構式如下：
[0006]
[0007] 其中，η為2至20。
[0008] 所述修飾劑通過以下方法來制備：
[0009] 1)使薄荷酮甘油縮酮(MGK)與Na-芐氧羰基-L-組氨酸(Cbz-His)在1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)的存在下反應生成Cbz-MH:
[0010]
[0011]
[0013] 3)使步驟2)中的MH與透明質(zhì)酸鈉(nHS)在1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的存在下反應生成nHM:
[0012]
[0014]
[0015] 本發(fā)明還提供了一種pH敏感的脂質(zhì)體制劑，其包含本發(fā)明的修飾劑。優(yōu)選地，所述 脂質(zhì)體制劑還包含磷脂、膽固醇和藥物。其中所述修飾劑與磷脂的重量比為1:4-1:16,優(yōu)選 為1:10;所述藥物與所述磷脂的重量比為1:10-1:30,優(yōu)選為1:30;并且所述膽固醇與所述 磷脂的重量比為1:10-1:1.25,優(yōu)選為1: 4。
[0016] 所述藥物可為抗腫瘤藥物。例如，所述藥物可由姜黃素和紫杉醇組成，并且所述姜 黃素與所述紫杉醇的重量比為1: 〇. 5-1:10，優(yōu)選為1:1。
[0017] 本發(fā)明提供的pH敏感的脂質(zhì)體制劑可用于治療腫瘤。
【附圖說明】
[0018] 圖1為本發(fā)明合成的脂質(zhì)體pH敏感性修飾劑的質(zhì)譜圖；
[0019] 圖2為oHM的臨界膠束濃度曲線；
[0020] 圖3為pH對修飾的脂質(zhì)體的粒徑和包封率的影響的圖；
[0021] 圖4為修飾的脂質(zhì)體在不同pH下和孵育時間下的釋藥量，其中C1%為修飾的脂質(zhì) 體在pH 7.0下的釋藥量，C2%為修飾的脂質(zhì)體在pH 5.0下的釋藥量，C3%為普通脂質(zhì)體在 pH 7.0下的釋藥量，Cl %為普通脂質(zhì)體在pH 5.0下的釋藥量；
[0022] 圖5為不同劑型通過靜脈給藥后紫杉醇在全血中的濃度隨時間的變化。
【具體實施方式】
[0023] 以下結合附圖對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并 非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0024] 實施例1oHM的制備
[0025] l)Cbz-MH 的合成
[0026] 于50mL反應器中，加入Cbz-His(0 · 5g，1 · 72mmol)、DMAP(0 · 3g，2 · 58mmol)、EDC (0 · 36g，I · 89mmoI)，DMF 15mL溶解，攪拌30min，溶液澄清，加入MGK(0 · 43g，I · 89mmoI)，室溫 反應8h(TLC檢測反應進度）。反應完全后，于250mL分液漏斗中，40ml乙酸乙酯萃取三次， 70mL去離子水洗兩次反應液，無水硫酸鈉干燥，減壓去除有機溶劑，過柱分離純化，得到淺 黃色油狀產(chǎn)物〇.858g。
[0027]
[0028] 2MH的合成
[0029] 于25mL反應器中，加入Cbz-MH 200mg、甲醇5mL，攪勻溶解，得澄清透明溶液，加入 少許鈀碳，H2保護，室溫反應24h(TLC監(jiān)測反應進度）。過濾除去鈀碳，減壓去除有機溶劑，得 到淺黃任I油狀物-
[0030]
[0031] 3)oHM 的合成
[0032] 于25mL反應器中，加入透明質(zhì)酸鈉（0.020g，0.05mmol)、EDC(0.016g，0.08mmol)、 NHS(0 . OlOg，0.08mmol)，3mL去離子水溶解，35°C攪拌4h后，ImL四氫呋喃溶解ΜΗ(0.029， 0.0 Smmol)加入到反應器中，中間檢測反應液的酸堿性，35°C攪拌48h后，反應混合液用過量 蒸餾水透析4h，然后將樣品真空冷凍干燥，得淡黃色粉末，低溫保存待用。
[0033]
[0034] 通過質(zhì)譜圖（圖1)顯示所得到的分子中存在縮酮結構、組氨酸結構和透明質(zhì)酸結 構。通過將所得到的分子的紅外光譜圖與寡聚透明質(zhì)酸的紅外光譜圖相比較，顯示所得到 的分子中體現(xiàn)出寡透明質(zhì)酸的峰，說明該分子中的透明質(zhì)酸結構為寡透明質(zhì)酸。該分子的 紅外光譜圖中還體現(xiàn)出存在酯羰基和咪唑環(huán)。結合氫譜和紅外光譜信息，證明得到目標產(chǎn) 物〇腿，產(chǎn)率為56.44 %。
[0035] oHM在常用溶劑中的溶解性如表1所示：
[0036]表Ι.οΗΜ在常用溶劑中的溶解性
[0038]以1373/1384值對IogC作圖，拐點處即為芘由親水環(huán)境進入膠束疏水內(nèi)核的oHM濃 度，即oHM膠束的CMC值，如圖2。芘熒光法測得的聚合物oHM的臨界膠束濃度為0.082mg/ml。 因此，后期制備的膠束中載體材料oHM的濃度應該大于0. 〇82mg/ml。
[0039] 實施例2.包含pH敏感性修飾劑的姜黃素-紫杉醇復方脂質(zhì)體制劑的制備
[0040] 1.脂質(zhì)體制備方法
[0041] 本領域常常使用三種方法來制備脂質(zhì)體，包括：薄膜蒸發(fā)法（Hand Shaken Method，HSM)、乙醇注入法（Ethanol In jection Method，EIM)和逆向蒸發(fā)法（Reverse Phase Evaporation Method，RPEM)。在本文中，發(fā)明人以薄膜蒸發(fā)法來制備所述脂質(zhì)體，但 是應理解，所述脂質(zhì)體還可使用另外兩種制備方法，或本領域已知的其他制備方法來制備。 本文所用的制備方法包括以下步驟：
[0042]精密稱取處方量的卵磷脂、膽固醇、0ΗΜ、紫杉醇、姜黃素在IOOmL茄形燒瓶中用適 量成膜介質(zhì)(氯仿)溶解，于約40°C水浴減壓充分蒸去成膜介質(zhì)，在燒瓶內(nèi)壁形成脂質(zhì)薄膜， 加入與成膜介質(zhì)等體積的水合介質(zhì)(磷酸緩沖液，PBS)，40°C充分振蕩水合，得到約含紫杉 醇lmg/mL的紫杉醇脂質(zhì)體混懸液，為了減小粒徑使用了超聲波細胞粉碎機均質(zhì)化。
[0043] 2.脂質(zhì)體包封率的影響因素
[0044] 脂質(zhì)體制備過程中，以下三個因素對脂質(zhì)體的包封率有影響：磷脂含量、oHM含量 和藥脂比。
[0045] 根據(jù)參考文獻和研究經(jīng)驗，發(fā)明人選擇了 1 %、2%和3%的磷脂含量;1:10、1:20和 1:30的藥脂比以及1:4、1:10和1:16的oHM:磷脂比進行分別組合，以找到最優(yōu)制備參數(shù)，結 果列于表2中。
[0046]表2.三種因素對包封率的影響
[0049] 以上實驗結果表明，磷脂濃度的影響最大，當磷脂的濃度為1 %時，包封率都在 80%以下，磷脂濃度為2%以上時，姜黃素+紫杉醇脂質(zhì)體的包封率都在80%以上，3%的磷 脂濃度包封率很高。藥脂比為次要因素，當藥脂比在1:10以下時，包封率都比較高。實驗結 果表明藥脂比在1:30時包封率最高。在這三個因素中，oHM與磷脂的比例是影響最小的因 素。由上表可得，優(yōu)化組合為3%的磷脂、1:30的藥脂比以及1:10的 〇HM:PC，即最優(yōu)處方為磷 脂濃度3%，紫杉醇和磷脂的比例為1:30，oHM和磷脂的比例為1: 10。
[0050] 3.脂質(zhì)體粒徑的優(yōu)化
[0051] 為了滿足靜脈給藥的要求，通常將以上得到的脂質(zhì)體進行超聲處理，以減小脂質(zhì) 體的粒徑。在超聲過程中對結果有影響的因素主要有:輸出功率、工作時間、間隔時間和周 期次數(shù)。
[0052] 根據(jù)參考文獻和研究經(jīng)驗，發(fā)明人選擇了 200、400和600W的輸出功率;超1停2、超2 停2和超3停2的超聲模式；以及90、180和270次的周期次數(shù)進行組合，以找到最優(yōu)制備參數(shù)， 結果列于表3中。
[0053] 表3.三種因素對粒徑、PI和包封率的影響 I

luu&6」 通]ο：多指稱z-評分y云得到，敢住丄藝穸數(shù)吆a艿揃出功準卻訓、趙ιι爭以及i8u 次。
[0057] 4. pH對脂質(zhì)體粒徑和包封率的影響
[0058] 在制備過程中分別使用pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.4的磷酸鹽緩沖液，以觀察不同 pH對粒徑和包封率的影響，結果如圖3所示，在pH 6.0時，包封率達到最高，粒徑也比較小。 故pH 6.0為制備過程中使用的磷酸鹽緩沖液的最佳pH值。
[0059] 實施例3修飾的脂質(zhì)體的性質(zhì)
[0060] 1.修飾的脂質(zhì)體在不同pH下和孵育時間下的釋藥量
[0061 ]取處方量的PC、0HM和PTX，加入處方量氯仿，旋轉蒸發(fā)成膜，分別加入pH為5.0和 7.0的磷酸緩沖液中，于37°C中水浴孵化。每隔一個小時取樣，測定PTX含量。結果如圖4所 示，在孵育1-4個小時期間，本發(fā)明的脂質(zhì)體在5.0的pH下的釋藥量(C2%)比在pH 7.0下的 釋藥量(Cl % )高得多并且在pH 5.0下孵育4小時達到70%左右，而普通脂質(zhì)體在兩個pH下 的釋藥量(C3%和C4%)相差不大，并且孵育4小時達到近100%。該結果說明，本發(fā)明的脂質(zhì) 體傾向于在pH較低的環(huán)境中釋放內(nèi)儲的藥物，并且具有緩釋作用。
[0062] 2.本發(fā)明的脂質(zhì)體在大鼠體內(nèi)的藥代動力學研究
[0063]采用三種劑型向大鼠進行紫杉醇給藥：注射劑（PTX-INJ) (n = 5)、普通脂質(zhì)體 (PTX-PL) (n = 5)以及本發(fā)明的修飾的脂質(zhì)體(PTX-ML) (n = 5)。在給藥后15min、30min、l小 時、2小時、4小時、6小時、8小時和12小時處取血，測定全血中的紫杉醇濃度。
[0064]結果如圖5所示，注射劑在6小時后基本檢測不到紫杉醇濃度，普通脂質(zhì)體在8小時 后基本檢測不到，本發(fā)明的修飾的脂質(zhì)體在12小時后仍能在全血中檢測到紫杉醇。這表明， 本發(fā)明的修飾的脂質(zhì)體增強了體內(nèi)緩釋作用。
[0005]各組的主要藥代動力學參數(shù)如表4所示。
[0066]表4靜脈施用紫杉醇后的主要藥代動力學參數(shù)
[0068] *相對于注射劑ρ〈0·05。
[0069] 以上數(shù)據(jù)說明，各組制劑快配置常數(shù)α的大小順序為:PTX-ML>PTX-PL>PTX-INJ，快 配置常數(shù)越大說明快速消除相PTX全血濃度隨時間降低越快;各組制劑慢配置常數(shù)邱勺大小 順序為:PTX-ML>PTX-PL>PTX-INJ;慢配置常數(shù)越大說明慢速消除相PTX全血濃度隨時間降 低越快;各組制劑表觀分布容積V的大小順序為:PTX-INJ>PTX-ML>PTX-PL，表觀分布容積越 大說明藥物在組織中的分布比例相對于全血越高;各組制劑清除率CL的大小順序為:PTX-INJ>PTX-PL>PTX-ML;各組制劑曲線下面積AUC(O-U)的大小順序為：PTX-ML>PTX-PL>PTX-INJ; PTX-ML 的 AUC(〇-tn)均大于 PTX-PL 及 PTX-INJ，其中AUC(O-U)最高的 PTX-ML 為 PTX-INJ 的1.5倍，相對于PTX-INJ達到了較好的長循環(huán)效果，各組制劑平均駐留時間MRT (0-tn)的大 小順序為:PTX-ML>PTX-PL>PTX-INJ。
[0070] 3.本發(fā)明的脂質(zhì)體的靶向性評價
[0071 ]以PTX-INJ為對照組，以相對攝取率(Re)、峰濃度比（Ce)、靶向效率(Te)作為評價 參數(shù)相對攝取率(re)、峰濃度比(Ce)、靶向率(Te)，進行靶向性評價。
[0072] Re=(AUCi)m/(AUCi)s，Re為同一器官或組織中實驗組和對照組的AUC之比，表示 同一器官或組織中兩種不同制劑的分布情況。Re>l表示在該器官或組織有靶向性，Re越大 靶向效果越好;Re〈l表示在該器官或組織沒有靶向性。腳注m和s分別為實驗組和對照組。 [0073 ]表5全血和組織中的紫杉醇的相對攝取率(Re)
[0075] 修飾的脂質(zhì)體和普通脂質(zhì)體在血液中較長時間維持一定濃度，這與前面的藥動學 數(shù)據(jù)基本一致，修飾的脂質(zhì)體明顯高于普通脂質(zhì)體和注射劑，顯示出一定長循環(huán)效果。Re> 1，修飾的脂質(zhì)體和普通脂質(zhì)體與注射劑型相比在肝、脾中靶向效果最好。Re接近1，在其他 臟器中不明顯，修飾的脂質(zhì)體比普通脂質(zhì)體在腎中略高。
[0076] Ce = ( Cmaxi )m/ (Cmaxi) s，每個組織或器官的Ce值表明藥物分布的差異性，Ce值越大， 表明藥物分布差別越大。
[0077] 表6全血和組織中的紫杉醇的峰濃度比（Ce)
[0080]修飾的脂質(zhì)體和普通脂質(zhì)體主要分布于血液、肝臟、脾臟，且修飾pH敏感脂質(zhì)體在 血液分布中較普通脂質(zhì)體高，而在肝臟、脾臟中普通脂質(zhì)體為高，可能是修飾的脂質(zhì)體有長 循環(huán)作用，所以在血液分布中較高，能提高在血液中的分布，降低在肝、脾系統(tǒng)的蓄積和吞 噬;其他臟器差別不明顯。
[0081 ] 靶向效率了6，了6 = 41](^_6/^1](^1。。(1，表示制劑對器官的選擇性，比值越大，選擇性 越強。
[0082 ] 表7全血和組織中的紫杉醇的靶向率(Te)
[0084] *p〈0.05vs PTX-INJ
[0085] 普通脂質(zhì)體在肝臟、脾臟靶向效率較高，經(jīng)t檢驗明顯高于修飾修飾pH敏感脂質(zhì)體 和注射劑，具有顯著性;而修飾的質(zhì)體和注射劑在組織分布中無顯著性，說明本發(fā)明的修飾 材料可以明顯降低脂質(zhì)體被肝臟、脾臟單核巨噬細胞的吞噬和攝取，避免肝脾系統(tǒng)的毒性。
[0086] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和 原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權項】
1. 一種用于修飾脂質(zhì)體pH敏感性的修飾劑，其特征在于，由在低分子量透明酸上的D-葡萄糖醛酸單元連接薄荷酮甘油縮酮而成，其結構式如下： 其中，η為2-20。2. -種制備權利要求1所述的修飾劑的方法，特征在于，包括以下步驟： 1) 使薄荷酮甘油縮酮與Να-芐氧羰基-L-組氨酸在1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺 鹽酸鹽和4-二甲氨基吡啶的存在下反應生成Cbz-MH:2) 使步驟1)中得到Cbz-MH與H2在鈀碳的存在下反應，生成ΜΗ:3) 使步驟2)中的ΜΗ與透明質(zhì)酸鈉(nHS)在1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽 和N-羥基琥珀酰亞胺的存在下反應生成oHM:3. -種pH敏感的脂質(zhì)體制劑，其特征在于，包含磷脂、膽固醇、藥物以及權利要求1所述 的修飾劑。4. 根據(jù)權利要求3所述的pH敏感的脂質(zhì)體制劑，其特征在于，其中所述修飾劑與磷脂的 重量比為1:4-1:16,所述藥物與所述磷脂的重量比為1:10-1:30,并且所述膽固醇與所述磷 脂的重量比為1:10-1:1.25。5. 根據(jù)權利要求4所述的pH敏感的脂質(zhì)體制劑，其特征在于，所述修飾劑與磷脂的重量 比為1:10,所述藥物與所述磷脂的重量比為1:30,并且所述膽固醇與所述磷脂的重量比為 1:4〇6. 根據(jù)權利要求4所述的pH敏感的脂質(zhì)體制劑，其特征在于，所述藥物是抗腫瘤藥物。7. 根據(jù)權利要求6所述的pH敏感的脂質(zhì)體制劑，其特征在于，所述抗腫瘤藥物由姜黃素 和紫杉醇組成，并且所述姜黃素與所述紫杉醇的重量比為1:0.5-1:10。8. 根據(jù)權利要求7所述的pH敏感的脂質(zhì)體制劑，其特征在于，所述姜黃素與所述紫杉醇 的重量比為1:1。9. 一種權利要求6-8中任一項所述的pH敏感的脂質(zhì)體制劑的用途，其特征在于，用于制 備抗腫瘤藥劑。
【文檔編號】A61P35/00GK105944108SQ201610257042
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年4月22日
【發(fā)明人】陳大全, 董雪, 劉暢, 于月明, 趙烽, 孫考祥, 劉萬卉, 吳子梅
【申請人】煙臺大學