一種人血清白蛋白負載喜樹堿類藥物的納米顆粒及其制備方法和應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種白蛋白負載喜樹堿類前藥納米顆粒及其制備方法和應用，本發(fā)明采用去溶劑法成功制備了白蛋白載藥納米粒，該法簡單、易操作，重復性好。制備的白蛋白載藥納米粒具有較強的抑制腫瘤細胞增殖的能力，證實白蛋白載藥納米粒具有廣闊的抗腫瘤應用前景。
【專利說明】
一種人血清白蛋白負載喜樹堿類藥物的納米顆粒及其制備方 法和應用
技術領域
[0001 ]本發(fā)明屬于抗腫瘤藥物領域，具體涉及白蛋白載喜樹堿類抗腫瘤藥物納米顆粒的 制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]利用納米載體及相關技術輸送抗癌藥物是目前腫瘤治療領域的熱點研究問題。納 米藥物主要有如下優(yōu)點：1)腫瘤血管的內(nèi)皮細胞間隙相對疏松，200nm以下的納米?？赏ㄟ^ 實體瘤的高通透與滯留效應(EPR)被動地進入腫瘤組織。此外，納米粒本身可以被配體分子 修飾用于主動靶向，無論是納米粒的主動或被動靶向作用，都可使藥物在腫瘤組織中富集， 在增加藥物療效的同時，相對減少了藥物劑量，使得抗癌藥物的毒副作用也大大降低。2)納 米粒可以提高藥物的溶解性和穩(wěn)定性，為藥物代謝動力學特征不理想的藥物進入臨床提供 可能性;尤其是對于水溶性極差的抗腫瘤藥物，通過納米技術，可提高難溶性藥物在水溶液 中的溶解性，達到增溶的目的。3)被納米粒包裹后的藥物降低了跟血液接觸的機會，使得藥 物在血液循環(huán)中的半衰期得以提高。通過對載藥納米粒進行合理的設計及載體的構(gòu)建，納 米載體及藥物已經(jīng)在抗腫瘤研究中取得了良好的應用前景。
[0003]組成納米粒的各種物質(zhì)對最終制劑的性質(zhì)有很大影響，因此制備納米時應考慮所 用的單體、聚合物及賦形劑的生物相容性、毒性等問題，優(yōu)先使用毒性低、內(nèi)源性或可被生 物降解成具有良好生理相容性的材料。
[0004] 白蛋白為內(nèi)源性物質(zhì)，是血漿中含量最多的蛋白質(zhì)，具有安全無毒、可生物降解、 生物相容性好等優(yōu)點，可作為理想的藥物載體（參考文獻4.0上12叩他 7，11.5&11^&11(1 N.A.Elgindy.Albumin-based nanoparticles as potential controlled release drug delivery systems. J.Controlled Release，2012,157，168_182·)。結(jié)合了納米粒載體和白 蛋白性質(zhì)兩方面優(yōu)勢白蛋白納米載藥系統(tǒng)近年來受到廣泛的關注，為難溶性藥物制劑的開 發(fā)提供了新的思路。其中由美國AbraxisBioSciencelnc.開發(fā)的紫杉醇人血清白蛋白納米 粒注射劑(Aferaxane 111)于2005年1月獲得美國FDA的批準上市，主要用于化療失敗的乳腺 癌患者的治療。Abraxane·是第一個上市的以nab技術為基礎的藥物。臨床研究顯示，該紫 杉醇蛋白納米粒比其聚氧乙烯蓖麻油制劑有更高的治療指數(shù)和安全性，并且避免了使用皮 質(zhì)類固醇的術前給藥，顯示了人血清白蛋白作為靜脈應用載體的廣闊前景。因此，以蛋白質(zhì) 為基礎的納米醫(yī)學已迅速成為藥物遞送系統(tǒng)研究的最新熱點，具有非常重要的臨床應用價 值。
[0005] 7-乙基-10-羥基喜樹堿(SN38)是天然抗腫瘤藥物喜樹堿的半合成衍生物，具有抗 癌作用強、抗癌活性高的特點，可通過抑制DNA拓撲異構(gòu)酶I引起細胞凋亡。該化合物的活性 是上市藥物伊立替康活性的100~1000倍。但SN38不溶于水及藥劑學可以接受的溶劑(如吐 溫或者聚氧乙烯蓖麻油），因此無法直接用于臨床注射。其水溶性衍生物伊立替康(CPT-11) 進入體內(nèi)后不穩(wěn)定、消除快、血藥濃度維持時間短;此外在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成具有治療效果的SN38 依賴于羧酸酯酶的活性，其轉(zhuǎn)化產(chǎn)率低于8 %，嚴重影響其療效。SN38由于其脂溶性較差，難 以直接與白蛋白溶液混合后被包埋進入白蛋白納米粒中，因此，需要采用化學方法對藥物 分子結(jié)構(gòu)進行改造，使其能夠被成功包埋，從而構(gòu)建白蛋白載藥納米粒。目前尚未見有將白 蛋白作為喜樹堿類抗腫瘤藥物載體的相關報道。
[0006]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供了一種人血清白蛋白負載喜樹堿類藥物的納米顆粒及其制備方法和 應用，該方法步驟簡單，可工業(yè)化大批量生產(chǎn)。
[0008] 本發(fā)明還提供了一種白蛋白載藥納米粒在制備抗癌藥物中的應用。細胞實驗顯 示，使用本發(fā)明的人血清白蛋白包裹后的納米藥物，對比臨床藥物伊立替康具有更高的抗 腫瘤細胞活性。
[0009] -種白蛋白載藥納米粒的制備方法，包括：向抗腫瘤藥物和白蛋白的混合物中加 入無水乙醇，再加入交聯(lián)劑，透析后得到載藥納米粒；
[0010] 所述的抗腫瘤藥物為喜樹堿類抗腫瘤藥物。
[0011 ]作為優(yōu)選，所述的白蛋白為人血清白蛋白。
[0012]作為優(yōu)選，所述的喜樹堿類抗腫瘤藥物是由7-乙基-10-羥基喜樹堿(SN38)通過酯 鍵與不飽和脂肪酸連接形成的藥物前體，結(jié)構(gòu)如式(I)所示：
[0013] (I)
[0014] 其中，R表示不飽和脂肪酸。
[0015]作為優(yōu)選，所述的不飽和脂肪酸為全反式維甲酸(RA)、二十二碳六烯酸(DHA)、亞 麻酸或亞油酸。
[0016] 作為優(yōu)選，所述的交聯(lián)劑為戊二醛，進一步優(yōu)選為濃度8 %的戊二醛溶液。
[0017] 作為優(yōu)選，混合物中抗腫瘤藥物與白蛋白的摩爾比為10:1~1:10。
[0018] 作為優(yōu)選，無水乙醇的體積是混合物體積的1~5倍。
[0019]作為優(yōu)選，每毫克白蛋白中加入的交聯(lián)劑體積在0.2~1.5yL之間。
[0020] 所述白蛋白載藥納米粒的具體制備方法如下：
[0021] (1)在人血清白蛋白與抗腫瘤藥物或抗腫瘤藥物前藥的混合溶液中，滴加無水乙 醇;該步驟中，無水乙醇為混合溶液的體積的1~5倍，進一步優(yōu)選為3倍。
[0022] (2)在步驟(1)后，加入8 %戊二醛溶液;該步驟中戊二醛溶液的體積與人血清白蛋 白質(zhì)量的比例為(0.2~1.5)yL: lmg，進一步優(yōu)選為1.4yL/mg。
[0023] (3)步驟(2)反應后溶液，經(jīng)透析去除多余戊二醛和無水乙醇，得到白蛋白載抗腫 瘤藥物或抗腫瘤藥物前藥的納米粒溶液。
[0024] 本發(fā)明提供了一種所述的制備方法制備得到的白蛋白載藥納米粒。
[0025] 本發(fā)明還提供了一種所述的白蛋白載藥納米粒在制備抗癌藥物中的應用。
[0026]本發(fā)明中，體外細胞實驗顯示，與腸癌細胞系HCT-116共培養(yǎng)48h后，各實驗組對腫 瘤細胞的存活率都有一定的影響。其中，HSA-SN38-NPs對腸癌細胞系HCT-116的IC5Q值為 0.14μΜ，與SN38細胞毒性接近，但抗腫瘤細胞活性是CPT-11的233倍;與HCT-116共培養(yǎng)72h 后，HSA-SN38-NPs對腫瘤細胞的存活率影響更明顯，是CPT-11的464倍。
【附圖說明】
[0027] 圖1為RA-SN38的合成路線圖；
[0028]圖2為亞油酸-SN38的合成路線圖；
[0029]圖3為亞麻酸-SN38的合成路線圖；
[0030] 圖4為DHA-SN38的合成路線圖；
[0031]圖5為實施例9中制備的納米粒電鏡圖 [0032]圖6為實施例9中制備的納米粒粒徑圖 [0033]圖7為實施例10中制備的納米粒電鏡圖 [0034]圖8為實施例10中制備的納米粒粒徑圖
[0035]圖9實施例6制備的納米粒對腫瘤細胞HCT-116的抑制效果(48h);
[0036] 圖10實施例6制備的納米粒對腫瘤細胞HCT-116的抑制效果(72h);
[0037] 圖中，RA表示全反式維甲酸，SN38表示7-乙基-10-羥基喜樹堿，DISC表示N，N'_二 異丙基碳二酰亞胺，DMAP表示4-二甲氨基吡啶，DIEA表示N，N-二異丙基乙胺，anhydrous DMF表示無水N，N-二甲基甲酰胺，RA-SN38表示全反式維甲酸與SN38偶聯(lián)物。
【具體實施方式】
[0038]下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細說明，但本發(fā)明并不受其限 制。
[0039] 實施例1
[0040] RA-SN38合成方法參考
【申請人】前期專利"一種全反式維甲酸-喜樹堿類抗癌藥物偶 聯(lián)物及其制備方法和應用"，專利申請?zhí)柣驅(qū)＠枮?01410692682.7。
[0041] 合成路線如圖1所示。
[0042] 實施例2
[0043]亞油酸-SN38合成方法參考
【申請人】前期專利"7-乙基-10-羥基喜樹堿藥物前體及 其制備方法和應用"，專利申請?zhí)枮?01410295432.X。
[0044] 合成路線如圖2所示。
[0045] 實施例3
[0046]亞麻酸-SN38合成方法參考
【申請人】前期專利"7-乙基-10-羥基喜樹堿藥物前體及 其制備方法和應用"，專利申請?zhí)枮?01410295432.X。
[0047] 合成路線如圖3所示。
[0048] 實施例4
[0049] DHA-SN38合成方法參考
【申請人】前期專利，專利申請?zhí)枮?01410295432.X。
[0050]合成路線如圖4所示。
[0051 ] 實施例5
[0052] 制備 HSA-RA-SN38 納米粒(HSA 與 RA-SN38 摩爾比 10:1)
[0053] 稱取10mg HSA，溶于lmL水中，加入實施例1制備的RA-SN38(20mg/mL溶于DMS0)， HSA與SN38摩爾比10:1，攪拌20min，加入3mL無水乙醇，再加入14yL 8 %戊二醛溶液，攪拌過 夜，透析(Mw 3500)4h后得到納米粒溶液，粒徑101 ±35nm。
[0054] 實施例6
[0055] 制備 HSA-RA-SN38 納米粒(HSA 與 RA-SN38 摩爾比5:1)
[0056] 稱取10mg HSA，溶于lmL水中，加入實施例1制備的RA-SN38(20mg/mL溶于DMS0)， HSA與SN38摩爾比5:1，攪拌20min，加入3mL無水乙醇，再加入14yL 8 %戊二醛溶液，攪拌過 夜，透析(Mw 3500)4h后得到納米粒溶液，粒徑109 ± 16nm。
[0057] 實施例7
[0058] 制備 HSA-RA-SN38 納米粒(HSA 與 RA-SN38 摩爾比1:1)
[0059] 稱取10mg HSA，溶于lmL水中，加入實施例1制備的RA-SN38(20mg/mL溶于DMS0)， HSA與SN38摩爾比1:1，攪拌20min，加入3mL無水乙醇，再加入14yL 8 %戊二醛溶液，攪拌過 夜，透析(Mw 3500 )4h后得到納米粒溶液，粒徑97 ± 22nm。
[0060] 實施例8
[0061 ]制備 HSA-RA-SN38 納米粒(HSA 與 RA-SN38 摩爾比 1:5)
[0062] 稱取10mg HSA，溶于lmL水中，加入實施例1制備的RA-SN38(20mg/mL溶于DMS0)， HSA與SN38摩爾比1:5，攪拌20min，加入3mL無水乙醇，再加入14yL 8 %戊二醛溶液，攪拌過 夜，透析(Mw 3500)4h后得到納米粒溶液，粒徑107 ± 17nm。
[0063] 實施例9
[0064] 制備 HSA-RA-SN38 納米粒(HSA 與 RA-SN38 摩爾比 1:10)
[0065] 稱取10mg HSA，溶于lmL水中，加入實施例1制備的RA-SN38(20mg/mL溶于DMS0)， HSA與SN38摩爾比1:10，攪拌20min，加入3mL無水乙醇，再加入14yL 8 %戊二醛溶液，攪拌過 夜，透析(Mw 3500)4h后得到納米粒溶液，由圖5可見，HSA-RA-SN38納米粒大小均勻，呈球 形，由圖6可見，納米粒分布均勾，粒徑102 ±34nm。
[0066] 實施例10
[0067] 制備HSA-亞油酸-SN38納米粒(HSA與亞油酸-SN38摩爾比1:10)
[0068] 稱取10mg HSA，溶于lmL水中，加入實施例7制備的亞油酸-SN38(20mg/mL溶于 DMSO)，HSA與SN38摩爾比1:10，攪拌20min，加入3mL無水乙醇，再加入14yL 8%戊二醛溶液， 攪拌過夜，透析(Mw 3500)4h后得到納米粒溶液，由圖7可見，HSA-亞油酸-SN38納米粒大小 均勾，呈球形，由圖8可見，納米粒分布均勾，粒徑153 ±35nm。
[0069] 實施例11
[0070] 考察實施例9中HSA-SN38-NPs對腫瘤細胞增長的抑制作用，具體方法如下：
[0071 ]取對數(shù)生長期細胞，接種于96孔培養(yǎng)板(5000個細胞/孔）。放入在37 °C細胞培養(yǎng)箱 中恒溫培養(yǎng)24h后，加入HSA-SN38-NPs，取7個濃度梯度，以SN38(溶于二甲亞砜)作為對照 組，每種藥每個濃度4個重復值，加完藥后將96孔細胞板放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48或72h后， 在96孔板的每孔內(nèi)加入30yL的四甲基偶氮唑藍(MTT)，繼續(xù)放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后，吸 棄培養(yǎng)基，每孔加入l〇〇yL二甲亞砜，用酶標儀檢測490nm處的吸光值。計算細胞存活率，繪 制出細胞存活曲線（圖9-10)，得到藥物對細胞生長的IC 5Q (半數(shù)抑制濃度）。HSA-SN38-NPs對 各種腫瘤細胞的體外毒性結(jié)果見表1。
[0072]表1各試驗藥物的體外細胞毒性評價結(jié)果(μΜ)
[0073]
[0074] 表1結(jié)果顯示，與腸癌細胞系HCT-116共培養(yǎng)48h后，各實驗組對腫瘤細胞的存活率 都有一定的影響。其中，HSA-SN38-NPs對腸癌細胞系HCT-116的IC 5Q值為0.14μΜ，與SN38 (0.22μΜ)細胞毒性接近，但抗腫瘤細胞活性是CPT-11的233倍；與HCT-116共培養(yǎng)72h后， HSA-SN38-NPs對腫瘤細胞的存活率影響更明顯，是CPT-11的464倍。細胞毒性實驗表明， HSA-SN38-NPs具有較強的抑制腫瘤細胞增殖的能力，證實HSA-SN38-NPs具有廣闊的抗腫瘤 應用前景。
【主權(quán)項】
1. 一種白蛋白載藥納米粒的制備方法，其特征在于，包括：向抗腫瘤藥物和白蛋白的混 合物中加入無水乙醇，再加入交聯(lián)劑，得到載藥納米粒， 所述的抗腫瘤藥物為喜樹堿類抗腫瘤藥物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的白蛋白載藥納米粒的制備方法，其特征在于，所述的白蛋白為 人血清白蛋白。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的白蛋白載藥納米粒的制備方法，其特征在于，所述的喜樹堿類 抗腫瘤藥物是由7-乙基-10-羥基喜樹堿通過酯鍵與不飽和脂肪酸連接形成的藥物前體。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的白蛋白載藥納米粒的制備方法，其特征在于，所述的不飽和脂 肪酸為全反式維甲酸(RA)、二十二碳六烯酸(DHA)、亞麻酸或亞油酸。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的白蛋白載藥納米粒的制備方法，其特征在于，所述的交聯(lián)劑為 戊二醛。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的白蛋白載藥納米粒的制備方法，其特征在于，混合物中抗腫瘤 藥物與白蛋白的摩爾比為10:1~1:10。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的白蛋白載藥納米粒的制備方法，其特征在于，無水乙醇的體積 是混合物體積的1~5倍。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的白蛋白載藥納米粒的制備方法，其特征在于，每毫克白蛋白中 加入的交聯(lián)劑體積在〇. 2~1.5yL之間。9. 一種如權(quán)利要求1~8任一項所述的制備方法制備得到的白蛋白載藥納米粒。10. -種如權(quán)利要求9所述的白蛋白載藥納米粒在制備抗癌藥物中的應用。
【文檔編號】A61P35/00GK105997943SQ201610496426
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月24日
【發(fā)明人】王杭祥, 陳建美
【申請人】浙江大學