益母草堿在制備治療血管性癡呆藥物中的用圖
【專利摘要】本發(fā)明屬制藥領(lǐng)域，涉及益母草堿在制備治療癡呆藥物中的用途，尤其是在制備治療血管性癡呆(vascular dementia,VD)藥物中的用途。本發(fā)明成功復(fù)制大鼠VD模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明益母草堿可以顯著改善VD導(dǎo)致的認(rèn)知功能損傷，緩解長時(shí)程突觸后抑制的損傷，降低過氧化氫(H2O2)和谷氨酸(glutamate)的含量,提高NR2A/2B的比值，下調(diào)LC3II/LC3I和Beclin?1的表達(dá)，從而抑制自噬流。所述益母草堿可作為治療藥物應(yīng)用于治療癡呆尤其是VD引起的腦損傷疾病。
【專利說明】
益母草堿在制備治療血管性癡呆藥物中的用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬制藥領(lǐng)域，涉及益母草堿在制備防治靶器官保護(hù)藥物中的用途，尤其是 在制備防治慢性低灌注引起血管性癡呆藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 慢性腦低灌注狀態(tài)是引起血管性癡呆(VD)的重要因素。是指由于多種原因?qū)е碌?腦組織灌注長期低于生理閾值而出現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)損害的一種病理狀態(tài)。主要表現(xiàn)為認(rèn)知功 能損害。血管性癡呆不僅嚴(yán)重?fù)p害患者的健康，降低其生存質(zhì)量，也給社會(huì)和家庭帶來沉重 的負(fù)擔(dān)。但是目前慢性腦部低灌注引發(fā)的血管性癡呆的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，也無特殊 有效的治療方法，臨床上大多采用對癥治療的方法。
[0003] 中草藥益母草(Leonurus heterophyllus Sweet)為唇形科草本植物，具有活血調(diào) 經(jīng)，利水消腫的功效。主要用于治療血滯經(jīng)閉、痛經(jīng)、經(jīng)行不暢、產(chǎn)后瘀滯腹痛、惡露不盡、水 月中、小便不利等。益母草堿為益母草中所含生物堿類的一種。目前，尚未見有關(guān)益母草堿防 治慢性低灌注引起血管性癡呆的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是尋找和解決制備防治慢性低灌注引起血管性癡呆藥物的問題，提 供益母草堿的新用途。
[0005] 本發(fā)明所述益母草堿的新用途是指，益母草堿在制備防治靶器官保護(hù)藥物中的用 途，尤其是在制備防治慢性低灌注引起的血管性癡呆藥物中的用途。
[0006] 本發(fā)明所述的益母草喊的分子式為:C14H21N3O5,分子量為311.33。所述的益母草喊 具有如下結(jié)構(gòu)式：
[0007]
[0008] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：
[0009] 本發(fā)明進(jìn)行了結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈復(fù)制慢性腦部低灌注模型，觀察益母草堿對 慢性腦部低灌注導(dǎo)致的血管性癡呆損傷的保護(hù)作用。通過Morris水迷宮的方法檢測益母草 堿對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明益母草堿可以明顯縮短大鼠逃避潛伏期 和游泳總路程，增加目標(biāo)象限百分比。
[0010] 本發(fā)明運(yùn)用電生理的方法觀察益母草堿對長時(shí)程突觸后抑制的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表 明益母草堿能夠增加 fEPSP的斜率，改善長時(shí)程突觸后抑制的損傷情況。
[0011] 本發(fā)明運(yùn)用Western blot的方法觀察益母草堿對認(rèn)知相關(guān)蛋白NR2A和NR2B表達(dá) 的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明益母草堿能夠上調(diào)NR2A/2B。
[0012]本發(fā)明通過檢測自噬流，明確益母草堿防治腦部慢性低灌注的調(diào)控機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié) 果表明，益母草堿能夠顯著下調(diào)LC3II/LC3I和Beclin-1蛋白的表達(dá)，從而抑制自噬流發(fā)揮 神經(jīng)保護(hù)作用。
[0013] 本發(fā)明中，所述的益母草堿通過降低過氧化氫和谷氨酸的含量發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作 用。
[0014] 本發(fā)明中，所述的益母草堿通過抑制自噬流發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
【附圖說明】
[0015] 圖1大鼠空間探索階段和反向空間探索階段逃避潛伏期。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤的 方式表示。#?〈0.05， ##?〈0.01表示與假手術(shù)組比較，$〈0.05表示與模型組比較。
[0016] 圖2大鼠空間探索階段和反向空間探索階段游泳速度。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤的方 式表示。#?〈0.05， ##?〈0.01表示與假手術(shù)組比較，$〈0.05表示與模型組比較。
[0017]圖3空間探索訓(xùn)練中穿越平臺(tái)次數(shù)。數(shù)據(jù)以均值土標(biāo)準(zhǔn)誤的方式表示Λ〈0.05，##ρ 〈0.01表示與假手術(shù)組比較/ρ〈0.05表示與模型組比較。
[0018]圖4測試階段目標(biāo)象限百分比。數(shù)據(jù)以均值土標(biāo)準(zhǔn)誤的方式表示。#?〈0.05，##?〈 0.01表示與假手術(shù)組比較，$〈〇.05表示與模型組比較。
[0019] 圖5反向?qū)W習(xí)階段空間探索訓(xùn)練中穿越平臺(tái)次數(shù)。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤的方式表 示。#?〈0.05，##?〈0.01表示與假手術(shù)組比較，$〈0.05表示與模型組比較。
[0020] 圖6反向?qū)W習(xí)測試階段目標(biāo)象限百分比。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤的方式表示。#ρ〈 0.05，##ρ〈0.01表示與假手術(shù)組比較/ρ〈0.05表示與模型組比較。
[0021] 圖7益母草堿對大鼠反向?qū)W習(xí)訓(xùn)練過程中第一象限停留時(shí)間百分比（％)。數(shù)據(jù)以 均值土標(biāo)準(zhǔn)誤的方式表示。#ρ〈0.05， ##ρ〈0.01表示與假手術(shù)組比較，*ρ〈0.05表示與模型組 比較。
[0022]圖8第二象限停留時(shí)間百分比（％)。數(shù)據(jù)以均值土標(biāo)準(zhǔn)誤的方式表示。#ρ〈0.05，##ρ 〈0.01表示與假手術(shù)組比較/ρ〈0.05表示與模型組比較。
[0023]圖9第三象限停留時(shí)間百分比（％)。數(shù)據(jù)以均值土標(biāo)準(zhǔn)誤的方式表示。#ρ〈0.05，##ρ 〈0.01表示與假手術(shù)組比較/ρ〈0.05表示與模型組比較。
[0024]圖10第四象限停留時(shí)間百分比（％)。數(shù)據(jù)以均值土標(biāo)準(zhǔn)誤的方式表示。#ρ〈0.05，## ρ〈0.01表示與假手術(shù)組比較/ρ〈0.05表示與模型組比較。
[0025]圖11游泳軌跡示意圖。
[0026]圖12益母草堿對大鼠海馬CA3-CA1區(qū)低頻刺激后fEPSPs斜率隨時(shí)間的變化情況； [0027]圖13益母草堿對大鼠海馬CA3-CA1區(qū)LTD后20分鐘fEPSPs斜率的統(tǒng)計(jì)圖。數(shù)據(jù)以均 值土標(biāo)準(zhǔn)誤的方式表示。 #p〈0.05，##p〈0.01表示與假手術(shù)組比較，*p〈0.05表示與模型組比 較。
[0028]圖14是益母草堿對大鼠海馬谷氨酸含量變化的影響。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤的方式 表示。#?〈0.05，##?〈0.01表示與假手術(shù)組比較，$〈0.05表示與模型組比較。
[0029]圖15益母草堿對大鼠海馬過氧化氫(H202)含量變化的影響。數(shù)據(jù)以均值土標(biāo)準(zhǔn)誤 的方式表示。#?〈0.05，##?〈0.01表示與假手術(shù)組比較，$〈0.05表示與模型組比較。
[0030]圖16益母草堿對大鼠海馬NR2A表達(dá)含量的影響。數(shù)據(jù)以均值土標(biāo)準(zhǔn)誤的方式表 示。#?〈0.05，##?〈0.01表示與假手術(shù)組比較，$〈0.05表示與模型組比較。
[0031]圖17益母草堿對大鼠海馬NR2B表達(dá)含量的影響。數(shù)據(jù)以均值土標(biāo)準(zhǔn)誤的方式表 示。#?〈0.05，##?〈0.01表示與假手術(shù)組比較，$〈0.05表示與模型組比較。
[0032]圖18益母草堿對大鼠海馬NR2A/2B比值的變化的影響。數(shù)據(jù)以均值土標(biāo)準(zhǔn)誤的方 式表示。#?〈0.05，##?〈0.01表示與假手術(shù)組比較，$〈0.05表示與模型組比較。
[0033]圖19益母草堿對大鼠海馬LC3II/LC3I表達(dá)含量的影響。數(shù)據(jù)以均值土標(biāo)準(zhǔn)誤的方 式表示。#?〈0.05，##?〈0.01表示與假手術(shù)組比較，$〈0.05表示與模型組比較。
[0034]圖20益母草堿對大鼠海馬Beclin-Ι表達(dá)含量的影響。數(shù)據(jù)以均值土標(biāo)準(zhǔn)誤的方式 表示。#?〈0.05，##?〈0.01表示與假手術(shù)組比較，$〈0.05表示與模型組比較。
【具體實(shí)施方式】
[0035]實(shí)施例1.益母草堿改善大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力
[0036]將實(shí)驗(yàn)大鼠用10%的水合氯醛麻醉成功后，仰臥位固定操作臺(tái)上，常規(guī)消毒后于 大鼠頸部正中做切口，鈍性分離肌肉，暴露出雙側(cè)頸總動(dòng)脈并用0號絲線結(jié)扎，隨后將肌肉 復(fù)位，縫合皮膚，待大鼠蘇醒后，放回籠中常規(guī)飼養(yǎng)。假手術(shù)組的操作與模型一致，但是只分 離雙側(cè)頸總動(dòng)脈而不結(jié)扎。術(shù)后模型+益母草堿組大鼠灌胃給予益母草堿60mg/kg/day 3 周。給藥結(jié)束后進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)(MWM)測試大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。實(shí)驗(yàn)一共分為四 個(gè)階段:定向巡航階段（initial training, IT);空間探索測試（initial probe trials, IPT);反向?qū)W習(xí)階段（reversal training,RT);反向測試（reversal probe trials，RPT)〇 第一階段:定向巡航階段(第1天至第4天)每天上午9點(diǎn)及下午5點(diǎn)各訓(xùn)練一次，共4天。每次 分別從4個(gè)象限圓周中點(diǎn)處將大鼠背部面對池壁輕柔地放入水中，記錄大鼠找到平臺(tái)的時(shí) 間，即：逃避潛伏期（escape latency);同時(shí)采集每只大鼠的游泳速度(swimming speed)。 第二階段:空間探索測試階段(第5天)移除水下平臺(tái)，記錄大鼠在1分鐘內(nèi)在目標(biāo)象限游泳 時(shí)間百分比（time in target quadrant of IPT)和穿越原來平臺(tái)放置區(qū)域的次數(shù) (platform crossings ofIPT)。第三階段:反向?qū)W習(xí)階段(第6天至第7天)在這個(gè)階段中，平 臺(tái)被移動(dòng)到原目標(biāo)象限的對側(cè)，其余操作方法同第一階段。第四階段:反向探索測試(第8 天）移除平臺(tái)，記錄大鼠在新平臺(tái)象限尋找平臺(tái)所用的時(shí)間占總時(shí)間的百分比（time in target quadrant ofRPT)以及穿越平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)(platform crossings ofRPT)。實(shí)驗(yàn)結(jié) 果表明，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長(參見圖1和圖2)，穿越平臺(tái)次數(shù) (參見圖3和圖5)及目標(biāo)象限百分比顯著降低(參見圖4和圖6)(P〈0.01)。與模型組比較，益 母草堿給藥組(60mg/kg)可以明顯縮短模型大鼠定向巡航階段和反向?qū)W習(xí)階段的逃避潛伏 期（參見圖1和圖2)，提高空間探索測試階段和反向探索測試目標(biāo)象限游泳時(shí)間百分比（參 見圖4和圖6)。
[0037]實(shí)施例2.益母草堿對大鼠反向?qū)W習(xí)訓(xùn)練過程中各象限停留時(shí)間百分比的影響 [0038]具體實(shí)施方法同實(shí)施例1。記錄大鼠在反向?qū)W習(xí)階段(第6天至第7天)各個(gè)象限游 泳時(shí)間的百分比（參見圖7,8,9，10)，并記錄大鼠游泳軌跡的數(shù)據(jù)(參見圖11)。
[0039]結(jié)果如圖2所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠第7天在原目標(biāo)象限（zone 1)游泳 探索的時(shí)間明顯延長(參見圖7)(P〈0.01);給予益母草堿60mg/kg可以減少大鼠在原目標(biāo)象 限（zone 1)的游泳時(shí)間（參見圖7)，增加其在新目標(biāo)象限（zone 4)的游泳時(shí)間（參見圖10) (Ρ〈0·05)。
[0040] 實(shí)施例3.益母草堿對大鼠海馬CA3-CA1區(qū)LTD的影響
[0041 ]用30%烏拉坦腹腔麻醉大鼠（4ml/kg)后固定于立體定位儀上，暴露顏骨，以前囟 為原點(diǎn)定位CA3(前囟后4 · 2mm，中線旁3 · 5mm，硬腦膜下2 · 5mm)及CA1區(qū)（前囟后3 · 5mm，中線 旁2.5mm，硬腦膜下2.0mm)。獲得穩(wěn)定的代表性波形圖后，記錄20min的基線，隨后給予1Hz， 900個(gè)脈沖的低頻刺激共15min誘導(dǎo)長時(shí)程突觸后抑制。然后恢復(fù)base記錄時(shí)的單刺激方 式，記錄60min。結(jié)果如圖3所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的fEPSPs的斜率明顯提高(參 見圖12和圖13)(P〈0.01);與模型組比較，益母草堿可以顯著降低大鼠的fEPSP S的斜率(參 見圖 12 和圖 13)(P〈0.05)。
[0042]實(shí)施例4.益母草堿對大鼠海馬過氧化氫和谷氨酸含量的影響 [0043]電生理記錄結(jié)束后，于冰上迅速分離大鼠海馬組織并勻漿提取蛋白進(jìn)行定量分 析。用試劑盒檢測大鼠海馬組織中過氧化氫和谷氨酸含量。結(jié)果如圖4所示，模型組大鼠海 馬組織中過氧化氫和谷氨酸含量明顯增高(參見圖14和圖15);益母草堿可以顯著降低過氧 化氫和谷氨酸的含量(參見圖14和圖15)。
[0044] 實(shí)施例5.益母草堿對大鼠海馬NR2A和NR2B表達(dá)的影響
[0045]電生理記錄結(jié)束后，于冰上迅速分離大鼠海馬組織并勻漿提取蛋白進(jìn)行定量分 析。蛋白變性后于Western blot儀器上進(jìn)行蛋白表達(dá)含量的檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，益 母草堿可以顯著提高大鼠 NR2A的表達(dá)含量(參見圖16)，減少NR2B的表達(dá)含量(參見圖17)， 進(jìn)而提高NR2A/NR2B的比值(參見圖18)。
[0046] 實(shí)施例6.益母草堿對大鼠海馬LC3II/LC3I和Beclin-Ι表達(dá)的影響
[0047]電生理記錄結(jié)束后，于冰上迅速分離大鼠海馬組織并勻漿提取蛋白進(jìn)行定量分 析。蛋白變性后于Western blot儀器上進(jìn)行蛋白表達(dá)含量的檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，益 母草堿可以顯著下調(diào)LC3II/LC3I和Beclin-Ι蛋白的表達(dá)(參見圖19和圖20)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 益母草堿在制備治療慢性低灌注引起的血管性癡呆疾病藥物中的用途，所述的益母 草堿的分子式為:C14H21N3O5，分子量為311.33，所述的益母草堿具有如下結(jié)構(gòu)式：2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征是，所述的益母草堿能夠改善血管性癡呆大鼠的 空間學(xué)習(xí)記憶能力的損傷。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征是，所述的益母草堿能夠改善長時(shí)程突觸后抑制 的損傷情況，增加 fEPSPs的斜率。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征是，所述的益母草堿能夠調(diào)節(jié)認(rèn)知相關(guān)蛋白NR2A 和NR2B的表達(dá)水平。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征是，所述的益母草堿能夠降低過氧化氫(H2O2)和 谷氨酸(glutamate)的含量。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征是，所述的益母草堿能夠抑制自噬信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通 路。
【文檔編號】A61P25/28GK105997975SQ201610343036
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月23日
【發(fā)明人】劉春華, 楊卓, 朱依諄, 張濤, 古險(xiǎn)峰, 高靜
【申請人】南開大學(xué), 復(fù)旦大學(xué)