擬桿菌在檢測和治療母乳性黃疸中的用圖
【專利摘要】本發(fā)明提供了擬桿菌和/或其代謝產(chǎn)物及其組合物的一種新用途，即在治療母乳性黃疸及相關(guān)疾病中的用途；本發(fā)明還提供了一種組合物，包括擬桿菌和/或其代謝產(chǎn)物，以及雙歧桿菌和/或其代謝產(chǎn)物；本發(fā)明進(jìn)一步提供了篩選易患母乳性黃疸的生物樣品的系統(tǒng)，通過此篩選系統(tǒng)，可篩選易患母乳性黃疸的生物樣品；本發(fā)明更進(jìn)一步提供了治療和輔助治療母乳性黃疸及相關(guān)疾病中的腸道菌種和/或其代謝物的篩選方法，通過此方法可篩選出治療和輔助治療母乳性黃疸及相關(guān)疾病中的腸道菌種和/或其代謝物。
【專利說明】
擬桿菌在檢測和治療母乳性黃疸中的用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及擬桿菌及其組合物在治療母乳性黃疸及相關(guān)疾病中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]母乳性黃疸(breast milk jaundice，BMJ)指母乳喂養(yǎng)的嬰兒在生后4?7天出現(xiàn)黃疸，非溶血性非結(jié)合性膽紅素(UCB)升高，患兒血清膽紅素水平高于生理性黃疸，但不超過12mg/dL，一般狀況良好，無溶血或貧血表現(xiàn)，黃疸一般持續(xù)3?4周。
[0003]隨著母乳喂養(yǎng)的普及，BMJ的發(fā)生率逐年提高，目前已達(dá)20%?30%。其發(fā)病機(jī)制至今尚未明確，多認(rèn)為與新生兒膽紅素代謝的腸肝循環(huán)增加有關(guān)，新生兒小腸內(nèi)的葡萄糖醛酸苷酶(β-GD)含量較多，主要來源于母乳，其活性也高，可催化結(jié)合膽紅素變成未結(jié)合膽紅素，吸收增加，即出現(xiàn)BMJ。另一方面，新生兒的腸道菌群不完善，可能因腸道中缺乏以上將膽紅素轉(zhuǎn)化為尿膽原的菌群，進(jìn)而導(dǎo)致腸道膽紅素不能順利轉(zhuǎn)化為糞膽原，從而引起膽紅素腸肝循環(huán)增加，出現(xiàn)BMJ。嚴(yán)重的BMJ患者可出現(xiàn)膽紅素腦病，因此它可以嚴(yán)重影響患兒的健康以及母親的心情，不利于母乳喂養(yǎng)的推廣。
[0004]微生態(tài)制劑已廣泛應(yīng)用于降低BMJ患兒腸道中β-GD的活性。目前已有報道指出新生兒腸道菌群的定植是個復(fù)雜的過程，嬰兒在出生后24h大腸桿菌占優(yōu)勢，雙歧桿菌于生后第2天出現(xiàn)，增長十分迅速，第4?5天開始占優(yōu)勢，I周后其數(shù)量可達(dá)細(xì)菌總數(shù)的98%。現(xiàn)有研究表明雙歧桿菌可能與BMJ有關(guān)，補(bǔ)充利用雙歧桿菌制成的微生態(tài)制劑可能會有效治療BMJ，但目前對BMJ患者的腸道菌群的研究還不全面。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供擬桿菌和/或其代謝物及其組合物在制備治療和輔助治療母乳性黃疸或其相關(guān)疾病的產(chǎn)品上的用途，本發(fā)明還提供一種篩選易患母乳性黃疸的生物樣品的系統(tǒng)以及一種用于治療和輔助治療母乳性黃疸的腸道菌種和/或其代謝物的篩選方法。
[0006]本發(fā)明第一方面公開了擬桿菌和/或其代謝物在制備治療和輔助治療母乳性黃疸或其相關(guān)疾病的產(chǎn)品上的用途。
[0007]在一優(yōu)選例中，所述的擬桿菌為脆弱擬桿菌或者多形擬桿菌，亦或者為脆弱擬桿菌和多形擬桿菌。
[0008]在一優(yōu)選例中，本發(fā)明第一方面所述的產(chǎn)品為藥物或食品。
[0009]本發(fā)明第二方面公開了包含擬桿菌和/或其代謝產(chǎn)物的組合物在制備治療和輔助治療母乳性黃疸或其相關(guān)疾病的產(chǎn)品上的用途。
[0010]在一優(yōu)選例中，所述的組合物包括:(a)安全有效量的本發(fā)明第一方面所述的擬桿菌和/或其代謝產(chǎn)物；以及(b)食品上可接受的載體或藥學(xué)上可接受的載體。
[0011]在一優(yōu)選例中，本發(fā)明第二方面所述的產(chǎn)品為藥物和食品。
[0012]在一優(yōu)選例中，所述的擬桿菌為脆弱擬桿菌或者多形擬桿菌，亦或者為脆弱擬桿菌和多形擬桿菌。
[0013]在一優(yōu)選例中，所述的組合物可進(jìn)一步包括:益生菌和/或益生元。更為具體地，所述的益生菌為雙歧桿菌。
[0014]在一優(yōu)選例中，本發(fā)明第一方面、第二方面所述的產(chǎn)品所述的產(chǎn)品為口服制劑。
[0015]在一優(yōu)選例中，本發(fā)明第一方面、第二方面所述的產(chǎn)品所述的產(chǎn)品為液態(tài)制劑、固態(tài)制劑、半固態(tài)制劑。
[0016]在一優(yōu)選例中，本發(fā)明第一方面、第二方面所述的產(chǎn)品所述的產(chǎn)品的劑型選自下組:粉末劑、散劑、片劑、糖衣劑、膠囊劑、顆粒劑、懸浮劑、溶液劑、糖漿劑、滴劑、和舌下含片。
[0017]在一優(yōu)選例中，本發(fā)明第一方面、第二方面所述的產(chǎn)品所述的產(chǎn)品包括乳液制品、?谷液制品、粉末制品、或懸浮液制品。
[0018]在一優(yōu)選例中，本發(fā)明第一方面、第二方面所述的產(chǎn)品所述的產(chǎn)品包括乳品、乳粉、或乳液。
[0019]在一優(yōu)選例中，本發(fā)明第一方面、第二方面所述的產(chǎn)品所述的液態(tài)制劑選自下組:?谷液制品或懸浮液制品。
[0020]本發(fā)明第三方面公開了一種組合物，包括擬桿菌和/或其代謝產(chǎn)物，以及雙歧桿菌和/或其代謝產(chǎn)物。
[0021 ]在一優(yōu)選例中，所述擬桿菌為脆弱擬桿菌和/或多形擬桿菌；
[0022]在一優(yōu)選例中，該組合物還包括食品上可接受的載體或藥學(xué)上可接受的載體。
[0023]本發(fā)明第四方面公開了一種篩選易患母乳性黃疸的生物樣品的系統(tǒng)，包括:
[0024]核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用于從所述生物樣品中提取核酸樣本；
[0025]核酸序列確定裝置，所述核酸序列確定裝置與所述核酸提取裝置相連，用于對所述核酸樣本進(jìn)行分析，以便確定所述核酸樣本的序列；以及
[0026]判斷裝置，所述判斷裝置與所述測序裝置相連，基于所述核酸樣本的序列對其腸道菌群所含的擬桿菌進(jìn)行分析，根據(jù)分析結(jié)果判斷所述生物樣品是否易患母乳性黃疸；
[0027]在一優(yōu)選例中，所述擬桿菌為脆弱擬桿菌和/或多形擬桿菌；
[0028]在一優(yōu)選例中，所述核酸序列確定裝置進(jìn)一步包括:
[0029]文庫構(gòu)建單元，所述文庫構(gòu)建單元用于基于所述核酸樣本，構(gòu)建所述核酸的文庫；以及
[0030]測序單元，所述測序單元與所述文庫構(gòu)建單元相連，對所述文庫進(jìn)行測序，以便確定所述核酸樣本的序列，
[0031]在一優(yōu)選例中，所述文庫構(gòu)建單元進(jìn)一步包括:
[0032]PCR擴(kuò)增模塊，所述PCR擴(kuò)增模塊中設(shè)置擬桿菌的特異性引物，以便利用所述特異性引物，對所述核酸樣本進(jìn)行擴(kuò)增。
[0033]本發(fā)明第五方面公開了一種用于檢測生物樣品中擬桿菌和/或其代謝產(chǎn)物水平的檢測試劑盒在篩選易患母乳性黃疸的生物樣品中的應(yīng)用；
[0034]在一優(yōu)選例中，所述擬桿菌為脆弱擬桿菌和/或多形擬桿菌。
[0035]本發(fā)明第六方面公開了一種用于檢測生物樣品中擬桿菌和/或其代謝產(chǎn)物，以及雙歧桿菌和/或其代謝產(chǎn)物的檢測試劑盒在篩選易患母乳性黃疸的生物樣品中的應(yīng)用；
[0036]在一優(yōu)選例中，所述擬桿菌為脆弱擬桿菌和/或多形擬桿菌。
[0037]本發(fā)明第七方面公開了一種篩選易患母乳性黃疸的生物樣品的系統(tǒng)，包括:
[0038]用于治療和輔助治療BMJ的腸道菌種和/或其代謝物的篩選方法，包括以下步驟:
[0039]I)分別收集母乳性黃疸患兒和正常嬰兒的糞便，提取糞便中DNA;
[0040]2)將提取的DNA建庫測序，獲得DNA測序結(jié)果；
[0041]3)根據(jù)DNA測序結(jié)果對腸道菌群進(jìn)行分類并對菌群進(jìn)行功能分析，獲得功能分析結(jié)果；
[0042]4)根據(jù)功能分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)菌群種類、豐度的差異，獲得差異信息；
[0043]5)根據(jù)差異信息將其中具有顯著差異的腸道菌種和/或其代謝物作為候選菌種和/或候選菌種代謝物；
[0044]所述候選菌種和/或候選菌種代謝物含有擬桿菌和/或其代謝物。
[0045]在一優(yōu)選例中，所述的擬桿菌為脆弱擬桿菌或者多形擬桿菌，亦或者為脆弱擬桿菌和多形擬桿菌;所述的代謝物為脆弱擬桿菌或多形擬桿菌的代謝物，亦或者為脆弱擬桿菌和多形擬桿菌的代謝物。
[0046]本發(fā)明具有以下有益效果:
[0047]本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)母乳性黃疸的致病與擬桿菌和/或其代謝物有關(guān)，因此可將擬桿菌和/或其代謝物及其組合物作為母乳性黃疸及其相關(guān)疾病的檢測標(biāo)志物，或者將擬桿菌和/或其代謝物及其組合物制備成產(chǎn)品應(yīng)用于母乳性黃疸及其相關(guān)疾病的治療。
【附圖說明】
[0048]圖1是母乳性黃疸(BMJ)和對照組菌群豐度及種類對比圖。其中左圖是樣品菌種豐度的分布情況，右圖是菌群種類的分布情況，縱軸均取1glO后的數(shù)據(jù)結(jié)果，每個點(diǎn)代表一個樣品。
[0049]圖2是母乳性黃疸(BMJ)和對照組差異顯著細(xì)菌熱圖。圖中每列代表一個樣品，每行代表有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)的菌種。其中顏色淺的代表低表達(dá)，顏色深的代表高表達(dá)。
【具體實(shí)施方式】
[0050]本文所用術(shù)語“擬桿菌”和“Bacteroides”可互換使用；“脆弱擬桿菌”和uBacteroides fragilis”可互換使用；“多形擬桿菌”和“Bacteroides theta1taomicron”可互換使用；“母乳性黃疸”和“BMJ”可互換使用。
[0051 ] 實(shí)施例一
[0052]1.樣品來源
[0053]16例母乳性黃疸(BMJ)患兒:男14例，女2例，年齡32-80天，平均46.6 ± 13.4天。足月15例，早產(chǎn)I例，順產(chǎn)及剖腹產(chǎn)均8例，均為母乳喂養(yǎng)。血清總膽紅素為73.7-330.7umol/l，平均212.2 ± 65.9umo 1/1,大便金黃，糊狀，無粘液膿血。BMJ樣品名稱分別為:BMJ1、BMJ1、BMJ3、BMJ4、BMJ5、BMJ6、BMJ7、BMJ8、BMJ9、BMJ10、BMJ11、12、BMJ13、BMJ14、BMJ15、BMJ16。
[0054]16例兒?？企w檢的正常嬰兒:男11例，女5例，年齡為40-80天，平均50.4 ± 14.6天，均為足月兒，順產(chǎn)13例，剖腹產(chǎn)3例，母乳喂養(yǎng)14例，配方奶喂養(yǎng)2例。對照樣品的名稱分別為:HAF1、HAF2、HBF1、HBF2、HBF3、HBF4、HBF5、HBF6、HBF7、HNF1、HNF2、HNF3、HNF4、HNF5、HNF6、HNF70
[0055]兩組嬰兒年齡及性別均無顯著性差異。所有嬰兒均要求出生后沒有應(yīng)用抗生素和微生態(tài)制劑。
[0056]2.糞便采集與DNA提取
[0057]在收集嬰兒糞便之前，由家長簽知情同意書。住院患兒在入院后6小時內(nèi)完成。糞便收集在一個容量為30ml的帶有旋轉(zhuǎn)蓋子的干凈的塑料盒中，收集大便約15克，編號登記后隨即放入-80°C低溫冰箱保存直到DNA提取。正常對照組嬰兒大便收集則在兒?？崎T診體檢完成后收集，處理同前。所有糞便標(biāo)本收集完后采用北京康為世紀(jì)生物科技有限公司提供的糞便DNA提取試劑盒(StoolGen DNA kit)進(jìn)行DNA的提取。
[0058]3.宏基因組建庫和鳥槍法宏基因組測序
[0059]取2ul已提取的DNA樣品進(jìn)行定量，所用的試劑盒為美國賽默飛世爾公司提供的試劑盒(Qubit dsDNA BR assay kit)。利用美國Illumina公司生產(chǎn)的Truseq DNA建庫試劑盒進(jìn)行建庫，文庫插入片段大小為200-500bp，該試劑盒連接在美國貝克曼庫爾特公司生產(chǎn)的自動化SPRI工作站上。每個文庫構(gòu)建完成后，采用美國安捷倫科技公司生產(chǎn)的Agilent2100生物分析儀進(jìn)行質(zhì)控(QC,quality control)。通過QC后，S卩文庫濃度需在3ng/yl以上，該文庫用于后期測序，測序所用的平臺為Illumina HiSeq 2500測序平臺，測序方式為150bp雙端測序。每個樣本測得IG以上的數(shù)據(jù)。
[0060]4.菌群分類和基因功能注釋
[0061]首先，過濾掉接頭序列和一些質(zhì)量差的測序reads。其次，所有測定的序列均對照人類參考基因組Hgl9以剔除人基因組序列。再次，采用最新的MEGAN軟件(S卩MEGAN5)(http://ab.1nf.un1-tuebinge η.de/software/megan5/下載)對鳥槍法宏基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行菌群分類及基因功能分析。最后，分類分析和基因功能注釋結(jié)果應(yīng)用KEGG(http://www.genome.jp/kegg/keggl.html)和eggNOG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能注釋，得到的菌種和基因功能通路等數(shù)據(jù)用于后續(xù)的統(tǒng)計(jì)分析。
[0062]5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
[0063]鳥槍法宏基因組測序得到的數(shù)據(jù)，菌群的豐度和種類進(jìn)行獨(dú)立T檢驗(yàn);菌群的豐度標(biāo)準(zhǔn)化(即均一化為一百萬條測序序列)后分別應(yīng)用wilcoxon秩和檢驗(yàn)和DESeq2(DESeq2的使用可參考文獻(xiàn)Love MI ,Huber ff ,Anders S.Moderated estimat1n of fold changeand dispers1n for RNA-seq data with DESeq2[J].Genome B1logy,2014,15(12):550)計(jì)算;KEGG注釋的功能通路得到的數(shù)據(jù)采用wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析。
[0064]結(jié)果:
[0065]1.BMJ組和對照組在菌群豐度和菌群種類的總體水平上無顯著差異。
[0066]通過測序所得的樣品菌群豐度及種類情況(如圖1)，采用獨(dú)立T檢驗(yàn)，BMJ組和對照組的數(shù)據(jù)無顯著差異(P>0.05)。
[0067]2.BMJ組和對照組在菌群種類上有細(xì)微差異，能檢測到一些差異顯著的菌種。
[0068]菌種數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后(即均一化為一百萬條測序序列)，用wilcoxon秩和檢驗(yàn)的方法，將得到的P值小于等于0.05的菌種，用DESeq2計(jì)算組間log2(樣品組/對照組)差異絕對值不小于I的菌種，然后，選擇樣品中菌群平均表達(dá)量不小于100的菌種，最后將這些菌種畫出熱圖，見圖2。結(jié)果顯示雙歧桿菌、擬桿菌(包括脆弱擬桿菌、多形擬桿菌)在BMJ組中明顯少于對照組(P<0.05)，而羅氏菌屬比BMJ組多，因此實(shí)際應(yīng)用中可以通過補(bǔ)充特定的菌群(擬桿菌和/或雙歧桿菌)或其代謝產(chǎn)物來治療母乳性黃疸。
[0069]3.BMJ和對照組在菌群功能通路水平上有差異
[ΟΟΤ?]利用KEGG數(shù)據(jù)庫對基因進(jìn)行功能注釋后，選取第三級的功能通路(kegg pathwaylevel 3)的數(shù)據(jù)，先標(biāo)準(zhǔn)化后(即均一化為一百萬條測序序列)，然后進(jìn)行wilcoxon秩和檢驗(yàn)，將差異顯著(P< = 0.05)的通路繪成熱圖，能發(fā)現(xiàn)在BMJ和對照組占比有差異的功能通路，而且，大多是BMJ組的表達(dá)高于對照組，如甘油脂質(zhì)代謝、花生四烯酸代謝、磷酸肌醇代謝及苯乙烯降解等功能。
[0071 ] 4.尋找BMJ和對照組代謝通路基因水平的差異
[0072]將BMJ組和對照組中KEGG數(shù)據(jù)庫里面注釋到的第二級通路數(shù)據(jù)(KEGG pathwaylevel 2)繪畫成盒子圖，發(fā)現(xiàn)BMJ和對照組在不同的功能通路水平有差異，尤其是糖生物合成和代謝通路。為了進(jìn)一步驗(yàn)證BMJ和對照組中糖合成和代謝的功能通路，我們將這部分?jǐn)?shù)據(jù)提取出來，進(jìn)行了 wilcoxon秩和檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)BMJ和對照組菌群中參與糖合成和代謝的基因數(shù)有顯著差異(P<0.05)，BMJ組菌群參與糖合成和代謝的基因數(shù)明顯少于對照組。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種擬桿菌和/或其代謝產(chǎn)物在制備治療或輔助治療母乳性黃疸或其相關(guān)疾病的產(chǎn)品上的用途。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的擬桿菌為脆弱擬桿菌和/或多形擬桿菌； 任選的，所述的產(chǎn)品為藥物或食品。3.—種包含擬桿菌和/或其代謝產(chǎn)物的組合物在制備治療或輔助治療母乳性黃疸或其相關(guān)疾病的產(chǎn)品上的用途； 任選的，所述組合物包括:(a)安全有效量的擬桿菌和/或其代謝產(chǎn)物；以及(b)食品上可接受的載體或藥學(xué)上可接受的載體； 任選的，所述的產(chǎn)品為藥物或食品。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述的擬桿菌為脆弱擬桿菌和/或多形擬桿菌。5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的用途，其特征在于，所述組合物還包括:益生菌和/或益生元； 任選的，所述益生菌為雙歧桿菌。6.一種組合物，其特征在于，包括擬桿菌和/或其代謝產(chǎn)物，以及雙歧桿菌和/或其代謝產(chǎn)物； 任選的，所述擬桿菌為脆弱擬桿菌和/或多形擬桿菌； 任選的，該組合物還包括食品上可接受的載體或藥學(xué)上可接受的載體。7.一種篩選易患母乳性黃疸的生物樣品的系統(tǒng)，其特征在于，包括: 核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用于從所述生物樣品中提取核酸樣本； 核酸序列確定裝置，所述核酸序列確定裝置與所述核酸提取裝置相連，用于對所述核酸樣本進(jìn)行分析，以便確定所述核酸樣本的序列；以及 判斷裝置，所述判斷裝置與所述測序裝置相連，基于所述核酸樣本的序列對其腸道菌群所含的擬桿菌進(jìn)行分析，根據(jù)分析結(jié)果判斷所述生物樣品是否易患母乳性黃疸； 任選的，所述擬桿菌為脆弱擬桿菌和/或多形擬桿菌； 任選的，所述核酸序列確定裝置進(jìn)一步包括: 文庫構(gòu)建單元，所述文庫構(gòu)建單元用于基于所述核酸樣本，構(gòu)建所述核酸的文庫；以及測序單元，所述測序單元與所述文庫構(gòu)建單元相連，對所述文庫進(jìn)行測序，以便確定所述核酸樣本的序列， 任選地，所述文庫構(gòu)建單元進(jìn)一步包括: PCR擴(kuò)增模塊，所述PCR擴(kuò)增模塊中設(shè)置擬桿菌的特異性引物，以便利用所述特異性引物，對所述核酸樣本進(jìn)行擴(kuò)增。8.用于檢測生物樣品中擬桿菌和/或其代謝產(chǎn)物水平的檢測試劑盒在篩選易患母乳性黃疸的生物樣品中的應(yīng)用； 任選的，所述擬桿菌為脆弱擬桿菌和/或多形擬桿菌。9.用于檢測生物樣品中擬桿菌和/或其代謝產(chǎn)物，以及雙歧桿菌和/或其代謝產(chǎn)物的檢測試劑盒在篩選易患母乳性黃疸的生物樣品中的應(yīng)用； 任選的，所述擬桿菌為脆弱擬桿菌和/或多形擬桿菌。10.—種用于治療或輔助治療母乳性黃疸的腸道菌種和/或其代謝物的篩選方法，包括以下步驟: 分別收集母乳性黃疸患兒和正常嬰兒的糞便，提取糞便中的DNA; 將DNA建庫測序，獲得DNA測序結(jié)果； 根據(jù)DNA測序結(jié)果對腸道菌群進(jìn)行分類并對菌群進(jìn)行功能分析，獲得功能分析結(jié)果； 根據(jù)功能分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)菌群種類、豐度的差異，獲得差異信息； 根據(jù)差異信息將其中具有顯著差異的腸道菌種和/或其代謝物作為候選菌種和/或候選菌種代謝物； 所述候選菌種和/或候選菌種代謝物包含有擬桿菌和/或其代謝物； 任選的，所述的擬桿菌為脆弱擬桿菌和/或多形擬桿菌。
【文檔編號】C12Q1/68GK106038609SQ201610583576
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月13日 公開號201610583576.4, CN 106038609 A, CN 106038609A, CN 201610583576, CN-A-106038609, CN106038609 A, CN106038609A, CN201610583576, CN201610583576.4
【發(fā)明人】周少明, 王明幫, 代東伶, 王艷, 蔡華波, 周建利
【申請人】深圳市兒童醫(yī)院, 深圳市英馬諾生物科技有限公司