細(xì)菌通過(guò)模擬Alpha?MSH的CLPB蛋白對(duì)食欲調(diào)節(jié)的影響的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及細(xì)菌Clp B蛋白和表達(dá)Clp B的細(xì)菌以及它們對(duì)飲食障礙的影響。本發(fā)明還涉及包含針對(duì)至少一種表達(dá)Clp B之細(xì)菌的抗生素的組合物和包含不表達(dá)Clp B蛋白的益生菌的組合物以及它們?cè)谥委熁蝾A(yù)防飲食障礙中的用途。本發(fā)明還涉及用于測(cè)定對(duì)象是否可能應(yīng)答于飲食障礙治療方法或針對(duì)飲食障礙的免疫方法的診斷工具。
【專利說(shuō)明】細(xì)菌通過(guò)模擬Alpha-MSH的CLPB蛋白對(duì)食欲調(diào)節(jié)的影響
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)菌ClpB蛋白和表達(dá)ClpB的細(xì)菌以及它們對(duì)飲食障礙的影響。本發(fā)明 還涉及包含針對(duì)至少一種表達(dá)ClpB之細(xì)菌的抗生素的組合物和包含不表達(dá)ClpB蛋白的益 生菌的組合物以及它們?cè)谥委熁蝾A(yù)防飲食障礙中的用途。本發(fā)明還涉及用于測(cè)定對(duì)象是否 有可能應(yīng)答于飲食障礙治療方法或針對(duì)飲食障礙的免疫方法的診斷工具。
[0002] 在過(guò)去的50年間，飲食障礙在世界范圍內(nèi)在男性和女性中間均有增長(zhǎng)。有證據(jù)表 明，西方國(guó)家的人尤其具有發(fā)生飲食障礙的最高風(fēng)險(xiǎn)，并且西方化程度增加該風(fēng)險(xiǎn)。隨著最 近的進(jìn)展，科學(xué)家對(duì)食欲的中樞處理了解得越來(lái)越多。已知飲食行為涉及誘導(dǎo)的、自我平衡 的和自我調(diào)節(jié)的控制過(guò)程之間的相互作用，這是飲食障礙的關(guān)鍵因素。
[0003] 近期的科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)調(diào)節(jié)子，人微生物組(microbiome)。高通量DNA測(cè)序 技術(shù)的進(jìn)展使得能夠進(jìn)行對(duì)人微生物組的探索，從而向理解宿主與其微生物群之間的分子 關(guān)系邁進(jìn)一大步。在該"第二基因組"（微生物組）中描述了超過(guò)4-5百萬(wàn)個(gè)的無(wú)冗余微生物 推定基因和1至2000個(gè)普遍微生物物種的類別。每個(gè)個(gè)體具有至少160個(gè)共有物種，多個(gè)良 好平衡的宿主-微生物分子關(guān)系限定個(gè)體的類群。
[0004] 認(rèn)為理解微生物群體與其人宿主之間的共生關(guān)系的基本特征可允許從內(nèi)在群體 的具體特征預(yù)測(cè)宿主表型，例如健康狀態(tài)。
[0005] 例如，腸微生物群的構(gòu)成已經(jīng)與包括肥胖、糖尿病和一些神經(jīng)精神障礙在內(nèi)的宿 主代謝表型相關(guān)聯(lián)，這提示腸細(xì)菌可影響由腦控制的功能和行為。
[0006] 在這種背景下，確定將微生物群與宿主行為相聯(lián)系的分子機(jī)制因而成為確定特定 微生物在宿主生理中的作用的必要步驟。
[0007] 引起飲食障礙包括神經(jīng)性厭食癥(AN)、神經(jīng)性貪食癥(BN)和暴食癥(BED)的分子 機(jī)制目前未知。之前的數(shù)據(jù)暗示，與α -黑素細(xì)胞刺激激素 (α -M S Η)有反應(yīng)性的免疫球蛋白 (Ig)或自身抗體(auto-Ab)參與調(diào)節(jié)進(jìn)食和情緒;然而，這種自身抗體的起源未知。
[0008] 本發(fā)明人使用蛋白質(zhì)組發(fā)現(xiàn)，共生腸細(xì)菌E.Coli K12的ClpB伴侶蛋白是參與能量 代謝和情緒調(diào)節(jié)的一種神經(jīng)肽黑素細(xì)胞刺激激素(α-MSH)的構(gòu)象模擬物。
[0009] 本發(fā)明人證明，經(jīng)ClpB免疫的小鼠產(chǎn)生與α-MSH交叉反應(yīng)的抗-ClpB IgG，影響食 物攝取、體重、焦慮和黑皮質(zhì)素受體4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，本發(fā)明人證明，在小鼠中長(zhǎng)期經(jīng)胃遞 送E. coli降低食物攝取并刺激ClpB反應(yīng)性和a-MSH反應(yīng)性抗體形成，而ClpB缺陷型E. coli 不影響食物攝取或抗體水平。最后，本發(fā)明人證明，與a-MSH交叉反應(yīng)的抗ClpB IgG的血漿 水平在患有AN、BN和BED的患者中增加，以及飲食障礙患者中的ED(飲食障礙)量表-2評(píng)分與 抗ClpB IgG和IgM相關(guān)。
[0010] 因此，本發(fā)明人證明，在若干共生和病原性微生物中存在的細(xì)菌ClpB蛋白可負(fù)責(zé) 產(chǎn)生與a-MSH有交叉反應(yīng)性的自身抗體，與患有飲食障礙的人中的進(jìn)食和情緒改變相關(guān)。 [0011 ]此外，本發(fā)明人證明，患有飲食障礙的患者中ClpB蛋白的血衆(zhòng)濃度升高。
[0012] 因此，ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體的存在可以與飲食障礙以及食欲和情緒失調(diào)相 聯(lián)系。
[0013] 已經(jīng)將ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體的存在與飲食障礙和食欲失調(diào)相關(guān)聯(lián)，從而降 低ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體的水平可導(dǎo)致對(duì)食欲的調(diào)節(jié)，并因此被用作對(duì)飲食障礙的療 法。
[0014] 因此，本發(fā)明涉及包含針對(duì)至少一種表達(dá)ClpB的細(xì)菌的至少一種抗生素的組合 物，其用于治療或預(yù)防飲食障礙。
[0015] 本發(fā)明還涉及調(diào)節(jié)對(duì)象的食欲的非治療方法，其包括向所述對(duì)象施用有效量的組 合物，所述組合物包含針對(duì)至少一種表達(dá)ClpB的細(xì)菌的至少一種抗生素。
[0016] 因此，本發(fā)明涉及包含不表達(dá)ClpB蛋白的益生菌的組合物，其用于治療或預(yù)防飲 食障礙。
[0017] 本發(fā)明還涉及調(diào)節(jié)對(duì)象的食欲的非治療方法，其包括向所述對(duì)象施用有效量的包 含不表達(dá)ClpB的益生菌的組合物。
[0018] 本發(fā)明還涉及作為疫苗或免疫原性組合物使用的包含ClpB蛋白的組合物。
[0019] 特別地，所使用的組合物用于針對(duì)飲食障礙進(jìn)行免疫。
[0020] 特別地，所使用的組合物用于預(yù)防飲食障礙。
[0021] 本發(fā)明還涉及用于診斷對(duì)象中的飲食障礙的體外方法，所述方法包括：
[0022] a)測(cè)量來(lái)自所述對(duì)象的生物樣品中ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體的水平；
[0023] b)將測(cè)量的所述ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體的水平與參考值相比較；以及 [0024] c)從中推斷所述對(duì)象是否患有飲食障礙。
[0025]本發(fā)明還涉及將患有飲食障礙的對(duì)象選擇為對(duì)降低ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體水 平的治療有應(yīng)答可能性的體外方法，其包括：
[0026] a)測(cè)量來(lái)自所述對(duì)象的生物樣品中ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體的水平；
[0027] b)將測(cè)量的所述ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體的水平與參考值相比較；以及 [0028] c)選擇用于降低ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體水平的治療的對(duì)象，其中所述降低 ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體水平的治療包括：向所述對(duì)象施用有效量的包含針對(duì)至少一種 表達(dá)ClpB的細(xì)菌的一種抗生素的組合物，和/或向所述對(duì)象施用有效量的包含不表達(dá)ClpB 的益生菌的組合物，和/或其組合。
[0029] 本發(fā)明人已經(jīng)證實(shí)，在小鼠中經(jīng)胃遞送E.coli由于細(xì)菌中ClpB蛋白的存在降低了 食物攝取和體重增加，本發(fā)明還涉及用于治療或預(yù)防肥胖癥的包含超表達(dá)（surexpress) ClpB蛋白的益生菌的組合物。
[0030] 發(fā)明詳述
[0031]本發(fā)明人使用蛋白質(zhì)組發(fā)現(xiàn)，共生腸細(xì)菌E.Coli K12的ClpB伴侶蛋白是參與能量 代謝和情緒調(diào)節(jié)的一種神經(jīng)肽黑素細(xì)胞刺激激素(α-MSH)的構(gòu)象模擬物，并且表達(dá)ClpB 的細(xì)菌的存在導(dǎo)致食欲失調(diào)。
[0032]因此，本發(fā)明涉及包含針對(duì)至少一種表達(dá)ClpB的細(xì)菌的至少一種抗生素的組合 物，其用于治療或預(yù)防飲食障礙。
[0033]本文中所用的"表達(dá)ClpB的細(xì)菌"是指表達(dá)伴侶蛋白ClpB的細(xì)菌。
[0034] "蛋白解聚伴侶蛋白"、"伴侶蛋白ClpB"、"ClpB蛋白"或"ClpB"也被稱為熱休克蛋 白F84.1，其是六聚AAA+-ATP酶的HSplOO/ClpB家族的成員。該家族包括細(xì)菌、真菌和植物 HsplOOATP酶，其中ClpB為細(xì)菌中的代表。作為壓力誘導(dǎo)的多伴侶蛋白系統(tǒng)的一部分，其參 與細(xì)胞從熱誘導(dǎo)損傷中的恢復(fù)，在蛋白質(zhì)解聚中與Hsp70系統(tǒng)(DnaK、DnaJ和GrpE)協(xié)作，其 中蛋白質(zhì)解聚為對(duì)于細(xì)胞在壓力條件下存活很關(guān)鍵的過(guò)程。
[0035] 在感染過(guò)程中，細(xì)菌病原體遭遇由旨在清除它們的宿主防御所產(chǎn)生的壓力條件， 并通過(guò)增加熱休克和其他壓力蛋白的合成來(lái)應(yīng)答這種宿主防御。對(duì)此，已經(jīng)將ClpB描述為 對(duì)獲得的熱耐受和對(duì)若干革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性病原菌例如Staphylococcus aureus、 Francisella turalensis、Listeria monocytogenes、Yersinia enterocolitica和 Salmonella thyphimurium的毒力和感染性重要的因子。
[0036] 在E.coli K12中，伴侶蛋白ClpB也被稱為熱休克蛋白F84.1或htpM，是857個(gè)氨基 酸的蛋白質(zhì)。
[0037] 通常，伴侶蛋白ClpB包含具有SEQ ID N0:1(NCBI參考號(hào)：NP_417083.1，如2013年 11月6日可得的，和/或UniProtKB/Swiss-Prot號(hào)：P63284，如2013年11月6日可得的）的來(lái)自 E.coli K12的伴侶蛋白ClpB的氨基酸序列或由該序列組成。優(yōu)選地，伴侶蛋白ClpB的氨基 酸序列包含與SEQ ID NO: 1的氨基酸序列80至100%相同的氨基酸序列或者由這樣的氨基 酸序列組成。優(yōu)選地，所述氨基酸序列與SEQ ID NO: 1的氨基酸序列90至100%相同，更優(yōu)選 95 至 100%、最優(yōu)選 95、96、97、98、99或100%相同。
[0038]因此，表達(dá)ClpB的細(xì)菌涉及表達(dá)或過(guò)表達(dá)以上所限定的伴侶蛋白ClpB或以下多肽 的細(xì)菌，所述多肽包含與SEQ ID NO: 1的氨基酸序列80至100%相同，更優(yōu)選與SEQ ID NO: 1 的氨基酸序列95至100%、最優(yōu)選95、96、97、98、99或100%相同的氨基酸序列或由這樣的氨 基酸序列組成。
[0039] 具有與本發(fā)明的查詢氨基酸序列至少例如95%"相同"的氨基酸序列的多肽是指， 除了所述多肽序列可包含每1〇〇個(gè)查詢氨基酸序列的氨基酸至多5個(gè)氨基酸改變外，所述多 肽的氨基酸序列與查詢序列相同。換言之，為了獲得具有與查詢氨基酸序列至少95%相同 的氨基酸序列的多肽，所述序列中的至多5% (100中5個(gè))的氨基酸殘基可以被插入、缺失或 者被另一氨基酸替換。
[0040] 在本發(fā)明的上下文中，同一性百分比使用全局比對(duì)計(jì)算（即，兩個(gè)序列在它們的全 長(zhǎng)上進(jìn)行比較）。用于比較兩個(gè)或更多個(gè)序列的同一性的方法是本領(lǐng)域公知的。例如可以使 用 "needle" 程序，其使用 Needle man-Wunsch全局比對(duì)算法（Needle man和Wunsch, 1970J.Mol. Biol. 48:443-453)來(lái)尋找兩個(gè)序列的在考慮它們?nèi)L(zhǎng)時(shí)的最優(yōu)比對(duì)(包括缺 口）needle程序例如可從ebi .ac.uk因特網(wǎng)網(wǎng)址獲得。根據(jù)本發(fā)明的同一"性百分比優(yōu)選使 用EMBOSS: meedle(全局）程序計(jì)算，其中"缺口開(kāi)放"參數(shù)等于10.0，"缺口延伸"參數(shù)等于 0.5,并使用Blosum62矩陣。
[0041 ] 與參照序列相比，由與參照序列"至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%相同"的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)可以包含突變，例如缺失、插入和/或替換。在替換的 情況下，由與參照序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序 列組成的蛋白質(zhì)可對(duì)應(yīng)于源自于與參照序列所源自的物種不同的另一物種的同源序列。氨 基酸替換可以是保守的或非保守的。優(yōu)選地，替換是保守替換，其中一個(gè)氨基酸被具有相似 結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)特性的另一氨基酸替換。替換優(yōu)選對(duì)應(yīng)于下表所示的保守替換。
[0042]
[0043] 表達(dá)ClpB的細(xì)菌是技術(shù)人員公知的并且可以通過(guò)任何常規(guī)技術(shù)鑒定。
[0044] 在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)ClpB的細(xì)菌選自由以下構(gòu)成的組：Staphylococcus aureusnFrancisella turalensis、Listeria monocytogenes、Yersinia enterocolitica、 Salmonella thyphimurium、Escherichia Coli、Enterobacteriaceae、Shigella sonnei、 Shigella flexneri、Shigella dysenteriae、Shigella boydii、Citrobacter youngae、 Salmonella bongori和Salmonella enterica屬。
[0045] ClpB蛋白包含兩個(gè)核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ATP1和ATP2)和兩個(gè)寡聚化結(jié)構(gòu)域(NBD1和 NBD2KN端結(jié)構(gòu)域可作為底物區(qū)分結(jié)構(gòu)域行使功能，將聚集的蛋白質(zhì)募集到ClpB六聚體和/ 或穩(wěn)定結(jié)合的蛋白。NBD2結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)寡聚化，而NBD1結(jié)構(gòu)域穩(wěn)定六聚體，該穩(wěn)定可能以ATP 依賴的方式進(jìn)行。在功能性六聚體中通過(guò)相鄰ClpB亞基的卷曲基序結(jié)合的卷曲結(jié)構(gòu)域的運(yùn) 動(dòng)對(duì)于ClpB將蛋白質(zhì)從聚集狀態(tài)釋放的能力是關(guān)鍵的，其可能是通過(guò)將大的聚集蛋白質(zhì)拉 開(kāi)。
[0046]本發(fā)明人證實(shí)，共生腸細(xì)菌E.Coli K12的ClpB伴侶蛋白是參與能量代謝和情緒調(diào) 節(jié)的一種神經(jīng)肽α-黑素細(xì)胞刺激激素(α-MSH)的構(gòu)象模擬物。
[0047] "α-MSH"也稱為"α-黑素細(xì)胞刺激激素"、"alpha-MSH"、"α-MSH"、α-促黑素、α-黑皮 質(zhì)素或α_中葉素，其是黑皮質(zhì)素家族的天然內(nèi)源肽激素，具有十三肽結(jié)構(gòu)。a-MSH的氨基酸 序列優(yōu)選地包含氨基酸序列SYSMEHFRWGKPV(SEQ ID N0:3)(Gen Pept序列ID，PRF:223274， 如2013年12月2日可得的）或由該序列組成。然而，存在乙酰狀態(tài)不同的三種a-黑素細(xì)胞刺 激激素:無(wú)乙酰a-MSH，其缺乏乙?；鶊F(tuán)；單乙酰a-MSH，其中SEQ ID N0:3的Ser-1的氨基被 乙?；?；以及二乙酰a-MSH，其中SEQ ID N0:3的Ser-Ι的氨基和羥基二者均被乙?；?。本文 使用的a-MSH特別指單乙酰a-MSH。
[0048] a-MSH關(guān)鍵性地參與能量平衡的調(diào)節(jié)并通過(guò)激活黑皮質(zhì)素4型受體(MC4R)增加能 量消耗，其在中樞和外周均起作用。在人和小鼠中，血漿a-MSH水平與體重改變相關(guān)。此外， a-MSH通過(guò)提升焦慮來(lái)調(diào)節(jié)心境和情緒。
[0049] "模擬物"指的是模擬另一蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。該模擬由于蛋白質(zhì)與其所模擬的蛋白 質(zhì)共有特定特性而成為可能。
[0050] "構(gòu)象模擬物"指的是蛋白質(zhì)與另一蛋白質(zhì)共有至少部分的相同構(gòu)象。
[0051 ] 本發(fā)明人證實(shí)，ClpB蛋白在SEQ ID NO: 1的第542至548位氨基酸與a-MSH有不連續(xù) 序列同源性，為氨基酸序列"RWTGIPV"（以SEQ ID N0:2表示）。不受理論的束縛，這種ClpB的 構(gòu)象使得能夠刺激針對(duì)ClpB和a-MSH二者的抗體的產(chǎn)生。
[0052]因此，本文的"構(gòu)象模擬物"優(yōu)選指的是能夠刺激針對(duì)ClpB的抗體的產(chǎn)生以及針對(duì) a-MSH的自身抗體的產(chǎn)生。
[0053] "針對(duì)至少一種表達(dá)ClpB的細(xì)菌的抗生素"指的是抑制表達(dá)ClpB的細(xì)菌的生長(zhǎng)和/ 或降低表達(dá)ClpB的細(xì)菌的量和/或破壞表達(dá)ClpB的細(xì)菌的抗微生物化合物。
[0054]優(yōu)選地，針對(duì)至少一種表達(dá)ClpB的細(xì)菌的抗生素選擇性地或優(yōu)先地抑制表達(dá)ClpB 的細(xì)菌的生長(zhǎng)、降低表達(dá)ClpB的細(xì)菌的量和/或破壞表達(dá)ClpB的細(xì)菌。所述抗生素優(yōu)選地不 對(duì)真核細(xì)胞造成不利影響。
[0055]特異性革E1向表達(dá)ClpB的細(xì)胞的抗生素是技術(shù)人員公知的，并且在Martin, I等人 (Journal of Medicinal Chemistry,2013,56:7177-7189)中進(jìn)一步描述。
[0056]針對(duì)至少一種表達(dá)ClpB的細(xì)菌的抗生素可以與ClpB結(jié)合并調(diào)節(jié)其活性。
[0057]特別地，針對(duì)至少一種表達(dá)ClpB的細(xì)菌的抗生素調(diào)節(jié)：
[0058] i)ClpB的ATP酶活性，和/或
[0059] ii)抑制ClpB的游離形式和/或底物結(jié)合形式，和/或
[0060] iii)抑制ClpB的激活。
[0061] 在一個(gè)實(shí)施方案中，針對(duì)至少一種表達(dá)ClpB的細(xì)菌的抗生素是芐基苯骨架上的水 楊醛衍生物，特別地，5-(2-氯芐基）-2-羥基-3-硝基苯甲醛（CAS號(hào)292644-32-7, Sigma Aldrich)或（2-{ [(3，4_二氯苯基）氨基]硫代甲基硫代}乙氧基）-N-苯酰胺（供應(yīng)商號(hào) ST034398，TimTec)。
[0062] 本發(fā)明的針對(duì)至少一種表達(dá)ClpB的細(xì)菌的抗生素的通常劑量可以為例如在約 0.01mg/kg至約30mg/kg的范圍內(nèi)；然而，預(yù)想到了在該示例性范圍之下或之上的劑量，尤其 是考慮到上述因素?？诜談┝糠桨缚梢允羌s〇.〇lmg/kg至約30mg/kg總體重，特別是0.01、 0·1、0·2、0·3、0·4、0·5、0·6、0·7、0·8、0·9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、 24、26、28、30mg/kg體重?？梢酝ㄟ^(guò)定期評(píng)估來(lái)監(jiān)控患者的進(jìn)展，并據(jù)此調(diào)節(jié)劑量。
[0063] 在本發(fā)明的上下文中，本文所用術(shù)語(yǔ)"治療"指的是逆轉(zhuǎn)、減輕、抑制使用該術(shù)語(yǔ)的 障礙或這種障礙或病癥的一種或更多種癥狀的進(jìn)展。
[0064] "預(yù)防"指的是為了防止使用該術(shù)語(yǔ)的障礙發(fā)生或者在障礙的早期階段采取的措 施。預(yù)防還指抑制使用該術(shù)語(yǔ)的障礙進(jìn)一步發(fā)展。
[0065] 治療或預(yù)防飲食障礙在本文中優(yōu)選地指在待治療對(duì)象中降低表達(dá)ClpB細(xì)菌的量 或濃度。
[0066] 在本發(fā)明的上下文中，"對(duì)象"指的是人或非人哺乳動(dòng)物，例如嚙齒動(dòng)物(大鼠、小 鼠、兔）、靈長(zhǎng)動(dòng)物(黑猩猩）、貓科動(dòng)物(貓)或犬科動(dòng)物(狗）。優(yōu)選地，所述對(duì)象是人。根據(jù)本 發(fā)明的對(duì)象可以特別地為雄性或雌性。
[0067] 優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的對(duì)象超過(guò)13歲。
[0068] 優(yōu)選地，所述對(duì)象是雌性。
[0069] "飲食障礙"指的是根據(jù)第5版精神障礙診斷和統(tǒng)計(jì)手冊(cè)（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders 5th Edition,DSM-5)和更早版本（DSM-4等）的 標(biāo)準(zhǔn)定義的精神病學(xué)疾病。異常的飲食習(xí)慣可涉及有害于個(gè)體的生理和精神健康的食物攝 取不足或過(guò)度。神經(jīng)性貪食癥(BN)、神經(jīng)性厭食癥(AN)和暴食癥(BED)是最常見(jiàn)的飲食障礙 的具體形式。根據(jù)DSM-5標(biāo)準(zhǔn)，診斷為患有神經(jīng)性厭食癥的人必須表現(xiàn)出：持續(xù)限制能量攝 取導(dǎo)致顯著的低體重(比照根據(jù)年齡、性別、發(fā)育軌跡和身體健康預(yù)期的最低體重），對(duì)增重 或變胖的強(qiáng)烈懼怕，或影響體重增加（即便在顯著的低體重的情況下）的持續(xù)行為，對(duì)體重 或體型的感知方式的異常，體型或體重對(duì)自我評(píng)價(jià)的過(guò)度影響，或者對(duì)現(xiàn)有低體重的嚴(yán)重 性持續(xù)缺乏認(rèn)知。
[0070]根據(jù)DSM-5標(biāo)準(zhǔn)，診斷為神經(jīng)性貪食癥的人必須表現(xiàn)出暴食的重復(fù)發(fā)作。暴食發(fā)作 的特征為以下二者:在分離的時(shí)間段(例如在任何2小時(shí)時(shí)間段中）中進(jìn)食明顯高于大部分 人在相似時(shí)間段和相似情況下會(huì)進(jìn)食的食物量和在發(fā)作期間對(duì)進(jìn)食缺乏控制的感覺(jué)（例 如，不能停止進(jìn)食或不能控制吃什么或吃多少的感覺(jué)），為了防止體重增加的重復(fù)的不適當(dāng) 的補(bǔ)償行為，例如自誘的嘔吐，濫用瀉藥、利尿劑或其他藥物，禁食或過(guò)度鍛煉。暴食和不適 當(dāng)?shù)难a(bǔ)償行為平均均每周發(fā)生至少一次，持續(xù)三個(gè)月。自我評(píng)價(jià)被體型和體重過(guò)度影響。
[0071]根據(jù)DSM-5標(biāo)準(zhǔn)，診斷為暴食癥的人必須表現(xiàn)出暴食的重復(fù)發(fā)作。暴食發(fā)作的特征 為以下二者:在分離的時(shí)間段(例如在任何2小時(shí)時(shí)間段中）中進(jìn)食明顯高于大部分人在相 似時(shí)間段和相似情況下會(huì)進(jìn)食的食物量，在發(fā)作期間對(duì)進(jìn)食缺乏控制的感覺(jué)(例如，不能停 止進(jìn)食或不能控制吃什么或吃多少的感覺(jué)）。暴食發(fā)作伴隨以下的三種或更多種情況： [0072]-進(jìn)食比正常的快得多；
[0073]-進(jìn)食直至感覺(jué)撐得不舒服；
[0074]-在身體未感覺(jué)饑餓時(shí)進(jìn)食大量食物；
[0075]-之后感覺(jué)自我厭棄、抑郁或非常愧疚。
[0076]暴食平均每周發(fā)生至少一次，持續(xù)三個(gè)月。
[0077]其他類型的飲食障礙包括其他特異性喂食或飲食障礙(0SFED)。
[0078]根據(jù)DSM-5標(biāo)準(zhǔn)，診斷為0SFED的人必須表現(xiàn)出這樣的喂食或進(jìn)食行為，其導(dǎo)致臨 床顯著的苦惱和機(jī)能方面的損傷，但不滿足任何其他喂食和進(jìn)食障礙的全部標(biāo)準(zhǔn)。然后可 進(jìn)行診斷以具體給出病情為何不滿足另一疾病的特征的具體原因（例如，神經(jīng)性貪食癥-低 頻率）。以下為0SFED的另一些實(shí)例：
[0079]-非典型神經(jīng)性厭食癥：除了盡管有顯著的體重減輕但個(gè)體的重量在正常范圍之 內(nèi)或之上外，滿足所有標(biāo)準(zhǔn)；
[0080] -暴食癥(低頻率和/或有限的持續(xù)時(shí)間）：除了較低的頻率和/或短于三個(gè)月之外， 滿足BED的所有標(biāo)準(zhǔn)；
[0081] -神經(jīng)性貪食癥(低頻率和/或有限的持續(xù)時(shí)間）：除了暴食和不適當(dāng)?shù)难a(bǔ)償行為以 較低頻率發(fā)生和/或發(fā)生短于三個(gè)月，滿足神經(jīng)性貪食癥的所有標(biāo)準(zhǔn)；
[0082]-清除異常（purging disorder):在沒(méi)有暴食的情況下為了影響體重或體型的重 復(fù)清除行為；
[0083]-夜食綜合征：夜食、從睡眠中醒過(guò)來(lái)后進(jìn)食或晚餐后過(guò)度攝取食物的重復(fù)發(fā)作。 行為并不能被環(huán)境影響或社會(huì)標(biāo)準(zhǔn)更好地解釋。行為導(dǎo)致顯著的苦惱/損傷。行為不能被另 一精神健康疾病更好地解釋（例如，BED);非特異性喂食或進(jìn)食障礙(UFED)。根據(jù)DSM-5標(biāo) 準(zhǔn)，該類別用于行為導(dǎo)致臨床上顯著的苦惱/機(jī)能損傷，但不滿足任何喂食或進(jìn)食障礙標(biāo)準(zhǔn) 的全部標(biāo)準(zhǔn)的情況。在臨床醫(yī)師選擇不具體確定為何未滿足標(biāo)準(zhǔn)的情況下，臨床醫(yī)師可以 使用該類別，包括可能沒(méi)有進(jìn)行更確定的診斷所需的足夠信息的病情(例如在急診室的情 況下）。
[0084] 在本發(fā)明的上下文中，進(jìn)食障礙選自由以下組成的組:神經(jīng)性厭食癥(AN)、神經(jīng)性 貪食癥(BN)、暴食癥(BED)、過(guò)度飲食(overeating)、食欲過(guò)剩(hyperphagia)、消耗性疾病 例如惡病質(zhì)(cachexia)。
[0085] "食欲"是指食用食物的期望，感覺(jué)上表現(xiàn)為饑餓。食欲在所有高等生命形式中存 在，并且起調(diào)節(jié)足量的能量攝取以保持代謝需要的作用。食欲由消化道、能量?jī)?chǔ)存例如脂肪 組織和肝中的能量?jī)?chǔ)存、以及腦之間的緊密相互作用來(lái)調(diào)節(jié)。通過(guò)測(cè)量攝入食物的量并且 通過(guò)評(píng)估對(duì)象進(jìn)食的期望來(lái)評(píng)估對(duì)象的食欲。
[0086] "食欲失調(diào)"指的是異常的食欲，其包括增加的食欲和減少的食欲，其長(zhǎng)久存在或 者一周中重復(fù)出現(xiàn)若干次，從而造成神經(jīng)性厭食癥、神經(jīng)性貪食癥、惡病質(zhì)、消耗性疾病、過(guò) 度飲食、暴食癥和食欲過(guò)剩。
[0087] 在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)象患有選自由以下組成的組的進(jìn)食障礙:神經(jīng)性厭食癥、神 經(jīng)性貪食癥、暴食癥、惡病質(zhì)和消耗性疾病，以及更特別地，神經(jīng)性厭食癥、神經(jīng)性貪食癥和 暴食癥。
[0088] "厭食癥"指的是對(duì)食欲感知的降低，從而導(dǎo)致食欲降低。盡管在非科學(xué)性出版物 中該術(shù)語(yǔ)經(jīng)常與神經(jīng)性厭食癥互換使用，但食欲降低有許多可能原因，其中有些可以是無(wú) 害的，而另一些指示嚴(yán)重的臨床病癥或構(gòu)成嚴(yán)重風(fēng)險(xiǎn)。
[0089] 本發(fā)明上下文中的"神經(jīng)性厭食癥(AN)"指的是特征為過(guò)度食物限制的進(jìn)食障礙， 過(guò)度食物限制的特征為不能將體重保持為正常體重的至少85%。此外，患有神經(jīng)性厭食癥 的對(duì)象對(duì)于體重增加有非理性的恐懼，并且具有歪曲的自我身體認(rèn)知，其中對(duì)象將其自身 視為超重的，盡管有壓倒性證據(jù)證明并非如此。
[0090] 因此，患有神經(jīng)性厭食癥的人優(yōu)選地具有至少一個(gè)選自由以下組成的組的心理特 征:對(duì)身體不滿意、追求清瘦、完美主義、效率低、不信任他人、社交不安全感和快感缺乏。優(yōu) 選地，患有神經(jīng)性厭食癥的人具有至少一個(gè)選自由以下組成的組的心理特征:對(duì)身體不滿 意、追求清瘦和完美主義。還優(yōu)選的是，患有神經(jīng)性厭食癥的人具有至少一個(gè)選自由以下組 成的組的心理特征:效率低、不信任他人、社交不安全感和快感缺乏。
[0091] 在另一實(shí)施方案中，患有神經(jīng)性厭食癥的對(duì)象具有低于17的BMI。
[0092] "ΒΜΓ或"身體質(zhì)量指數(shù)"被定義為對(duì)象的身體質(zhì)量除以其身高的平方。在醫(yī)藥中 普遍使用的該公式產(chǎn)生了 kg/m2的測(cè)量單位。
[0093] "貪食癥"或"神經(jīng)性貪食癥"是具有以下特征的進(jìn)食障礙:暴食和清除，或在短時(shí) 間內(nèi)攝取大量食物然后努力使自身擺脫攝取的食物(清除），該努力通常是通過(guò)嘔吐、吃瀉 藥或利尿劑和/或過(guò)量運(yùn)動(dòng)。一些對(duì)象可傾向于在神經(jīng)性貪食癥和神經(jīng)性厭食癥之間交替。 患有貪食癥的對(duì)象可以表現(xiàn)為正常的BMI范圍，通常低于25。
[0094] "暴食癥"或"BED"指的是以暴食為特征的進(jìn)食障礙，由以下構(gòu)成:在分離的時(shí)間段 (例如在任何2小時(shí)時(shí)間段中）中進(jìn)食明顯高于大部分人在相似時(shí)間段和相似情況下會(huì)進(jìn)食 的食物量，并且伴隨有失去控制感。暴食平均每周發(fā)生至少兩次，持續(xù)6個(gè)月。與貪食癥不 同，暴食癥不與重復(fù)使用不適當(dāng)?shù)难a(bǔ)償行為相聯(lián)系?；加蠦ED的對(duì)象對(duì)于暴食有嚴(yán)重焦慮。 此外，患有BED的對(duì)象進(jìn)食直至由于攝入的食物量而身體不舒服并且惡心和/或在無(wú)聊或抑 郁時(shí)進(jìn)食和/或甚至在不太餓的時(shí)候進(jìn)食大量食物和/或由于對(duì)于食物感覺(jué)到不好意思而 在正常進(jìn)食時(shí)間獨(dú)自進(jìn)食和/或在暴食后感覺(jué)到厭惡、抑郁或愧疚?；加斜┦嘲Y的對(duì)象對(duì)其 進(jìn)食行為沖動(dòng)并且感覺(jué)到缺乏控制。此外，患有暴食癥的對(duì)象在應(yīng)對(duì)壓力、焦慮、憤怒、悲 傷、無(wú)聊和擔(dān)心方面有問(wèn)題。
[0095]在本發(fā)明的上下文中，患有BED的對(duì)象優(yōu)選地肥胖以及具有高于30的BMI。
[0096] "過(guò)度飲食"是相對(duì)于機(jī)體消耗(或通過(guò)排泄排出）的能量攝取過(guò)量食物，導(dǎo)致體重 增加。過(guò)度飲食有時(shí)可以是暴食癥或貪食癥的癥狀。強(qiáng)迫型過(guò)度飲食的人在有壓力、多次感 覺(jué)抑郁和感覺(jué)無(wú)助時(shí)依賴于食物來(lái)安慰自身。
[0097] "食欲過(guò)剩"也稱為"多食癥"，指的是過(guò)度的饑餓(強(qiáng)迫型）或增加的食欲。在一個(gè) 實(shí)施方案中，食欲過(guò)剩可由例如糖尿病、克-列二氏綜合征、遺傳疾病Prader-Willi綜合征 和Bardet Biedl綜合征的疾病引起。
[0098] "消耗性疾病"指的是衰弱性疾病導(dǎo)致肌肉和脂肪組織"消耗"掉的過(guò)程。消耗可以 由極低的能量攝入(例如由饑荒引起）、感染引起的營(yíng)養(yǎng)喪失或低攝入和高損失的組合引 起。
[0099] "惡病質(zhì)"是與體重減輕和/或肌肉萎縮和/或疲乏、衰弱和食欲顯著缺失相聯(lián)系的 消耗性疾病，其可以由癌癥、AIDS、慢性阻塞性肺病、多發(fā)性硬化、充血性心力衰竭、結(jié)核病、 家族性淀粉樣多神經(jīng)病、汞中毒(肢痛癥)和激素缺乏造成。惡病質(zhì)（也可稱為消耗)見(jiàn)于若 干疾病，例如AIDS、癌癥、后髖骨折、慢性心衰、慢性肺病例如慢性阻塞性肺病(COLD)和/或 慢性阻塞性肺部疾病(C0PD)、肝硬化、腎衰竭和自身免疫疾病例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng) 性狼瘡、敗血癥和嚴(yán)重感染。此外，消耗也見(jiàn)于衰老。
[0100] 在一些實(shí)施方案中，惡病質(zhì)由癌癥引起。
[0101] 惡病質(zhì)的最重要標(biāo)志是體重減輕，不止減輕脂肪組織，還減輕肌肉組織甚至骨骼。 該非脂肪性組織也被稱為"瘦體重"。
[0102]此外還有食欲喪失、衰弱(無(wú)力）和血紅蛋白水平下降(貧血）。
[0103] 惡病質(zhì)以許多不同的臨床病癥的終末階段或在慢性疾病中出現(xiàn)，例如癌癥、感染、 AIDS、充血性心力衰竭、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)核病、后髖骨折、囊性纖維化和克羅恩氏病。惡 病質(zhì)還可以在不具有任何明顯疾病癥狀的老年人中出現(xiàn)。
[0104] "增加的食欲"是指對(duì)象相比身體所需的具有更高的食物攝入的食欲。這可以或可 以不導(dǎo)致體重增加。
[0105] "正常食欲"因而指的是對(duì)象具有對(duì)應(yīng)于身體所需食物量的食物攝入。
[0106] "降低的食欲"和/或"減少的食欲"是指對(duì)象相比身體所需的具有更低的食物攝入 的食欲。這可以或可以不導(dǎo)致體重減輕。
[0107] "食物攝入"可以使用多種技術(shù)測(cè)量，包括使用例如日志或調(diào)查問(wèn)卷自報(bào)告、通過(guò) 在攝取之前對(duì)食物稱重或稱重并分析成對(duì)的食物量來(lái)測(cè)量自助進(jìn)餐的卡路里攝入?？梢砸?餐、天、周或月為基礎(chǔ)測(cè)量食物攝入。
[0108] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物用于降低對(duì)象的體重增加。
[0109] 所述組合物可以被用于例如降低食欲，其中增加的食欲是由于暴食癥或過(guò)度飲食 引起。
[0110] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述治療導(dǎo)致食物攝入相對(duì)于開(kāi)始治療之前的平均 食物攝入降低至少1 %，例如降低2 %、更優(yōu)選地3 %或5 %或7 %以及更優(yōu)選10 %。
[0111] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述治療導(dǎo)致卡路里攝入的降低而無(wú)關(guān)食物攝入的改變， 因?yàn)樗鶖z取食物量可能不與攝取的卡路里攝入直接相關(guān)，這是由于多種食物項(xiàng)目例如脂 肪、碳水化合物和蛋白質(zhì)在單位量食物中含有不同量的卡路里。
[0112] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述治療導(dǎo)致卡路里攝入相對(duì)于開(kāi)始治療之前的平 均卡路里攝入降低至少1%，例如降低2%、更優(yōu)選地3%或5%或7%以及甚至更優(yōu)選卡路里 攝入降低10%。
[0113] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物用于增加對(duì)象的體重增加。
[0114] 所述組合物可以被用于例如刺激食欲，其中食欲降低是由于厭食癥、神經(jīng)性厭食 癥、神經(jīng)性貪食癥、惡病質(zhì)或消耗性疾病，特別是厭食癥、神經(jīng)性厭食癥或神經(jīng)性貪食癥。
[0115] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述治療導(dǎo)致食物攝入相對(duì)于開(kāi)始治療之前的平均 食物攝入增加至少1 %，例如增加2 %、更優(yōu)選地3 %或5 %或7 %以及甚至更優(yōu)選10 %。
[0116] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述治療導(dǎo)致卡路里攝入的增加而無(wú)關(guān)食物攝入的改變， 因?yàn)樗鶖z取食物量可能不與攝取的卡路里攝入直接相關(guān)，這是由于多種食物項(xiàng)目例如脂 肪、碳水化合物和蛋白質(zhì)在單位量食物中含有不同量的卡路里。
[0117] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述治療導(dǎo)致與開(kāi)始治療之前相比卡路里攝入 增加至少1 %，例如增加2%、更優(yōu)選地3 %或5%或7 %以及甚至更優(yōu)選卡路里攝入增加 10%〇
[0118] 在一些實(shí)施方案中，所述組合物用于治療或預(yù)防選自由以下組成的組的障礙：神 經(jīng)性厭食癥(AN)、神經(jīng)性貪食癥(BN)、暴食癥(BED)、過(guò)度飲食、食欲過(guò)剩、消耗性疾病例如 惡病質(zhì)，以及更特別地神經(jīng)性厭食癥(AN)、神經(jīng)性貪食癥(BN)和暴食癥(BED)。
[0119] 還提供了一種治療對(duì)象的飲食障礙或者降低其發(fā)生的可能性的方法，所述方法包 括，對(duì)有此需要的對(duì)象施用組合物，所述組合物包含針對(duì)至少一種表達(dá)ClpB的細(xì)菌的至少 一種抗生素，和/或向所述對(duì)象施用有效量的包含不表達(dá)ClpB的益生菌的組合物，和/或其 組合，如以下所述。
[0120]有此需要的對(duì)象是患有如本文所限定的飲食障礙的對(duì)象，所述飲食障礙特別地是 選自由以下組成的組的障礙:神經(jīng)性厭食癥(AN)、神經(jīng)性貪食癥(BN)、暴食癥(BED)、食欲過(guò) 剩、消耗性疾病例如惡病質(zhì)，以及更特別地神經(jīng)性厭食癥(AN)、神經(jīng)性貪食癥(BN)和暴食癥 (BED)〇
[0121] 還提供了包含針對(duì)至少一種表達(dá)ClpB的細(xì)菌的至少一種抗生素的組合物在制備 用于治療或預(yù)防如本文所限定的飲食障礙的藥物中的用途。
[0122] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，食欲失調(diào)與以下相關(guān):ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體的存在，以及抗-α-MSH-反應(yīng)性抗體優(yōu)選抗ClpB IgG和/或IgM和抗-α-MSH-反應(yīng)性IgG和/或IgM的升高的血 衆(zhòng)水平。
[0123] 在一個(gè)實(shí)施方案中，降低對(duì)象中表達(dá)ClpB的細(xì)菌的量或濃度導(dǎo)致所述對(duì)象食欲的 正常化。
[0124] 不被理論束縛，包含針對(duì)至少一種表達(dá)ClpB的細(xì)菌的至少一種抗生素的組合物降 低表達(dá)ClpB的細(xì)菌的量，從而降低ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體的水平或濃度，和/或降低抗-a-MSH-反應(yīng)性抗體的水平，從而導(dǎo)致正常化的食欲。
[0125] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明上下文中使用的組合物是藥物組合物。
[0126] 在本發(fā)明上下文中使用的藥物組合物優(yōu)選地被設(shè)計(jì)為適于所選定的施用模式或 施用途徑，并且適當(dāng)時(shí)使用可藥用稀釋劑、載劑和/或賦形劑，例如分散劑、緩沖劑、表面活 性劑、防腐劑、增溶劑、等滲劑、穩(wěn)定劑等。這種組合物可以根據(jù)例如Remington，The Science and Practice of Pharmacy,第19片反，Gennaro編，Mack Publishing Co.,Easton, PA 1995中公開(kāi)的常規(guī)技術(shù)設(shè)計(jì)。
[0127] 用于藥物組合物的合適載劑包括在與本發(fā)明的抗生素組合時(shí)保持分子活性并且 與對(duì)象的免疫系統(tǒng)無(wú)反應(yīng)性的任何物質(zhì)。
[0128] 根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以以合適的藥物單位劑型的形式經(jīng)口施用。本發(fā)明的 藥物組合物可以以多種形式制備，包括片劑、硬或軟明膠膠囊、水性溶液劑、懸液劑、和脂質(zhì) 體以及其他緩慢釋放制劑，例如成形的聚合物凝膠。
[0129] 施用模式和劑型與對(duì)于給定的治療應(yīng)用期望和有效的治療劑或治療組合物的特 性緊密相關(guān)。合適的劑型包括但不限于經(jīng)口、靜脈內(nèi)、經(jīng)直腸、舌下、經(jīng)肌肉、經(jīng)鼻、經(jīng)眼、皮 下、肌內(nèi)、透皮、經(jīng)脊椎、鞘內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、蛛網(wǎng)膜下、經(jīng)支氣管和經(jīng)淋巴施用，以及用于 系統(tǒng)遞送活性成分的其他劑型。
[0130] 本發(fā)明的藥物組合物可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法施用，包括但不限于透皮 (被動(dòng)的通過(guò)貼片、凝膠、乳、油膏或離子電滲）；靜脈內(nèi)（團(tuán)注、輸注）；皮下(輸注、儲(chǔ)庫(kù)）；經(jīng) 肌肉（經(jīng)頰和舌下，例如經(jīng)口可分散的片劑、薄片、膜和泡騰制劑;經(jīng)結(jié)膜(滴眼劑）；經(jīng)直腸 (栓劑、灌腸劑））；或皮內(nèi)（團(tuán)注、輸注、儲(chǔ)庫(kù)）。
[0131 ]經(jīng)口液體藥物組合物可以為例如水性或油性懸液劑、溶液劑、乳液劑、糖漿或酏劑 的形式，或者可以以在使用前用水或其他可溶載體構(gòu)建的干燥產(chǎn)品的形式呈現(xiàn)。這種液體 藥物組合物可以含有常規(guī)的添加劑，例如懸浮劑、乳化劑、非水性載體(其可包括食用油)或 防腐劑。
[0132] 本發(fā)明的藥物組合物還可以被配制用于腸胃外施用（例如通過(guò)注射，例如團(tuán)注或 連續(xù)輸注），并且可以在安瓿、預(yù)填裝注射器、小體積輸注容器或多劑量容器(具有添加的防 腐劑）中以單位劑型呈現(xiàn)。藥物組合物可以采用的形式例如是懸液劑、溶液劑或油性或水性 載體中的乳液劑，并且可以含有配制試劑例如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘?，本發(fā)明的 藥物組合物可以是使用前用合適載體例如無(wú)菌的無(wú)熱原水構(gòu)建的粉末形式，其通過(guò)無(wú)菌固 體的無(wú)菌分離或通過(guò)溶液的凍干獲得。
[0133] 其中載劑為固體的適用于經(jīng)直腸施用的藥物組合物最優(yōu)選以單位劑量的栓劑呈 現(xiàn)。合適的載劑包括可可脂和本領(lǐng)域通常施用的其他物質(zhì)，栓劑可以通過(guò)以下常規(guī)地形成， 通過(guò)將藥物組合物與軟化或熔化的載劑混合然后冷卻并在模具中定形。
[0134] 對(duì)于吸入施用，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物從吹藥器、噴霧器或加壓包裝或者遞送 氣溶膠噴霧的其他方便方式方便地遞送。加壓包裝可以包含合適的推進(jìn)劑，例如二氯二氟 甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟甲烷、二氧化碳或其他合適氣體。在加壓氣溶膠的情況下，單位 劑量可以通過(guò)提供閥以遞送計(jì)量的量來(lái)確定?；蛘?，對(duì)于吸入或吹入施用，本發(fā)明的藥物組 合物可以采用干粉組合物的形式，例如，藥物組合物與合適的藥物基質(zhì)例如乳糖或淀粉的 粉末混合物。粉末組合物可以以在可在吸入器或吹藥器的幫助下從其施用粉末的例如膠囊 或藥筒或明膠或泡罩包裝中的單位劑型呈現(xiàn)。
[0135] 對(duì)于鼻內(nèi)施用，本發(fā)明的藥物組合物可以通過(guò)液體噴霧施用，例如通過(guò)塑料瓶噴 霧器。其的典型為Mistometerg(異丙基腎上腺素吸入器-Wintrop)和Medfhaler?(異丙基 腎上腺素吸入器-Riker)。
[0136] 本發(fā)明的藥物組合物還可以含有賦形劑，例如調(diào)味劑、著色劑、抗微生物劑或防腐 劑。
[0137] 施用方案可以為例如進(jìn)行至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、 55、60、65、70、75、80、85、90、95、100天的時(shí)間。
[0138] 劑量范圍取決于待施用的組合物并且如以上所限定。
[0139] 如醫(yī)藥領(lǐng)域公知的，用于任一對(duì)象的劑量取決于許多因素，包括患者體型、體表面 積、年齡、待施用的具體化合物、性別、施用時(shí)間和途徑、一般健康狀況和同時(shí)施用的其他藥 物。
[0140] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明的治療或預(yù)防方法使得能夠通過(guò)施用包含針對(duì)至少 一種表達(dá)ClpB的細(xì)菌的至少一種抗生素的組合物維持穩(wěn)定的體重。
[0141] 超重或體重過(guò)低在一些文化背景下也可能被認(rèn)為是較缺乏吸引力的身體外觀。
[0142] 因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種調(diào)節(jié)對(duì)象的食欲的非治療方法，其包 括，向所述對(duì)象施用有效量的組合物，所述組合物包含針對(duì)至少一種表達(dá)ClpB的細(xì)菌的至 少一種抗生素。
[0143] 以上所提及的所有限定也適用于所述非治療方法。
[0144] 在一個(gè)實(shí)施方案中，有效量或治療有效量是對(duì)對(duì)象賦予治療益處或益處所需的活 性劑的至少最低劑量，但低于毒性劑量。換言之，用于治療飲食障礙的這種量例如是誘導(dǎo)、 改善或以其他方式導(dǎo)致對(duì)象狀態(tài)改進(jìn)例如食物攝入調(diào)整的量。
[0145] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述非治療方法是美容方法。
[0146] 如上所述，本發(fā)明還涉及用于治療或預(yù)防飲食障礙的組合物，其包含不表達(dá)ClpB 蛋白的益生菌。
[0147] 以上所提及的所有限定也適用于所述組合物。
[0148] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述飲食障礙選自由以下組成的組:神經(jīng)性厭食癥(AN)、神經(jīng) 性貪食癥(BN)、暴食癥(BED)、食欲過(guò)剩、消耗性疾病例如惡病質(zhì)，以及更特別地神經(jīng)性厭食 癥(AN)、神經(jīng)性貪食癥(BN)和暴食癥(BED)。
[0149] 本發(fā)明還涉及調(diào)節(jié)對(duì)象的食欲的非治療方法，其包括，向所述對(duì)象施用有效量的 組合物，所述組合物包含不表達(dá)ClpB蛋白的益生菌。
[0150] 以上所提及的所有限定也適用于所述非治療方法。
[0151] "益生菌"是指旨在被引入膳食中的包含有效量的微生物的食品添加劑。根據(jù)WH0， 益生菌是活的微生物，其在以足量施用時(shí)對(duì)宿主健康有益處(WHO, 2001)。
[0152] 在本發(fā)明的上下文中，被引入膳食的所述細(xì)菌是不表達(dá)ClpB蛋白的細(xì)菌。特別地， 其是在正常情況下表達(dá)ClpB蛋白質(zhì)但其中所述蛋白質(zhì)的表達(dá)已經(jīng)被缺失的細(xì)菌。
[0153] 表達(dá)ClpB的細(xì)菌是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且可以通過(guò)常規(guī)技術(shù)鑒定。
[0154]在一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述蛋白質(zhì)的表達(dá)已經(jīng)被缺失的表達(dá)ClpB的細(xì)菌選自由 以下構(gòu)成的組：已知為人中的益生或共生的非病原性的細(xì)菌，例如非病原性Escherichia coli 〇
[0155] 不表達(dá)ClpB蛋白的細(xì)菌可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備。這可以例如通 過(guò)DNA重組進(jìn)行。
[0156] 在本發(fā)明的上下文中，"有效量"是指允許展現(xiàn)治療或預(yù)防飲食障礙的期望效果的 細(xì)菌量。特別地，其意指10億到100億UFC.天4的量。
[0157] 如上所述，本發(fā)明還涉及作為疫苗或免疫原性組合物使用的組合物，其包含ClpB 蛋白。
[0158] "免疫原性組合物"在本發(fā)明的上下文中是指包含ClpB蛋白的組合物，其在施用給 個(gè)體時(shí)觸發(fā)免疫應(yīng)答或?qū)γ庖邞?yīng)答進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)（即免疫抑制或免疫刺激），或在施用給個(gè) 體時(shí)誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生。
[0159] "疫苗"是指施用其以免疫調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的例如本文所述的免疫原性組合物的組 合物，其將保護(hù)或治療個(gè)體使其免受疾病，特別是由于所述試劑。本發(fā)明的疫苗特別地是預(yù) 防性(防止性)疫苗，其在個(gè)體發(fā)生飲食障礙之前被施用。
[0160] 特別地，所述組合物被用于針對(duì)飲食障礙進(jìn)行免疫。
[0161] 更特別地，所述組合物用于預(yù)防飲食障礙。
[0162] 還提供了在對(duì)象中進(jìn)行免疫或接種的方法，所述方法包括，向有此需要的對(duì)象施 用包含ClpB蛋白的組合物。
[0163] 特別地，所述方法用于降低對(duì)象中飲食障礙發(fā)生的可能性。
[0164] 有此需要的對(duì)象是被懷疑患有飲食障礙的對(duì)象。
[0165] 還提供了包含ClpB蛋白的組合物在制備用于針對(duì)飲食障礙進(jìn)行免疫的疫苗或免 疫原性組合物中的用途。
[0166] 特別地，所述組合物用于預(yù)防飲食障礙。
[0167] 特別地，所述飲食障礙選自：神經(jīng)性厭食癥（AN)、神經(jīng)性貪食癥（BN)、暴食癥 (BED)、過(guò)度飲食、食欲過(guò)剩、消耗性疾病例如惡病質(zhì)，特別是神經(jīng)性厭食癥、神經(jīng)性貪食癥 和暴食癥。
[0168] 在一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗或免疫原性組合物還可以包含本文公開(kāi)的多種ClpB蛋白 的組合。
[0169] 獲得疫苗組合物或免疫原性組合物的方法是本領(lǐng)域公知的。一般地，這種方法涉 及使用例如超聲、蛋白裂解消化、熱處理、凍融處理、滲透沖擊處理等的技術(shù)從細(xì)菌制備物 提取蛋白質(zhì)。人工細(xì)菌制劑的實(shí)例包括部分或全部通過(guò)合成或重組方法獲得的蛋白質(zhì)制 劑。
[0170] 包含ClpB的疫苗或免疫原性組合物的典型劑量可以為例如在約0.01nm〇l/kg至約 1000nmol/kg的范圍內(nèi)；然而，預(yù)想到了在該示例性范圍之下或之上的劑量。特別地，所述劑 量為約0 · lnmol/kg至約100nmol/kg總體重，優(yōu)選是約0· lnmol/kg至約20nmol/kg，更特別地 從約 〇.lnmol/kg至約10nmol/kg，特別是0·1、0·2、0·3、0·4、0·5、0·6、0·7、0·8、0·9、1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10nmol/kg 體重。
[0171] 對(duì)于所述疫苗和免疫原性組合物，適合于可注射用的形式包括無(wú)菌水性溶液或分 散液以及用于臨時(shí)制備無(wú)菌可注射溶液或分散液的無(wú)菌粉末。在所有情況下，所述形式必 須是無(wú)菌的并且流動(dòng)程度必須使得具備易于注射的能力。所述形式必須在制備和儲(chǔ)存條件 下穩(wěn)定，并且必須被保護(hù)以免受微生物例如細(xì)菌和真菌的污染作用。載劑可以是含有例如 水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等）、其合適的混合物和/或植物油的溶 劑或分散介質(zhì)?？梢酝ㄟ^(guò)例如使用涂層例如卵磷脂、通過(guò)在懸浮液的情況下保持需要的粒 徑和通過(guò)使用表面活性劑來(lái)保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性?？梢酝ㄟ^(guò)多種抗菌和抗真菌劑例如對(duì)羥基 苯甲酸類、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等來(lái)防止微生物的作用。在許多情況下，優(yōu)選包含 等滲劑，例如糖或氯化鈉?？梢酝ㄟ^(guò)在組合物中使用延遲吸收的試劑例如單硬脂酸鋁和明 膠來(lái)賦予可注射組合物延長(zhǎng)的吸收。
[0172] 對(duì)于在水性溶液中的腸胃外施用，例如，需要的情況下溶液應(yīng)該被合適地緩沖并 且液體稀釋液首先應(yīng)用足夠的鹽水或葡萄糖變成等滲。這些特定的水性溶液特別適合用于 靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、瘤內(nèi)和腹膜內(nèi)施用。對(duì)此，可以應(yīng)用的無(wú)菌水性介質(zhì)是本領(lǐng)域 技術(shù)人員根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容已知的。例如，一個(gè)劑量可以被溶解在lml的等滲NaCl溶液中，添 加到1000ml的皮下輸注液或者在輸注的建議位點(diǎn)注射(參見(jiàn)例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版，Lippincot和Williams,2005)。根據(jù)被治療的對(duì)象的 狀況將需要進(jìn)行劑量的一些改變。此外，對(duì)于人的施用，制劑應(yīng)該滿足Π )Α生物標(biāo)準(zhǔn)辦公室 所要求的無(wú)菌性、熱原性、一般安全和純度標(biāo)準(zhǔn)。
[0173] 通過(guò)過(guò)濾滅菌通過(guò)將所需量的活性化合物摻入合適的溶劑來(lái)制備無(wú)菌可注射溶 液。
[0174] 本文所用的"載劑"包括但不限于溶劑、分散介質(zhì)、載體、涂層、稀釋劑、抗菌和抗真 菌劑、等滲和吸收延遲劑、緩沖劑、載劑溶液、懸液、膠體、脂質(zhì)體和病毒體，如Bomse 1等 (2011)Immunity 34:269-280中所描述的。這種介質(zhì)和試劑在藥物活性物質(zhì)中的使用是本 領(lǐng)域公知的。
[0175] 詞語(yǔ)"可藥用"或"藥理上可接受"是指在施用給人時(shí)不產(chǎn)生變態(tài)或類似不利反應(yīng) 的分子實(shí)體和組合物。含有作為活性成分的蛋白質(zhì)的水性組合物的制備是本領(lǐng)域中公知 的。通常，這種組合物被制備為液體溶液或懸液形式的可注射劑;還可以制備在注射前適于 溶于或懸浮于液體中的固體形式。
[0176] 在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述免疫原性或疫苗組合物還包含一種或幾種 佐劑。
[0177] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"佐劑"指的是被添加到免疫原性組合物特別是疫苗的內(nèi)容物中 的、增加在施用所述組合物的宿主中誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的強(qiáng)度的產(chǎn)品。佐劑特別地可以增加 施用所述組合物后所述哺乳動(dòng)物能夠產(chǎn)生的特異性抗體的量，從而提高免疫效力。
[0178] 優(yōu)選地，佐劑在人宿主中沒(méi)有副作用。
[0179] 佐劑包括發(fā)揮提高保護(hù)性免疫應(yīng)答作用的任何化合物。佐劑可以包括例如乳化 劑;胞壁?；?阿夫立定;水性佐劑例如氫氧化鋁;含氧金屬鹽;基于殼聚糖的佐劑和多 種皂素中的任意種、油和本領(lǐng)域已知的其他物質(zhì)，例如Ampf a i gen、LPS、細(xì)菌細(xì)胞壁提取物、 細(xì)菌DNA、CpG序列、合成的寡核苷酸及其組合（Schi jns等（2000)Curr .Opin. Immunol，12: 456)、Mycohacterialplilei(phlei)細(xì)胞提取物（CWE)(美國(guó)專利No .4,744,984)、M.phlei DNA(M-D A)和M-DNA-M phlei細(xì)胞壁復(fù)合體(MCC)、不耐熱腸毒素(LT)、霍亂毒素(CT)、霍亂 毒素 B亞基(CTB)、聚合脂質(zhì)體、突變毒素例如LTK63和LTR72、微膠囊、白介素（例如IL-Ιβ、 IL-2、IL-7、IL-12、INF γ )、GM-CSF、MDF衍生物、CpG寡核苷酸、LPS、MPL、磷酸磷腈 (phosphophazenes)、 Adju-PllOS?、葡聚糖、抗原制劑、脂質(zhì)體、DDE、DHEA、DMPC、DMPG、D0C/ 鋁復(fù)合體、弗氏不完全佐劑、ISCOMs?、LT口服佐劑、胞壁?；?、單磷酰酯A、胞壁酰基 三肽和磷酸二酰乙醇胺。可用作乳化劑的化合物包括天然和合成的乳化劑，以及陰離子、陽(yáng) 離子和非離子型化合物。含氧金屬鹽包括A1、K、Ca、Mg、Zn、Ba、Na、Li、B、Be、Fe、Si、Co、Cu、 Ni、Ag、Au和Cr的鹽，其為硫酸鹽、氫氧化物、磷酸鹽、硝酸鹽、碘酸鹽、溴酸鹽、碳酸鹽、水化 物、乙酸鹽、檸檬酸鹽、草酸鹽和酒石酸鹽及其混合物形式，包括氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁、 硫酸鋁鉀、磷酸媽、Maalox (氫氧化鋁和氫氧化鎂的混合物）、氫氧化鈹、氫氧化鋅、碳酸鋅、 氯化鋅和硫酸鋇。在合成的化合物中，陰離子型乳化劑包括例如月桂酸和油酸的鉀、鈉和鋁 鹽，脂肪酸的鎂和鋁鹽，以及有機(jī)磺酸鹽，例如十二烷基硫酸鈉。合成的陽(yáng)離子型試劑包括 例如cetyltrhethylarnmonlum bromide，而合成的非離子型制劑的例子為甘油酯（例如甘 油單硬脂酸酯）、聚氧乙二醇酯和醚，和山梨聚糖脂肪酸酯(例如山梨聚糖單棕櫚酸酯)及其 聚氧乙烯衍生物(例如聚氧乙烯山梨聚糖單棕櫚酸酯）。天然乳化劑包括阿拉伯膠、明膠、卵 磷脂和膽固醇。
[0180] 可以用油組分形成其他合適的佐劑，例如單一油、油的混合物、油包水乳劑或水包 油乳劑。所述油可以是礦物油、植物油或動(dòng)物油。礦物油是通過(guò)蒸餾技術(shù)從石油獲得的液體 烴，在本領(lǐng)域中也被稱為液體石蠟、液體石油或者白礦物油。合適的動(dòng)物油包括例如鱈魚(yú)肝 油、大比目魚(yú)油、鯡油、橘棘鯛魚(yú)油和鯊魚(yú)肝油，它們所有均市售可得。合適的植物油包括例 如芥花油、杏仁油、棉花籽油、玉米油、橄欖油、花生油、藏紅花油、芝麻油、大豆油等。弗式完 全佐劑(FCA)和弗氏不完全佐劑(FIA)是在疫苗制備中常用的兩種常用佐劑，它們也適用于 本發(fā)明。FCA和FIA二者均是礦物油包水乳劑;然而，F(xiàn)CA還含有殺滅的分枝桿菌屬物種。用于 經(jīng)粘膜疫苗的特別優(yōu)選的佐劑為半乳糖神經(jīng)酰胺(GalCer)，如Lee等（2011)Vaccine 29: 417-425中所述。
[0181] 所述疫苗組合物中還可使用免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子來(lái)增強(qiáng)疫苗效力，例如，佐劑。這 種細(xì)胞因子的非限制性實(shí)例包括干擾素 a(IFN-a)、白介素-2(IL_2)和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落 刺激因子(GM-CSF)或其組合。
[0182] 所述疫苗和免疫原性組合物可以通過(guò)以下施用:靜脈內(nèi)施用、動(dòng)脈內(nèi)、經(jīng)內(nèi)窺鏡、 損傷內(nèi)、經(jīng)皮、皮下、肌內(nèi)、鞘內(nèi)、眶內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、表皮下、通過(guò)胸骨內(nèi)注射、靜脈 內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮內(nèi)、透皮、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、皮下、經(jīng)皮、氣管內(nèi)、腹膜內(nèi)、通過(guò)吸入或經(jīng)鼻噴霧、通過(guò) 氣管內(nèi)途徑等等。所述組合物的施用可以通過(guò)輸注或注射(例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、 鞘內(nèi)、十二指腸內(nèi)、腹膜內(nèi)等等）。此外，所述組合物可以通過(guò)"無(wú)針"遞送系統(tǒng)施用。
[0183] 所述注射可以被分開(kāi)為多個(gè)注射，這種分開(kāi)的接種優(yōu)選地基本同時(shí)施用。當(dāng)以分 開(kāi)接種的形式施用時(shí)，免疫原的劑量?jī)?yōu)選(但不必須)在每個(gè)單獨(dú)的注射中比例相等。如果 在疫苗組合物中存在佐劑，佐劑的劑量?jī)?yōu)選(但不一定)在每個(gè)單獨(dú)的注射中比例相等。用 于分開(kāi)接種的單獨(dú)的注射優(yōu)選地在患者身體上大體彼此鄰近的位置施用。在一些優(yōu)選的方 面，在身體上彼此相距至少約lcm的位置施用所述注射。在一些優(yōu)選的方面，在身體上彼此 相距至少約2.5cm的位置施用所述注射。在一些極為優(yōu)選的方面，在身體上彼此相距至少約 5cm的位置施用所述注射，在一些方面，在身體上彼此相距至少約10cm的位置施用所述注 射，在一些方面，在身體上彼此相距大于l〇cm的位置施用所述注射，例如在身體上彼此相距 至少約12.5、15、17.5、20或更多cm的位置。
[0184] 可以使用多種替代性藥物遞送系統(tǒng)。這種系統(tǒng)的非限制性實(shí)例包括脂質(zhì)體和乳 劑。也可以使用某些有機(jī)溶劑例如二甲亞砜。此外，可以施用持續(xù)釋放系統(tǒng)遞送所述疫苗組 合物，例如含有所述蛋白質(zhì)的固體聚合物的半滲透基質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知多種持續(xù)釋 放材料。持續(xù)釋放膠囊可以根據(jù)其化學(xué)特性在幾天至幾周至幾個(gè)月的范圍內(nèi)釋放疫苗組合 物。
[0185] 理想地，在有飲食障礙之前或者在飲食障礙的任何癥狀之前向?qū)ο笫┯媒M合物。
[0186] 可以通過(guò)腸胃外或非腸胃外途徑進(jìn)行施用。施用途徑包括例如靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮 內(nèi)、透皮、肌內(nèi)、經(jīng)粘膜、皮下、經(jīng)皮、氣管內(nèi)、腹膜內(nèi)、灌注和灌洗。例如，施用可以通過(guò)經(jīng)粘 膜途徑，例如通過(guò)經(jīng)鼻、經(jīng)口（經(jīng)過(guò)消化系統(tǒng)的粘膜）、經(jīng)陰道、經(jīng)頰、經(jīng)直腸、舌下、經(jīng)眼、經(jīng) 尿道、經(jīng)肺或經(jīng)耳途徑。
[0187] 免疫可以包括多個(gè)"單位劑量"。
[0188] 不一定將單位劑量作為單次注射施用，而是其可以包括經(jīng)一定時(shí)間段的連續(xù)輸 注。單位劑量可以包含約〇.〇lnmol/kg至約1000nmol/kg。特別地，所述劑量為約0. lnmol/kg 至約100nmol/kg總體重，優(yōu)選是約0· lnmol/kg至約20nmol/kg，更特別地從約0· lnmol/kg至 約10nmol/kg，特別是0· 1、0·2、0·3、0·4、0·5、0·6、0·7、0·8、0·9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10nmol/kg 體重。
[0189] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述疫苗組合物可以以單個(gè)日劑量施用，或者總?cè)談┝靠梢?以多個(gè)劑量施用，例如每日2、3或4次。此外，所述疫苗組合物可以以經(jīng)鼻形式通過(guò)合適經(jīng)鼻 載體的局部使用，通過(guò)透皮途徑使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的那些透皮皮膚貼劑形式，通過(guò) 可植入栗，或通過(guò)任何其他合適施用方式施用。為了以透皮遞送系統(tǒng)的形式施用，例如，劑 量的施用將當(dāng)然在劑量方案期間是是連續(xù)的而非間歇的。
[0190]疫苗施用還可包含引發(fā)-加強(qiáng)方案。在這些方法中，一個(gè)或更多個(gè)引發(fā)免疫之后是 一個(gè)或更多個(gè)加強(qiáng)免疫。對(duì)于每個(gè)免疫，實(shí)際的免疫原性組合物可以相同或不同，免疫原性 組合物的類型、途徑和免疫原制劑也可以不同。一種有用的引發(fā)-加強(qiáng)方案提供間隔4周的 兩次引發(fā)免疫，然后是在最后的引發(fā)免疫之后第4周和第8周的兩次加強(qiáng)免疫。
[0191] 對(duì)于動(dòng)物(包括人)的免疫時(shí)間表(或方案)是公知的，并且可以針對(duì)具體的對(duì)象和 組合物容易地確定。因而，可以對(duì)對(duì)象施用一次或更多次組合物。優(yōu)選地，在免疫原性組合 物的分開(kāi)的施用之間有確定時(shí)間間隔。盡管該間隔對(duì)于每個(gè)對(duì)象不同，但是通常其范圍為 10天到幾周，通常是2、4、6或8周。對(duì)于人，間隔通常是2至6周。在一個(gè)本發(fā)明的特別有利的 實(shí)施方案中，間隔更長(zhǎng)，有利地約10周、12周、14周、16周、18周、20周、22周、24周、26周、28 周、30周、32周、34周、36周、38周、40周、42周、44周、46周、48周、50周、52周、54周、56周、58 周、60周、62周、64周、66周、68周或70周。
[0192] 免疫方案通常具有組合物的1到6次施用，但是可以具有少至1、2、3、4或5次。誘導(dǎo) 免疫應(yīng)答的方法還可以包括伴隨組合物施用佐劑。在一些情況下，每年、每?jī)赡昊蚱渌L(zhǎng) 間隔(5-10年)的加強(qiáng)免疫可以補(bǔ)充起初的免疫方法。
[0193] 本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案提供在對(duì)象中誘導(dǎo)針對(duì)飲食障礙的免疫應(yīng)答的方法， 其通過(guò)向?qū)ο笫┯靡淮位蚋啻伪景l(fā)明的疫苗或免疫原性組合物實(shí)現(xiàn)，其中ClpB的水平足 以在對(duì)象中誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答。這種免疫可以根據(jù)期望的免疫方案以至少2、4或6周(或 更長(zhǎng))的時(shí)間間隔重復(fù)多次。
[0194] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了ClpB蛋白和抗ClpB抗體之間的關(guān)系，特別是抗ClpB IgG和飲食障 礙特別是神經(jīng)性厭食癥和神經(jīng)性貪食癥之間的關(guān)系。
[0195] 因此，本發(fā)明還涉及用于診斷對(duì)象的飲食障礙的體外方法，所述方法包括：
[0196] a)測(cè)量來(lái)自所述對(duì)象的生物樣品中的ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體的水平；
[0197] b)將測(cè)量的所述ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體的水平與參考值相比較；以及
[0198] c)推斷所述對(duì)象是否患有飲食障礙。
[0199] 在本發(fā)明的上下文中，所述對(duì)象產(chǎn)生針對(duì)細(xì)菌蛋白ClpB的抗體，稱為抗ClpB抗體。
[0200] 本發(fā)明的上下文中由所述對(duì)象產(chǎn)生的抗體可以是IgM、IgD、IgG、IgA和/或IgE抗 體，特別是IgG和/或IgM抗體。
[0201] 在本發(fā)明的上下文中，以表達(dá)ClpB之細(xì)菌菌株的形式存在的所述ClpB蛋白增加針 對(duì)ClpB的抗體和/或針對(duì)α-MSH的抗體的產(chǎn)生。
[0202] 針對(duì)a-MSH的由所述對(duì)象產(chǎn)生的抗體也稱為自身抗體。
[0203] 術(shù)語(yǔ)"自身抗體"是指由免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的針對(duì)對(duì)象自身蛋白的抗體。
[0204] 優(yōu)選地，抗ClpB抗體如以上定義的與a-MSH交叉反應(yīng)。
[0205]因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，抗ClpB抗體也是抗a-MSH抗體。
[0206] "抗體"或"免疫球蛋白"（Ig)可以是天然或常規(guī)抗體，其中兩個(gè)重鏈通過(guò)二硫鍵彼 此連接，每個(gè)重鏈通過(guò)二硫鍵與輕鏈連接。有兩種類型的輕鏈，λ(1)和K(k)。有五種主要的 重鏈類型（或同種型），其確定抗體分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每個(gè)鏈含有不 同的序列結(jié)構(gòu)域。輕鏈包括兩個(gè)結(jié)構(gòu)域或區(qū)域，可變結(jié)構(gòu)域(VL)和恒定結(jié)構(gòu)域(CL)。重鏈包 括四個(gè)結(jié)構(gòu)域，可變結(jié)構(gòu)域(VH)和三個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域(CH1、CH2和CH3,統(tǒng)稱為CH)。輕鏈(VL)和 重鏈(VH)二者的可變結(jié)構(gòu)域決定結(jié)合識(shí)別行為和對(duì)抗原的特異性。輕鏈(CL)和重鏈(CH)的 恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域賦予重要的生物特性，例如抗體鏈結(jié)合、分泌、穿過(guò)胎盤(pán)的運(yùn)動(dòng)性、補(bǔ)體結(jié)合 和與Fc受體(FcR)的結(jié)合。Fv片段是免疫球蛋白Fab片段的N端部分，由一個(gè)輕鏈和一個(gè)重鏈 的可變部分組成?？贵w的特異性依賴于抗體結(jié)合位點(diǎn)和抗原決定簇之間的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性?？?體結(jié)合位點(diǎn)由主要來(lái)自高變或互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基構(gòu)成。偶爾地，來(lái)自非高變或框架區(qū) (FR)的殘基影響整體結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，從而影響結(jié)合位點(diǎn)。互補(bǔ)決定區(qū)或CDR是指一起限定了天 然免疫球蛋白結(jié)合位點(diǎn)的天然Fv區(qū)的結(jié)合親和性和特異性的氨基酸序列。免疫球蛋白的輕 鏈和重鏈各具有三個(gè)CDR，分別命名為CDR1-L、CDR2-L、CDR3-L和〇)1?1-!1、〇)1?2-!1丄01?3-!1。因 此，常規(guī)抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)包含6個(gè)⑶R，包括來(lái)自重鏈和輕鏈V區(qū)域的⑶R組。
[0207] "框架區(qū)"（FR)是指在⑶R之間的氨基酸序列，即在一個(gè)物種中的不同免疫球蛋白 之間相對(duì)保守的免疫球蛋白輕鏈和重鏈的那些部分。免疫球蛋白的輕鏈和重鏈各具有4個(gè) FR，分別命名為FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。
[0208] 本文所用"人框架區(qū)"是與天然人抗體的框架區(qū)基本相同（約85%或更多，特別地 90%、95%、97%、99% 或 100%)的框架區(qū)。
[0209] 本文所用的"用于診斷的方法"或"診斷方法"或簡(jiǎn)單的"診斷"是指確定或鑒定對(duì) 象中的可能疾病或障礙的方法。在本發(fā)明的上下文中，診斷方法涉及確定或鑒定飲食障礙， 特別是選自神經(jīng)性厭食癥(AN)、神經(jīng)性貪食癥(BN)、暴食癥(BED )、過(guò)度飲食、食欲過(guò)剩、消 耗性疾病例如惡病質(zhì)，特別是神經(jīng)性厭食癥、神經(jīng)性貪食癥和暴食癥的飲食障礙。
[0210] 本文所用術(shù)語(yǔ)"生物樣品"是指生物來(lái)源的物質(zhì)。生物樣品的示例包括但不限于血 液、血漿、血清或唾液。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的生物樣品是血液、血清和/或血漿樣品，特別是 血漿樣品。根據(jù)本發(fā)明的生物樣品可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何合適取樣方法從對(duì)象獲得。
[0211] 根據(jù)本發(fā)明的診斷飲食障礙的方法包括步驟b):將測(cè)量的所述ClpB蛋白和/或抗 ClpB抗體的水平與參考值相比較。
[0212] 優(yōu)選地，所述參考值在與本發(fā)明所述方法步驟a)的對(duì)象的生物樣品具有相同的組 織來(lái)源。
[0213] 優(yōu)選地，"參考值"對(duì)應(yīng)于ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體的正常水平。
[0214] 本文所述的ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體的"正常水平"是指生物樣品中ClpB蛋白 和/或抗ClpB抗體的水平在ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體的標(biāo)準(zhǔn)截?cái)嘀抵畠?nèi)。所述標(biāo)準(zhǔn)取決于 生物樣品的類型和用于測(cè)量生物樣品中ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體的水平的方法。特別地， 所述正常水平是健康群體中ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體的平均水平。
[0215] 特別地，參考值對(duì)應(yīng)于健康對(duì)象中ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體的水平。因此，參考 值可以對(duì)應(yīng)于來(lái)源于健康對(duì)象的參考樣品中的ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體的水平。
[0216] 特別地，參考值對(duì)應(yīng)于健康對(duì)象中ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體的水平，特別在步驟 a)中測(cè)量ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體的水平時(shí)。
[0217] 本文所用的"健康群體"指的是由之前未被診斷為飲食障礙的對(duì)象構(gòu)成的群體。健 康群體的對(duì)象優(yōu)選地不另外地顯示飲食障礙的任何癥狀。換言之，如果由專業(yè)醫(yī)生檢查，這 樣的對(duì)象將被表征為健康并且沒(méi)有疾病癥狀。
[0218] 因此，"健康對(duì)象"指的是之前未被診斷為飲食障礙的對(duì)象。健康對(duì)象不另外地顯 示飲食障礙的任何癥狀。換言之，如果由專業(yè)醫(yī)生檢查，這樣的健康對(duì)象將被表征為健康并 且沒(méi)有疾病癥狀。
[0219] 優(yōu)選地，健康對(duì)象不顯示以上提及的任何飲食障礙。
[0220]在本發(fā)明的上下文中，可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法檢測(cè)ClpB蛋白抗 ClpB抗體的水平，例如通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定。
[0221] 特別地，例如，ClpB蛋白的水平通過(guò)免疫測(cè)定或免疫印跡或通過(guò)分析方法如質(zhì)譜 (MS)、毛細(xì)電泳-質(zhì)譜(CE-MS)、液相色譜偶聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS、LC-MS/MS)測(cè)量。
[0222] 根據(jù)本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)"免疫測(cè)定"包括競(jìng)爭(zhēng)、直接反應(yīng)或夾心型測(cè)定。這種測(cè)定 包括但不限于凝集測(cè)試、酶標(biāo)記和介導(dǎo)的免疫測(cè)定，例如ELISA，生物素/親和素型測(cè)試、放 射免疫測(cè)定、免疫電泳和免疫沉淀，更直接地涉及ELISA。
[0223] 質(zhì)譜(MS)、毛細(xì)電泳-質(zhì)譜(CE-MS)、液相色譜偶聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS、LC-MS/MS)均為本 領(lǐng)域技術(shù)人員公知的分析方法，并且適用于進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的方法。
[0224] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，通過(guò)對(duì)對(duì)象糞便中的ClpB DNA進(jìn)行定量來(lái)測(cè)量ClpB DNA水平，例如通過(guò)在以下實(shí)驗(yàn)部分在ClpB DNA測(cè)定下公開(kāi)的方法，或者如下方法:從細(xì)菌 菌株的培養(yǎng)物中提取并使用QIAampR DNA Stool Mini Kit(QIAGEN,France)從糞便純化 DNA。將細(xì)菌溶解在水中并在100°C下煮5分鐘，在11，00(^.?.111.下離心1分鐘后，將含有0嫩 的上清液儲(chǔ)存在 _20 °C。使用NCBI引物設(shè)計(jì)工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/ primer-blast/)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增編碼含有一個(gè)經(jīng)鑒定α-MSH樣表位的ClpB蛋白片段的180bp DNA 區(qū)域的以下核苷酸引物，正向5 ' -GCAGCTCGAAGGCAAAACTA-3 '（SEQ ID NO: 4)和反向：5'_ ACCGCTTCGTTCTGACCAAT-S'(SEQ ID NO :5)(Invitrogen Custom Primers,Cergy Ponto i se，F(xiàn)rance)。在具有MicroAmp管（Eppendorf，Hambourg，Germany)的熱循環(huán)儀中進(jìn)行 PCR。反應(yīng)在含有25μ1 Go TaqR Green Master Mix 2X(Promega，Madison，WI)、lyl (20pmol)各引物、21μ1雙蒸水和ΙμL細(xì)菌DNA的50μ1體積中進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件如下：94°C 3 分鐘，然后35個(gè)循環(huán)的94°C 30s，60°C 30s和72°C 1.5min。在1%瓊脂糖凝膠(Sigma)上可 視化PCR產(chǎn)物，具有預(yù)期的大小180bp，使用ClpB突變菌株確認(rèn)特異性。
[0225] 特別地，與ClpB反應(yīng)的抗體的水平使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)測(cè)量。
[0226] 通常，在通常的pH 9.6的100mM NaHC03緩沖液中使用例如100μΙ和2μg/ml濃度的 ClpB蛋白（Delphi Gene tics)包被通常的Maxi sorp平板(Nunc，Roches ter，NY)，通常在4 °C 下進(jìn)行72小時(shí)。用通常含有0.05 % Tween 200、pH 7.4的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)清洗平板例 如(5分鐘X 3)，然后用1:200的在PBS中稀釋的1 ΟΟμΙ小鼠或大鼠血漿孵育例如在4°C過(guò)夜以 確定游離抗體水平，或用1: 200的在通常的pH 8.9的解離3M NaCl，1.5M甘氨酸緩沖液中稀 釋的100μΙ小鼠或大鼠血漿孵育例如在4°C過(guò)夜以確定以確定總抗體水平。清洗平板(3x)并 用通常的1〇〇μ1堿性磷酸酶(AP)-綴合的山羊抗大鼠 IgG(l:2000)、抗大鼠 IgM(l:1000)、抗 小鼠 IgG(l :2000)或抗小鼠 IgM(l: 1000)(全部來(lái)自 Jackson Immu n oRe sear ch Laboratories，Inc.，West Grove，PA)孵育。清洗(3x)后，通常加入100μ1對(duì)硝基苯磷酸緩沖 液(Sigma)作為堿性磷酸酶底物。在通常的40分鐘室溫下孵育后，通過(guò)加入3Ν NaOH停止反 應(yīng)。使用通常的讀板器Metertech960(Metertech Inc ·，Taipei，Taiwan)典型地在405nm測(cè) 定〇D(光密度）。從樣品0D值中減去讀自未添加血漿樣品的空白0D值。每個(gè)測(cè)定通常一式兩 份地進(jìn)行。一式兩份的值之間的變化通常小于5%。
[0227] 典型地，使用類似的方案測(cè)量使用通常的相應(yīng)抗人IgG或IgM AP綴合的抗體通常 1:400稀釋的人血漿中的抗ClpB IgG和IgM抗體。
[0228] 優(yōu)選地，特別在使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定測(cè)量抗ClpB抗體的水平時(shí)，抗ClpB抗體的 參考值特別地以血漿中抗ClpB IgG的0D測(cè)量，并且0D值在0-3之間，優(yōu)選地在2.0-3.0之間 和/或在0.0-1.0之間。
[0229]優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，確定所測(cè)量的ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體的水平是否 高于(增加)或低于(降低)根據(jù)本發(fā)明的參考值。
[0230]本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，盡管在對(duì)照中抗ClpB IgG與幾種心理特性的正常范圍負(fù)相關(guān)， 在AN患者中，抗ClpB IgG與核心心理特性例如對(duì)身體不滿意和追求清瘦正相關(guān)。
[0231 ]因此，所述方法還可以包括步驟b2)，其中評(píng)估表征飲食障礙的心理特性。
[0232]在一個(gè)實(shí)施方案中，抗ClpB IgG的值相比于參考值增加指示存在飲食障礙，特別 在AN中。
[0233]在一個(gè)實(shí)施方案中，指示存在飲食障礙的心理特性是對(duì)身體不滿意和追求清瘦。 [0234]在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，抗ClpB IgG的值相比于參考值增加和/或在步驟b2)中 檢測(cè)到與飲食障礙相關(guān)的心理特性表明存在飲食障礙，特別是AN。
[0235] 評(píng)估與飲食障礙相關(guān)的"心理特性"的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
[0236] 在一個(gè)示例中，與飲食障礙相關(guān)的心理特性可以使用飲食障礙量表-2測(cè)定。
[0237] "飲食障礙量表(EDI)"是用于評(píng)估以下飲食障礙的存在與否的自報(bào)告調(diào)查問(wèn)卷， (a)限制性和暴食/清除型神經(jīng)性貪食癥；（b)神經(jīng)性厭食癥;和(c)其他未指出的飲食障礙 包括暴食癥(BED)。最初的調(diào)查問(wèn)卷由64個(gè)問(wèn)題組成，分為8個(gè)亞標(biāo)度。EDI-2是指1991年復(fù) 核的版本。
[0238] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明診斷方法的步驟c)涉及推斷對(duì)象是否患有飲食障礙， 其中抗ClpB抗體相比于參考值的升高優(yōu)選地指示存在飲食障礙。
[0239] 在另一實(shí)施方案中，檢測(cè)到步驟b2)中檢測(cè)的具有飲食障礙的心理特性指示存在 飲食障礙。
[0240]所述方法因此可以包括另一步驟預(yù)-c)，其確定相比于步驟a)中確定的抗ClpB IgG總水平，所述樣品中與α-MSH交叉反應(yīng)的抗ClpB IgG水平的比率。
[0241]與a-MSH交叉反應(yīng)的抗ClpB IgG水平的比率可以通過(guò)以下確定：例如通過(guò)用通常 的10_6Ma-MSH肽(Bachem)預(yù)孵育以1:400在PBS中稀釋的人血漿樣品例如在4 °C下過(guò)夜，之后 將樣品添加至通常的包被有ClpB蛋白（Delphi Genetics)的96孔Maxisorp平板(Nunc)。通 常地通過(guò)ELISA使用相應(yīng)的抗人AP綴合抗體(Jackson)檢測(cè)與ClpB反應(yīng)的IgG抗體。與a-MSH 交叉反應(yīng)的抗ClpB IgG的百分比可以相對(duì)于等于100%的在各個(gè)血漿樣品中無(wú)吸附的抗 ClpB IgG的水平計(jì)算。
[0242] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，相比于抗ClpB抗體總水平的與a-MSH交叉反應(yīng)的抗 ClpB IgG水平的比率比參考值升高指示存在進(jìn)食障礙。
[0243] 本發(fā)明還涉及治療對(duì)象的飲食障礙或者降低其發(fā)生的可能性的方法，所述方法包 括，對(duì)所述對(duì)象施用包含針對(duì)至少一種表達(dá)ClpB的細(xì)菌的至少一種抗生素的組合物，和/或 向所述對(duì)象施用包含不表達(dá)ClpB的益生菌的組合物，和/或其組合，其中所述對(duì)象通過(guò)以下 被診斷為患有進(jìn)食障礙：
[0244] a)測(cè)量來(lái)自所述對(duì)象的生物樣品中的ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體的水平；
[0245] b)將測(cè)量的所述ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體的水平與參考值相比較；以及
[0246] c)推斷所述對(duì)象是否患有飲食障礙。
[0247] 以上所提及的所有限定也適用于所述方法。
[0248]本發(fā)明還涉及將患有飲食障礙的對(duì)象選擇為對(duì)降低ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體水 平的治療有應(yīng)答可能性的體外方法，其包括：
[0249] a)測(cè)量來(lái)自所述對(duì)象的生物樣品中的ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體的水平；
[0250] b)將測(cè)量的所述ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體的水平與參考值相比較；以及
[0251] c)選擇用于降低ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體水平的治療的對(duì)象，其中所述降低 ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體水平的治療包括：向所述對(duì)象施用有效量的包含針對(duì)至少一種 表達(dá)ClpB的細(xì)菌的一種抗生素的組合物，和/或向所述對(duì)象施用有效量的包含不表達(dá)ClpB 的益生菌的組合物，和/或其組合。
[0252]在一個(gè)實(shí)施方案中，相比參考值具有升高的ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體值的對(duì)象 被選擇為對(duì)降低ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體水平的治療有應(yīng)答可能性。
[0253]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法因此可以包括步驟b2)，其中如上所述評(píng)估表征飲食 障礙的心理特性。
[0254]本發(fā)明的所述診斷方法的步驟c)涉及選擇用于降低ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體水 平的治療的對(duì)象，其中相比參考值具有升高的ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體值的對(duì)象被選擇 為對(duì)降低ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體水平的治療有應(yīng)答可能性。
[0255] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，相比參考值具有升高的ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體值 和/或在步驟b2)中檢測(cè)為具備與進(jìn)食障礙相關(guān)的心理特性的對(duì)象被選擇為對(duì)降低ClpB蛋 白和/或抗ClpB抗體水平的治療有應(yīng)答可能性。
[0256] 在一個(gè)實(shí)施方案中，指示存在進(jìn)食障礙的生理心理特性為對(duì)身體不滿意和追求清 瘦。
[0257] 此外，本發(fā)明人證實(shí)，在小鼠中長(zhǎng)期經(jīng)胃遞送E.coli減少食物攝取，本發(fā)明還涉及 用于治療或預(yù)防肥胖癥的包含過(guò)表達(dá)ClpB蛋白的益生菌的組合物。
[0258] "肥胖癥"在本文中指對(duì)象優(yōu)選地具有高于30的BMI的醫(yī)學(xué)病癥。
[0259] "過(guò)表達(dá)"是指由于以提高的量表達(dá)基因而人工表達(dá)蛋白，這里表達(dá)提高的基因編 碼ClpB蛋白。
[0260] 過(guò)表達(dá)ClpB蛋白的細(xì)菌可以通過(guò)技術(shù)人員已知的方法制備。這例如可以通過(guò)用表 達(dá)ClpB DNA的載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌來(lái)進(jìn)行。
[0261] 在一個(gè)實(shí)施方案中，過(guò)表達(dá)ClpB的細(xì)菌選自已知的人中的益生或共生非病原菌的 細(xì)菌，例如非病原性Escherichia coli。
[0262] "有效量"是指允許展現(xiàn)期望效果的細(xì)菌量。特別地，其意指10億到100億UFC.天4 的量。
[0263] 在本申請(qǐng)全文中，術(shù)語(yǔ)"包含"、"包括"應(yīng)被解釋為涵蓋所有具體提及的特征以及 任選的、額外的未具體指出的特征。本文所用的術(shù)語(yǔ)"包含"、"包括"的使用還公開(kāi)了其中不 存在除具體提及的特征外的特征的實(shí)施方案(g卩，"由……組成"）。
[0264] 現(xiàn)將參照以下附圖和實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
[0265] jy^lj
[0266] SEQ ID N0:1 顯示了NCBI參考號(hào)：NP_417083.1 和Uni-Prot收錄號(hào)P63284示出的來(lái) 自E.coli K12的伴侶蛋白ClpB的氨基酸序列。
[0267] SEQ ID N0:2顯示了SEQ ID NO: 1的來(lái)自E.coli K12的伴侶蛋白ClpB的氨基酸序 列的第542-548位氨基酸。
[0268] SEQ ID N0:3 顯示了 Gen Pept 序列 ID，PRF: 223274 示出的來(lái)自智人（Homo sapiens)的α-MSH的氨基酸序列。
[0269] SEQ ID N0:4顯示了核苷酸引物ClpB的核酸序列。
[0270] SEQ ID N0:5顯示了核苷酸引物ClpB的核酸序列。
[0271]
[0272] 圖l:E.coli K12蛋白與a-MSH之間分子模擬的蛋白質(zhì)組鑒定。
[0273] (a)E.coli細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)的2D GEjbw)用Rb抗a-MSH IgG檢測(cè)的E.coli蛋白的免 疫印跡，用a-MSH預(yù)吸附（c)或未預(yù)吸附(b)。被a-MSH IgG特異性識(shí)別的點(diǎn)用紅圈圈出，用于 蛋白質(zhì)鑒定。藍(lán)圈表示非特異性點(diǎn)。點(diǎn)1-4鑒定的蛋白質(zhì)為ClpB的同種型。（d)使用 Stretcher程序進(jìn)行a-MSH和ClpB的氨基酸序列比對(duì)。（e)用抗a-MSH IgG顯示的重組ClpB的 western印跡。泳道1和2分別為20yg和10yg ClpB。
[0274] 圖2.小鼠中的ClpB免疫。
[0275] 將ClpB免疫的小鼠（ClpB+Ad j)與接收佐劑(Ad j) JBS或?qū)φ眨–tr)的小鼠比較。 (a)在研究的32天期間的體重改變。在BioDAQ籠中在最后2周期間研究食物攝入和進(jìn)食模 式。在研究最后10天期間的平均日食物攝入(b)、餐食量（c)和進(jìn)餐數(shù)(cOJe)注射a-MSH (100yg kg-1體重，i .p.)或PBS后24小時(shí)期間的食物攝入。⑴用10-6Ma-MSH吸附前和吸附后 ClpB反應(yīng)性IgG的血漿水平。（g)作為解離平衡常數(shù)(KD值)顯示的抗ClpB IgG的親和力。（h) a-MSH反應(yīng)性總I gG的血漿水平。（i)抗a-MSH I gG的親和力(KD)。（ j)在用單獨(dú)的a-MSH或用 與從ClpB免疫或Adj注射的小鼠合并的IgG(0.5mg πιΓ1) -起進(jìn)行刺激后過(guò)表達(dá)MC4R的人胚 胎腎-293細(xì)胞的cAMP測(cè)定。（k)用耗盡抗a-MSH IgG的IgG進(jìn)行cAMP測(cè)定。（a)a-MSH注射（100 yg kg-1體重，i ·ρ·)前變異的雙向重復(fù)測(cè)量分析(AN0VA)，Ρ〇0·0001，Bonferroni事后檢驗(yàn)*a 至少，P〇0 · 05ClpB組相比于Ctr ;*b至少，P〇0 · 05Ad j組相比于Ctr · ;*c，P〇0 · 05，Student ' s t 檢驗(yàn)ClpB組相比于PBS;和*d，P〇0 · 05，Student ' s t檢驗(yàn)ClpB組相比于Ctr。（b)ANOVA P = Ο · 0002，Tukey ' S事后檢驗(yàn)林*P〇0 · 001，**P〇0 · 01，#P〇0 · 05，Student ' s t檢驗(yàn)。（c)ANOVA P = 0 · 007，Tukey ' s事后檢驗(yàn)林PoO · 01。（e)Student ' s t檢驗(yàn)，*P〇0 · 05。（f，g)ANOVA PoO · 0001， Tukey ' s事后檢驗(yàn) ***P〇0.001 ClpB+Ad j 相比于其他組，配對(duì)的 t檢驗(yàn) ##P〇0.01，###P〇0.001。 (h)ANOVA P = 0 · 0002，Tukey ' s事后檢驗(yàn)林*P〇0 · 001，*P〇0 · 05; (i )Kruskal-Wal 1 is檢驗(yàn)P = 0·003，Dunn's事后檢驗(yàn)**P〇0.01，（平均值土s·e.m.，11 = 8)。（]_)八從)\^\ P = 0·005，Tukey 's事 后檢驗(yàn)*P〇0·05;ANOVA P = 0·04，Student's t檢驗(yàn)#P〇0·05，aClpB相比于α-MSH,bClpB相比 于Adj(平均值土s.e.m. ;j,n = 6,k，n = 3)。
[0276] 圖3:小鼠中的E.coli補(bǔ)充。
[0277] 用E.coli K12野生型(WT)、ClpB缺陷（AClpB)E.coli K12或LB培養(yǎng)基對(duì)小鼠經(jīng)胃 每日管飼(第1-21天)對(duì)體重(a)、食物攝入(b)、餐食量(c)和進(jìn)餐數(shù)(d)的作用。（e)PCR檢測(cè) 細(xì)菌ClpB DNA的180堿基對(duì)片段，第一泳道，分子量標(biāo)記，第二泳道，來(lái)自E.coli K12WT體外 培養(yǎng)物的DNA，第三泳道，來(lái)自E.coli Κ12Δ ClpB的體外培養(yǎng)物的DNA，以及剩余泳道，在第 21天收集的來(lái)自小鼠糞便的DNA。用l(T6Ma-MSH吸附前和吸附后抗ClpB IgM(f)和IgG(g)的 以酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定中光強(qiáng)度的血漿水平。
[0278] 抗a-MSH IgM(h)和IgG(i)的血漿水平。（j)抗a-MSH IgG的親和力(平衡常數(shù)）。（&) 變異的雙向重復(fù)測(cè)量分析(AN0VA)，P = 0 ·3，Bonferroni事后檢驗(yàn)第2天廣P〇0.01對(duì)照(Ctr) 相比于E · co 1 i WT。（ b)AN0VA第 1 -2天，P = 0 · 0006，Tukey ' s事后檢驗(yàn)***P〇0 · 001，*P〇0 · 05， E·coli WT相比于aCtr和bLB。（c)Kruskal-Wallis(K-W)檢驗(yàn)第3周P = 0·0001，Dunn's事后 檢驗(yàn)，***?〇0.001，**卩〇0.013.。〇11耵相比于&(：讓，131^和〇&(：1?8。（(1從勵(lì)￥厶第1-2天，？= 0 · 006，Tukey ' s事后檢驗(yàn)**P〇0 · 01，*P〇0 · 05，K-W檢驗(yàn)第3周P〇0 · 0001，Dunn ' s事后檢驗(yàn)廣* Ρ〇0·001，**Ρ〇0·01，E.coli WT相比于aCtr，bLB和CAClpBjf^K-W檢驗(yàn)，吸附前Ρ = 0·02, Dunn's事后檢驗(yàn)*Ρ〇0·05,AN0VA吸附后,Ρ〇0·0001 ,Tukey's事后檢驗(yàn)**Ρ〇0·01 ,Ε·coli WT相 比于其他組。（g)AN0VA吸附前，P = 0.01，Tukey ' s事后檢驗(yàn)*P〇0.05，E. co 1 i WT相比于其他 組，配對(duì)的 t檢驗(yàn)##P〇0 · 01。（h) Student ' s t檢驗(yàn)，E · co 1 i WT相比于其他組*P〇0 · 05。（ j)K-W 檢驗(yàn)P = 0·02，Dunn's事后檢驗(yàn)*P〇0·05，Mann_Whitney檢驗(yàn)，#P〇0.05.(平均值土s.e.m.，n = 8)〇
[0279] 圖4:ED患者中的抗ClpB抗體。
[0280] 健康女性(對(duì)照，Ctr)和患有AN、BN和BED的患者中抗ClpB IgG (a)和IgM(b)的血漿 水平。用1 (T6Ma-MSH吸附前和吸附后ClpB IgG(c)和IgM(d)的血漿水平。α-MSH交叉反應(yīng)性抗 ClpB IgG(e)和IgM(f)的百分比。（b) Student ' s t檢驗(yàn) *P〇0.05。（c，d)配對(duì)t檢驗(yàn) *** PoO · 001，**P〇0 · 01。（e)Kruskal-Wal 1 is檢驗(yàn)PoO · 0001，Dunn ' s事后檢驗(yàn)，**P〇0 · 01，Mann-Whitney檢驗(yàn)#P〇0 · 05。（f)變異分析P = 0 · 02，Tukey ' s事后檢驗(yàn)*P〇0 · 05。（平均值土 s · e .m.， Ctr，n = 65，AN，n = 27BN，n = 32 以及BED，n = 14)。
[0281] 圖5:患有進(jìn)食障礙的患者和健康對(duì)照(Ctr)中細(xì)菌ClpB的血漿濃度。
[0282] AN，神經(jīng)性厭食癥;BN，神經(jīng)性貪食癥;BED，暴食癥。*p〈0，05平均ClpB濃度相比于 Ctr的Student ' s t檢驗(yàn)。具有高于對(duì)照的平均值+2標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)的ClpB濃度的患者的百分 比（％)。 實(shí)施例
[0283] 以下實(shí)施例證實(shí)，共生腸細(xì)菌E.Coli K12的ClpB伴侶蛋白是參與能量代謝和情緒 調(diào)節(jié)的一種神經(jīng)肽黑素細(xì)胞刺激激素（α-MSH)的構(gòu)象模擬物。本發(fā)明人還揭示了表達(dá) ClpB的腸細(xì)菌與通過(guò)產(chǎn)生與α-MSH交叉反應(yīng)的ClpB蛋白和抗ClpB抗體調(diào)節(jié)動(dòng)機(jī)性行為和情 緒之間的分子聯(lián)系。本發(fā)明人還證明，表達(dá)ClpB的微生物參與提高ClpB蛋白和ClpB抗體的 產(chǎn)生并建立異常喂食行為和情緒。
[0284] 實(shí)施例1
[0285] 材料和方法
[0286] E.Coli K12培養(yǎng)和蛋白質(zhì)提取
[0287] 在研究中使用的細(xì)菌菌株是E.Coli K12,其由法國(guó)魯昂大學(xué)的UMR6270CNRS實(shí)驗(yàn) 室提供。在37°C下在250ml Luria Bertani(LB)培養(yǎng)液（MP Biomedicals，lllkirch， France)中培養(yǎng)E.Coli K12 24小時(shí)。如Marti等（PLoS ONE 2011，e26030)所述進(jìn)行蛋白質(zhì) 提取。簡(jiǎn)言之，通過(guò)在4°C在4000g下離心30分鐘收獲細(xì)菌，將所得沉淀重懸在提取緩沖液 (300mM NaCl和20mM Tris-HCI，pH 8)中。通過(guò)超聲(3x 3min，在21%振幅脈沖開(kāi)Is關(guān)Is)破 壞懸液，并且在4°C在10000g下離心10分鐘?；厥丈锨逡翰⒃?0000g在4°C下超離心45分鐘 以進(jìn)一步將蛋白質(zhì)分離進(jìn)細(xì)胞質(zhì)（上清液)和包膜(沉淀）級(jí)分。使用2-D Quant試劑盒(GE Healthcare，Piscataway，NJ, USA)測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。
[0288] 二維聚丙烯酰胺凝膠電泳
[0289] 對(duì)于二維(2D)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，將400yg E.coli K12蛋白質(zhì)提取物添 加到等電聚焦緩沖液(7M尿素，2M硫脲和0.5%兩性電解質(zhì)，pH 4-7,20mM DTT，2mM TBP，2% CHAPS和0.005%溴酚藍(lán)），并在輕微搖晃下在室溫下溶解60分鐘。使用ReadyStrip IPG試條 (18cm,pH 4-7NL，Bio-Rad，Marnes-la-Coquette，F(xiàn)rance)進(jìn)行第一維凝膠分離。用等電聚 焦緩沖液被動(dòng)再水化試條24小時(shí)后，將蛋白質(zhì)樣品通過(guò)放置在距陰極1.5cm處的進(jìn)樣杯添 加到試條。用Ettan IPGphor 3系統(tǒng)(GE Healthcare，0rsay,France)以以下4個(gè)步驟進(jìn)行等 電聚焦（31 500Vh):500V lh，1000V梯度，10 000V梯度和 10 000V 2h。在分別用2%DTT和 2.5%碘乙酰胺進(jìn)行兩個(gè)平衡步驟后，在Ettan Daltsix垂直電泳系統(tǒng)(GE Healthcare)上 以每凝膠12mA進(jìn)行第二維，即SDS_PAGE(10%聚丙稀酰胺凝膠，20cm X 18-cm X 1mm)。在 SDS-PAGE后，在室溫下在2% (vol/vol)正磷酸和50% (vol/vol)甲醇中固定2D凝膠2小時(shí)。 然后用水清洗凝膠，通過(guò)CBB G-250(Bi〇-Rad)染色(34% (vol: vol)甲醇，17% (wt: vol)硫 酸銨，2%(￥〇1:￥〇1)正磷酸和0.668088 6-250/升)使蛋白質(zhì)點(diǎn)可視化。
[0290] 免疫印跡
[0291] 2D-PAGE之后，通過(guò)干轉(zhuǎn)方法(Trans Blot Cell, Bio-Rad, USA)和0.8mA. cm-2膜體 積的恒定電流經(jīng)2小時(shí)將E.coli細(xì)胞質(zhì)蛋白轉(zhuǎn)移到Hybond-ECL PVDF膜(GE Healthcare)。 轉(zhuǎn)移后，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS pH 8,和ΙδΟπιΜ.Γ^ια)和0.05 % (vol: vol)Tween 20中的5% (wt: vol)乳(1^8；113；[1:，？抑1106)封閉膜。清洗后，在4°0下用多克隆兔 抗α-MSH IgG( 1:1000，Peninsula Laboratories，San Carlos，CA,USA)孵育膜過(guò)夜，然后清 洗，用多克隆豬抗兔辣根過(guò)氧化物酶綴合的Ig(l: 3000;Dako，Trappes，F(xiàn)rance)孵育。通過(guò) ECL檢測(cè)系統(tǒng)(GE Healthcare)顯示免疫印跡，用通過(guò)使用灰度標(biāo)記(Kodak)預(yù)先校準(zhǔn)的 ImageScanner II(GE Healthcare)掃描，并用Labscan 6.00軟件（GE Healthcare)數(shù)字化。 在用 10-6Ma-MSH肽（Bachem AG，Bubendorf，Switzerland)吸附兔抗α-MSH IgG后在4°C下進(jìn) 行相同過(guò)程過(guò)夜。
[0292] 蛋白質(zhì)鑒定
[0293] 將感興趣的蛋白質(zhì)點(diǎn)使用Ettan Spot Picker(GE Healthcare)從CBB G-250染色 的2D凝膠切出，在Ettan Digester (GE Heal thcare)上進(jìn)行自動(dòng)化凝膠中蛋白質(zhì)消化。然后 將蛋白質(zhì)提取物重懸在1〇μ1 5%(vol :vol)乙腈/0. l%(vol :vol)甲酸中，然后用偶聯(lián)配備 有納米噴霧源和HPLC芯片塊界面的6340離子阱質(zhì)譜儀的納米-LC1200系統(tǒng)（Agilent Technologies，Courtaboeuf，F(xiàn)rance)進(jìn)行分析。簡(jiǎn)言之，在4〇-nl RPC18捕獲柱上對(duì)肽進(jìn)行 富集和脫鹽，在Zorbax(30_nm孔徑，5-μπι粒徑）C18柱（43mm長(zhǎng)X 75μηι內(nèi)徑；Agilent Technologies)上分離。使用400nl .min-1流速的9分鐘線性梯度（3-80%乙腈在0.1 %甲酸 中），在離子阱質(zhì)譜儀上分析洗脫物。對(duì)于蛋白質(zhì)之鑒定，提取MS/MS峰列表并使用MASCOT Daemon 2.2.2版本(Matrix Science)搜索引擎與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)相比較。使用以下具體參數(shù) 進(jìn)行搜索:酶特異性，胰蛋白酶;允許一個(gè)切割缺失;沒(méi)有固定的修飾;可變修飾，甲硫氨酸 氧化，半胱氨酸脲基甲基化，絲氨酸、酪氨酸和蘇氨酸磷酸化;單一同位素;肽電荷2+和3+; 前體離子的質(zhì)量耐受，1.5Da ;片段化的質(zhì)量耐受，0.6Da;ESI-TRAP作為儀器；分類學(xué)， E. col i ;國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)（NCBInr 20120531 ( 18280215序列， 6265275233殘基）；Bethesda，MD，USA)。如果蛋白質(zhì)命中滿足以下標(biāo)準(zhǔn)之一則自動(dòng)確認(rèn)：鑒 定有至少2個(gè)具有454的MASCOT評(píng)分(P〇0.01)的排名高的肽(紅粗體)或至少兩個(gè)具有447的 MASCOT評(píng)分(P〇0.05)的排名高的肽。為了評(píng)估假陽(yáng)性率，使用MASCOT的"假目標(biāo)"選項(xiàng)進(jìn)行 所有初始的數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。如果假陽(yáng)性率從未超過(guò)1%，則認(rèn)為結(jié)果相關(guān)。
[0294] 從0FFGEL鑒定蛋白質(zhì)
[0295] 使用0FFGEL pH3-10試劑盒（Agilent Technologies)在31000FFGEL分級(jí)器上將 E.Coli K12蛋白高分辨地分離成24個(gè)級(jí)分。根據(jù)Agilent快速入門(mén)指南中描述的實(shí)驗(yàn)方案 進(jìn)行蛋白質(zhì)樣品（400yg)制備和所有0FFGEL系統(tǒng)部件的組裝。使用標(biāo)準(zhǔn)程序0G24PR0采用最 大限量的電流參數(shù)(800〇ν，50μΑ和200mW)進(jìn)行0FFGEL分級(jí)，直至30小時(shí)后達(dá)到64KVh。在實(shí) 驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將所有級(jí)分轉(zhuǎn)移到0 · 8ml深孔(Thermo Fisher Scientif ic，11 lkirch，F(xiàn)rance) 并在-20 °C下儲(chǔ)存。如下研究從0FFGEL的中央部分回收的9個(gè)含蛋白質(zhì)的級(jí)分，使用兔抗a-MSH IgG(Peninsula Laboratories)進(jìn)行western印跡然后如上所述進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。
[0296] 小鼠中的免疫和行為
[0297] 根據(jù)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院指南和EU規(guī)范進(jìn)行所有實(shí)驗(yàn)流程，倫理學(xué)會(huì)委員會(huì)批準(zhǔn)了動(dòng) 物實(shí)驗(yàn)。使兩月齡雄性C57B16小鼠 （Janvier Laboratories，L'Arbresle，F(xiàn)rance)適應(yīng)動(dòng)物 設(shè)備1周，其中進(jìn)行12小時(shí)的明暗循環(huán)，在0700小時(shí)開(kāi)燈并且各被飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)小鼠籠(n = 8) 中。小鼠用標(biāo)準(zhǔn)顆粒鼠食(RM1飲食，SDS，UK)喂養(yǎng)并自由取食，飲用水不限量，每日通過(guò)輕柔 抓握進(jìn)行操作并測(cè)量體重。在適應(yīng)期間，將小鼠分配至1」4個(gè)籠中，以使每個(gè)籠具有相似的平 均體重/小鼠。在1周的適應(yīng)后，將每個(gè)籠的小鼠分配到4個(gè)實(shí)驗(yàn)組之一并接受以下處理：（i) 組1，ClpB免疫(n = 8) :ClpB蛋白（Delphi Genetics，Gosselies，Belgium)50yg/小鼠，在200 以11:1(>〇1:￥〇1)的？133與完全弗氏佐劑(3181]1&，31：]^〇1118，]/[0，1]3厶）中，腹膜內(nèi)（;[.口.） ；（;[;0 組2，佐劑注射對(duì)照(η = 8): 200μ1的PBS中的完全弗氏佐劑（1:1 (vo 1: vo 1)，i . p.); (i ii)組 3，PBS注射對(duì)照(η = 8): 200μ1 roS( i . p.);和（iv)組4，未處理對(duì)照(η = 8):未接受注射，然 后所有小鼠被返回其籠中。15天后，小鼠接受加強(qiáng)免疫和以下處理：（i)組l(n = 8)，ClpB蛋 白（Delphi Genetics)50yg/小鼠，200μ1 1: l(vol: vol)的PBS與不完全弗氏佐劑（Sigma) i.p. ;(ii)組2(η = 8):200μ1 的PBS中的不完全弗氏佐劑（l:l(vol:vol)，i.p.);(iiiHi3， (η = 8) :200μ1的roS(i.p.);和iv)組4,（n = 8):未接受注射。加強(qiáng)后第二天，將小鼠單獨(dú)放 置在BioDAQ小鼠籠（Research Diets，Inc ·，New Brunswick，NJ，USA)，每個(gè)籠配備有自動(dòng)喂 食監(jiān)控器。自由獲取食物(Serlab，Montataire France)和飲用水，并每天測(cè)量體重。在適應(yīng) BioDAQ籠3天后，小鼠接受以下處理:組1、2和3(各n = 8)(即分別已經(jīng)用ClpB免疫、被注射佐 劑和roS的小鼠）全部在1000小時(shí)時(shí)接受100μΙ PBS中l(wèi)OOyg.kg^1體重的α-MSH肽(Bachem AG)急性注射（i.p.)。對(duì)照小鼠 （n = 8)僅接受PBS(i.p.)。持續(xù)監(jiān)控喂食數(shù)據(jù)并使用BioDAQ data viewer 2.3.07(Research Diets)進(jìn)行分析。對(duì)于餐食模式分析，餐食間間隔被設(shè)置 為300s。
[0298] 在喂食研究后，將小鼠置于各個(gè)自由獲取食物和水的小鼠籠，在接連2天中進(jìn)行的 〇-迷宮(Med Associate, Inc.，St Albans, VT，USA)測(cè)試中分析自主運(yùn)動(dòng)和焦慮。在0-迷宮 測(cè)試2小時(shí)后，通過(guò)截端機(jī)斷頭處死小鼠并將軀干血收集到含EDTA的管中。通過(guò)在4°C下在 350(^.?.111.(1.48)離心10分鐘分離血漿，并在測(cè)定前在-80°(：儲(chǔ)存。
[0299] 自主運(yùn)動(dòng)和焦慮測(cè)試
[0300] 在BioDAQ籠中的喂食研究后，使用Versamax動(dòng)物運(yùn)動(dòng)監(jiān)測(cè)器（AccuScan Instruments，Inc.，Columbus，0H，USA)分析小鼠的自主運(yùn)動(dòng)。自主運(yùn)動(dòng)測(cè)試后的第二天，在 升高的〇-迷宮中檢測(cè)所有小鼠的焦慮。升高的〇-迷宮是更常見(jiàn)的被藥理學(xué)驗(yàn)證用于嚙齒動(dòng) 物的焦慮測(cè)試的升高十字形迷宮的變形。〇-迷宮的優(yōu)勢(shì)是其沒(méi)有傳統(tǒng)十字形迷宮的界限模 糊的中央廣場(chǎng)。〇-迷宮由在地面之上升高了 80cm的圓形紅外線平臺(tái)（外直徑120cm)組成，具 有由灰色塑料制成的兩個(gè)開(kāi)放區(qū)段和兩個(gè)封閉區(qū)段。封閉區(qū)段由延伸到高于迷宮表面20cm 的墻封閉，并用黑色的紅外線膠質(zhì)玻璃蓋覆蓋。通過(guò)將小鼠置于兩個(gè)封閉區(qū)段之一來(lái)起始 每個(gè)測(cè)試。測(cè)試持續(xù)5分鐘，用放置在0-迷宮上方的錄像機(jī)和EthoVision錄像追蹤軟件 (Noldus IT,Wageningen,The Netherlands)記錄。分析在開(kāi)放和封閉區(qū)段中測(cè)量的行走的 距離和花費(fèi)的時(shí)間。在每次小鼠測(cè)試之間，用30 %乙醇清潔0-迷宮。
[0301] ClpB和α-MSH自身抗體測(cè)定
[0302] 根據(jù)公開(kāi)的實(shí)驗(yàn)流程(Fetissov SO.，Methods Biol Mol 2011)使用酶聯(lián)免疫吸 附測(cè)定測(cè)量與ClpB、a_MSH和促腎上腺皮質(zhì)激素反應(yīng)的自身抗體的血漿水平。簡(jiǎn)言之，在4°C 下在pH 9.6的100mM NaHC03緩沖液中使用100μ1和2μg/ml濃度的ClpB蛋白（Delphi Genetics)、a-MSH或促腎上腺皮質(zhì)激素 （Bachem AG)包被96孔Maxisorp平板（Nunc， Rochester，NY，USA) 72小時(shí)。用pH 7.4的PBS 中0.05 % Tween 200清洗平板(5分鐘3次），然后 用在PBS中1:200稀釋的100μ1小鼠血漿孵育在4 °C過(guò)夜以確定游離自身抗體水平，或用在pH 8.9的解離3M NaCl和1.5M甘氨酸緩沖液中1:200稀釋的100μ1小鼠血漿以確定總自身抗體 水平。清洗平板(3次)并用100μ1堿性磷酸酶(ΑΡ)-綴合的山羊抗小鼠 IgG(l:2000)或抗小鼠 IgM(l: 1000)(全部來(lái)自 Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. (West Grove, PA)) 孵育。清洗(3次）后，加入lOOyl對(duì)硝基苯磷酸緩沖液(Sigma)作為AP底物。在40分鐘室溫下 孵育后，通過(guò)加入3N NaOH停止反應(yīng)。使用讀板器Metertech 960(Metertech Inc.，Taipei, Taiwan)在405nm測(cè)定光密度。從樣品0D值中減去讀自未添加血漿樣品的空白光密度值。每 個(gè)測(cè)定一式兩份地進(jìn)行。一式兩份的值之間的變化小于5%。使用相應(yīng)抗人IgG或IgM AP綴 合的抗體（1:2000 Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc ·)米用類似的方案測(cè)量人 血漿(1:400)中的抗ClpB IgG和IgM。
[0303] 用α-MSH吸附ClpB抗體
[0304] 通過(guò)用10-6Ma-MSH肽(Bachem AG)預(yù)孵育以1:400在roS中稀釋的人血漿樣品或以 1:200在PBS中稀釋的小鼠血漿樣品在4°C下過(guò)夜，之后將樣品添加至包被有ClpB蛋白 (Delphi Genetics)的96孔Maxisorp平板(Nunc)。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定使用相應(yīng)的抗小 鼠或抗人AP綴合抗體（Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)如上所述檢測(cè)與 ClpB反應(yīng)的IgG和IgM抗體。與α-MSH交叉反應(yīng)的抗ClpB抗體的百分比可以相對(duì)于等于100% 的在各個(gè)血漿樣品中無(wú)吸附的抗ClpB抗體的水平計(jì)算。
[0305] 從血漿純化IgG
[0306]根據(jù)公開(kāi)的實(shí)驗(yàn)流程（Legrand等，Protoc Exch 2014, doi :10. 1038/ protex2014.004)進(jìn)行IgG純化和親和測(cè)定。通過(guò)血衆(zhòng)酸化和在C18SEP柱（Phoenix Pharmaceutical s，Burl ingame，CA，USA)上分離進(jìn)行血衆(zhòng)球蛋白的提取，然后將500μ1小鼠 血漿與500μ1緩沖液A (水中的1 %三氟乙酸)混合。通過(guò)在lml緩沖液Β (60 %乙腈在1 %三氟 乙酸中）中在7〇〇r.p.m.下離心3分鐘并用3ml緩沖液A洗滌3次來(lái)活化柱。將稀釋的血漿(緩 沖液A中1:1)添加到柱中，并保存(在-20°C下冷凍)流出液（1ml)用于進(jìn)一步純化IgG。使用 Melon凝膠試劑盒(Thermo Fisher Scientific，Rockford，IL,USA)從小鼠血衆(zhòng)樣品的流出 液中純化總IgG。在試劑盒的純化緩沖液中以1:4稀釋血漿流出液，并添加到在柱中沉積的 經(jīng)洗滌me Ion凝膠。在6000r. p. m.旋轉(zhuǎn)柱1分鐘，保留含有IgG的流出液并保存在-20 °C，然后 凍干。將凍干的IgG在HBS-EP緩沖液(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)中重構(gòu)。對(duì)于環(huán) 狀單磷酸腺苷(cAMP)實(shí)驗(yàn)，將從ClpB和從佐劑對(duì)照組的8只小鼠中純化的IgG分別合并成兩 種合并物，并將其分成兩部分。直接在cAMP測(cè)定中使用一部分，使用包被在經(jīng)活化 UltraLink珠(Pierce，Rockford，IL,USA)上的a-MSH(Bachem AG)的親和色譜進(jìn)一步純化另 一部分。保存耗盡α-MSH IgG的IgG流出液，凍干并在PBS中稀釋。
[0307]親和動(dòng)力學(xué)測(cè)定
[0308] 在BIAcore 1000儀器(GE Healthcare)上通過(guò)基于表面等離子共振現(xiàn)象的生物特 異性相互作用分析來(lái)測(cè)定小鼠 IgG對(duì)ClpB和α-MSH的親和動(dòng)力學(xué)。a-MSH(Bachem AG)或ClpB 蛋白（Delphi Genetics)在pH 5.0的10mM乙酸鈉緩沖液（GE Healthcare)中被稀釋至 O.Smg.mr1，通過(guò)使用胺偶聯(lián)試劑盒(GE Healthcare)將其共價(jià)偶聯(lián)到感應(yīng)器芯片CM5(GE Healthcare)。在相同的α-MSH或ClpB包被芯片上進(jìn)行所有測(cè)量。對(duì)于親和動(dòng)力學(xué)分析，使用 各IgG樣品的5種連續(xù)稀釋物來(lái)進(jìn)行多循環(huán)方法:3360，1680，840，420和210(nmol)，其中包 括一式兩份的840nmo 1和空白樣品（僅HBS-EP緩沖液）。每個(gè)循環(huán)包括在25 °C下2分鐘的分析 物注射和5分鐘的解離，流速為βΟμΙ.π?ιΓ1。
[0309] 在各樣品注射之間，用10mM NaOH再生結(jié)合表面，使得感應(yīng)譜具有相同的基線水 平。使用BiaEvaluation 4.1 · 1程序(GE Healthcare)分析親和動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。對(duì)于擬合動(dòng)力 學(xué)數(shù)據(jù)，使用Langmuir's 1:1模型，通過(guò)減去空白值來(lái)校正樣品值。
[0310] 體外cAMP測(cè)定
[0311]使用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)產(chǎn)生的表達(dá)人MC4R的人胚胎腎-293細(xì)胞的穩(wěn)定細(xì)胞系購(gòu)自 Amsbio (Oxon，UK)。在Amsbio和我們自己的實(shí)驗(yàn)室中通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR驗(yàn)證了轉(zhuǎn)染細(xì)胞中MC4R mRNA的高表達(dá)。通過(guò)在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白來(lái)在每次實(shí)驗(yàn)前確認(rèn)細(xì)胞中轉(zhuǎn)基 因的存在，所述綠色熒光蛋白基因用MC4R慢病毒載體插入在相同細(xì)胞中但在不同的啟動(dòng)子 下。將〇-]\^胡太（83(*6111厶6)在誘導(dǎo)緩沖液（？85,50(^厘181?，10(^厘1?0 20-1724(5丨8111&)， 20mM MgC12)中稀釋到終濃度分別為2、1、750、500、250、100、75、50和1011]\1，分別對(duì)應(yīng)于0.6、 3、4.5、6、15、30、45、60和120?111〇1的€[-]\〇1劑量，還包括了一個(gè)空白樣品。在解凍后，在25〇1111 組織培養(yǎng)燒瓶(BD-Falcon,Beckton-Dickinson，Bedford，MA,USA)中在補(bǔ)充有（2mM L-谷氛 酰胺，10%胎牛血清，〇. ImM非必需氨基酸和1 %青霉素-鏈霉素）的Dulbecco ' s經(jīng)修改Eagle 培養(yǎng)基4 · 5g · Γ1 葡萄糖(Eurobio，Courtaboeuf，F(xiàn)rance)中，在37°C，5%C〇2下在加濕細(xì)胞培 養(yǎng)孵育器中培養(yǎng)細(xì)胞8-10天。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，用0.25%胰蛋白酶-EDTA(Sigma-Aldrich)處理 培養(yǎng)的MC4R人胚胎腎-293細(xì)胞，將細(xì)胞沉淀重懸在未經(jīng)處理的生物發(fā)光白96微孔板(Nunc， Roskilde，Denmark)PBS中以獲得5000細(xì)胞/孔（10μ1)。使用生物發(fā)光測(cè)定cAMP-Glo Max測(cè) 定試劑盒(Promega，Madi son，WI，USA)根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)測(cè)量cAMP產(chǎn)生。簡(jiǎn)言之，用不同 濃度的單獨(dú)的α-MSH肽或α-MSH和來(lái)自ClpB免疫或佐劑對(duì)照組的小鼠 IgG合并物(在臨加入 a-MSH之前加入)在室溫下孵育細(xì)胞15分鐘。在相同的微孔板中測(cè)定cAMP標(biāo)準(zhǔn)品（由試劑盒 提供）的系列稀釋物。將cAMP檢測(cè)溶液添加到每個(gè)孔，然后通過(guò)攪拌均化細(xì)胞，在 1000r. p .m.離心2分鐘，然后在23 °C下孵育20分鐘。在每孔中添加 Kinase-Glo試劑底物，在 23°C下孵育10分鐘后，用生物發(fā)光儀(Safas Spectrometer，Monaco)讀出生物發(fā)光。在獨(dú)立 的孔中進(jìn)行每個(gè)稀釋的三個(gè)測(cè)試，并且在分別的兩天進(jìn)行重復(fù)，使得在使用天然IgG時(shí)cAMP 活化曲線的每個(gè)點(diǎn)n = 6。在從抗α-MSH IgG級(jí)分耗盡天然IgG后，如上所述用各α-MSH濃度和 IgG進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)。
[0312] 小鼠中的E.coli管飼
[0313] 使1月齡的雄性C57B16小鼠 （Janvier Laboratories)適應(yīng)動(dòng)物設(shè)備1周，并且如上 所述喂養(yǎng)。將小鼠分配到如下4個(gè)組(每組n = 8)中，（i)用lOSE.coli K12細(xì)菌管飼；（ii)用 108ClpB缺陷E.coli K12細(xì)菌管飼；（iii)僅用LB培養(yǎng)基管飼;和（iv)未接受任何處理的對(duì) 照。在Bernd Bukau的實(shí)驗(yàn)室（ZMBH，海德堡大學(xué)，海德堡，德國(guó)）產(chǎn)生ClpB突變菌株，Axel Mogk博士善意提供了相應(yīng)的野生型（11'^.〇 〇1丨細(xì)菌。將小鼠單獨(dú)放置在^〇040籠 (Research Diets)中并且每天在開(kāi)始暗階段之前經(jīng)胃管飼具有或不具有細(xì)菌的0.5ml培養(yǎng) 基，持續(xù)21天。管飼后，通過(guò)斷頭法殺死小鼠并將軀干血液收集到含EDTA的管中。通過(guò)在4°C 在3500r. p.m. (1.4g)離心10分鐘分離血漿，并在測(cè)定前儲(chǔ)存在-80°C?？笴lpB和抗α-MSH IgG和IgM的血漿水平如上所述測(cè)定。
[0314] ClpB DNA測(cè)定
[0315] 從WT和ClpB突變菌株的培養(yǎng)物中提取DNA并使用QIAampR DNA Stool Mini Kit (QIAGEN，F(xiàn)rance)從小鼠糞便純化DNA。將細(xì)菌溶解在水中并在100°C下煮5分鐘，在11， OOOr.p.m.下離心1分鐘后，將含有DNA的上清液儲(chǔ)存在-20°C。使用NCBI引物設(shè)計(jì)工具 (http://www.ncbi .nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)，我們?cè)O(shè)計(jì)了擴(kuò)增編碼含有一個(gè) 經(jīng)鑒定α-MSH樣表位的ClpB蛋白片段的180bp DNA區(qū)域的以下核苷酸引物（圖le)，正向5'_ GCAGCTCGAAGGCAAAACTA-3'（SEQ ID N0:4)和反向：5'-ACCGCTTCGTTCTGACCAAT-3'（SEQ ID NO: 5) (Invitrogen Custom Primers ,Cergy Pontoise，F(xiàn)rance) 〇在具有MicroAmp管 (Eppendorf，Hambourg,Germany)的熱循環(huán)儀中進(jìn)行PCR。反應(yīng)在含有25μ1 Go Taq Green Master Mix 2X(Promega)、lyl(20pmol)各引物、21μ1 雙蒸水和ΙμL細(xì)菌DNA的50μ1 體積中進(jìn) 行。PCR條件如下：94°C 3分鐘，然后35個(gè)循環(huán)的94°C 30s，60°C 30s和72°C 1.5min。在1% 瓊脂糖凝膠(Sigma)上可視化PCR產(chǎn)物，具有預(yù)期大小180bp，使用ClpB突變菌株確認(rèn)了特異 性。
[0316]細(xì)菌ClpB蛋白的血衆(zhòng)濃度
[0317]根據(jù)以下實(shí)驗(yàn)流程使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)測(cè)量細(xì)菌ClpB的血漿濃度。在4 。(:下在pH 9.6的100mM NaHC03緩沖液中使用100μΙ和2μg/ml濃度的兔多克隆抗ClpB IgG (從Delphi Genetics (Gossel ies，Belgium)定制生產(chǎn)）包被96孔Maxisorp平板（Nunc， 尺〇(^68七61階)24小時(shí)。用?!17.4的磷酸鹽緩沖鹽水(？83)中0.05%了￥6611 200清洗平板(5 分鐘3次）。將作為標(biāo)準(zhǔn)的從Delphi Genetics定制生產(chǎn)的重組ClpB蛋白在相同的緩沖液 (卩83，疊氮化鈉0.02%，？!17.4)中系列稀釋為5、10、25、50、70、100和150?]\1，并一式兩份添 加到孔中。將來(lái)自患有進(jìn)食障礙的患者和健康對(duì)照（1:25在樣品緩沖液中）的血漿樣品一式 兩份添加到剩余孔中，在室溫(RT)下孵育ClpB標(biāo)準(zhǔn)和血漿樣品2小時(shí)。用具有0.05%Tween 200的pH 7.4的PBS清洗板(5分鐘3次）。將從Delphi Genetics定制生產(chǎn)并且經(jīng)預(yù)篩選與α-MSH沒(méi)有交叉反應(yīng)性的小鼠單克隆抗ClpB IgG(l :500在樣品緩沖液中）添加到孔中，在室溫 下孵育90分鐘。用具有0 · 05 % Tween 200的pH 7 · 4的PBS清洗板(5分鐘3次）。將來(lái)自Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc · (West Grove，PA)的喊性磷酸酶綴合的山羊抗小鼠 IgG(l:2000在樣品緩沖液中）添加到孔中，在RT下孵育90分鐘。用具有0.05%Tween 200的 pH 7.4的roS清洗板(5分鐘3次），然后加入100μ1對(duì)硝基苯磷酸緩沖液（Sigma，St.Louis， M0)作為堿性磷酸酶的底物。在40分鐘室溫下孵育后，通過(guò)加入3N NaOH停止反應(yīng)。使用讀板 器Metertech 960(Metertech Inc.，Taipei，Taiwan)在405nm測(cè)定光密度（0D)。從樣品0D值 中減去讀自未添加血漿樣品或ClpB蛋白標(biāo)準(zhǔn)稀釋液的平板的空白0D值?；贑lpB標(biāo)準(zhǔn)曲線 的0D計(jì)算ClpB的血漿濃度并根據(jù)血漿稀釋度調(diào)整。
[0318]統(tǒng)計(jì)分析
[0319] 使用GraphPad Prism 5.02(GraphPad Software Inc.，San Diego,CA,USA)分析 數(shù)據(jù)和作圖。通過(guò)Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)評(píng)估正態(tài)性。根據(jù)正態(tài)性結(jié)果，通過(guò)變異分析或 無(wú)參數(shù)Kruskal-Walli檢驗(yàn)和分別的Tukey's或Dunn's事后檢驗(yàn)分析組的差異。使用雙向重 復(fù)測(cè)量變異分析和Bonferroni事后檢驗(yàn)分析體重變化。根據(jù)正態(tài)性結(jié)果，使用Student's t 檢驗(yàn)或Mann-Whitney檢驗(yàn)比較各個(gè)組。使用成對(duì)t檢驗(yàn)分析ClpB抗體吸附α-MSH的效果。根 據(jù)變量的正態(tài)性計(jì)算Pearson' s或Spearman' s相關(guān)系數(shù)。使用非線性回歸擬合（（log(α-MSH)相對(duì)于歸一化cAMP應(yīng)答）分析cAMP產(chǎn)生，方程為Y=10(V(l + 10(LogEC50-X)x Hi 1 lSlope。以平均值土 s. e.m.顯示數(shù)據(jù)，對(duì)于所有檢驗(yàn)，認(rèn)為P〇0.05具有統(tǒng)計(jì)顯著性。
[0320] 題
[0321] 細(xì)菌α-MSH模擬物的蛋白質(zhì)組鑒定
[0322]為了鑒定分子模擬a-MSH的細(xì)菌蛋白質(zhì)，開(kāi)發(fā)了基于蛋白質(zhì)組技術(shù)的研究策略。從 E. co 1 i K12培養(yǎng)物提取總蛋白，通過(guò)2D凝膠電泳（圖la)解析細(xì)胞質(zhì)級(jí)分，并轉(zhuǎn)移到聚二氟 乙烯膜。為了增加在細(xì)菌蛋白中檢測(cè)多個(gè)α-MSH樣表位的可能性，用多克隆抗α-MSH IgG檢 測(cè)膜。發(fā)現(xiàn)了 13個(gè)免疫陽(yáng)性蛋白質(zhì)點(diǎn)（圖lb )，其中在用l(T6Ma-MSH預(yù)吸附抗體后點(diǎn)1-8消失 (圖lc)，證實(shí)了特異性a-MSH模擬表位。使用質(zhì)譜，將顯示最強(qiáng)a-MSH樣染色的蛋白質(zhì)點(diǎn)1、2、 3和4鑒定為名為ClpB的熱休克蛋白的同種型，其為857個(gè)氨基酸的蛋白，857氨基酸蛋白質(zhì) 解聚伴侶或ClpB，Mff 95526(分子量:95526Da,登錄號(hào):NP_417083.1，SEQ ID N0:1)。染色強(qiáng) 度較低的α-MSH樣點(diǎn)5-8(最高M(jìn)ASCOT評(píng)分分別為880、877、874和800)是548個(gè)氨基酸的蛋白 伴侶素 GroEL(分子量:57293Da;登錄號(hào):YP_001732912.1)。還使用了E.coli蛋白質(zhì)分離的 替代性策略，使用0FFGEL分級(jí)器然后進(jìn)行一維凝膠電泳和用預(yù)吸附或未預(yù)吸附α-MSH的抗 α-MSH IgG進(jìn)行western印跡(數(shù)據(jù)未顯示）。一條帶被抗α-MSH IgG特異性識(shí)別，發(fā)現(xiàn)其含有 ClpB蛋白（最高M(jìn)ASCOT評(píng)分1065)?；谶@些結(jié)果，ClpB被選擇為進(jìn)一步驗(yàn)證其對(duì)a-MSH的分 子模擬的目標(biāo)蛋白。為了分析a-MSH和細(xì)菌ClpB之間的氨基酸序列同源性，在使用 Needleman-Wunsch算法（http: //www. ebi · ac .uk/Tools/emboss/)的Emboss Stretcher程 序中比對(duì)兩條序列。該比對(duì)揭示了與α-MSH顯示不連續(xù)的5個(gè)氨基酸的序列同源性的ClpB蛋 白位點(diǎn)（圖Id)。該推定α-MSH樣表位位于ClpB蛋白結(jié)構(gòu)的螺旋間環(huán)上，暗示其暴露于蛋白質(zhì) 表面，即，對(duì)于自身抗體的結(jié)合是可及的。使用抗α-MSH IgG測(cè)定的重組ClpB蛋白的western 印跡顯示了96kDa的條帶（圖le)，證實(shí)了ClpB蛋白含有a-MSH樣表位。這些結(jié)果證明了根據(jù) 分子模擬的概念存在至少連續(xù)5個(gè)氨基酸的序列同源性不是細(xì)菌蛋白被與神經(jīng)肽交叉反應(yīng) 的IgG識(shí)別的必需條件。
[0323]用ClpB免疫小鼠
[0324]為了研究E.coli ClpB是否可以誘導(dǎo)與a-MSH交叉反應(yīng)的自身抗體從而影響喂食 和焦慮，用重組細(xì)菌ClpB蛋白免疫小鼠。接受ClpB與佐劑或單獨(dú)的佐劑的小鼠在注射后幾 天顯示較低體重（圖2a)。但是，4周之后，ClpB免疫的小鼠相對(duì)于對(duì)照具有更高的體重（+ 5%)(圖2a)。在ClpB免疫的小鼠中，相較于其他組在試驗(yàn)的最后10天期間測(cè)量的平均日食 物攝入也更高(+13%)(圖2b)。食物攝入的該增加是由于餐食量的增加（圖2c)，因?yàn)橛貌蛿?shù) 沒(méi)有改變（圖2d)，這表明ClpB免疫干擾飽腹感而非饑餓機(jī)制。這與α-MSH誘導(dǎo)飽腹感的已知 作用相符合。為了進(jìn)一步確認(rèn)ClpB免疫與a-MSH厭食作用的相關(guān)性，使小鼠接受i.p.注射的 a-MSH。在接下來(lái)的24小時(shí)中，ClpB免疫小鼠的食物攝入和體重沒(méi)有被影響（圖2e)，表明它 們對(duì)于施用的在未免疫小鼠中存在的a-MSH的厭食作用不敏感。在喂食試驗(yàn)后，在開(kāi)放場(chǎng)和 〇-迷宮測(cè)試中研究了小鼠的主動(dòng)運(yùn)動(dòng)和焦慮。在試驗(yàn)組之間在開(kāi)放區(qū)域相比于邊緣區(qū)域的 總主動(dòng)運(yùn)動(dòng)和花費(fèi)的時(shí)間沒(méi)有顯著區(qū)別(數(shù)據(jù)未顯示）。然而，在0-迷宮的封閉臂中，ClpB免 疫小鼠相比于對(duì)象移動(dòng)了更短距離(數(shù)據(jù)未顯示），與所有其他組相比花了更短的時(shí)間（數(shù) 據(jù)未顯示），這表明焦慮的降低。為了證實(shí)免疫效果，測(cè)定了抗ClpB的血漿水平，測(cè)量了其親 和力。在ClpB免疫的小鼠中，發(fā)現(xiàn)抗ClpB IgG水平（圖2f)的很大升高且具有較低親和力（圖 2g)，這與最近的IgG誘導(dǎo)相符合。還在ClpB免疫小鼠中發(fā)現(xiàn)了a-MSH反應(yīng)性IgG的血漿水平 提高（圖2h);這些IgG也被類似地表征為與對(duì)照相比對(duì)a-MSH親和力較低（圖2i)。用a-MSH吸 附小鼠血衆(zhòng)顯著地降低了抗ClpB IgG的血衆(zhòng)水平，證實(shí)抗ClpB IgG的一部分但非全部與a-MSH有交叉反應(yīng)性（圖Sfha-MSH IgM自身抗體的血漿水平在組之間沒(méi)有顯著差異(數(shù)據(jù)未 顯示）。還分析了 ClpB免疫是否可以誘導(dǎo)與腎上腺皮質(zhì)激素(含有a-MSH序列的39個(gè)氨基酸 的肽)交叉反應(yīng)的自身抗體。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)血漿腎上腺皮質(zhì)激素反應(yīng)性IgG的顯著差別(數(shù)據(jù)未 顯示），證明ClpB和a-MSH之間的構(gòu)象模擬的選擇性。
[0325]小鼠 IgG對(duì)MC4R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用
[0326]為了確定ClpB免疫誘導(dǎo)的a-MSH交叉反應(yīng)性IgG對(duì)MC4R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，研究了其 在表達(dá)MC4R的細(xì)胞中對(duì)α-MSH誘導(dǎo)的cAMP產(chǎn)生的作用。與單獨(dú)α-MSH或用來(lái)自佐劑注射小鼠 的IgG預(yù)孵育的α-MSH相比，用來(lái)自ClpB免疫小鼠的IgG預(yù)孵育α-MSH時(shí)發(fā)現(xiàn)cAMP濃度更低。 在兩個(gè)最高的a-MSH濃度有8-10%的降低（圖2j)。在從合并的IgG中耗盡a-MSH反應(yīng)性IgG 后，來(lái)自ClpB免疫小鼠的剩余IgG沒(méi)有對(duì)a-MSH誘導(dǎo)的cAMP釋放顯示任何作用（圖2k)，表明 ClpB免疫小鼠中的抗a-MSH交叉反應(yīng)性IgG負(fù)責(zé)降低響應(yīng)于a-MSH的cAMP產(chǎn)生。從而，MC4R激 活和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的降低可導(dǎo)致在ClpB免疫小鼠中觀察到的增加的食物攝入和降低的焦慮。
[0327] 在小鼠中經(jīng)胃遞送E.coli
[0328] 為了測(cè)試E. col i是否可以誘導(dǎo)針對(duì)ClpB蛋白的免疫原性應(yīng)答并導(dǎo)致產(chǎn)生與a-MSH 交叉反應(yīng)的抗ClpB自身抗體，在3周期間通過(guò)經(jīng)胃管飼每日給予小鼠 WT和Δ ClpB E.coli K12菌株。另一組小鼠僅用細(xì)菌培養(yǎng)基管飼，對(duì)照組沒(méi)有接受任何處理。在管飼的第一天，接 受WT E.coli的小鼠中體重和食物攝入降低，然后逐漸回升至對(duì)照水平（圖3a和b)。同樣，在 管飼的最后一周，在接受E.coli WT的小鼠中喂食模式受到影響，顯示餐食量的降低和進(jìn)餐 數(shù)的增加（圖3c和d)。顯著地，接受△ ClpB E.coli的小鼠在體重增加、食物攝入或喂食模式 方面在任何時(shí)間點(diǎn)均未與對(duì)照有顯著差異。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了細(xì)菌ClpB特異性參與了 E.coli 感染后宿主食物攝入的急性降低以及喂食模式的長(zhǎng)期調(diào)節(jié)。意料到的是，在接受E.coli WT 的小鼠糞便中C1 p B D ΝΑ更多，盡管在一些對(duì)照小鼠中也檢測(cè)到了低水平的C1 p B D ΝΑ (圖 3e)。在3周的管飼后，抗ClpB IgM和IgG的血漿水平在接受Ε. coli WT的小鼠中相比于對(duì)照 和Δ ClpB E. coli組升高（圖3f和g)。用α-MSH吸收血漿降低了E. co 1 i WT管飼小鼠中的抗 ClpB IgG水平（圖3g)，表明存在與a-MSH交叉反應(yīng)的抗ClpB IgG。有趣的是，IgM類的抗ClpB 自身抗體的血漿水平在用a-MSH吸收后升高，表明a-MSH引起與在E.coli WT管飼小鼠中升 高的ClpB交叉反應(yīng)的a-MSH IgM免疫復(fù)合體的解聚（圖3f)。與所有其他組相比，抗a-MSH IgM的血漿水平也被E. coli WT遞送提高（圖3h)，而抗a-MSH反應(yīng)性IgG僅稍有提高而沒(méi)有達(dá) 至很著（圖3i)。但是，E.coli管飼小鼠中a-MSH IgG的親和動(dòng)力學(xué)分析顯示了較低的解離平 衡常數(shù)值（圖3j)，結(jié)合或解離率沒(méi)有顯著改變(數(shù)據(jù)未顯示）。包括IgM類別a-MSH反應(yīng)性自 身抗體的水平升高在內(nèi)的這些改變可能反映針對(duì)ClpB的如同新抗原的免疫應(yīng)答。實(shí)際上， 沒(méi)有接受E.coli WT的小鼠糞便中ClpB DNA的水平低或不能檢測(cè)暗示表達(dá)ClpB的微生物在 所研究小鼠中不是主要的腸共生物。因此，ClpB免疫小鼠顯示水平增加的低親和力抗a-MSH IgG與餐食量增加和體重增加，與其不同，E.coli管飼小鼠顯示親和力增加的抗a-MSH反應(yīng) 性IgM和IgG二者的產(chǎn)生增加以及餐食量和體重降低。
[0329] ED患者中的抗ClpB抗體
[0330]由于確認(rèn)了E.coli ClpB蛋白刺激a-MSH交叉反應(yīng)性自身抗體產(chǎn)生的能力，然后通 過(guò)研究患有AN、BN或BED的患者中的抗ClpB抗體來(lái)確定細(xì)菌ClpB與ED的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)抗ClpB IgG和IgM二者在ED患者以及健康對(duì)象的血漿中容易檢測(cè)到，其平均水平?jīng)]有顯著差異（圖 4a和b)。然而，在所有研究組中差異很大，這表明遭遇ClpB樣抗原的個(gè)人史不同。為了確認(rèn) 人抗ClpB抗體是否類似地與α-MSH交叉反應(yīng)，用l(T 6Ma-MSH吸附血漿樣品，導(dǎo)致在所有研究 組中抗ClpB IgG和IgM的可檢測(cè)水平顯著下降（圖4c和d)。此外，相對(duì)于健康對(duì)照，a-MSH交 叉反應(yīng)性抗ClpB IgG的相對(duì)水平在所有三組ED患者中增加，特別是BN和BED(圖4e)。相比于 BN，在AN中發(fā)現(xiàn)了升高水平的a-MSH交叉反應(yīng)性抗ClpB IgM(圖4f)。為了進(jìn)一步確定抗ClpB IgG和IgM與ED的相關(guān)性，研究了其血漿水平是否可與ED患者和對(duì)照中通過(guò)EDI-2測(cè)量的行 為特性相關(guān)。發(fā)現(xiàn)在對(duì)照中，ClpB IgG與幾種心理特性的正常范圍反相關(guān)，但在AN患者中， ClpB IgG水平與核心精神病理學(xué)特性正相關(guān)，例如對(duì)身體不滿意和追求清瘦(表1)。此外， 在AN和BED患者中，EDI-2亞標(biāo)度評(píng)分與ClpB IgM以相反的方式相關(guān)，在AN中反在BED中正 (表1)。然而，在BED患者中，ClpB IgM水平與年齡反相關(guān)，提示最高抗ClpB IgM水平與疾病 的急性形式相關(guān)。值得注意的是，在AN患者中發(fā)現(xiàn)的ClpB IgG或IgM與追求清瘦或不信任他 人之間的聯(lián)系非常類似在之前的研究中在不同的AN患者組中發(fā)現(xiàn)的相同心理特性與a-MSH 反應(yīng)性I gG或I gM之間的聯(lián)系。
[0331] 表1.通過(guò)飲食障礙量表-2測(cè)定的飲食障礙患者和對(duì)照(Contr.)的心理特性和抗 ClpB IgG和IgM血衆(zhòng)水平之間的顯著關(guān)聯(lián)。所有Spearman's r*p〈0.05，**p〈0.01，除了對(duì)于 完美主義Pearson's r*p〈0.05(n = 65Contr·，n = 27AN,和n = 14BED)〇
[0332]
(BED)
[0333] 細(xì)菌ClpB蛋白的血漿濃度
[0334] 在所有研究對(duì)象的血漿樣品中檢測(cè)的ClpB蛋白為10pM至180pM，在健康對(duì)照中平 均水平約30pM。在患有飲食障礙的患者的所有組中ClpB的平均血漿水平顯著升高，包括AN、 BN和BED(參見(jiàn)圖5)。通過(guò)采用等于或超過(guò)2標(biāo)準(zhǔn)偏差的診斷相關(guān)濃度改變的通常標(biāo)準(zhǔn)， 21.7%的AN、32%的BN和25%的BED患者顯示升高的血漿ClpB水平。
[0335] 結(jié)論
[0336] 這些結(jié)果揭示了表達(dá)ClpB的腸細(xì)菌通過(guò)產(chǎn)生ClpB蛋白和與α-MSH交叉反應(yīng)的抗 ClpB抗體與有動(dòng)機(jī)行為和情緒的調(diào)節(jié)之間有分子聯(lián)系。其證明腸微生物群的特定改變可導(dǎo) 致如在ED患者中觀察到的行為和情緒異常。ED患者中ClpB蛋白和與a-MSH交叉反應(yīng)的抗 ClpB IgG的水平升高和抗ClpB抗體與患者精神病理學(xué)特性的相關(guān)性的發(fā)現(xiàn)證明了表達(dá) ClpB的微生物參與提高ClpB抗體產(chǎn)生和建立異常喂食行為和情緒。
[0337] 總之，所述結(jié)果將ClpB鑒定為導(dǎo)致與ED患者的精神病理學(xué)特性相關(guān)的與a-MSH交 叉反應(yīng)的自身抗體的起源的蛋白，從而將表達(dá)ClpB的微生物鑒定為診斷和治療ED的新特異 性靶標(biāo)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于治療或預(yù)防飲食障礙的組合物，其包含針對(duì)至少一種表達(dá)ClpB蛋白的細(xì)菌 的至少一種抗生素。2. -種調(diào)節(jié)對(duì)象的食欲的非治療方法，其包括，向所述對(duì)象施用有效量的組合物，所述 組合物包含針對(duì)至少一種表達(dá)ClpB蛋白的細(xì)菌的至少一種抗生素。3. -種治療對(duì)象的飲食障礙或者降低其發(fā)生的可能性的方法，所述方法包括，對(duì)有此 需要的對(duì)象施用組合物，所述組合物包含針對(duì)至少一種表達(dá)ClpB的細(xì)菌的至少一種抗生 素。4. 一種用于治療或預(yù)防飲食障礙的組合物，其包含不表達(dá)ClpB蛋白的益生菌。5. -種調(diào)節(jié)對(duì)象的食欲的非治療方法，其包括，向所述對(duì)象施用有效量的組合物，所述 組合物包含不表達(dá)ClpB蛋白的益生菌。6. -種作為疫苗或免疫原性組合物使用的組合物，其包含ClpB蛋白。7. 根據(jù)權(quán)利要求5使用的組合物，其用于針對(duì)飲食障礙進(jìn)行免疫。8. 根據(jù)權(quán)利要求5或6使用的組合物，其用于預(yù)防飲食障礙。9. 一種用于診斷對(duì)象的飲食障礙的體外方法，所述方法包括： a) 測(cè)量來(lái)自所述對(duì)象的生物樣品中的ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體的水平； b) 將測(cè)量的所述ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體的水平與參考值相比較；以及 c) 推斷所述對(duì)象是否患有飲食障礙。10. -種將患有飲食障礙的對(duì)象選擇為對(duì)降低ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體水平的治療 有應(yīng)答可能性的體外方法，其包括： a) 測(cè)量來(lái)自所述對(duì)象的生物樣品中的ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體的水平； b) 將測(cè)量的所述ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體的水平與參考值相比較；以及 c) 選擇用于降低ClpB蛋白和/或抗ClpB抗體水平的治療的對(duì)象，其中所述降低ClpB蛋 白和/或抗ClpB抗體水平的治療包括：向所述對(duì)象施用有效量的包含針對(duì)至少一種表達(dá) ClpB的細(xì)菌的一種抗生素的組合物，和/或向所述對(duì)象施用有效量的包含不表達(dá)ClpB的益 生菌的組合物，和/或其組合。11. 根據(jù)權(quán)利要求9至10中任一項(xiàng)的體外方法，其中步驟a)中ClpB蛋白的水平通過(guò)定量 所述對(duì)象的糞便中的ClpB DNA來(lái)測(cè)量。12. 根據(jù)權(quán)利要求1、4或6至8中任一項(xiàng)使用的組合物，根據(jù)權(quán)利要求2或5的非治療方法 或者根據(jù)權(quán)利要求9至10中任一項(xiàng)的體外方法，其中所述飲食障礙選自由以下組成的組:神 經(jīng)性厭食癥(AN)、神經(jīng)性貪食癥(BN)、暴食癥(BED)、過(guò)度飲食、食欲過(guò)剩、消耗性疾病例如 惡病質(zhì)。13. -種用于治療或預(yù)防肥胖癥的組合物，其包含過(guò)表達(dá)ClpB蛋白的益生菌。
【文檔編號(hào)】A61K31/00GK106061491SQ201480066463
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2014年12月4日
【發(fā)明人】謝爾蓋·費(fèi)特蘇, 艾曼紐樂(lè)·德, 納歐·特諾尼, 喬納森·布里頓, 菲利普·陳-特池-松, 皮埃爾·德徹樂(lè)特, 羅曼·勒格朗
【申請(qǐng)人】國(guó)家醫(yī)療保健研究所, 魯昂大學(xué)醫(yī)療中心, 魯昂大學(xué)