一種檸檬苦素類化合物在制備血管保護(hù)的藥物中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檸檬苦素類化合物在制備血管保護(hù)藥物中的應(yīng)用，屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種檸檬苦素類化合物及含其的藥物組合物在制備血管保護(hù)藥物中的應(yīng)用。該應(yīng)用中的化合物為首次報(bào)道，是一種結(jié)構(gòu)新穎的檸檬苦素類化合物，可以從干燥的陳皮中提取、分離純化得到。體外試驗(yàn)證明該化合物具有清除自由基和活性氧的抗氧化特性，對H2O2氧化損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，可以用來開發(fā)成血管保護(hù)的藥物。
【專利說明】
一種檸檬苦素類化合物在制備血管保護(hù)的藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從干燥的陳皮中分離得到的一種檸檬苦素類 化合物在制備血管保護(hù)的藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 血管疾病，主要指動脈粥樣硬化、炎癥性血管疾病、功能性血管疾病、血管的真性 腫瘤性疾病等。其中以動脈粥樣硬化最為常見。心腦血管疾病是一種嚴(yán)重威脅人類，特別是 50歲以上中老年人健康的常見病，具有高患病率、高致殘率和高死亡率的特點(diǎn)，即使應(yīng)用目 前最先進(jìn)、完善的治療手段，仍可有50%以上的腦血管意外幸存者生活不能完全自理，全世 界每年死于心腦血管疾病的人數(shù)高達(dá)1500萬人，居各種死因首位。
[0003] 陳皮是蕓香科植物橘(Citrus reticulata Blaneo)及其栽培變種的干燥成熟果 皮。采摘成熟果實(shí)，剝?nèi)」?，曬干或低溫干燥。味苦、辛，性溫，具有理氣健脾、燥濕化痰?用，用于脘腹脹滿，食少吐瀉，咳嗽痰多。藥材分為"陳皮"和"廣陳皮"。一般來說，陳皮果皮 常剝成數(shù)瓣，基部相連或呈不規(guī)則碎片。外表面橙黃色或紅棕色，有細(xì)皺紋及凹下的點(diǎn)狀油 室；內(nèi)表面黃白色，粗糙呈海綿狀，附黃白色或黃棕色筋絡(luò)狀維管束，質(zhì)稍硬而脆，氣香，味 辛而微苦。而廣陳皮果皮則多剖成3至4瓣，基部相連，形狀整齊有序，厚度約1毫米。點(diǎn)狀油 室較大，對光照視透明清晰，質(zhì)較柔軟。但是不管是陳皮還是廣陳皮都以片大、色鮮、油潤、 質(zhì)軟、香氣濃、味甜苦辛者為佳。主產(chǎn)于廣東、福建、四川、江蘇、浙江、江西、湖南等地。
[0004] 陳皮主要含有揮發(fā)油、黃酮類、有機(jī)胺類及微量元素等成分。陳皮含揮發(fā)油約占 2%~4%，主要成分為梓檬苦素和梓檬醛。
[0005] 現(xiàn)代藥理學(xué)表明陳皮在心血管、胃腸道、呼吸道、內(nèi)分泌、抗癌、抗衰老、養(yǎng)顏美容、 營養(yǎng)補(bǔ)虛方面具有很好作用，這為陳皮深度開發(fā)提供廣闊前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種從干燥的陳皮中分離得到的一種檸檬苦素類化合物及 其藥物組合物在制備血管保護(hù)的藥物中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：
[0008] -種檸檬苦素類化合物在制備血管保護(hù)的藥物中的應(yīng)用，其特征在于，具有下述 結(jié)構(gòu)式的化合物(I):
[0009]
[0010] 上述應(yīng)用中的所述化合物(I)從陳皮中提取獲得，具體包含以下操作步驟：
[0011] (a)將干燥的陳皮粉碎，用70~80%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味， 依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物 和正丁醇萃取物；
[0012] (b)步驟（a)中正丁醇取物用大孔樹脂除雜，先用5%乙醇洗脫6個(gè)柱體積，再用 70 %乙醇洗脫8個(gè)柱體積，收集70 %洗脫液，減壓濃縮得70 %乙醇洗脫濃縮物；
[0013] (C)步驟(b)中70 %乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為50:1、30:1、 15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組分；
[0014] (d)步驟(C)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為8:1、5:1和2:1的二 氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；
[0015] (e)步驟（d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為 70 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~12個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物 (1)〇
[0016] 進(jìn)一步地，步驟(a)中，用75%乙醇熱回流提取，合并提取液。
[0017]進(jìn)一步地，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。
[0018] -種藥物組合物在制備血管保護(hù)的藥物中的應(yīng)用，其中含有治療有效量的上述化 合物(I)和藥學(xué)上可接受的載體。
[0019] 該藥物組合物含有治療有效量的本發(fā)明化合物（I)，其余為藥物學(xué)上可接受的、對 人和動物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
[0020] 所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料 以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明藥物可 通過口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時(shí)，可將其制成片劑、緩釋片、控 釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等;用于注射時(shí)，可制成滅菌的 水性或油性溶液、無菌粉針、脂質(zhì)體或乳劑等。
[0021 ]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有益效果體現(xiàn)在：
[0022]本發(fā)明的應(yīng)用，可以有效地起到血管保護(hù)的作用，體外試驗(yàn)證明上述化合物具有 清除自由基和活性氧的抗氧化特性，對H2O2氧化損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，可以用來 開發(fā)成血管保護(hù)的藥物
【附圖說明】
[0023] 圖1為化合物(I)結(jié)構(gòu)式；
[0024] 圖2為化合物（I)計(jì)算E⑶和實(shí)驗(yàn)E⑶圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對 本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
[0026] 主要材料、試劑來源及儀器類型：
[0027]乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購自上海凌峰化學(xué)試劑有限 公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。
[0028]實(shí)施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0029] (a)將干燥的陳皮(8kg)粉碎，用75 %乙醇熱回流提取(30L X 3次），合并提取液，濃 縮至無醇味(6L)，依次用石油醚(6L X 3次）、乙酸乙酯（6L X 3次)和水飽和的正丁醇(6L X 3 次）萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物（375g)和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中 乙酸乙酯萃取物用AB-8大孔樹脂除雜，先用5%乙醇洗脫6個(gè)柱體積，再用70%乙醇洗脫8個(gè) 柱體積，收集70 %洗脫液，減壓濃縮得70 %乙醇洗脫濃縮物（I 29g);(c)步驟(b)中70 %乙醇 洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為50:1 (8個(gè)柱體積）、30:1 (8個(gè)柱體積）、15:1 (8 個(gè)柱體積)和5:1(10個(gè)柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得至1」4個(gè)組分；（d)步驟(c)中組分 4(27g)用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為8:1(8個(gè)柱體積）、5:1(10個(gè)柱體積)和2:1 (8個(gè)柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2(15g)用十八烷 基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為70 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~12個(gè) 柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)(38mg)。
[0030] 結(jié)構(gòu)確證：白色無定形粉末;HR-ESMS顯示[Μ+Na]+為m/z 553.2402，結(jié)合核磁特 征可得分子式為C29H38O9，不飽和度為11。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δΗ(ρρηι，DMS0_d6，500MHz):H-I (4.03，t，J = 5.7)，H-2(2.76，dd，J=14.9,5.7)，H-2(2.61，dd，J=14.9,5.7)，H-5(2.54， dd，J = 7.5,3.6)，H-6(2.39，m)，H-9(3.29，d，J = 8.7)，H-ll(4.26，t，J = 8.7)，H-12(5.38， d，J = 8.7)，H-15(3.78，s)，H-16(1.71，m)，H-16(2.15，dd，J=14.0,7.4)，H-17(2.90，dd，J =10.8,7.4)，H-18(0.80，s)，H-19(0.97，s)，H-21(7.03，s)，H-22(6.07，s)，H-23(7.23，s)， H-28(0.91，s)，H-29(1.02，s)，H-30(5.21，s)，H-30(5.22，s)，7-0CH3(3.63，s)，12-0Ac (I · 79，s);核磁共振碳譜數(shù)據(jù)Sc(ppm，DMS〇-d6，125MHz): 82 · I (CH，1-C)，39 · 5(CH2，2-C)， 212.8(C，3-C)，48.0(C，4-C)，48.7(CH，5-C)，31.2(CH2,6-C)，174.1(C，7-C)，138.2(C，8-C)，56.0(CH，9-C)，48.1(C，10-C)，80.1(CH，11-C)，76.2(CH，12-C)，44.5(C，13-C)，71.4(C， 14-C)，58.9(CH，15-C)，33.7(CH2，16-C)，37.7(CH，17-C)，14.1(CH3，18-C)，17.9(CH 3，19-C)，122.6(C，20-C)，140.1(CH，21-C)，111.1(CH，22-C)，142.3(CH，23-C)，25.2(CH 3,28-C)， 20.8(CH3,29-C)，119.1(CH2,30-C)，52.2(CH3,7-0CH3)，170.7(C，12-0Ac)，21.1(CH 3，12-OAc);碳原子標(biāo)記參見圖1。紅外光譜表明該化合物含有羥基(3442CHT1)和羰基（173801^) 基團(tuán)。 13C NMR譜和DEPT譜顯示有29碳信號，其中包括六個(gè)甲基，四個(gè)亞甲基（一個(gè)烯烴亞甲 基），十個(gè)次甲基(三個(gè)烯烴碳，四個(gè)含氧碳），以及九個(gè)季碳(兩個(gè)烯烴碳，三個(gè)羰基碳，一個(gè) 含氧季碳）。此外，該化合物含有一個(gè)β單取代呋喃環(huán)[叱122.6(C-20)，140.1(C-21)，111. 1 (C-22)和 142.3(023)]，根據(jù) HMBC 譜中 H-17(δH2·90，dd，J=10·8,7·4Hz)與C-20，C-21和C-22的相關(guān)性，可推斷呋喃環(huán)位于C-17位上。通過核磁數(shù)據(jù)分析可知該化合物是一個(gè)B環(huán)開環(huán) 的檸檬苦素類化合物。C-1(SC82.1)和C-11(SC80.1)之間通過氧原子相連組成一個(gè)五元環(huán)。 HMBC 譜中Me-19(SH0.97，s)與〇1，!1-1(5!14.03，^ = 5.7!^)與(：-11的相關(guān)性，以及1!1-1!1 COSY 譜中 H-I 與 H2-2(SH2.76，dd，J=14.9,5.7Hz;2.61，dd，J=14.9,5.7Hz)，H-ll(SH4.26， ^ = 8.7抱）與!1-120!15.38，(1，1 = 8.7抱）的交叉峰表明1，11-環(huán)氧環(huán)的存在。腿8(：譜中，!1-1，]^-28〇!10.91，8)和]\^-29(5!11.02,8)與(：-3(50212.8)的相關(guān)性表明(：-3為酮羰基。腿8〇 譜中，!1-120!15.38，(1，1 = 8.7抱）與乙酰羰基0(：17〇.7)的相關(guān)性，表明(：-120〇76.2)位連 有一個(gè)乙酰氧基。ROESY譜中，Me-19與Me-29和H-12,以及H-12與H-17相關(guān)性表明它們?yōu)棣?構(gòu)型。此外，Η-9與Η-11，Η-9與Η-5，Η-5與Me-28以及H-Il與Me-18的交叉峰表明它們均為的 α_構(gòu)型。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和ROESY譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定 該化合物如圖1所示，立體構(gòu)型進(jìn)一步通過ECD試驗(yàn)確定，理論值與實(shí)驗(yàn)值基本一致(圖2)。 [0031]實(shí)施例2:化合物(I)藥理作用試驗(yàn) [00 32] -、材料和儀器
[0033]血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECV-304)由山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫教研室饋贈。化合物（I)自制，制 備方法見實(shí)施例1，HPLC歸一化純度大于98 %。RPMI-1640干粉培養(yǎng)基、胰蛋白酶購于美國 Gibeo公司。胎牛血清購于天津TBD公司。ΜΤΤ、瓊脂糖、AnnexinV-FITC購于美國Sigma公司。 0)!1、10^、500、65!?^測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所。0150購于中國醫(yī)藥(集團(tuán)） 上?；瘜W(xué)試劑有限公司。蘇木素購于福州邁新生物技術(shù)有限公司。Rhodamine 123購于美國 Solarbic公司。陽性藥川考嗪購自上海源葉生物科技有限公司。
[0034] 倒置光學(xué)顯微鏡（日本OlymPus公司），二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Forma Scientific公 司），電子分析天平(ER-182A型）（日本A&D公司），超凈工作臺（ZHJH-1209型）（上海智城分析 儀器制造有限公司），流式細(xì)胞儀(FACS Vantage型）（美國Beeton Diehnson公司），恒溫振 蕩器（江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠），1420Vietor3多標(biāo)記分析儀（美國PerkinElmer Lifescience公司），721型可見紫外光柵分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)有限公司），電熱恒溫水 浴箱(上海醫(yī)療儀器三廠生產(chǎn)），酶聯(lián)免疫檢測儀(MK3 Multiskan)(上海Thermo Labsystem 分析儀器公司）。
[0035]二、試驗(yàn)方法 [0036] 1、細(xì)胞培養(yǎng)
[0037] ECV-304細(xì)胞以RPMI-1640培養(yǎng)基于37°C，5%⑶2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。鏡下觀察，待 細(xì)胞匯合率達(dá)到70%以上時(shí)用胰蛋白酶消化傳代，以生長穩(wěn)定的第3-5代細(xì)胞制備細(xì)胞懸 液。
[0038] 2、細(xì)胞分組及處理
[0039]取生長良好的ECV-304細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種于96孔、24孔、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板或培 養(yǎng)皿中，37°C，5%CO2培養(yǎng)24h。隨機(jī)分為六組:①正常組;②H2O2模型組（150ymol/L);③川芎 嗪（TMP)(50ymol/L)+H 2〇2 組；④化合物（1)(1(^111〇1/1)+!1202組；?化合物（1)(5(^111〇1/1) + 出02組；?化合物（I) (I OOymo I /L) +H2O2 組。
[0040] 3、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目及檢測指標(biāo)
[0041] 3.1 MTT法檢測細(xì)胞活力
[0042] 將生長良好的ECV-304細(xì)胞制備成5 X IO4AiL的細(xì)胞懸液，按每孔IOOyL接種于96 孔板，置37°C，5%C02孵育24h。細(xì)胞分組及處理上。繼續(xù)培養(yǎng)6h和12h后，每孔加入IOyL MTT 溶液(終濃度0.5mg/L)置37 °C，5 % CO2培養(yǎng)箱孵育4h后，每孔加入IOOyL DMSO，靜置IOmin后 振蕩60s，30min內(nèi)置酶聯(lián)免疫檢測儀上檢測570nm處吸光度值(OD570)。
[0043] 按公式：細(xì)胞損傷抑制率=(用藥組OD57Q-模型組0D57Q)A正常組OD57Q-模型組 OD570) X 100%，計(jì)算細(xì)胞損傷抑制率。
[0044] 3.2LDR釋放率測定
[0045] 取生長良好的ECV-304細(xì)胞制成I X IO5AiL的細(xì)胞懸液接種于24孔板，置37°C，5% CO2孵育24h。細(xì)胞分組及處理同上。繼續(xù)培養(yǎng)6h和12h，收集培養(yǎng)上清液。PBS洗滌2次后，每 孔加入〇.5mL細(xì)胞裂解液（150mmol/L NaCl，150mmol/L Tris-HCI，lmmol/L EDTA，1 % TritonX-100)，于4°C靜置15min后振蕩數(shù)分鐘，10000rpm，4°C離心10min收集細(xì)胞裂解液， 參照LDH試劑盒說明書分別測定上清液和細(xì)胞裂解液中的LDH活性。
[0046] 按公式:LDH釋放率=上清液中LDH活性/(上清液中LDH活性+細(xì)胞裂解液中LDH活 性）' X 100 %，計(jì)算LDH釋放率。
[0047] 3 · 3酶生化法測定MDA含量、SOD活力、GSH-Px活力
[0048] 取生長良好的ECV-304細(xì)胞制成I X IO5AiL的細(xì)胞懸液接種于24孔板，置37°C，5% CO2孵育24h。細(xì)胞分組及處理同上。繼續(xù)培養(yǎng)12h，收集培養(yǎng)上清液。按MDA、SOD、GSH-Px檢測 試劑盒說明書測定細(xì)胞MDA含量、SOD活力、GSH-Px活力。
[0049] 4、數(shù)據(jù)處理
[0050] Microsoft Excel自帶的統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以:??表示，組間差異用t 檢驗(yàn)。
[0051 ]三、結(jié)果及結(jié)論
[0052] 1、化合物（I)對H20^iECV-304細(xì)胞生存率的影響
[0053]正常活細(xì)胞線粒體能量代謝過程中產(chǎn)生琥珀酸脫氫酶，可將淡黃色MTT還原成不 溶于水的藍(lán)紫色的甲臘結(jié)晶，結(jié)晶數(shù)量與活細(xì)胞數(shù)成正比。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:ECV-304細(xì)胞 經(jīng)H2〇 2(15〇ym〇l/L)氧化損傷6h和12h后，細(xì)胞OD值明顯降低且與正常組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義(P〈0.01)，表明細(xì)胞活力下降。而化合物（I)對細(xì)胞具有保護(hù)作用，能顯著抑制H 2O2對細(xì)胞 的氧化損傷，提高存活率。作用6h，50、100μ mol/L化合物（I)對細(xì)胞損傷抑制率分別為 16.67%(?〈0.05)和28.21%(?〈0.01)。作用1211，10、50、10(^111〇1/1化合物（1)對細(xì)胞損傷抑 制率提高為24 · 85% (P〈0 · 05)，29 · 64% (P〈0 · 01)和38 · 47 % (P〈0 · 01)。見表1 (#P〈0 · Olvs Normal;#P〈0.05，#P〈0.01vs 出02區(qū)『〇即；~〈0.05，^^〈0.01丫8 TMP group，下同）〇 [0054] 2、化合物（I)對H2O2損傷ECV-304細(xì)胞LDH釋放率的影響
[0055]乳酸脫氫酶能催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸與2,4-二硝基苯肼反應(yīng)生成丙酮酸二 硝基苯腙，在堿性溶液中呈棕紅色，通過比色測定反應(yīng)產(chǎn)物可間接求出乳酸脫氫酶活力。結(jié) 果表明：與正常組相比，模型組ECV-304細(xì)胞LDH釋放率顯著增高(？〈0.01)。與模型組比，化 合物（I)各組細(xì)胞LDH釋放率均減少：10、50、100μπιο 1/L化合物（I)作用6h，細(xì)胞的LDH釋放率 降為 20.54%(?〈0.01)和21.22%(卩〈0.01);50、10(^111〇1/1化合物（1)作用1211，細(xì)胞的0)!1釋 放率降為33.64% (P〈0.01)和29.53% (P〈0.01)?；衔铮↖)隨濃度的增加，對氧化損傷ECV-304細(xì)胞的保護(hù)作用也逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。結(jié)果見表2。
[0056] 3、化合物（I)對H2O2損傷ECV-304細(xì)胞MDA含量、SOD、GSH-Px活力的影響
[0057] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與正常組比模型組ECV-304細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量顯著增高（P〈 〇. 01)。與模型組相比，10、50、100μ mol/L化合物（I)組細(xì)胞MDA生成量均明顯減少，分別為 3.00±0.79nmol/mL(P〈0.05)，2.86±0.75nmol/mL(P〈0.05WP2.69±0.45nmol/mL(P〈 〇. 01)?；衔铮↖)各濃度組組間對照顯示，隨濃度的增加，化合物（I)對ECV-304細(xì)胞脂質(zhì)過 氧化損傷的保護(hù)作用也逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。結(jié)果見表3。
[0058] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與正常組相比，模型組ECV-304細(xì)胞SOD活性顯著降低(P〈0.01)。與 模型組相比，50、100μ mol/L化合物（I)均可增強(qiáng)ECV-304細(xì)胞的SOD活性，SOD活性分別提高 為 17.9±1.341]/111以？〈0.05)和19.25±0.811]/111以？〈0.01)。且隨濃度的增加，細(xì)胞的500活 性也逐漸提高，表明化合物（I)可增強(qiáng)ECV-304細(xì)胞的抗氧自由作用，具一定量效關(guān)系；10μ mol/L化合物（I)雖也可提高SOD活性，但不具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。
[0059] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與正常組相比，模型組ECV-304細(xì)胞培養(yǎng)液中GSH-Px活性顯著降低 (P〈0.01)。與模型組相比，10、50、100μ mol/L化合物（I)組細(xì)胞GSH-Px活性均顯著提高，分別 為 73.8±10.31]/111以？〈0.05)，92.2±8.51]/111以？〈0.01)和102.5±10.31]/111以？〈0.01)。且隨 化合物（I)濃度的增加，ECV-304細(xì)胞的GSH-Px活性也逐漸提高，表明細(xì)胞抗氧化作用的能 力也逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。結(jié)果見表3。
[0060]總結(jié):本實(shí)驗(yàn)采用H2O2作為外源性自由基生成系統(tǒng)，能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECV-304) 氧化應(yīng)激損傷 ，促進(jìn)細(xì)胞凋亡 。通過 MTT法和 LDH 活性檢測證實(shí)化合物 （I )對出02 氧化損 傷細(xì)胞具有保護(hù)作用；通過細(xì)胞上清液MDA含量、SOD活性、GSH-Px活性的測定，證實(shí)化合物 (I)有清除自由基和活性氧的抗氧化特性。
[0061 ] 表1化合物（I)對H20；^iECV-304細(xì)胞生存率的影響(文土 :s,n = 8)
[0063] 表2化合物（I)對H202損傷ECV-304細(xì)胞LDH釋放率的影響(X 土 s，η = 8)
[0065] 表3化合物（I)對H2O2損傷ECV-304細(xì)胞MDA含量、SOD、GSH-Px活力的影響(X土 s，n = 8)
[0067] 實(shí)施例3
[0068] 片劑的制備:按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬 酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為1:7的 比例加入賦形劑，制粒壓片。
[0069] 實(shí)施例4
[0070] 口服液的制備:按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸 檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)口服液制法制成口 服液。
[0071] 實(shí)施例5
[0072] 膠囊劑或顆粒劑的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒 石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重 量比為1:9的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。
[0073] 實(shí)施例6
[0074] 注射液的制備:按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸 檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)加注射用水，精濾， 灌封滅菌制成注射液。
[0075] 實(shí)施例7
[0076] 無菌粉針的制備:按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或 檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，將其溶于無菌注射用水 中，攪拌使溶，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于安瓿中，低溫冷凍干燥后無菌熔封 得粉針劑。
[0077]上述實(shí)施例的作用在于說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種巧樣苦素類化合物在制備血管保護(hù)的藥物中的應(yīng)用，其特征在于，具有下述結(jié) 構(gòu)式的化合物(I):2. 權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述化合物（I)從陳皮中提取獲得，具體包含W 下操作步驟： (a) 將干燥的陳皮粉碎，用70~80%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次 用石油酸、乙酸乙醋和水飽和的正下醇萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正 下醇萃取物； (b) 步驟(a)中正下醇取物用大孔樹脂除雜，先用5%乙醇洗脫6個(gè)柱體積，再用70%乙 醇洗脫8個(gè)柱體積，收集70 %洗脫液，減壓濃縮得70 %乙醇洗脫濃縮物； (C)步驟(b)中70 %乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為50:1、30:1、15:1 和5:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組分； (d) 步驟(C)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為8:1、5:1和2:1的二氯甲 燒-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分； (e) 步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為70%的 甲醇水溶液等度洗脫，收集8~12個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:步驟(a)中，用75%乙醇熱回流提取，合并 提取液。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。5. -種藥物組合物在制備血管保護(hù)的藥物中的應(yīng)用，其特征在于：其中含有治療有效 量的權(quán)利要求1所述的化合物(I)和藥學(xué)上可接受的載體。
【文檔編號】A61P39/06GK106074490SQ201610392061
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月3日 公開號201610392061.6, CN 106074490 A, CN 106074490A, CN 201610392061, CN-A-106074490, CN106074490 A, CN106074490A, CN201610392061, CN201610392061.6
【發(fā)明人】吳芊葭
【申請人】吳芊葭