銅綠假單胞菌在降解赭曲霉毒素中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種銅綠假單胞菌的新用途，即銅綠假單胞菌在降解赭曲霉毒素中的應(yīng)用。本發(fā)明通過實驗證明銅綠假單胞菌可高效降解赭曲霉毒素，銅綠假單胞菌作為赭曲霉毒素降解的生物材料，在開發(fā)新的生物降解菌劑和生物降解無菌制劑方面都具有很好的應(yīng)用前景。
【專利說明】
銅綠假單胞菌在降解赭曲霉毒素中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種銅綠假單胞菌的新用途，即銅綠假單胞菌在降解赭曲霉毒素中的 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 赭曲霉毒素(ochratoxins)是曲霉屬和青霉屬等產(chǎn)毒菌株產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似的 有毒代謝產(chǎn)物，廣泛存在于各種食品、飼料及其他農(nóng)副產(chǎn)品中。赭曲霉毒素包括7種有相似 化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，其中赭曲霉毒素 A(ochratoxinA，OTA)在自然界中分布最廣泛，毒性最 強，對人類和動植物影響最大。赭曲霉毒素 A具有腎臟毒性、肝臟毒性、免疫毒性，以及致畸、 致癌和致突變作用等多種毒性，對動物和人體健康有很大的潛在危害。因此世界各國均重 視對赭曲霉毒素 A的檢測和控制，制定了相關(guān)限量標準，以便于確保食品安全和消除國際貿(mào) 易中的技術(shù)壁皇。因此，開展赭曲霉毒素的抑制與去除技術(shù)研究，對于保護人類和動物健 康，確保國家食品安全和糧食安全具有重大的意義。
[0003] 赭曲霉毒素去毒方法可分為物理、化學(xué)和生物三大類，其中生物法因具有效率高、 特異性強以及對食品、飼料和環(huán)境沒有污染的特點，利用生物手段進行赭曲霉毒素的降解 則成為近年來赭曲霉毒素毒素降解研究的熱點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供提供一種銅綠假單胞菌的新用途，即銅綠假單胞菌在降解赭 曲霉毒素中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明保護銅綠假單胞菌和/或銅綠假單胞菌發(fā)酵液和/或銅綠假單胞菌代謝產(chǎn) 物在降解赭曲霉毒素中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明還保護銅綠假單胞菌和/或銅綠假單胞菌發(fā)酵液和/或銅綠假單胞菌代謝 產(chǎn)物在制備產(chǎn)品中的應(yīng)用;所述產(chǎn)品的用途為降解赭曲霉毒素。
[0007] 本發(fā)明還保護一種降解赭曲霉毒素的方法，為使用銅綠假單胞菌對赭曲霉毒素進 行降解處理。
[0008] 所述方法中，降解處理的方式為將銅綠假單胞菌和/或銅綠假單胞菌發(fā)酵液和/或 銅綠假單胞菌代謝產(chǎn)物與含有赭曲霉毒素的樣品混合。
[0009] 本發(fā)明還保護一種產(chǎn)品，其活性成分為銅綠假單胞菌和/或銅綠假單胞菌發(fā)酵液 和/或銅綠假單胞菌代謝產(chǎn)物;所述產(chǎn)品的用途為降解赭曲霉毒素。
[0010] 以上任一所述銅綠假單胞菌，具體為保藏編號為:CGMCC No.8511的銅綠假單胞菌 N17-1。
[0011] 以上任一所述赭曲霉毒素，具體可為赭曲霉毒素 A。
[0012] 本發(fā)明通過實驗證明，銅綠假單胞菌可高效降解赭曲霉毒素，銅綠假單胞菌作為 赭曲霉毒素降解的生物材料，在開發(fā)新的生物降解菌劑和生物降解無菌制劑方面都具有很 好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0013]圖1為實施例1中LC/MS/MS檢測結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0014] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平 均值。
[0015] 銅綠假單胞菌N17-1 (Pseudomonas aeruginosa):保藏編號：CGMCC No .8511。記載 并保護"銅綠假單胞菌Ν17-Γ的專利的申請?zhí)枮椋?01410001212.1，授權(quán)公告號為CN 103710292 B(授權(quán)公告日為2016.01.20)。
[0016] ppm：mg/L〇
[0017] 赭曲霉毒素 A(OTA)標準品：Sigma-Aldrich，產(chǎn)品編號01877。
[0018] 赭曲霉毒素免疫親和柱:美國VICAM公司，產(chǎn)品編號13012。
[0019] 1 X赭曲霉毒素洗脫緩沖液:美國VICAM公司，產(chǎn)品編號G1112。
[0020] 赭曲霉毒素 A的結(jié)構(gòu)式如下：
[0022]實施例1、銅綠假單胞菌N17-1對赭曲霉毒素出的降解作用 [0023] NB液體培養(yǎng)基：由溶劑和溶質(zhì)組成;溶質(zhì)為蛋白胨、牛肉膏和NaCl，溶劑為水;蛋白 胨在NB液體培養(yǎng)基中的濃度為lg/100ml，牛肉膏在NB液體培養(yǎng)基中的濃度為0.3g/100ml， NaCl在NB液體培養(yǎng)基中的濃度為0.5g/100ml。
[0024] 1、將銅綠假單胞菌N17-1接種于液體NB培養(yǎng)基中至初始0D6Q() = 0.05,37°C條件下， 200rpm(旋轉(zhuǎn)半徑20mm)震蕩培養(yǎng)24h，收集全部菌液（即含有菌體和上清在內(nèi)的整個培養(yǎng)體 系)。
[0025] 2、將lmg赭曲霉毒素 A (0ΤΑ)標準品溶解于10ml色譜純甲醇中獲得濃度為1 OOppm的 赭曲霉毒素 A溶液。
[0026] 3、制備實驗組溶液：
[0027]取0.5ml步驟1收集的菌液，置于1.5ml離心管中，向離心管中加入5yL步驟2得到的 赭曲霉毒素 A溶液，充分混勻后37°C靜置72h，然后10000g離心10min并收集上清，得到實驗 組溶液。
[0028] 4、制備對照組溶液：
[0029] 按照步驟3的方法，取0.5ml液體NB培養(yǎng)基替代0.5ml步驟1收集的菌液，其余操作 不變，得到對照組溶液。
[0030] 5、效果檢測：
[0031 ]實驗組溶液和對照組溶液分別作為待測溶液，進行如下步驟：
[0032] 1、向6體積份待測溶液中加入4體積份無水甲醇，室溫振蕩提取5分鐘，12000r/min 離心5分鐘，取上清液用于下一步凈化操作。
[0033] 2、取步驟1得到的上清液，使用赭曲霉毒素免疫親和柱，進行除雜，具體操作過程 如下：
[0034] 取步驟1得到上清液，使其通過赭曲霉毒素免疫親和柱，調(diào)節(jié)流速為1-2滴/s，直至 空氣完全通過免疫親和柱。用l〇ml的IX赭曲霉毒素洗脫緩沖液以1-2滴/s的流速通過親和 柱，對親和柱進行清洗。取l〇ml純水以1-2滴/s的流速通過親和柱，對親和柱進行清洗。取用 1.5ml甲醇以1-2滴/s的流速淋洗親和柱，用2ml離心管收集洗脫液，用0.22μπι有機相尼龍膜 過濾后，裝入2ml色譜進樣小瓶中，得到樣品液。
[0035] 3、取步驟2得到的樣品液，進行LC/MS/MS(液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜）。
[0036]液相色譜相關(guān)參數(shù)：
[0037] 儀器agilent 6460LC/MS/MS;
[0038] 色譜柱：agilent XDB-SB-C18(2.1x50mm，1·8μπι);
[0039] 上樣體積：2yL;
[0040] 柱溫：30°C;
[0041] 洗脫過程(梯度洗脫）：第〇_lmin，A液在洗脫液中所占的體積百分含量為70%;第 l-8min，A液在洗脫液中所占的體積百分含量為10% ;第8-9min，A液在洗脫液中所占的體積 百分含量為70%;后運行4min，后運行過程繼續(xù)保持A液在洗脫液中所占的體積百分含量為 70 % ;流速為0.3mL/min;洗脫液由A液和B液組成，A液為體積百分含量為0.1 %的甲酸水溶 液，B液為體積百分含量為0.1%的乙腈水溶液。
[0042]質(zhì)譜相關(guān)參數(shù)：ESI+MRM(多反應(yīng)監(jiān)測）；霧化氣溫度為300°C，霧化氣流速為6L/ min;氣簾氣溫度為350°C，氣簾氣流速為10L/min，氣簾氣壓力為45psi;電力電壓為4000v; 檢測離子對:404.1 > 239.0，404.1 > 358.1;碰撞電壓均為30ev。
[0043]用赭曲霉毒素 A(OTA)標準品的梯度稀釋液代替樣品液進行上述步驟。
[0044] 計算赭曲霉毒素 A(OTA)降解率，計算方法為：
[0045] 0ΤΑ降解率（％ )=(對照組0ΤΑ含量-實驗組0ΤΑ含量)/對照組0ΤΑ含量X 100。
[0046] 實驗重復(fù)五次，結(jié)果取平均值。
[0047] LC/MS/MS檢測結(jié)果如圖1所示。圖1中，A為赭曲霉毒素 A標準品的分析結(jié)果，B為對 照組溶液的分析結(jié)果，C為實驗組溶液的分析結(jié)果。結(jié)果表明，銅綠假單胞菌N17-1對赭曲霉 毒素 A有較好的降解效果，經(jīng)過統(tǒng)計降解率為85.4±4.9%。
【主權(quán)項】
1. 銅綠假單胞菌和/或銅綠假單胞菌發(fā)酵液和/或銅綠假單胞菌代謝產(chǎn)物在降解赭曲 霉毒素中的應(yīng)用。2. 銅綠假單胞菌和/或銅綠假單胞菌發(fā)酵液和/或銅綠假單胞菌代謝產(chǎn)物在制備產(chǎn)品 中的應(yīng)用;所述產(chǎn)品的用途為降解赭曲霉毒素。3. 如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述銅綠假單胞菌的保藏編號為CGMCC No.8511〇4. 如權(quán)利要求1-3任一所述的應(yīng)用，其特征在于:所述赭曲霉毒素為赭曲霉毒素 A。5. -種降解赭曲霉毒素的方法，包括如下步驟:使用銅綠假單胞菌對赭曲霉毒素進行 降解處理。6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述降解處理的方式為將銅綠假單胞菌和/ 或銅綠假單胞菌發(fā)酵液和/或銅綠假單胞菌代謝產(chǎn)物與含有赭曲霉毒素的樣品混合。7. 如權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于:所述赭曲霉毒素為赭曲霉毒素 A。8. -種產(chǎn)品，其活性成分為銅綠假單胞菌和/或銅綠假單胞菌發(fā)酵液和/或銅綠假單胞 菌代謝產(chǎn)物;所述產(chǎn)品的用途為降解赭曲霉毒素。9. 如權(quán)利要求8所述的產(chǎn)品，其特征在于:所述赭曲霉毒素為赭曲霉毒素 A。
【文檔編號】A62D101/28GK105833459SQ201610266547
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年4月26日
【發(fā)明人】劉陽, 趙月菊, 王瑤, 邢福國, 王龑
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所