多通道熒光顯微的復(fù)合顯微系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種多通道熒光顯微的復(fù)合顯微系統(tǒng)，屬于顯微鏡技術(shù)領(lǐng)域，它包括顯微鏡主體、成像模塊，復(fù)合照明模塊，通過控制系統(tǒng)控制機械轉(zhuǎn)鏡改變復(fù)合照明模塊的光路，由機械轉(zhuǎn)鏡選擇與成像模塊匹配的經(jīng)過不同方式調(diào)制的光照進(jìn)入顯微鏡主體中，對樣品進(jìn)行照明。該裝置具有四種功能，分別為雙色熒光定位顯微功能、結(jié)構(gòu)光照明顯微功能、光漂白后熒光恢復(fù)功能，明場成像功能，在生物實驗中既可以根據(jù)樣品樣品的特點及對成像的要求選擇合適的方法對樣品進(jìn)行高空間分辨率或高時間分辨率成像，又可以對同一樣品的同一位置進(jìn)行不同方式的成像，解決了單一顯微方法成像結(jié)果片面性的問題。
【專利說明】
多通道熒光顯微的復(fù)合顯微系統(tǒng)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于顯微鏡技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種多通道熒光顯微的復(fù)合顯微系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0002]生物顯微技術(shù)在生命科學(xué)技術(shù)的研究中起著舉足輕重的作用，且隨著研究生命過程的發(fā)展及細(xì)化，生物顯微技術(shù)遇到了越來越多的挑戰(zhàn)。第一個挑戰(zhàn)為對所研究樣品中觀察內(nèi)容的尺度越來越小，細(xì)胞的尺寸為十微米量級，細(xì)胞器如線粒體葉綠體的尺寸為微米量級，細(xì)胞內(nèi)的囊泡尺寸在幾百到幾十個納米的量級，蛋白質(zhì)的尺寸則大部分小于50納米，要看清楚這些尺度上的生命結(jié)構(gòu)，就對熒光顯微鏡的空間分辨率提出了很高的要求。第二個挑戰(zhàn)為對生命過程的實時觀察，也就是活樣品成像，因為生命活動的時間尺度在秒或毫秒量級，熒光顯微鏡的時間分辨率越高，就可以觀察到越細(xì)致的生命活動過程。另外，熒光顯微系統(tǒng)中使用的照明光的強度也對生命活動過程及可觀察時間的長短有著重要的影響，照明光強度過高，不僅會影響樣品的生物活性，甚至?xí)⑺罉悠?，對樣品的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不可逆的影響；熒光顯微鏡所觀察的生物樣品大多需要熒光分子或熒光蛋白質(zhì)標(biāo)記，照明光強太高也會使特異性標(biāo)記的熒光物質(zhì)產(chǎn)生不可逆的淬滅效應(yīng)，這樣就縮短了觀察時間。要得到高空間分辨率，高時間分辨率，低照明光強度的熒光顯微系統(tǒng)一直為科研的終極目標(biāo)。莊小威、埃里克貝奇格(Eric Bezig)分別于2006年先后提出了焚光定位顯微技術(shù)，打破了恩斯特阿貝(Ernst Abbe)于十八世紀(jì)七十年代提出的光學(xué)成像分辨率理論，可以突破200nm的分辨率極限，將光學(xué)顯微鏡的空間分辨率提高到20nm的范圍。然而這種方法需要用較強的激光對樣品進(jìn)行較長時間的照射成像，這樣就不適合進(jìn)行活樣品成像。結(jié)構(gòu)光照明顯微技術(shù)主要由美國Janelia Farm的Mats Gustafsson研發(fā)，這種方法可以使用低強度照明光實現(xiàn)高空間分辨率(約10nm)，高信噪比的成像，且成像時間遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于熒光定位顯微技術(shù)，所以非常適合進(jìn)行活樣品成像。光漂白后恢復(fù)技術(shù)為研究活細(xì)胞生理狀態(tài)下分子運動信息的重要方法。在生命科學(xué)實驗過程中，對不同的生物樣品成像需要選擇不同的熒光顯微鏡，這就使得研究的成本大大提升;另外，若需要對同一樣品的同一位置進(jìn)行不同尺度的成像，就需要在實驗過程中更換顯微鏡系統(tǒng)，并找到相同的位置，這在操作上是很難做到的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有的上述問題，提供一種具有四種功能，分別為雙色熒光定位顯微功能、結(jié)構(gòu)光照明顯微功能、光漂白后熒光恢復(fù)功能，明場成像功能的具有多通道雙色熒光定位顯微功能的復(fù)合顯微系統(tǒng)。
[0004]本發(fā)明的目的可通過下列技術(shù)方案來實現(xiàn):一種多通道熒光顯微的復(fù)合顯微系統(tǒng)，其特征在于，它包括:
[0005]顯微鏡主體，包括樣品臺、物鏡、光路光學(xué)元件；
[0006]成像模塊；
[0007]復(fù)合照明模塊，包括光源和以下子模塊:
[0008]明場光照明子模塊，光源通過明場光照明子模塊照射樣品；
[0009]雙色熒光定位照明子模塊，可在普通寬場熒光顯微照明模式、半全內(nèi)反射照明模式和全內(nèi)反射照明模式中連續(xù)調(diào)節(jié)，以獲取不同厚度的樣品空間分辨率雙通道同時成像結(jié)果;
[0010]結(jié)構(gòu)光照明子模塊，光源通過結(jié)構(gòu)光照明子模塊進(jìn)行調(diào)制后照射樣品；
[0011]光漂白后熒光恢復(fù)功能照明子模塊，通過編輯空間光調(diào)制器的調(diào)制圖案，使得光源可以在所觀測樣品的某一區(qū)域形成高強度的聚焦點，使得標(biāo)記該區(qū)域的熒光分子淬滅；
[0012]機械轉(zhuǎn)鏡，通過控制系統(tǒng)控制機械轉(zhuǎn)鏡改變復(fù)合照明模塊的光路，由機械轉(zhuǎn)鏡選擇與成像模塊匹配的經(jīng)過不同方式調(diào)制的光照進(jìn)入顯微鏡主體中，對樣品進(jìn)行照明。
[0013]所述的照明模塊包括單模光纖激光。
[0014]所述成像模塊與照明模塊相對應(yīng)，包括以下子模塊:
[0015]明場成像子模塊，光源通過明場光照明子模塊照射樣品后映射在明場成像子模塊上，凸顯樣品的輪廓和狀態(tài)獲以此取所得信息；
[0016]結(jié)構(gòu)光照明成像子模塊，光源通過結(jié)構(gòu)光照明子模塊中的可編程空間光調(diào)制器周期性調(diào)制激發(fā)光場，形成高準(zhǔn)確的照明光條紋，之后通過對照明光條紋與樣品結(jié)構(gòu)相互作用產(chǎn)生的熒光混頻圖像進(jìn)行后續(xù)頻譜分析重構(gòu)，以獲得超分辨率成像結(jié)果；
[0017]雙色熒光定位成像子模塊，可獲取不同厚度的樣品高空間分辨率雙通道同時成像結(jié)果；
[0018]光漂白后熒光恢復(fù)成像子模塊，通過記錄樣品熒光淬滅處熒光恢復(fù)的時間來獲取所得?目息。
[0019]所述單模光纖激光提供波長為405]1111、48811111、56111111、64711111、750111]1的激光照明。
[0020]所述單模光纖激光位于顯微鏡主體的后部接口接入。
[0021 ]所述顯微鏡主體為基本的倒置熒光顯微鏡結(jié)構(gòu)。
[0022]所述復(fù)合顯微系統(tǒng)還包括拍攝的SCMOS或EMCXD相機。
[0023]所述雙色熒光定位照明子模塊和明場光照明子模塊處于第一照明系統(tǒng)中，結(jié)構(gòu)光照明子模塊和光漂白后熒光恢復(fù)功能照明子模塊處于第二照明系統(tǒng)中，所述第一照明系統(tǒng)、第二照明系統(tǒng)的照明模塊由機械轉(zhuǎn)鏡調(diào)控。
[0024]與現(xiàn)有技術(shù)相比，該裝置具有四種功能，分別為雙色熒光定位顯微功能、結(jié)構(gòu)光照明顯微功能、光漂白后熒光恢復(fù)功能，明場成像功能。在生物實驗中既可以根據(jù)樣品樣品的特點及對成像的要求選擇合適的方法對樣品進(jìn)行高空間分辨率或高時間分辨率成像，又可以對同一樣品的同一位置進(jìn)行不同方式的成像，解決了單一顯微方法成像結(jié)果片面性的問題。在同一顯微系統(tǒng)中加入不同功能的模塊，降低了科研成本，提升儀器利用率。
【附圖說明】
[0025]圖1是本發(fā)明的模塊關(guān)系示意圖。
[0026]圖2是實施例1的復(fù)合照明模塊的具體光路圖。
【具體實施方式】
[0027]以下是本發(fā)明的具體實施例并結(jié)合附圖，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的描述，但本發(fā)明并不限于這些實施例。
[0028]實施例1
[0029]圖1所示本發(fā)明中包括顯微鏡主體、SCMOS或EMCCD相機、復(fù)合照明模塊，所述復(fù)合照明模塊包括光源和明場光照明子模塊、雙色熒光定位照明子模塊、結(jié)構(gòu)光照明子模塊、光漂白后熒光恢復(fù)功能照明子模塊。所述光源經(jīng)各照明子模塊進(jìn)入顯微鏡主體中，并照射在樣品上。所述的樣品選擇映射在明場成像子模塊、雙色熒光定位成像子模塊、結(jié)構(gòu)光照明成像子模塊及光漂白后熒光恢復(fù)成像子模塊上。圖2中雙色熒光定位照明子模塊和明場光照明子模塊處于第一照明系統(tǒng)I中，結(jié)構(gòu)光照明子模塊和光漂白后熒光恢復(fù)功能照明子模塊處于第二照明系統(tǒng)2中，所述第一照明系統(tǒng)1、第二照明系統(tǒng)2的照明模塊由機械轉(zhuǎn)鏡1-3及機械轉(zhuǎn)鏡1-4調(diào)控。通過控制系統(tǒng)控制機械轉(zhuǎn)鏡1-3及機械轉(zhuǎn)鏡1-4改變復(fù)合照明模塊的光路，由機械轉(zhuǎn)鏡1-3及機械轉(zhuǎn)鏡1-4選擇與四種成像模塊匹配的經(jīng)過不同方式調(diào)制的光照進(jìn)入顯微鏡主體中，對樣品進(jìn)行照明。
[°03°]圖2所不，機械轉(zhuǎn)鏡1-3可以選擇(將全反射鏡、50: 50分光鏡、或全透鏡)鏡片放入到光路中，通過調(diào)節(jié)機械轉(zhuǎn)鏡1-3，將其放入到光路中，可以將雙色熒光定位成像模塊的激光導(dǎo)入到第二成像系統(tǒng)中(全反射鏡)，或?qū)朊鲌龀上衲K及第二成像系統(tǒng)中(50:50分光鏡)，而通過調(diào)節(jié)機械轉(zhuǎn)鏡1-4可以選擇一種模塊中的照明光進(jìn)入到顯微鏡主體里。雙色熒光定位成像模塊及明場成像模塊中由單模光纖激光1-1及單模光纖激光1-2發(fā)出的激光先通過透鏡2-1及透鏡2-3進(jìn)行準(zhǔn)直，經(jīng)過分色鏡2-2、分色鏡2-4，并經(jīng)過反光鏡2_5反射進(jìn)入中繼透鏡2-6及中繼透鏡2-8再進(jìn)入到顯微鏡主體中，機械轉(zhuǎn)鏡1-3和中繼透鏡2-8之間設(shè)有可改變角度的反射鏡2-7。
[0031]通過調(diào)節(jié)單模光纖激光1-1及單模光纖激光1-2端口的位置可以對樣品樣品進(jìn)行寬場照明、半全內(nèi)反射照明、全內(nèi)反射照明中照明方法的選擇，這在熒光定位顯微成像中非常重要。在結(jié)構(gòu)光照明成像模塊中，單模光纖激光1-1及單模光纖激光1-2端口需位于寬場照明位置，從單模光纖激光1-1及單模光纖激光1-2端口發(fā)出的點光源經(jīng)過中繼透鏡2-6匯聚在準(zhǔn)直透鏡3-2的后焦平面上，通過準(zhǔn)直透鏡3-2即成為平行光。偏振分光晶體3-3及半波片3-4的作用為調(diào)節(jié)入射光的偏振方向，使其與空間光調(diào)制器3-5所需要的偏振方向相同，通過計算機可編程的空間光調(diào)制器3-5上顯示的條紋間距、密度及方向，可以調(diào)制照明光得到不同的結(jié)構(gòu)光照明，如成像僅需提高信噪比，對空間分辨率沒有太高要求，這種情況使用一個方向、較為稀疏的條紋結(jié)構(gòu)光即可，這樣可簡化解調(diào)算法，使時間分辨率變高;若成像對空間分辨率的要求較高，則需要使用密度較高的條紋結(jié)構(gòu)光，當(dāng)結(jié)構(gòu)光的密度與顯微鏡系統(tǒng)的分辨率極限相同時，即可獲得結(jié)構(gòu)光照明的最大空間分辨率，為顯微鏡系統(tǒng)分辨率極限的一半，并且這種情況下需要使用0°、45°、90°、135°四個方向的條紋結(jié)構(gòu)光對樣品進(jìn)行照明成像，以獲得xy方向相同的空間分辨率提升?？臻g光調(diào)制器上的條紋會經(jīng)過聚焦透鏡3-6匯聚在光遮罩3-9的位置，光遮罩3-9可以擋掉沒有被調(diào)制的光成分，增強結(jié)構(gòu)光的調(diào)制深度。光束進(jìn)一步通過中繼透鏡3-12、中繼透鏡3-14及顯微鏡主體中的透鏡成像在樣品樣品的焦平面上，當(dāng)可編程的空間光調(diào)制器上的調(diào)制圖案發(fā)生變化時，無需改變?nèi)魏喂鈱W(xué)器件的位置即可在樣品焦平面上產(chǎn)生條紋密度不同，方向不同的結(jié)構(gòu)光照明。光漂白后熒光恢復(fù)成像模塊需要在樣品樣品上實現(xiàn)一個聚焦光束的照明，這同時可以通過可編程的空間光調(diào)制器上的圖案來實現(xiàn)，同時這種方法也可以準(zhǔn)確調(diào)節(jié)這個聚焦光束在樣品樣品上的位置。圖2中3-1、3-7、3-8、3-10、3-11、3_13均為改變光束方向的反光鏡。
[0032]例如若需要追蹤細(xì)胞分裂的過程，并研究分裂過程中某個時間節(jié)點處某兩種蛋白質(zhì)的相對位置關(guān)系，就可首先使用明場成像功能，大尺度地快速挑選某個健康的細(xì)胞;之后使用結(jié)構(gòu)光照明顯微成像功能對該細(xì)胞進(jìn)行超分辨率快速的成像，追蹤其分裂的過程，并判斷此細(xì)胞所處的生命階段;在達(dá)到需要的時間節(jié)點時使用雙色熒光定位顯微成像功能，對這兩種蛋白質(zhì)進(jìn)行成像，若使用單一功能的熒光顯微鏡系統(tǒng)幾乎不可能對同一細(xì)胞進(jìn)行如此多角度多方位的觀察。
[0033]實施例2
[0034]復(fù)合顯微系統(tǒng)的成像模式為:明場成像(高時間分辨率，大視野)；雙色熒光定位成像(高空間分辨率xy方向20nm，y方向50nm)；結(jié)構(gòu)光照明成像(高空間分辨率xy方向I OOnm，y方向500nm;高時間分辨率約360ms每幀，成像范圍2048*2048像素；高信噪比)；光漂白后熒光恢復(fù)成像；明場及雙色熒光定位同時成像；明場及結(jié)構(gòu)光照明同時成像；明場及光漂白后熒光恢復(fù)同時成像。這六種成像模式可以通過軟件進(jìn)行便捷的選擇。
【主權(quán)項】
1.一種多通道熒光顯微的復(fù)合顯微系統(tǒng)，其特征在于，它包括: 顯微鏡主體，包括樣品臺、物鏡、光路光學(xué)元件； 成像模塊； 復(fù)合照明模塊，包括光源和以下子模塊: 明場光照明子模塊，光源通過明場光照明子模塊照射樣品； 雙色熒光定位照明子模塊，可在普通寬場熒光顯微照明模式、半全內(nèi)反射照明模式和全內(nèi)反射照明模式中連續(xù)調(diào)節(jié)，以獲取不同厚度的樣品空間分辨率雙通道同時成像結(jié)果；結(jié)構(gòu)光照明子模塊，光源通過結(jié)構(gòu)光照明子模塊進(jìn)行調(diào)制后照射樣品； 光漂白后熒光恢復(fù)功能照明子模塊，通過編輯空間光調(diào)制器的調(diào)制圖案，使得光源可以在所觀測樣品的某一區(qū)域形成高強度的聚焦點，使得標(biāo)記該區(qū)域的熒光分子淬滅； 機械轉(zhuǎn)鏡，通過控制系統(tǒng)控制機械轉(zhuǎn)鏡改變復(fù)合照明模塊的光路，由機械轉(zhuǎn)鏡選擇與成像模塊匹配的經(jīng)過不同方式調(diào)制的光照進(jìn)入顯微鏡主體中，對樣品進(jìn)行照明。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多通道熒光顯微的復(fù)合顯微系統(tǒng)，其特征在于，所述的照明模塊包括單模光纖激光。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多通道熒光顯微的復(fù)合顯微系統(tǒng)，其特征在于，所述單模光纖激光提供波長為405nm、488nm、56Inm、647nm、750nm的激光照明。4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的多通道熒光顯微的復(fù)合顯微系統(tǒng)，其特征在于，所述單模光纖激光位于顯微鏡主體的后部接口接入。5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的多通道熒光顯微的復(fù)合顯微系統(tǒng)，其特征在于，所述成像模塊與照明模塊相對應(yīng)，包括以下子模塊: 明場成像子模塊，光源通過明場光照明子模塊照射樣品后映射在明場成像子模塊上，凸顯樣品的輪廓和狀態(tài)獲以此取所得信息； 結(jié)構(gòu)光照明成像子模塊，光源通過結(jié)構(gòu)光照明子模塊中的可編程空間光調(diào)制器周期性調(diào)制激發(fā)光場，形成高準(zhǔn)確的照明光條紋，之后通過對照明光條紋與樣品結(jié)構(gòu)相互作用產(chǎn)生的熒光混頻圖像進(jìn)行后續(xù)頻譜分析重構(gòu)，以獲得超分辨率成像結(jié)果； 雙色熒光定位成像子模塊，可獲取不同厚度的樣品高空間分辨率雙通道同時成像結(jié)果; 光漂白后熒光恢復(fù)成像子模塊，通過記錄樣品熒光淬滅處熒光恢復(fù)的時間來獲取所得?目息O6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多通道熒光顯微的復(fù)合顯微系統(tǒng)，其特征在于，所述成像模塊與照明模塊相對應(yīng)，包括以下子模塊: 明場成像子模塊，光源通過明場光照明子模塊照射樣品后映射在明場成像子模塊上，凸顯樣品的輪廓和狀態(tài)獲以此取所得信息； 結(jié)構(gòu)光照明成像子模塊，光源通過結(jié)構(gòu)光照明子模塊中的可編程空間光調(diào)制器周期性調(diào)制激發(fā)光場，形成高準(zhǔn)確的照明光條紋，之后通過對照明光條紋與樣品結(jié)構(gòu)相互作用產(chǎn)生的熒光混頻圖像進(jìn)行后續(xù)頻譜分析重構(gòu)，以獲得超分辨率成像結(jié)果； 雙色熒光定位成像子模塊，可獲取不同厚度的樣品高空間分辨率雙通道同時成像結(jié)果; 光漂白后熒光恢復(fù)成像子模塊，通過記錄樣品熒光淬滅處熒光恢復(fù)的時間來獲取所得?目息O7.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的多通道熒光顯微的復(fù)合顯微系統(tǒng)，其特征在于，所述顯微鏡主體為基本的倒置熒光顯微鏡結(jié)構(gòu)。8.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的多通道熒光顯微的復(fù)合顯微系統(tǒng)，其特征在于，所述復(fù)合顯微系統(tǒng)還包括拍攝的SCMOS或EMCCD相機。9.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的多通道熒光顯微的復(fù)合顯微系統(tǒng)，其特征在于，所述雙色熒光定位照明子模塊和明場光照明子模塊處于第一照明系統(tǒng)中，結(jié)構(gòu)光照明子模塊和光漂白后熒光恢復(fù)功能照明子模塊處于第二照明系統(tǒng)中，所述第一照明系統(tǒng)、第二照明系統(tǒng)的照明模塊由機械轉(zhuǎn)鏡調(diào)控。
【文檔編號】G02B21/36GK106094189SQ201610452347
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月20日
【發(fā)明人】王瑩
【申請人】金華納觀生物科技有限公司