專利名稱：對(duì)kdr特異的抗體及其應(yīng)用的制作方法
背景技術(shù)：
血管發(fā)生是生成新的血管的過程。該過程涉及原先存在的血管的毛細(xì)管上皮細(xì)胞(capillary endothelial cell)的增殖、遷移和組織浸潤(tissue infiltration)。血管發(fā)生在正常的生理過程中，包括胚胎發(fā)育、卵泡生長和傷口愈合，以及在涉及腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移的病理?xiàng)l件下是很重要的(Folkman，J.and Klagsbrun，M.Science235442-447(1987))。
在成人中，血管內(nèi)皮通常是靜息的，并且它在血管發(fā)生中的激活受到嚴(yán)緊的控制。幾個(gè)因子被認(rèn)為可能是體內(nèi)血管發(fā)生的調(diào)節(jié)者。這些包括轉(zhuǎn)化生長因子(TGFb)，酸性和堿性纖維原細(xì)胞生長因子(aFGF和bFGF)，血小板生長因子(PDGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)(Klagsbrun，M.and D’Amore，P.(1991)，Annual rev.Physiol.53217-239)。VEGF，一種內(nèi)皮細(xì)胞特異的分裂原，顯然是這些因子中的一種，因?yàn)樗ㄟ^特異性地促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖而作為血管發(fā)生誘導(dǎo)因子發(fā)揮作用。
VEGF是由兩個(gè)結(jié)構(gòu)上與PDGF類似的23KD亞基組成的同二聚體糖蛋白。由于mRNA的不同剪接(alternative splicing)，存在四種不同的VEGF單體亞型。這些亞型包括兩種膜結(jié)合形式亞型(VEGF206和VEGF189)和兩種可溶形式亞型(VEGF165和VEGF121)。在除了胎盤外的所有人類組織中，VEGF165是最豐富的亞型。
VEGF在胚胎組織中(Breier et al.，Development(Camb.)114521(1992))、巨噬細(xì)胞中、傷口愈合中的增殖的上皮角化細(xì)胞中(Brown et al.，J.Exp.Med.，1761375(1992))表達(dá)，并可能對(duì)與炎癥相關(guān)的組織水腫負(fù)責(zé)(Ferrara et al.，Endocr.Rev.1318(1992))。原位雜交表明，在許多人類腫瘤系中，包括多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme)，成血管細(xì)胞瘤，中樞神經(jīng)系統(tǒng)瘤和AIDS相關(guān)的Kaposi’s肉瘤中，VEGF大量表達(dá)(Plate，K.et al.(1992)Nature 359845-848；Plate，K.et al.，(1993)Cancer Res.535822-5827；Berkman，R.et al.(1993)J.Clin.Invest.91153-159；Nakarmura，S et al.(1992)AIDS Weekly，13(1))。在組織缺氧誘導(dǎo)的血管發(fā)生中也觀察到了高水平的VEGF(Shweiki，D et al.(1992)Nature 359843-845)。
VEGF的生物學(xué)應(yīng)答是通過高親和性的VEGF受體介導(dǎo)的，該受體在胚胎發(fā)生(Millauer，B.，et al.，(1993)Cell 7283-846)和腫瘤形成過程中選擇性地在內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)。VEGF受體通常為III類受體類型的酪氨酸激酶，其特征為在它們的氨基端細(xì)胞外受體-配基結(jié)合區(qū)域具有幾個(gè)，通常為5或7個(gè)，類似免疫球蛋白的環(huán)(Kaipainen et al.，J.Exp.Med.1782077-2088(1993))。另外兩個(gè)區(qū)域包括跨膜區(qū)域和羧基端的細(xì)胞內(nèi)催化結(jié)構(gòu)域，催化結(jié)構(gòu)域被一段不同長度的，被稱為激酶插入結(jié)構(gòu)域的親水性激酶內(nèi)序列(interkinase sequence)的插入所中斷(Terman et al.，Oncogene61677-1683(1991))。VEGF受體包括FLT-1(由Shibuya M.etal.Oncogene 5，519-524(1990)所測序)；KDR(含激酶插入結(jié)構(gòu)域的受體，kinase insert domain-containg receptor)，在1992年2月20日歸檔的PCT/US92/01300中和在Terman et al.，Oncogene 61677-1683(1991)中描述；和FLK-1，由Matthews W.et al.Proc.Acad.Sci.USA，889026-9030(1991)測序。KDR是小鼠FLK-1的人類同源物。KDR和FLK-1也被稱為VEGFR2。
具有同源氨基酸序列的對(duì)等受體，如上文所定義，存在于所有的哺乳動(dòng)物中，例如，人類，小鼠。與一種VEGF受體結(jié)合的抗體并不一定意味著和另一種VEGF受體結(jié)合，與一種哺乳動(dòng)物中的一種VEGF受體結(jié)合并不一定意味著和另一種哺乳動(dòng)物中的對(duì)等受體結(jié)合。
有人提出KDR通路在人類腫瘤的血管發(fā)生中起著重要作用。VEGF受體主要在內(nèi)皮細(xì)胞和造血細(xì)胞上表達(dá)。當(dāng)腫瘤細(xì)胞合成和分泌VEGF后，VEGF與VEGFR2受體結(jié)合并刺激新的血管的生長。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)除非有專門的血液供應(yīng)，否則腫瘤的生長不能超過一定的大小。
在PCT申請(qǐng)US95/01678中描述了通過雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)抗鼠VEGF受體FLK-1的單克隆抗體。這些單克隆抗體被認(rèn)為通過干擾VEGF和它的受體的相互作用而抑制受體的激活。這些抗體被證明能特異性地抑制VEGF對(duì)轉(zhuǎn)染的3T3細(xì)胞上表達(dá)的FLI-1受體的激活。在體內(nèi)，它被表明能夠通過抑制與腫瘤相關(guān)的血管發(fā)生而強(qiáng)烈抑制人類成膠質(zhì)細(xì)胞瘤異種移植物在裸鼠中的生長。
但是，不是所有與鼠受體FLK-1結(jié)合的抗體都能夠以足夠的親和性與其人類同源物，KDR，反應(yīng)，以成為可用于人類治療用的，商業(yè)上可行的產(chǎn)品。因此，需要比現(xiàn)有技術(shù)中已知的抗體具有更高親和性的抗KDR抗體。
本發(fā)明的目標(biāo)為提供能夠中和VEGF和其人類受體，KDR，之間的相互作用的高效力抗體，上述抗體的親和性比現(xiàn)有技術(shù)中已知的抗體要高。
發(fā)明概述通過提供與KDR結(jié)合的，親和性與人類VEGF可比的并且能夠中和KDR的激活的免疫球蛋白，已經(jīng)達(dá)到了這些和其它目標(biāo)，這對(duì)于本領(lǐng)域具有普通技術(shù)的人員將是顯而易見的。
免疫球蛋白分子包括單價(jià)單鏈抗體，多價(jià)單鏈抗體，雙體(diabody)，三體(triabody)，抗體，人源化抗體和嵌合抗體。
本發(fā)明進(jìn)而提供了編碼這些免疫球蛋白分子的核酸分子。
本發(fā)明還提供了制備上述免疫球蛋白的方法。本發(fā)明進(jìn)而提供了用這樣的免疫球蛋白分子，中和KDR激活的方法，在哺乳動(dòng)物中抑制血管發(fā)生的方法和在哺乳動(dòng)物中抑制腫瘤生長的方法。縮寫VEGF，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子；bFGF，堿性成纖維細(xì)胞生長因子；KDR，含激酶插入結(jié)構(gòu)域的受體(也稱為VEGF受體2)；FLK-1，胎肝激酶1；scFv，單鏈Fv；HUVEC，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；PBS，0.01M磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)；PBST，含有0.1％吐溫20的PBS；AP，堿性磷酸酶；EGF，上皮細(xì)胞生長因子；VH和VL，分別為免疫球蛋白重鏈和輕鏈的可變區(qū)。
附圖描述

圖1是顯示不同的scFv抗體(p1C11，p1F12，p2A6，和p2A7)與固定的KDR直接結(jié)合的圖。
圖2是顯示不同的scFv抗體(p1C11，p1F12，p2A6，和p2A7)對(duì)KDR與固定的VEGF165的結(jié)合的抑制作用的圖。
圖3是顯示scFv抗體(p2A6和p1C11)對(duì)VEGF誘導(dǎo)的HUVEC增殖的抑制作用的圖。
圖4是c-p1C11的VH和VL鏈的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列。
圖5是顯示抗體(c-p1C11，p1C11，p2A6)與固定的KDR直接結(jié)合的圖。
圖6是顯示c-p1C11與表達(dá)KDR的HUVEC細(xì)胞結(jié)合的FACS分析的圖。
圖7是顯示不同的scFv抗體(c-p1C11，p1C11，p2A6)對(duì)KDR受體與固定的VEGF165結(jié)合的抑制作用的圖。
圖8是顯示c-p1C11和未標(biāo)記VEGF165對(duì)放射性標(biāo)記的VEGF165與固定的KDR受體結(jié)合的抑制作用的圖。
圖9是顯示抗KDR抗體(c-p1C11，p1C11)對(duì)VEGF誘導(dǎo)的HUVEC增殖的抑制作用的圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了與KDR的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域特異結(jié)合的免疫球蛋白，其親和性可以與VEGF相比。這種結(jié)合的結(jié)果是，與先前描述的免疫球蛋白分子相比，該免疫球蛋白可以更有效地中和對(duì)受體的激活。VEGF受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域在本文定義為在該受體的細(xì)胞外區(qū)域的配基結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
免疫球蛋白分子是識(shí)別并結(jié)合特定抗原或物質(zhì)的蛋白。免疫球蛋白分子包括天然存在的抗體，單價(jià)單鏈抗體，多價(jià)單鏈抗體，雙體，三體，嵌合抗體，人源化抗體和其它與抗原特異結(jié)合的分子。
本發(fā)明的免疫球蛋白分子與KDR結(jié)合的親和性可以和天然配基相比。親和性，由抗原和免疫球蛋白分子結(jié)合的平衡常數(shù)(K)表示，度量了抗原決定簇和免疫球蛋白分子結(jié)合的強(qiáng)度，而與結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量無關(guān)。抗原決定簇，也被稱為表位，是在抗原上的特定免疫球蛋白分子結(jié)合的位點(diǎn)。通常K值為105到1011升/mol。任何小于104升/mol的K值被認(rèn)為是意味著非特異結(jié)合。K的倒數(shù)被指定為Kd(Kd也可以被稱為解離常數(shù))。Kd越小，抗原決定簇與抗體結(jié)合位點(diǎn)之間的結(jié)合力越強(qiáng)。
KDR的天然配基是人VEGF。VEGF以0.93nM的親和性(Kd)結(jié)合KDR。為了抑制VEGF與KDR的結(jié)合，抗KDR抗體必需以與VEGF可比的親和性與KDR結(jié)合。也就是說，抗KDR抗體必需成功地在與KDR的結(jié)合上與VEGF競爭。Kd至多為5nM的抗體，其與KDR結(jié)合的親和性被認(rèn)為是與天然配基可以相比的。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體結(jié)合KDR的親和性至多為約4nM，更優(yōu)選地，親和性至多為約3nM，最優(yōu)選地，親和性為至多約2nM，最佳親和性為約1nM。
本發(fā)明的抗體中和KDR(參見實(shí)施例)。在本說明書中，中和受體的意思是減小和/或失活該受體轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的內(nèi)源激酶活性。KDR中和的一種可靠的檢測方法是對(duì)受體磷酸化的抑制。
本發(fā)明不受任何特定的KDR中和機(jī)制的限制。在提出本申請(qǐng)時(shí)，抗體中和KDR的機(jī)制尚未被很好地了解，并且一種抗體所遵循的機(jī)制不一定與另一種抗體相同。一些可能的機(jī)制包括防止VEGF配基與KDR細(xì)胞外結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并且防止受體的二聚體化或寡聚體化。但是，不能排除其它機(jī)制。
優(yōu)選的免疫球蛋白分子是稱為單價(jià)單鏈抗體(scFv)的抗體片段。單價(jià)單鏈抗體包括一個(gè)抗體重鏈可變片段(VH)通過肽接頭與一個(gè)抗體輕鏈可變片段(VL)連接，上述肽接頭允許兩個(gè)片段結(jié)合形成功能性的抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見，例如U.S.Pat.No.4,946,778，Ladner et al.，(Genex)；WO88/09344，CreativeBiomolecules，Inc/Huston et al.)。WO 92/01047 CambridgeAntibody Technology et al./McCafferty et al.，描述了scFv在可溶的重組基因展示包裝(soluble recombinant genetic displaypackage)，如噬菌體，表面上的展示。帶有接頭的單鏈抗體可以被表示為VL-L-VH或VH-L-VL。
價(jià)(Valency)是指一個(gè)免疫球蛋白分子上所具有的對(duì)特定表位的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。例如，單價(jià)抗體具有一個(gè)特定表位的結(jié)合位點(diǎn)。抗體親抗源性(avidity)是對(duì)免疫球蛋白分子和其抗原之間結(jié)合強(qiáng)度的度量?？贵w親抗源性同時(shí)涉及表位與其免疫球蛋白分子上的抗原結(jié)合位點(diǎn)之間的親和性以及免疫球蛋白的價(jià)。
單鏈抗體缺少它們所源自的完整抗體的部分或全部恒定結(jié)構(gòu)域。因此，它們可能克服與完整抗體的使用相關(guān)的一些問題。例如，單鏈抗體傾向于避免重鏈恒定區(qū)和生物分子之間的不合乎需要的相互作用，或其它不需要的生物學(xué)活性。此外，單鏈抗體要比完整抗體小很多，因此可能具有比完整抗體更大的毛細(xì)管滲透性，從而允許單鏈抗體更有效地定位并更有效地與目的抗原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。同時(shí)，單鏈抗體可以在原核細(xì)胞中較大量地產(chǎn)生，從而便利于它們的生產(chǎn)。進(jìn)而，單鏈抗體相對(duì)較小的大小使得它們?cè)诮邮苷?recipient)中引起不合乎需要的免疫應(yīng)答的可能性比完整抗體更小。
用來產(chǎn)生單鏈抗體的肽接頭可以是柔性的肽，柔性肽的選擇確保VL和VH連接后形成正確的三維折疊，以便使其保持全長的抗KDR抗體的目標(biāo)分子結(jié)合活性。通常，VL或VH序列的羧基端被這樣的肽接頭連接到互補(bǔ)VH或VL序列的氨基端。該接頭通常為10-50個(gè)氨基酸殘基。優(yōu)選地，該接頭為10-30個(gè)氨基酸殘基。更優(yōu)選地，該接頭為12-30個(gè)氨基酸殘基。最優(yōu)選地，該接頭為15-25個(gè)氨基酸殘基。這樣的接頭肽的一個(gè)例子為(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3。
單鏈抗體，每個(gè)具有通過一個(gè)第一肽接頭共價(jià)連接的一個(gè)VH和一個(gè)VL，可以至少被另一個(gè)肽接頭共價(jià)連接以形成多價(jià)單鏈抗體。多價(jià)單鏈?zhǔn)沟镁哂型暾贵w的特異性和抗體親抗源性，但是缺少全長抗體的恒定區(qū)的抗體片段的構(gòu)建成為可能。
多價(jià)免疫球蛋白抗體可以是單特異性的或多特異性的。術(shù)語特異性指特定免疫球蛋白分子能夠結(jié)合的不同抗原決定簇的數(shù)目。如果免疫球蛋白分子只能結(jié)合一種抗原決定簇，該免疫球蛋白分子就是單特異性的。如果免疫球蛋白分子能結(jié)合不同的抗原決定簇，那么該免疫球蛋白分子就是多特異性的。
例如雙特異性多價(jià)抗原允許其識(shí)別兩個(gè)不同的表位。上述表位可以都在KDR上。替代地，一個(gè)表位可以是在KDR上，而另一個(gè)表位可以在其它抗原上。
多價(jià)單鏈抗體的每一條鏈包含一個(gè)輕鏈可變片段和一個(gè)重鏈可變片段，并且通過肽接頭和至少一個(gè)其它鏈連接。上述肽接頭至少由15個(gè)氨基酸殘基組成。最大氨基酸殘基數(shù)大約為100。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，VL和VH結(jié)構(gòu)域的數(shù)目是相等的。優(yōu)選地，肽接頭(L1)將VH和VL結(jié)構(gòu)域連接在一起形成一條鏈，肽接頭(L2)將兩條或多條鏈連接在一起形成具有基本上相同氨基酸序列的多價(jià)scFv。
例如，兩價(jià)單鏈抗體可以如下表示VL-L1-VH-L2-VL-L1-VH，或VL-L1-VH-L2-VH-L1-VL，或VH-L1-VL-L2-VH-L1-VL，或VH-L1-VL-L2-VL-L1-VH。
三價(jià)或更高價(jià)的多價(jià)單鏈抗體具有通過其它肽連接序列連接到兩價(jià)單鏈抗體上的肽片段。三價(jià)單鏈抗體的一個(gè)例子為VL-L1-VH-L2-VL-L1-VH-L2-VL-L1-VH兩個(gè)單鏈抗體可以被組合成二體，也稱為二價(jià)二聚體。二體具有兩條鏈，二體的每條鏈含有一個(gè)與VL結(jié)構(gòu)域連接的VH結(jié)構(gòu)域。連接結(jié)構(gòu)域的接頭足夠短，以防止同一條鏈上的結(jié)構(gòu)域之間配對(duì)，因而促使不同鏈上的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，從而再現(xiàn)兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。上述肽接頭包括至少5個(gè)氨基酸殘基和不多于10個(gè)氨基酸殘基，例如，(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)，(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2。上述二體的結(jié)構(gòu)是剛性而緊密的。抗原結(jié)合位點(diǎn)位于該分子相對(duì)的兩端。二體可以是單特異性的或雙特異性的。
三個(gè)單鏈抗體可以被組合成三體，也稱為三價(jià)三聚體。三體是通過VL或VH結(jié)構(gòu)域的氨基端直接與VH或VL結(jié)構(gòu)域的羧基端融合而構(gòu)建的，即，無任何接頭序列。三體含有三個(gè)Fv頭部，其多肽是以環(huán)狀的，頭尾相接的方式排列的。三體分子的可能構(gòu)象是平面的，三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)位于一個(gè)平面上，彼此之間的角度為120度。三體可以是單特異性的，雙特異性的或三特異性的。
優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體含有完整抗體的所有6個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)，雖然含有少于所有的這些區(qū)域，例如3個(gè)，4個(gè)或5個(gè)CDR，的抗體也是具有功能的。
為了將鼠源抗體的免疫原性最小化，本發(fā)明還提供了與KDR的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合并中和受體的激活的，嵌合的和人源化的抗體。嵌合抗體含有源自小鼠抗體的可變區(qū)和源自人類抗體的恒定區(qū)。嵌合抗體保持了它的結(jié)合特異性，但是更接近天然的人抗體。人源化抗體含有小鼠氨基酸的部份僅僅為那些識(shí)別KDR所必需的部分，即，CDR。
可以通過結(jié)合基本上或完全編碼人類恒定區(qū)的DNA和編碼可變區(qū)的DNA而制備得到編碼嵌合抗體的DNA，上述可變區(qū)基本上或完全源自除了人類以外的哺乳動(dòng)物的可變區(qū)序列。
可以通過結(jié)合編碼恒定區(qū)和除了CDR外的可變區(qū)的DNA和編碼CDR的DNA而制備編碼人源化抗體的DNA，上述恒定區(qū)和除了CDR外的可變區(qū)基本上或完全源自相應(yīng)的人類抗體，上述CDR基本上或完全源自人類以外的哺乳動(dòng)物。
除了人類以外的適當(dāng)?shù)牟溉閯?dòng)物包括任何可以從其制備單克隆抗體的哺乳動(dòng)物。這樣的哺乳動(dòng)物的例子包括兔子、大鼠、小鼠、馬、山羊或靈長類。小鼠是優(yōu)選的。
編碼抗體片段的DNA分子的適當(dāng)來源包括任何表達(dá)全長抗體的細(xì)胞，如雜交瘤和脾細(xì)胞。另一來源是本領(lǐng)域中已知的，從噬菌體展示文庫產(chǎn)生的單鏈抗體。
本發(fā)明的抗體可以是任何類型的免疫球蛋白，如IgG，IgM，IgA，IgD，或IgE，和它們的亞類的成員，或者由這些成員結(jié)合而成。
用于制備免疫球蛋白分子的KDR通常是與細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞，結(jié)合的。上述KDR也可以是與非內(nèi)皮細(xì)胞，如腫瘤細(xì)胞，結(jié)合。替代地，KDR可以是不與細(xì)胞結(jié)合的，優(yōu)選地為可溶形式。
在以下的實(shí)施例中，封閉VEGF和KDR結(jié)合的高親和性抗KDR scFv抗體分離自噬菌體展示文庫，上述文庫是從用可溶形式的人類VEGF受體免疫的小鼠構(gòu)建得到的。經(jīng)過兩輪篩選后回收的克隆的90％以上對(duì)KDR具有特異性。KDR與這些scFv結(jié)合的親和性是在nM的范圍內(nèi)，這與幾種通過雜交瘤技術(shù)制備的抗KDR二價(jià)單克隆抗體的親和性一樣高。
人類噬菌體文庫也可以被用來產(chǎn)生這樣的高親和性抗KDR scFv抗體。
上述scFv抗體，p1C11(圖4)，是從分離自噬菌體展示文庫的單鏈抗體(scFv)制備得到的。(參見下文的實(shí)施例)。p1C11被顯示能夠封閉VEGF-KDR相互作用，抑制VEGF刺激的受體磷酸化和HUVEC有絲分裂。該scFv同時(shí)結(jié)合可溶性的KDR和在HUVEC細(xì)胞表面表達(dá)的KDR。p1C11是本發(fā)明的一種優(yōu)選的scFv。它和KDR以高親和性結(jié)合(Kd＝2.1nM)。
本發(fā)明抗體的每個(gè)結(jié)構(gòu)域都可以是完整的免疫球蛋白重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，或者它可以是天然存在的結(jié)構(gòu)域的功能對(duì)等物或突變體或衍生物，或者是利用，例如，諸如WO93/11236(Medical ResearchCouncil et al./Griffiths et al.)中描述的技術(shù)體外構(gòu)建的合成結(jié)構(gòu)域。例如，可以將相應(yīng)于抗體可變結(jié)構(gòu)域的，缺少至少一個(gè)氨基酸的結(jié)構(gòu)域連接在一起。最重要的特征是每個(gè)結(jié)構(gòu)域與互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域連接形成抗原結(jié)合位點(diǎn)的能力。因此，術(shù)語“重鏈/輕鏈可變片段”不應(yīng)當(dāng)被解釋為將對(duì)本發(fā)明發(fā)揮作用無實(shí)質(zhì)性影響的變體排除在外。
本發(fā)明的功能對(duì)等物包括氨基酸序列和全長KDR抗體的可變區(qū)或高變區(qū)的氨基酸序列基本上相同的多肽?！盎旧舷嗤钡陌被嵝蛄性诒疚闹斜欢x為一段氨基酸序列和另一氨基酸序列的同源性至少為70％，優(yōu)選地至少為約80％，更優(yōu)選地至少為約90％，上述同源性是通過根據(jù)Pearson and Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.UsA 85，2444-2448(1988)的FASTA搜索方法確定的。
本發(fā)明的抗體可以與另外的氨基酸殘基融合。這樣的殘基可以是一段肽標(biāo)記(peptide tag)，也許是為了便于分離，或者它們可以是在合成時(shí)從宿主細(xì)胞分泌的信號(hào)序列?？梢赃m當(dāng)?shù)厥褂梅置谝龑?dǎo)序列，引導(dǎo)序列是與多肽的N-末端連接的將該多肽導(dǎo)出細(xì)胞質(zhì)的氨基酸序列。
本發(fā)明還提供了含有根據(jù)本發(fā)明的多肽的編碼序列的核酸分子，以及這樣的核酸的各種庫。
可以通過已知的技術(shù)，如PCT申請(qǐng)WO93/21319，WO89/09622，歐洲專利申請(qǐng)239,400，338,745和332,424中所描述的技術(shù)和/或其它常規(guī)的重組DNA技術(shù)進(jìn)行上文描述的DNA的缺失和重組，如下文所述。
在下文描述的實(shí)施例中從p1c11產(chǎn)生了嵌合的抗KDR抗體，c-p1C11。嵌合-p1C11與可溶的以及細(xì)胞表面表達(dá)的KDR的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域特異性地結(jié)合。c-p1C11的結(jié)合親和性為0.82nM。它有效地中和了人類內(nèi)皮細(xì)胞的KDR和MAP激酶p44/p42的激活。另外，c-p1C11有效地中和了VEGF誘導(dǎo)的人類內(nèi)皮細(xì)胞有生分裂。
c-p1C11與KDR的結(jié)合比其母體scFv，p1C11，更為有效，并且在中和KDR相互作用的活性上和在抑制VEGF刺激的HUVEC有絲分裂上更為強(qiáng)有力。c-p1C11結(jié)合KDR的親和性大約為其母體scFv的2.5倍，這主要是由于二價(jià)c-p1C11的較低的解離速率(見表2)。
實(shí)施例下文列出的實(shí)施例是用來幫助對(duì)本發(fā)明的理解，而不是用來，并不應(yīng)被理解為用來，在任何方面限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例不包括對(duì)傳統(tǒng)方法的詳細(xì)描述，如那些用于構(gòu)建載體和質(zhì)粒的方法，將編碼多肽的基因插入到這樣的載體和質(zhì)粒的方法或?qū)①|(zhì)粒引入宿主細(xì)胞的方法。這樣的方法對(duì)于本領(lǐng)域中具有普通技術(shù)的人員是眾所周知的，并且在許多出版物中都有所描述，包括Sambrook，J.，fritsch，E.F.and Maniais，T.(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press.實(shí)施例I.單鏈抗體的產(chǎn)生實(shí)施例I(a)細(xì)胞系和蛋白原代培養(yǎng)的HUVEC細(xì)胞在EBM-2培養(yǎng)基中，在37℃，5％ CO2的條件下維持。所有分析中使用的細(xì)胞都在2-5代之間。VEGF165蛋白在桿狀病毒中表達(dá)并純化。編碼KDR細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的cDNA是通過RT-PCR從人胎腎mRNA中分離得到的，并且被亞克隆到AP-Tag載體的Bg1 II和BspE I位點(diǎn)之間。在上述質(zhì)粒中，KDR的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與人胎盤AP cDNA在讀碼框架內(nèi)融合。上述質(zhì)粒與新霉素表達(dá)載體pSV-Neo一起被通過電穿孔法導(dǎo)入NIH3T3細(xì)胞，并用G418選擇穩(wěn)定的細(xì)胞克隆。利用固定的針對(duì)AP的單克隆抗體通過親和層析從細(xì)胞培養(yǎng)物的上清中純化融合蛋白KDR-AP。實(shí)施例I(b).小鼠的免疫和單鏈抗體噬菌體展示文庫的構(gòu)建在雌性BALB/C小鼠的腹膜內(nèi)(i.p.)兩次注射10μg在200μlRIBI佐劑系統(tǒng)中的KDR-AP，并且在兩個(gè)月后進(jìn)行一次無RIBI佐劑的i.p.注射。在第一次免疫同時(shí)，也在上述小鼠的皮下(s.c.)注射10μg在200μlRIBI佐劑系統(tǒng)中的KDR-AP。在進(jìn)行安樂死的三天之前，對(duì)上述小鼠腹膜內(nèi)進(jìn)行20μg KDR-AP的加強(qiáng)注射。取出供體小鼠的脾臟并且分離細(xì)胞。提取RNA，并從脾細(xì)胞的總RNA中純化mRNA。利用上述mRNA構(gòu)建scFv噬菌體展示文庫，該mRNA被展示在絲狀噬菌體M13的表面。
在絲狀噬菌體表面展示scFv時(shí)，抗體VH和VL結(jié)構(gòu)域通過15個(gè)氨基酸長的接頭(GGGGS)3被連接在一起并且與噬菌體蛋白III的N末端融合。在VL的C末端和蛋白III之間插入一個(gè)15氨基酸長的E標(biāo)記物，其后緊接琥珀密碼子(TAG)，以便用于檢測和其它分析目的。位于E標(biāo)記物和蛋白III之間的琥珀密碼子使得當(dāng)構(gòu)建體被轉(zhuǎn)入到抑制宿主時(shí)(如TGI細(xì)胞)，構(gòu)建體以表面展示的形式制造scFv，當(dāng)構(gòu)建體被轉(zhuǎn)入到非抑制宿主時(shí)(如HB2151)，構(gòu)建體以可溶的形式制造scFv。
裝配的scFv DNA被連接到PCANTAB 5E載體。轉(zhuǎn)化后的TG1細(xì)胞被涂布到2YTAG平板上并溫育。將菌落刮取到10ml 2YT培養(yǎng)基中，與5ml 50％的甘油混合并儲(chǔ)存在-70 C作為文庫的儲(chǔ)存物。實(shí)施例I(c)生物淘選(Biopanning)文庫的儲(chǔ)存物被生長到對(duì)數(shù)生長期，用M13K07輔助噬菌體援救(resecue)并在2YTAK培養(yǎng)基含有(100μg/ml氨芐青霉素和50μg/ml卡那霉素的2YT培養(yǎng)基)中30C擴(kuò)增過夜。噬菌體制備物用4％PEG/0.5M NaCl沉淀，重懸浮于含有500μg/mlAP蛋白的3％脫脂牛奶/PBS中，并在37C溫育1小時(shí)以捕獲展示抗AP scFv的噬菌體并封閉其它非特異性結(jié)合。
將用KDR-AP(10μg/ml)包被的Maxisorp Star管(Nunc，Denmark)首先用3％牛奶/PBS在37C封閉1小時(shí)，然后與噬菌體制備物在室溫溫育1小時(shí)。將該管用PBST洗10次后，用PBS洗10次(含0.1％吐溫20的PBS)。將結(jié)合的噬菌體在室溫用新鮮制備的100mM三乙胺洗脫10分鐘。將洗脫的噬菌體與10ml對(duì)數(shù)中期的TG1細(xì)胞37C靜置溫育30分鐘和搖晃溫育30分鐘。將感染的TG1細(xì)胞涂布到2YTAG平板上并30C溫育過夜。
經(jīng)過3輪篩選后，百分之九十九(185/186)的克隆都被發(fā)現(xiàn)是KDR的特異性結(jié)合者。但是，這些結(jié)合者中只有15個(gè)(8％)能夠封閉KDR與固定的VEGF的結(jié)合。這15個(gè)克隆的BstN I指紋圖譜表明存在兩種不同的消化圖譜；而21種隨機(jī)挑取的VEGF非封閉克隆(non-blocker)產(chǎn)生4種不同的方式。在第二輪淘選后鑒定的克隆中也見到了所有的消化圖譜。
從第二輪淘選后的克隆中挑出每種消化圖譜的代表克隆并進(jìn)行DNA測序。在15個(gè)測序的克隆中，鑒定出了2個(gè)獨(dú)特的VEGF封閉克隆(blocker)和3個(gè)非封閉克隆。一種既不結(jié)合KDR也不封閉VEGF和KDR的結(jié)合的scFv，p2A7，被選出作為所有研究的陰性對(duì)照。實(shí)施例I(d)噬菌體ELISA在96孔板中37℃生長單個(gè)克隆，并如上文所述用M13K07輔助噬菌體進(jìn)行援救。擴(kuò)增的噬菌體制備物用1/6體積的18％牛奶/PBS室溫封閉1小時(shí)，并加入到用KDR-AP或AP(1μg/ml×100μl)包被的Maxi-sorp 96孔微量滴定板(Nunc)。室溫溫育1小時(shí)后，將滴定板用PBST洗3次，并與兔抗M13噬菌體-HRP交聯(lián)物溫育。將滴定板洗5次，加入TMB過氧化物酶底物，用讀板機(jī)讀取450nm的OD，鑒定scFv抗體并測序。實(shí)施例I(e)可溶性scFv的制備用單個(gè)克隆的噬菌體感染非抑制(non-suppressor)E.coli宿主HB2151，并在2YTAG-N平板上篩選被感染的宿主。通過在含有1mM異丙基β-D硫代半乳糖苷的2YTA培養(yǎng)基中30C培養(yǎng)細(xì)胞而誘導(dǎo)scFv在HB2151細(xì)胞中的表達(dá)。細(xì)胞周質(zhì)抽提物的制備如下將細(xì)胞沉淀懸浮于含有20％(w/v)20％蔗糖，200mM NaCl，1mM EDTA和0.1mMPMSF的25mM Tris(pH7.5)中，然后在4C溫育并輕柔攪拌1小時(shí)。15,000rpm離心15分鐘后，利用RPAS Purification Module(Pharmacia Biotech)通過親和層析從上清中純化可溶性的scFv。實(shí)施例II分析檢測實(shí)施例II(a)定量KDR結(jié)合分析兩種分析方法被用來定量檢驗(yàn)純化的可溶scFv與KDR的結(jié)合。
用非抑制宿主E.coli HB 2151細(xì)胞在搖床燒瓶中表達(dá)4個(gè)不同的克隆，包括兩個(gè)VEGF封閉克隆，p1C11和p1F12，一個(gè)非封閉克隆，顯性克隆p2A6和一個(gè)不結(jié)合的克隆，p2A7。通過抗-E-標(biāo)記的親和層析從E.coli的周質(zhì)抽提物中純化可溶的scFv。這些克隆的純化scFv的產(chǎn)量在100-400μg/升培養(yǎng)物之間。
在直接結(jié)合分析中，不同量的可溶scFv被加入到KDR包被的96孔Maxi-sorp微量滴定板中并在室溫溫育1小時(shí)，然后用PBST洗板3次。然后將滴定板在室溫與100μl小鼠抗-E-標(biāo)記抗體溫育1小時(shí)，接著與100pl兔抗鼠抗體-HRP交聯(lián)物溫育。按照上文噬菌體ELISA實(shí)驗(yàn)中描述的方法將滴定板洗滌和顯色。
在另一個(gè)分析檢測中，即，競爭性VEGF封閉檢測中，不同量的scFv與固定量的KDR-AP(50ng)混合并在室溫溫育1個(gè)小時(shí)。將混合物轉(zhuǎn)移到用VEGF165(200ng/孔)包被的96孔微量滴定板并在室溫繼續(xù)溫育2小時(shí)，然后將滴定板洗5次，加入AP的底物以對(duì)結(jié)合的KDR-AP分子定量。然后計(jì)算IC50，即，50％抑制KDR與VEGF結(jié)合所需要的scFv濃度。
圖1示通過直接結(jié)合ELISA測定的，scFv和固定的KDR的劑量依賴型結(jié)合。如圖2中所示，克隆p1C11和克隆p1F12也能封閉KDR與固定的VEGF的結(jié)合，但是克隆p2A6不能。圖2中所示的數(shù)據(jù)是3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)±SD。陰性對(duì)照克隆，p2A7既不能結(jié)合KDR也不能封閉KDR與VEGF的結(jié)合(圖1和2)?？寺1C11，每次淘選后的顯性克隆，表現(xiàn)出最高的KDR結(jié)合能力和最大的封閉VEGF與KDR結(jié)合的強(qiáng)度(表1)。與KDR 50％最大結(jié)合所需要的和50％抑制KDR與VEGF結(jié)合所需要的克隆p1C11的抗體濃度分別為0.3nM和3nM(見表1)。FACS分析表明p1C11，p1F12和p2A6也能與HUVEC細(xì)胞表面表達(dá)的受體結(jié)合。實(shí)施例II(b)可溶scFv的BIAcore分析用BIAcore生物感應(yīng)器(Pharmacia Biosensor)測量了可溶性scFv與KDR結(jié)合的動(dòng)力學(xué)。KDR-AP融合蛋白被固定到感應(yīng)器的芯片上，被注射的可溶性scFv的濃度在62.5nM到1000nM之間。在每個(gè)濃度得到感應(yīng)器譜圖(Sensorgram)，并用一個(gè)程序，BIA Evaluation2.0對(duì)其進(jìn)行評(píng)估，以確定速率常數(shù)kon和koff。從速率常數(shù)kon/koff的比率計(jì)算得到Kd。
表1示在BIAcore儀器上的表面等離子體共振的結(jié)果。VEGF-封閉性的scFv，p1C11和p1F12，分別和固定的KDR以Kd 2.1和5.9nM結(jié)合。非封閉性的scFv，p2A6，與KDR結(jié)合的親和性比最好的結(jié)合克隆p1C11大約弱6倍(Kd，11.2nM)，主要是由于其解離速率要快很多。如所預(yù)期的那樣，p2A7不與固定在BIAcore上的KDR結(jié)合。實(shí)施例II(c)磷酸化分析磷酸化分析是利用HUVEC的早期傳代細(xì)胞按照先前描述的方法進(jìn)行的。簡言之，將HUVEC與補(bǔ)充了0.5％牛血清白蛋白的，無血清的EBM-2基礎(chǔ)培養(yǎng)基在有或無5μg/ml scFv抗體的情況下室溫溫育10分鐘，然后用20ng/ml的VEGF165在室溫繼續(xù)刺激15分鐘。裂解細(xì)胞，用偶聯(lián)了兔抗KDR多克隆抗體(ImClone Systems Incorporated)的蛋白A Sepharose小珠從細(xì)胞裂解液中免疫沉淀KDR受體。洗滌小珠，與SDS上樣緩沖液混合，將上清進(jìn)行Western印跡分析。為了檢測KDR的磷酸化，印跡用抗磷酸化酪氨酸的Mab，4G10檢測。對(duì)于MAP激酶活性分析，將細(xì)胞裂解液用SDS-PAGE進(jìn)行解析后利用磷特異的MAP激酶抗體進(jìn)行Western印跡分析。所有的信號(hào)都用FCL探測。
結(jié)果表明VEGF-封閉性的scFv p1C11能夠抑制VEGF刺激的KDR受體的磷酸化，而非封閉性的scFv p2A6不能。進(jìn)而，p1C11也有效地抑制了VEGF刺激對(duì)MAP激酶p44/p42的激活。相反，p1C11和p2A6都不能抑制FGF刺激對(duì)MAP激酶p44/p42的激活。實(shí)施例II(d)抗有絲分裂原分析將HUVEC(5×103細(xì)胞/孔)加入到96孔組織培養(yǎng)板(Wallach，Inc.，Gaithersburg，MD)的200μl無VEGF，bFGF或EGF的EBM-2培養(yǎng)基中并在37C溫育72小時(shí)。往一式兩份的平行孔(duplicate wells)中加入不同量的抗體并在37C預(yù)溫育1小時(shí)，然后加入終濃度16ng/ml的VEGF165。溫育18小時(shí)后往每個(gè)孔中加入0.25μCi的[3H]-TdR(Amersham)并繼續(xù)溫育4小時(shí)。將細(xì)胞置于冰上，用無血清的培養(yǎng)基洗兩次，然后與10％TCA在4C溫育10分鐘。然后將細(xì)胞用水洗一次，并用25μl2％的SDS溶解。加入閃爍液(150μl/孔)并在液閃計(jì)數(shù)器(Wallach，Model 1450 MicrobetaScintillation Counter)上測定摻入DNA的放射性活性。
scFv抗體封閉HUVEC上VEGF刺激的有絲分裂原活性的結(jié)果在圖3顯示。VEGF-封閉性的scFv p1C11強(qiáng)有力地抑制了HUVEC中VEGF誘導(dǎo)的DNA合成，其EC50，即對(duì)VEGF刺激的HUVEC有絲分裂50％抑制所需要的抗體濃度，為大約5nM。非封閉性的scFv p2A6對(duì)VEGF的有絲分裂原活性表現(xiàn)為無抑制效應(yīng)。p1C11和p2A6都不能抑制HUVEC中bFGF誘導(dǎo)的DNA合成(數(shù)據(jù)未示出)。圖3中顯示的數(shù)據(jù)為至少3次單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的代表。()只有VEGF；()無VEGF。實(shí)施例IV.嵌合抗體的產(chǎn)生實(shí)施例IV(a)細(xì)胞系和蛋白原代培養(yǎng)的人臍靜脈細(xì)胞(HUVEC)在EBM-2培養(yǎng)基中，在37℃，5％CO2的條件下維持。所有分析中使用的細(xì)胞都在2-5代之間。VEGF165和KDR-堿性磷酸酶融合蛋白(KDR-AP)分別在桿狀病毒中和NIH 3T3細(xì)胞中表達(dá)，并按照上文描述的方法純化?？筀DR的scFvp1C11和scFv p2A6，一種與KDR結(jié)合但是不封閉KDR-VEGF相互作用的抗體，是從噬菌體展示文庫分離得到的，上述噬菌體展示文庫是從用KDR免疫的小鼠構(gòu)建得到的，如上文所述。C225是針對(duì)上皮生長因子(EGF)受體的一種嵌合IgG1抗體。實(shí)施例(b)scFv p1C11可變結(jié)構(gòu)域的克隆p1C11的輕鏈(VL)和重鏈(VH)可變結(jié)構(gòu)域是分別利用引物1和2，以及引物3和4，通過PCR從scFv表達(dá)載體克隆得到的。分別利用引物5和2，以及引物5和4，通過PCR，將用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中負(fù)責(zé)蛋白分泌的引導(dǎo)肽序列加入到VL和VH的5’端。引物15′CTA GTA GCA ACT GCA ACT GGA GTA CAT TCA GAC ATCGAG CTC3′引物25′TCG ATC TAG AAG GAT CCA CTC ACG TTT TAT TTC CAG3′BamHI引物35′CTA GTA GCA ACT GCA ACT GGA GTA CAT TCA CAG GTCAAG CTG3′引物45′TCG AAG GAT CCA CTC ACC TGA GGA GAC GGT3′BamHI引物55′GGT CAAAAG CTTATG GGA TGG TCA TGT ATC ATC CTT TTTHindIIICTA GTA GCA ACT3′實(shí)施例IV(e)嵌合p1C11 IgG表達(dá)載體的構(gòu)建分別構(gòu)建了用于表達(dá)嵌合IgG輕鏈和重鏈的載體。克隆的VL基因用Hind III和BamHI水解，并與含有人κ輕鏈恒定區(qū)(CL)的載體pKN100連接以產(chǎn)生表達(dá)嵌合p1C11輕鏈，c-p1C11-L，的載體。克隆的VH基因用HindIII和BamH I水解，并與含有人IgG1(γ)重鏈恒定區(qū)(CH)的載體pGID105連接以產(chǎn)生表達(dá)嵌合p1C11重鏈，c-p1C11-H，的表達(dá)載體。通過限制性內(nèi)切酶水解檢測上述兩種構(gòu)建體，并通過脫氧核酸測序確認(rèn)。
如圖4中所見，VH和VL結(jié)構(gòu)域都在其5’端精確地和編碼導(dǎo)肽序列的基因片段融合，如所標(biāo)明的那樣。VH和VL結(jié)構(gòu)域通過HindIII和BamH I水解位點(diǎn)分別被連接到載體pG1D105和pKN100上，上述質(zhì)粒pG1D105含有cDNA形式的人γ1恒定區(qū)基因，質(zhì)粒pKN100含有cDNA形式的人κ鏈恒定區(qū)基因。在每種情況下，表達(dá)都是在HCMVi啟動(dòng)子的控制之下，并且由人工終止序列終止。根據(jù)Kabat et al.等人的關(guān)于高變序列的描述定義的輕鏈和重鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)用下劃線表示并且分別標(biāo)明CDR-H1到H3和CDR-L1到L3。實(shí)施例IV(d)IgG的表達(dá)和純化用等量的c-p1C11-L和c-p1C11-H質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞以進(jìn)行IgG的瞬時(shí)表達(dá)。在含有DMEM/10％FCS的150mm培養(yǎng)皿中生長的分會(huì)合(subconfluent)COS細(xì)胞用20ml含有40mM Tris(pH7.4)的DMEM洗滌一次，然后與4ml的DMEM/DEAE-Dextran/DNA混合物(含有40mM Tris，0.4mg/ml的DEAE-Dextran(Sigma)，以及c-p1C11-L和c-p1C11-H質(zhì)粒各20μg的DEME)在37C一起溫育4.5小時(shí)。上述細(xì)胞與4ml含有100nM氯喹(Sigma)的DMEM/2％FCS在37℃溫育1小時(shí)，然后與1.5ml 20％的甘油/PBS在室溫溫育1min。上述細(xì)胞用DMEM/5％FCS洗滌兩次并在20ml同樣的培養(yǎng)基中37℃溫育過夜。用普通的DMEM洗滌兩次后，將上述細(xì)胞轉(zhuǎn)入無血清的DMEM/HEPES培養(yǎng)基中。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)和120小時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)物的上清。按照廠商(Pharmacia Biotech)所描述的方法利用Protein G柱通過親和層析從收集的上清中純化嵌合的IgG。收集含有IgG的級(jí)分，將緩沖液換成PBS，并用Centricon 10濃縮器濃縮(Amicon Corp.，Beverly，MA)。IgG的純度用SDS-PAGE進(jìn)行分析。用羊抗人y鏈特異的抗體作為捕捉劑，用HRP交聯(lián)的羊抗人k鏈抗體作為檢測試劑，通過ELISA確定純化的抗體的濃度。利用臨床級(jí)別的抗體，C225，校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線。
Protein G親和純化后，在SDS-PAGE中看到一條～150KD的單一蛋白條帶。用HRP交聯(lián)的抗人IgG1 Fc特異的抗體進(jìn)行的Western印跡分析確認(rèn)了純化的蛋白中存在人IgG Fc部分(未顯示)。
ELISA結(jié)果表明c-p1C11與固定的KDR的結(jié)合比母體scFv更有效(圖5)。實(shí)施例V.檢測和分析實(shí)施例V(a).FACS分析將早期傳代(early passage)的HUVEC細(xì)胞在無生長因子的EBM-2培養(yǎng)基生長過夜，以誘導(dǎo)KDR的表達(dá)。收集上述細(xì)胞并用PBS洗滌三次，與c-p1C11 IgG(5μg/ml)在4C溫育1小時(shí)，然后與FITC標(biāo)記的兔抗人Fc抗體(Capper，Organon Teknika Corp.，WestChester，PA)繼續(xù)溫育60min。洗滌上述細(xì)胞并用流式細(xì)胞儀(ModelEPICS，CoulterCorp.，Edison，NJ)分析。
圖6是顯示c-p1C11與表達(dá)KDR的HUVEC結(jié)合的FACS分析圖。與先前在母體scFv中所見到的那樣，c-p1C11與在早期傳代HUVEC上表達(dá)的KDR特異結(jié)合。實(shí)施例V(b).定量KDR結(jié)合分析將不同量的抗體加入到KDR包被的96孔Maxi-sorp微滴定量板(Nunc.Danmark)并在室溫溫育1小時(shí)，然后用含有0.1％吐溫-20的PBS將上述滴定板洗滌三次。然后，對(duì)于scFv，將上述滴定板與100μl的小鼠抗-E標(biāo)記的抗體-HRP交聯(lián)物(Pharmacia Biotech)室溫溫育1小時(shí)，或?qū)τ谇逗螴gG，將滴定板與100μl兔抗人IgG特異的抗體-HRP交聯(lián)物(Cappel，Organon Teknika Corp.)室溫溫育1小時(shí)。將滴定板洗滌5次，加入TMB過氧化物酶底物(KPL，Gaithersburg，MD)，用讀板機(jī)(Molecular Device，Sunnyvale，CA)讀取450nm的OD值。
圖5是顯示抗體與固定的KDR直接結(jié)合的圖。顯示的結(jié)果表明C-p1C11與固定的KDR受體的結(jié)合比其母體scFv更有效實(shí)施例V(c)BIAcore分析用BIAcore生物感應(yīng)器(Pharmacia Biosensor)測量了抗體與KDR結(jié)合的動(dòng)力學(xué)。KDR-AP融合蛋白被固定到感應(yīng)器芯片上，濃度在25nM到200nM之間的抗體或VEGF被注射入。在每個(gè)濃度得到感應(yīng)器譜圖(Sensorgram)，并用一個(gè)程序，BIA Evaluation 2.0對(duì)其進(jìn)行評(píng)估，以確定速率常數(shù)kon和koff。從速率常數(shù)kon/koff的比率計(jì)算得到Kd。
BIAcore分析結(jié)果表明c-p1C11與KDR的結(jié)合比其母體scFv的親和性更高(表2)。c-p1C11的Kd是0.82nM，而scFv的是2.1nM。c-p1C11親和性的升高主要是由于二價(jià)的嵌合IgG的解離速率(koff)較低。值得注意的是c-p1C11和KDR結(jié)合的親和性(Kd)與天然配基VEGF結(jié)合KDR的親和性，根據(jù)BIAcore分析的測定為0.93nM(表2)，相似。實(shí)施例V(d)競爭性VEGF結(jié)合實(shí)驗(yàn)在第一個(gè)分析實(shí)驗(yàn)中，將不同量的抗體與固定量的KDR-AP(50ng)混合并在室溫溫育1小時(shí)。然后將混合物轉(zhuǎn)移到VEGF165(200ng/孔)包被的96孔微量滴定板并在室溫繼續(xù)溫育2小時(shí)，之后將滴定板洗5次，加入AP的底物(p-硝基酚磷酸(p-nitrophenyl phosphate)，Sigma)以對(duì)結(jié)合的KDR-AP分子進(jìn)行定量。然后計(jì)算EC50，即50％抑制KDR與VEGF結(jié)合所需要的抗體濃度。
圖7顯示c-p1C11以劑量依賴的方式封閉了KDR受體與固定的VEGF的結(jié)合。在封閉VEGF-KDR相互作用上嵌合抗體更為強(qiáng)有力，其IC50為0.8nM，而scFv的為2.0nM。作為對(duì)照的scFv p2A6也與KDR結(jié)合，但是不能封閉VEGF-KDR相互作用(圖7)。
在第二個(gè)分析實(shí)驗(yàn)中，將不同量的c-p1C11抗體或無同位素標(biāo)記的VEGF165蛋白與固定量的125I標(biāo)記的VEGF165混合并加入到KDR受體包被的96孔微量滴定板。滴定板在室溫溫育2小時(shí)，洗滌5次后計(jì)數(shù)與固定的KDR受體結(jié)合的放射性標(biāo)記的VEGF165。確定50％封閉放射性VEGF與固定的KDR受體結(jié)合所需要的c-p1C11和未標(biāo)記VEGF165的濃度。
對(duì)放射性標(biāo)記的VEGF165結(jié)合的抑制的結(jié)果在圖8顯示。顯示的數(shù)據(jù)是三次重復(fù)測量的平均值。顯示結(jié)果表明c-p1C11能以劑量依賴的方式有效地與125I標(biāo)記的VEGF競爭結(jié)合固定的KDR受體。如所預(yù)期的那樣，C225，針對(duì)EGF受體的的嵌合抗體不與KDR受體結(jié)合或封閉VEGF-KDR相互作用(結(jié)果未顯示)。實(shí)施例V(e)磷酸化分析實(shí)驗(yàn)前將接近匯合(subconfluent)的HUVEC細(xì)胞在無生長因子的EBM-2培養(yǎng)基中生長24到48小時(shí)。用50nM正釩酸鈉預(yù)處理30分鐘后，細(xì)胞在有或無抗體的條件下溫育15分鐘，然后用20ng/ml的VEGF165或10ng/ml的EGF繼續(xù)刺激15分鐘。然后在裂解緩沖液(50nM Tris，150mM NaCl，1％NP-40，2mM EDTA，0.25％脫氧膽酸鈉，1mM PMSF，1μg/ml亮肽素(Leupeptin)，1μg/ml抑肽素(pepstatin)，10μg/ml抑肽酶(aprotinin)，pH7.5)中裂解細(xì)胞，將細(xì)胞裂解液用于KDR和MAP激酶磷酸化分析。用偶聯(lián)了抗KDR抗體，Mab 4.13(ImClone Systems)的蛋白A Sepharose小珠(SantaCrutz Biotechnology，Inc.CA)從細(xì)胞裂解液中免疫沉淀KDR受體。用SDS-PAGE解析蛋白并進(jìn)行Western印跡分析。為了檢測KDR磷酸化，用抗磷酸酪氨酸Mab，PY20(ICN Biomedicals，Inc.Aurora，OH)對(duì)印跡進(jìn)行探測。對(duì)于MAP激酶活性分析，細(xì)胞裂解液用SDS-PAGE解析，然后用磷酸特異的MAP激酶抗體(New England BioLabs，Beverly，MA)進(jìn)行Western印跡分析。用ECL(Amersham，ArlingtonHeights，IL)檢測所有的信號(hào)。在兩種分析實(shí)驗(yàn)中，用多克隆抗KDR抗體(ImClone Systems)重新檢測印跡以保證在每個(gè)SDS-PAGE凝膠道中上樣了等量蛋白。
C-p1C11有效地抑制了VEGF刺激的KDR受體的磷酸化以及p44/p42 MAP激酶的激活。相反，C225未顯示出任何對(duì)VEGF刺激的KDR受體和MAP激酶的激活的抑制。單獨(dú)的c-p1C11和單獨(dú)的C225對(duì)KDR受體和p44/p42 MAP激酶的活性都無任何的作用。與先前在scFv p1C11中所見到的那樣，c-p1C11不抑制FGF刺激的p44/p42 MAP激酶的激活(未顯示)。此外，scFv p2A6和p2A6的嵌合IgG形式(c-p2A6)都不抑制VEGF刺激的KDR受體和MAP激酶的激活(未顯示)。實(shí)施例V(f).抗有絲分裂分析通過[3H]-TdR DNA摻入分析，用HUVEC確定了抗KDR抗體對(duì)VEGF刺激的人內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂的作用。將HUVEC(5×103細(xì)胞/孔)加入到96孔組織培養(yǎng)板的200μl無VEGF，bFGF或EGF的EBM-2培養(yǎng)基中，并在37C溫育72小時(shí)。將不同量的抗體加入微孔，一式兩份并在37C預(yù)溫育1小時(shí)，然后加入最終濃度為16ng/ml的VEGF165。溫育18小時(shí)后，在每孔中加入0.25μCi的[3H]-TdR并繼續(xù)溫育4小時(shí)。用閃爍計(jì)數(shù)器確定摻入的DNA的放射性。圖9中所示的數(shù)據(jù)是至少三個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的代表。
c-p1C11和scFv p1C11都有效地抑制了VEGF刺激的HUVEC有絲分裂(圖9)。C-p1C11對(duì)VEGF誘導(dǎo)的HUVEC有絲分裂的抑制比母體scFv更強(qiáng)。對(duì)于c-p1C11和scFv，50％抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC有絲分裂所需要的抗體濃度分別是0.8nM和6nM。如所預(yù)期的那樣，scFv p2A26未顯示出任何對(duì)VEGF刺激的內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制作用。
權(quán)利要求
1.一種免疫球蛋白，它與KDR結(jié)合的親和性可與人VEGF相比，并且它中和KDR的激活。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的免疫球蛋白分子，其中該免疫球蛋白分子選自單鏈抗體，雙體，三體或抗體。
3.一種中和KDR的激活的單鏈抗體，其中該單鏈抗體含有至少一個(gè)重鏈可變片段，該重鏈可變片段包含CDRH1，具有SEQ.ID.NO.1所列出的氨基酸序列；CDRH2，具有SEQ.ID.NO.2所列出的氨基酸序列；以及CDRH3，具有SEQ.ID.NO.3所列出的氨基酸序列；以及至少一個(gè)輕鏈可變片段，該輕鏈可變片段包含CDRL1，具有SEQ.ID.NO.4所列出的氨基酸序列；CDRL2，具有SEQ.ID.NO.5所列出的氨基酸序列；以及CDRL3，具有SEQ.ID.NO.6所列出的氨基酸序列。
4.一種中和KDR的激活的單鏈抗體，其中該單鏈抗體含有至少一個(gè)重鏈可變片段，該片段具有SEQ.ID.NO.7所列出的氨基酸序列；以及至少一個(gè)輕鏈可變片段，該片段具有SEQ.ID.NO.8所列出的氨基酸序列。
5.一種編碼權(quán)利要求3的單鏈抗體的核酸分子。
6.權(quán)利要求5的核酸分子，其由SEQ.ID.NO.9所列出的編碼CDRH1的核酸序列；SEQ.ID.NO.10所列出的編碼CDRH2的核酸序列；SEQ.ID.NO.11所列出的編碼CDRH3的核酸序列；SEQ.ID.NO.12所列出的編碼CDRL1的核酸序列；SEQ.ID.NO.13所列出的編碼CDRL2的核酸序列；以及SEQ.ID.NO.14所列出的編碼CDRL3的核酸序列組成。
7.一種編碼權(quán)利要求4的單鏈抗體的核酸分子。
8.權(quán)利要求7的核酸分子，其由SEQ.ID.NO.15所列出的編碼重鏈可變片段的核酸序列；以及SEQ.ID.NO.16所列出的編碼輕鏈可變片段的核酸序列組成。
9.權(quán)利要求3的單鏈抗體，其中重鏈可變片段和輕鏈可變片段通過至少一個(gè)肽接頭共價(jià)地連接在一起。
10.權(quán)利要求9的單鏈抗體，其中肽接頭含有至少15個(gè)氨基酸。
11.權(quán)利要求9的單鏈抗體，其中肽接頭含有SEQ.ID.NO.17所列出的氨基酸序列。
12.一種編碼權(quán)利要求11的肽接頭的核酸分子。
13.權(quán)利要求12的核酸分子，其由SEQ.ID.NO.18所列出的編碼肽接頭的核酸序列組成。
14.一種中和KDR的激活的雙體，其中該雙體含有至少一個(gè)重鏈可變片段，該重鏈可變片段包含CDRH1，具有SEQ.ID.NO.1所列出的氨基酸序列；CDRH2，具有SEQ.ID.NO.2所列出的氨基酸序列；以及CDRH3，具有SEQ.ID.NO.3所列出的氨基酸序列；以及至少一個(gè)輕鏈可變片段，該輕鏈可變片段包含CDRL1，具有SEQ.ID.NO.4所列出的氨基酸序列；CDRL2，具有SEQ.ID.NO.5所列出的氨基酸序列；以及CDRL3，具有SEQ.ID.NO.6所列出的氨基酸序列。
15.一種中和KDR的激活的雙體，其中該雙體含有一個(gè)重鏈可變片段，它具有SEQ.ID.NO.7所列出的氨基酸序列；以及一個(gè)輕鏈可變片段，它具有SEQ.ID.NO.8所列出的氨基酸序列。
16.一種編碼權(quán)利要求14的雙體的核酸分子。
17.權(quán)利要求16的核酸分子，其由SEQ.ID.NO.9所列出的編碼CDRH1的核酸序列；SEQ.ID.NO.10所列出的編碼CDRH2的核酸序列；SEQ.ID.NO.11所列出的編碼CDRH3的核酸序列；SEQ.ID.NO.12所列出的編碼CDRL1的核酸序列；SEQ.ID.NO.13所列出的編碼CDRL2的核酸序列；以及SEQ.ID.NO.14所列出的編碼CDRL3的核酸序列組成。
18.一種編碼權(quán)利要求15的雙體的核酸分子。
19.權(quán)利要求18的核酸分子，其由SEQ.ID.NO.15所列出的編碼重鏈可變片段的核酸序列；以及SEQ.ID.NO.16所列出的編碼輕鏈可變片段的核酸序列組成。
20.權(quán)利要求14的雙體，其中重鏈可變片段和輕鏈可變片段通過至少一個(gè)肽接頭共價(jià)地連接在一起。
21.權(quán)利要求20的雙體，其中肽接頭含有至少5個(gè)氨基酸并且不多于10個(gè)氨基酸。
22.權(quán)利要求21的雙體，其中肽接頭含有SEQ.ID.NO.19所列出的氨基酸序列。
23.一種編碼權(quán)利要求22的肽接頭的核酸分子。
24.權(quán)利要求23的核酸分子，其由編碼SEQ.ID.NO.20所列出的肽接頭的核酸序列組成。
25.權(quán)利要求14的雙體，其中所述的雙體是單一特異性的。
26.權(quán)利要求14的雙體，其中所述的雙體是雙特異性的并且該雙體與KDR上至少一個(gè)表位結(jié)合。
27.一種中和KDR的激活的三體，其中該三體含有至少一個(gè)重鏈可變片段，該重鏈可變片段包含CDRH1，具有SEQ.ID.NO.1所列出的氨基酸序列；CDRH2，具有SEQ.ID.NO.2所列出的氨基酸序列；以及CDRH3，具有SEQ.ID.NO.3所列出的氨基酸序列；以及至少一個(gè)輕鏈可變片段，該輕鏈可變片段包含CDRL1，具有SEQ.ID.NO.4所列出的氨基酸序列；CDRL2，具有SEQ.ID.NO.5所列出的氨基酸序列；以及CDRL3，具有SEQ.ID.NO.6所列出的氨基酸序列。
28.一種中和KDR的激活的三體，其中該三體含有至少一個(gè)重鏈可變片段，它具有SEQ.ID.NO.7所列出的氨基酸序列；以及至少一個(gè)輕鏈可變片段，它具有SEQ.ID.NO.8所列出的氨基酸序列。
29.一種編碼權(quán)利要求27的三體的核酸分子。
30.權(quán)利要求29的核酸分子，其由SEQ.ID.NO.9所列出的編碼CDRH1的核酸序列；SEQ.ID.NO.10所列出的編碼CDRH2的核酸序列；SEQ.ID.NO.11所列出的編碼CDRH3的核酸序列；SEQ.ID.NO.12所列出的編碼CDRL1的核酸序列；SEQ.ID.NO.13所列出的編碼CDRL2的核酸序列；以及SEQ.ID.NO.14所列出的編碼CDRL3的核酸序列組成。
31.一種編碼權(quán)利要求28的三體的核酸分子。
32.權(quán)利要求31的核酸分子，其由SEQ.ID.NO.15所列出的編碼重鏈可變片段的核酸序列；以及SEQ.ID.NO.16所列出的編碼輕鏈可變片段的核酸序列組成。
33.權(quán)利要求27的三體，其中所述的三體是單一特異性的。
34.權(quán)利要求27的三體，其中所述的三體是雙特異性的并且該三體與KDR上至少一個(gè)表位結(jié)合。
35.權(quán)利要求27的三體，其中所述的三體是三特異性的并且該三體與KDR上至少一個(gè)表位結(jié)合。
36.一種中和KDR的激活的抗體，其中該抗體含有至少一個(gè)重鏈可變片段，該重鏈可變片段包含CDRH1，具有SEQ.ID.NO.1所列出的氨基酸序列；CDRH2，具有SEQ.ID.NO.2所列出的氨基酸序列；以及CDRH3，具有SEQ.ID.NO.3所列出的氨基酸序列；以及至少一個(gè)輕鏈可變片段，該輕鏈可變片段包含CDRL1，具有SEQ.ID.NO.4所列出的氨基酸序列；CDRL2，具有SEQ.ID.NO.5所列出的氨基酸序列；以及CDRL3，具有SEQ.ID.NO.6所列出的氨基酸序列。
37.一種中和KDR的激活的抗體，其中該抗體含有一個(gè)重鏈可變片段，它具有SEQ.ID.NO.7所列出的氨基酸序列；以及一個(gè)輕鏈可變片段，它具有SEQ.ID.NO.8所列出的氨基酸序列。
38.一種編碼中和KDR的激活的抗體的核酸分子，該核酸分子含有SEQ.ID.NO.9所列出的編碼CDRH1的核酸序列；SEQ.ID.NO.10所列出的編碼CDRH2的核酸序列；SEQ.ID.NO.11所列出的編碼CDRH3的核酸序列；SEQ.ID.NO.12所列出的編碼CDRL1的核酸序列；SEQ.ID.NO.13所列出的編碼CDRL2的核酸序列；以及SEQ.ID.NO.14所列出的編碼CDRL3的核酸序列。
39.一種編碼中和KDR的激活的抗體的核酸分子，該核酸分子含有SEQ.ID.NO.15所列出的編碼重鏈可變片段的核酸序列；以及SEQ.ID.NO.16所列出的編碼輕鏈可變片段的核酸序列。
40.一種含有權(quán)利要求36的抗體的嵌合抗體。
41.一種含有權(quán)利要求36的抗體的人源化抗體。
42.一種制備免疫球蛋白的方法，該免疫球蛋白與KDR結(jié)合的親和性可與人VEGF相比，并且中和KDR的激活，該方法包括在宿主細(xì)胞中插入編碼該免疫球蛋白分子的核酸序列，以及表達(dá)該核酸序列。
43.一種中和KDR的激活的方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效量的免疫球蛋白分子，該免疫球蛋白分子與KDR結(jié)合的親和性可與人VEGF相比，并且中和KDR的激活。
44.一種減緩腫瘤生長的方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效量的免疫球蛋白分子，該免疫球蛋白分子與KDR結(jié)合的親和性可與人VEGF相比，并且中和KDR的激活。
45.一種抑制血管發(fā)生的方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效量的免疫球蛋白分子，該免疫球蛋白分子與KDR結(jié)合的親和性可與人VEGF相比，并且中和KDR的激活。
46.一種制備單鏈抗體方法，該單鏈抗體與KDR結(jié)合的親和性可與人VEGF相比并且中和KDR的激活，該方法包括在宿主細(xì)胞中插入編碼該單鏈抗體的核酸序列，以及表達(dá)該核酸序列。
47.一種中和KDR的激活的方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效量的單鏈抗體，該單鏈抗體與KDR結(jié)合的親和性可與人VEGF相比，并且中和KDR的激活。
48.一種減緩腫瘤生長的方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效量的單鏈抗體，該單鏈抗體與KDR結(jié)合的親和性可與人VEGF相比，并且中和KDR的激活。
49.一種抑制血管發(fā)生的方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效量的單鏈抗體，該單鏈抗體與KDR結(jié)合的親和性可與人VEGF相比，并且中和KDR的激活。
50.一種制備雙體的方法，該雙體與KDR結(jié)合的親和性可與人VEGF相比，并且中和KDR的激活，該方法包括在宿主細(xì)胞中插入編碼該雙體的核酸序列，以及表達(dá)該核酸序列。
51.一種中和KDR的激活的方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效量的雙體，該雙體與KDR結(jié)合的親和性可與人VEGF相比，并且中和KDR的激活。
52.一種減緩腫瘤生長的方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效量的雙體，該雙體與KDR結(jié)合的親和性可與人VEGF相比，并且中和KDR的激活。
53.一種抑制血管發(fā)生的方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效量的雙體，該雙體與KDR結(jié)合的親和性可與人VEGF相比，并且中和KDR的激活。
54.一種制備三體的方法，該三體與KDR結(jié)合的親和性可與人VEGF相比，并且中和KDR的激活，該方法包括在宿主細(xì)胞中插入編碼該三體的核酸序列，以及表達(dá)該核酸序列。
55.一種中和KDR的激活的方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效量的三體，該三體與KDR結(jié)合的親和性可與人VEGF相比，并且中和KDR的激活。
56.一種減緩腫瘤生長的方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效量的三體，該三體與KDR結(jié)合的親和性可與人VEGF相比，并且中和KDR的激活。
57.一種抑制血管發(fā)生的方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效量的三體，該三體與KDR結(jié)合的親和性可與人VEGF相比，并且中和KDR的激活。
58.一種制備抗體的方法，該抗體與KDR結(jié)合的親和性可與人VEGF相比，并且中和KDR的激活，該方法包括在宿主細(xì)胞中插入編碼該抗體的核酸序列，以及表達(dá)該核酸序列。
59.一種中和KDR的激活的方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效量的抗體，該抗體與KDR結(jié)合的親和性可與人VEGF相比，并且中和KDR的激活。
60.一種減緩腫瘤生長的方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效量的抗體，該抗體與KDR結(jié)合的親和性可與人VEGF相比，并且中和KDR的激活。
61.一種抑制血管發(fā)生的方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用有效量的抗體，該抗體與KDR結(jié)合的親和性可與人VEGF相比，并且中和KDR的激活。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種與SI(KDR)結(jié)合的,親和性和人類VEGF可比的,能夠中和KDR的激活的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白分子包括單價(jià)單鏈抗體、多價(jià)單鏈抗體、雙體(diabody)、三體(tribody)、抗體、人源化抗體和嵌合抗體。本發(fā)明進(jìn)而提供了編碼這些免疫球蛋白分子的核酸分子。本發(fā)明還提供了制備上述免疫球蛋白的方法。本發(fā)明進(jìn)而提供了用這樣的免疫球蛋白分子中和KDR激活的方法,在哺乳動(dòng)物中抑制血管發(fā)生的方法和在哺乳動(dòng)物中抑制腫瘤生長的方法。
文檔編號(hào)C07K16/28GK1345334SQ00805856
公開日2002年4月17日 申請(qǐng)日期2000年1月28日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月29日
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