專利名稱：作為光學(xué)診斷用造影劑的短鏈肽－染料結(jié)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于腫瘤診斷的化合物，該化合物由染料與短鏈肽的結(jié)合物組成，而所述肽是由血管活性腸肽、促生長(zhǎng)素抑制素或神經(jīng)降壓肽衍生的。本發(fā)明還涉及這些化合物作為光學(xué)診斷劑的應(yīng)用以及包含這些化合物的診斷劑。
在細(xì)胞水平上，疾病誘導(dǎo)的變化通常表現(xiàn)為與正常狀態(tài)相比已發(fā)生變化的受體分布或表達(dá)。這些差異可以是定量型的(如增殖細(xì)胞中的轉(zhuǎn)鐵蛋白的量)或者也可以是定性型的(如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF的表達(dá))。以前主要是在放射診斷中注意研究病理受體表達(dá)或分布的顯象，這是因?yàn)闄z測(cè)方法所需要的靈敏度。
七螺旋(heptahelical)受體是許多藥理活性成分(如β-阻斷劑、H2-酸阻斷劑、抗組胺藥)的目標(biāo)分子。除治療應(yīng)用外，這些受體的主要經(jīng)放射標(biāo)記的激動(dòng)劑配體在診斷中用于所謂的受體閃爍法，以體內(nèi)檢測(cè)并定位腫瘤。在此情況下，受體介導(dǎo)的細(xì)胞攝粒作用的機(jī)理例如被促生長(zhǎng)素抑制素受體使用，該促生長(zhǎng)素抑制素受體在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中被更強(qiáng)烈地表達(dá)。促生長(zhǎng)素抑制素類似物111In-DTPA-pentetreotide(Octreoscan)在臨床上已被批準(zhǔn)用于常規(guī)的閃爍診斷；文獻(xiàn)J.SteroidBiochem.Mol.Biol.37，1079-82，1990；J.Nucl.Med.32，1184-9，1991；J.Nucl.Med.33，652-8，1992；Digestion 3，54-9，1994；J.Clin.Invest.93，1321-5，1994；Metabolism 45，21-3，1996。
其他藥物包括使用經(jīng)放射標(biāo)記的結(jié)合VIP受體的VIP及VIP類似物。寬譜腫瘤(如腺癌)都更強(qiáng)烈地表達(dá)VIP受體。
WO 96/30055描述了放射診斷和放射治療劑，特殊的VIP受體結(jié)合肽，其是經(jīng)放射標(biāo)記的，而且可用于放射診斷和放射治療?？捎肨c-99m標(biāo)記用于閃爍法的VIP受體結(jié)合肽被描述是特別有利的。其他的文獻(xiàn)Cancer Research 54，690-700，1994；Endocrinology 136，2662-80，1994；J.Nucl.Med.40，353-361，1999。
上述所有基于促生長(zhǎng)素抑制素受體和VIP受體的診斷劑都是放射診斷藥(閃爍法，用123I、125I、111In、99mTc標(biāo)記的肽)。
文獻(xiàn)EP 588754、US 5650134、US 5620675、US 5225180、WO96/23527；J.Steroid Biochem.Mo.Biol.37，1083-87，1990；Lancet 242-4，1989；J.Nucl.Med.39，1913-17，1998。
然而，目前尚未知曉熒光標(biāo)記的與染料結(jié)合的肽，其使得體內(nèi)熒光檢測(cè)腫瘤成為可能(Photochem.Photobiol.68，603-632，1998)。
本發(fā)明的目的是提供新的化合物，該化合物使得用受體特異性結(jié)合目標(biāo)組織的化合物通過檢測(cè)熒光輻射來靈敏診斷腫瘤成為可能。在此情況下，偶聯(lián)至生物分子上的特殊染料分子將產(chǎn)生高度靈敏的、可檢測(cè)的熒光信號(hào)。
該目的是通過包含熒光染料的化合物來實(shí)現(xiàn)的，其中熒光染料共價(jià)鍵地結(jié)合在短鏈肽上。這些結(jié)合物對(duì)七螺旋受體、特別是促生長(zhǎng)素抑制素受體、VIP受體(血管活性腸肽)以及神經(jīng)降壓肽受體具有高的結(jié)合親和性，而且它們?nèi)芜x地通過受體介導(dǎo)的細(xì)胞攝粒作用在細(xì)胞內(nèi)被吸收。因此，根據(jù)本發(fā)明的化合物適合用于對(duì)腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織進(jìn)行技術(shù)上簡(jiǎn)單、無害的光學(xué)診斷，所述腫瘤細(xì)胞或腫瘤組織與健康的細(xì)胞相比更多地表達(dá)促生長(zhǎng)素抑制素受體、VIP受體或神經(jīng)降壓肽受體。本發(fā)明的化合物特別適合用于熒光診斷，對(duì)于中空器官中熒光內(nèi)窺鏡診斷是特別有利的，例如食管、結(jié)腸、子宮頸、以及支氣管的各種腫瘤，如腺癌、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤或者胰管腫瘤。
特別優(yōu)選的染料具有以下特征它們滿足某些光物理和化學(xué)要求。從光物理角度看，染料必須具有高的吸收系數(shù)和高的熒光量子產(chǎn)量，以便即使在最小的組織濃度時(shí)仍能提供有效的信號(hào)。最大吸收必須以可自由選擇的方式重疊寬的光譜范圍。因此，為檢測(cè)更低的組織層(低于表面幾厘米)，600-900nm的光譜范圍是必須的，而對(duì)于表面檢測(cè)，400-600nm的吸收波長(zhǎng)就已足夠。從化學(xué)角度看，染料必須具有高的光穩(wěn)定性，而且在激發(fā)過程中必須沒有分解信號(hào)(光漂白)。染料在固相合成肽時(shí)必須可用作合成成分，而且因此在常規(guī)合成條件下是穩(wěn)定的，使得在染料和肽之間確保簡(jiǎn)單而且有利地產(chǎn)生結(jié)構(gòu)明確并有固體化學(xué)計(jì)量比的染料-肽結(jié)合物。多亞甲基染料，特別是菁、部花菁、氧雜菁和squarilium染料，可以最好地滿足這些要求。
因此，本發(fā)明的主題是通式(I)的肽-多亞甲基染料結(jié)合物及其生理相容鹽A1-(X)m-A2(I)其中X代表具有D或L構(gòu)型的α-、β-或Y-氨基酸；m代表5-30的數(shù)，其中所產(chǎn)生的氨基酸序列(X)m可為直鏈或者通過兩個(gè)半胱氨酸或高半胱氨酸之間的二硫鍵或者在N-和C-端之間的酰胺化而環(huán)化，并代表血管活性腸肽(VIP)、促生長(zhǎng)素抑制素或神經(jīng)降壓肽的氨基酸序列，或者代表VIP、促生長(zhǎng)素抑制素或神經(jīng)降壓肽的片段、部分序列、衍生物或類似物；A1代表氫原子、具有最多10個(gè)碳原子的?；蛲榛鼈兛扇芜x地被1-3個(gè)羧基和/或l-6個(gè)羥基取代，或者代表具有2-30個(gè)-CH2CH2O-單元的聚(氧乙烯)基團(tuán)，或者代表選自于多亞甲基染料的染料分子，該染料在380-1200nm的范圍內(nèi)具有至少一個(gè)最大吸收；A2代表羥基、氨基或者選自于多亞甲基染料的染料分子，該染料在380-1200nm的范圍內(nèi)具有至少一個(gè)最大吸收；其條件是A1或A2基團(tuán)中至少一個(gè)代表選自于多亞甲基染料的染料分子，而且該染料在380-1200nm的范圍內(nèi)具有至少一個(gè)最大吸收，其中如果A1和/或A2代表選自于多亞甲基染料的染料分子，而且該染料在380-1200nm的范圍內(nèi)具有至少一個(gè)最大吸收，則A1連接在N-端氨基上，而A2連接在氨基酸序列(X)m中任意位置處的氨基酸賴氨酸的氨基或者氨基酸絲氨酸的羥基上。
上述肽的片段、部分序列、衍生物或類似物代表例如縮短的氨基酸序列、單個(gè)或所有氨基酸與相應(yīng)的D-氨基酸的交換物、單個(gè)氨基酸與其他氨基酸的交換物、反向序列以及上述特征的組合。
上述肽的片段、部分序列、衍生物或類似物也可包含非天然的氨基酸，如萘丙氨酸(naphthalanine)、環(huán)己基丙氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、α-氨基己二酸、α-氨基丁酸、β-丙氨酸、β-環(huán)己基丙氨酸、鳥氨酸、肌氨酸或δ-羥基賴氨酸。
本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案是具有以下特征的通式I化合物染料分子A1和/或A2代表菁、squarilium、croconium、部花菁或氧雜菁染料。這些染料屬于多亞甲基染料類，而且具有如上所述的優(yōu)點(diǎn)。
其他優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的通式I化合物具有以下特征染料分子A1和/或A2代表以下通式II的菁染料或squarilium染料 其中D代表相應(yīng)于以下通式III-VI的片段，其中用星號(hào)標(biāo)記的位置表示與B的連接位 B代表相應(yīng)于以下通式VII-XII的片段 R1和R2代表E1，R3代表氟、氯、溴或碘原子或者硝基或者基團(tuán)-COOE1、-CONE1E2、-NHCOE1、-NHCONHE1、-NE1E2、-OE1、-OSO3E1、-SO3E1、-SO2NHE1、-E1，其中E1和E2相互獨(dú)立地代表氫原子、C1-C4磺基烷基、飽和或不飽和、直鏈或支鏈C1-C50烷基鏈，其中該鏈或其一部分可任選地形成一個(gè)或多個(gè)芳香或飽和環(huán)C5-C6單元或者二環(huán)C10單元，而且C1-C50烷基鏈中可插入0-15個(gè)氧原子和/或0-3個(gè)羰基和/或被0-5個(gè)羥基取代，R4代表氫原子、氟、氯、溴、碘原子或者支鏈或直鏈C1-C10烷基鏈，b代表2或3的數(shù)，X和Y相互獨(dú)立地代表O、S、Se、-CH＝CH-或者C(CH3)2，L代表以下式的基團(tuán) 其中n代表1-10的數(shù)。
(在上述式中，分子部分中在左側(cè)畫的實(shí)線表示與染料骨架相連的鍵，而分子部分中在右側(cè)畫的虛線表示與肽相連的鍵。)在多亞甲基染料中，菁染料，例如以吲哚結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的茚炭(indocarbo)菁、茚二炭(indodicarbo)菁和茚三炭(indotricarbo)菁，是特別有利的。這些結(jié)構(gòu)的特征在于具有高度化學(xué)和光化學(xué)穩(wěn)定性。通過有利的合成法，可制得以任何所希望的方式在400-1000nm之間吸收并發(fā)熒光的衍生物，其可用合適的連接基和官能團(tuán)、優(yōu)選羧基通過取代反應(yīng)偶聯(lián)在肽上，而且特別是由于磺酸基而具有高度的水溶性。與文獻(xiàn)中已知的菁染料相反，根據(jù)本發(fā)明使用的化合物僅具有一個(gè)活性基團(tuán)，這使得作為結(jié)合物的樹脂合成的一部分化學(xué)計(jì)量比確定地偶聯(lián)在肽上成為可能。
因此，根據(jù)本發(fā)明的通式I化合物的特別優(yōu)選的實(shí)施方案具有以下特征——染料分子A1和/或A2代表茚炭菁染料、茚二炭菁染料或茚三炭菁染料；——染料分子A1和/或A2代表以下通式XIII或XIV的茚炭菁染料、茚二炭菁染料或茚三炭菁染料 其中p代表1、2或3，n代表1、2、3、4或10的數(shù)，R1和R2相互獨(dú)立地代表4-磺基丁基、3-磺基丙基、2-磺基乙基、3-甲基-3-磺基丙基、甲基、乙基、或丙基，而R3代表氫、氯、溴或碘原子或者硝基或者基團(tuán)-COOE1、-CONE1E2、-NHCOE1、-NHCONHE1、-NE1E2、-OE1、-OSO3E1、-SO3E1、-SO2NHE1，其中E1和E2相互獨(dú)立地代表氫原子、或者代表甲基或乙基或者C3-C6烷基，該烷基可插入0-2個(gè)氧原子和/或0-1個(gè)羰基，和/或被0-5個(gè)羥基取代，或者E1和E2代表具有2-30個(gè)-CH2CH2O-單元的聚(氧乙烯)二醇基團(tuán)；——染料分子A1和/或A2代表以下通式XIII或XIV的茚炭菁染料、茚二炭菁染料或茚三炭菁染料 其中p代表1、2或3，n代表1、2或4，R1和R2相互獨(dú)立地代表4-磺基丁基或3-磺基丙基，而R3代表氫、或者基團(tuán)-COOE1或-CONHE1，其中E1和E2相互獨(dú)立地代表氫原子、或者代表甲基或乙基或者C3-C6烷基，該烷基可插入0-2個(gè)氧原子和/或0-1個(gè)羰基，和/或被0-5個(gè)羥基取代；——染料分子A1和/或A2代表以下通式XV或XVI的茚三炭菁染料 其中n代表2或3，R1和R2相互獨(dú)立地代表4-磺基丁基、3-磺基丙基或2-磺基乙基，R3代表基團(tuán)-CONH-肽、-CONH-(CH2)m-CONH-肽、-CONH-(CH2)n-NH-CS-NH-肽或者-CONH-(CH2)n-NHCO-CH2-肽，其中m＝1-10，而n＝2或3，或者R3代表以下基團(tuán) R4和R5相互獨(dú)立地代表氫原子、甲基或羥基化烷基，如2-羥基乙基、3-羥基丙基、2，3-二羥基丙基、1，3-二羥基-2-丙基、2，3，4-三羥基丁基、1，3，4-三羥基-2-丁基、2，3，4，5，6-五羥基己基，R6代表以下基團(tuán)之一-(CH2)m-CONH-肽其中m＝0-2，-(CH2)m-NH-CS-NH-肽其中m＝0-2，而X代表氧原子或硫原子；——染料分子A1和/或A2代表以下通式XVII的茚三炭菁染料 其中R1和R2相互獨(dú)立地代表4-磺基丁基或3-磺基丙基，R3代表基團(tuán)-CONH-肽、-CONH-(CH2)m-CONH-肽、-CONH-(CH2)n-NH-CS-NH-肽或者-CONH-(CH2)n-NHCO-CH2-肽，其中m＝1-10，而n＝2或3，或者R3代表以下基團(tuán) R4和R5相互獨(dú)立地代表氫原子、甲基或羥基化烷基，如2-羥基乙基、3-羥基丙基、2，3-二羥基丙基、1，3-二羥基-2-丙基、2，3，4-三羥基丁基、1，3，4-三羥基-2-丁基、2，3，4，5，6-五羥基己基。
使用經(jīng)染料標(biāo)記的抗體檢測(cè)腫瘤在文獻(xiàn)中是已知的(J.Cell.Pharmacol.3，141-145，1992；Cancer Immunol.Immunother.41，257-63，1995；Cancer Research 54，2643-9，1994；Biotechnol.Prog.13，649-658，1997)。
相反地，根據(jù)本發(fā)明的化合物包含對(duì)抗體具有優(yōu)勢(shì)的低分子量肽和肽衍生物作為生物分子，所述肽或肽衍生物例如對(duì)目標(biāo)結(jié)構(gòu)具有高結(jié)合性，其診斷潛力不會(huì)由于不利的藥代動(dòng)力學(xué)而受到限制(長(zhǎng)的血液半衰期，過敏性副作用(免疫原性))。
因此，對(duì)肽序列的生物及藥理學(xué)要求是當(dāng)在目標(biāo)組織中快速增加時(shí)具有足夠的血漿穩(wěn)定性，并同時(shí)從身體的其他部分、優(yōu)選通過腎排泄途徑消除。
現(xiàn)在足以令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，包含至少5個(gè)VIA序列之C-端側(cè)氨基酸而且在其上偶聯(lián)用于熒光診斷的染料的肽序列，與天然VIP相比，能夠在腫瘤細(xì)胞中顯影。另外還發(fā)現(xiàn)，摻入至少一個(gè)D-氨基酸或者用至少一個(gè)D-氨基酸交換，可顯著增加血漿穩(wěn)定性。例如在結(jié)合VIP的染料-肽結(jié)合物中，所有L-氨基酸被D-氨基酸完全交換，則顯示結(jié)合性質(zhì)及細(xì)胞顯影沒有變化。
其他特別優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的通式I化合物具有以下特征——(X)m代表天然的人血管活性腸肽的序列，其相應(yīng)于以下序列HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN或者由5-30個(gè)氨基酸組成的血管活性腸肽的片段、部分序列、衍生物或者類似物；——(X)m代表促生長(zhǎng)素抑制素的氨基酸序列，其相應(yīng)于以下序列 或者由5-20個(gè)氨基酸組成的促生長(zhǎng)素抑制素的片段、部分序列、衍生物或者類似物；
——(X)m代表神經(jīng)降壓肽的氨基酸序列，其相應(yīng)于以下序列焦谷氨酸-LYENKPRRPYIL或者由5-20個(gè)氨基酸組成的神經(jīng)降壓肽的片段、部分序列、衍生物或者類似物；——作為血管活性腸肽(VIP)的片段、部分序列、衍生物或者類似物，選擇以下氨基酸序列RLRKQMAVKKYLNSILN RLRKQMAVKKYLNSIL RLRKQMAVKKYLNSILRKQMAVKKYLNSILNLRKQMAVKKYLNSILLRKQMAVKKYLNSIRKQMAVKKYLNSILN RKQMAVKKYLNSIL RKQMAVKKYLNSIKQMAVKKYLNSILN KQMAVKKYLNSIL KQMAVKKYLNSIQMAVKKYLNSILN QMAVKKYLNSIL QMAVKKYLNSIMAVKKYLNSILNMAVKKYLNSILMAVKKYLNSIAVKKYLNSILN AVKKYLNSIL AVKKYLNSIRLRKQMAVKKYLNS RLRKQMAVKKYLN RLRKQMAVKKYLLRKQMAVKKYLNS LRKQMAVKKYLN LRKQMAVKKYLRKQMAVKKYLNSRKQMAVKKYLNRKQMAVKKYLKQMAVKKYLNS KQMAVKKYLN KQMAVKKYLQMAVKKYLNS QMAVKKYLN QMAVKKYLMAVKKYLNS MAVKKYLN MAVKKYLAVKKYLNSAVKKYLN AVKKYL，——作為VIP序列的類似物，選擇以下氨基酸序列FSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNISDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNLSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHFDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHHDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHIDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHLDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHMDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHQDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHTDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHVDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHWDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHYDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSAAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSEAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSFAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSHAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSIAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSLAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSMAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSWAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSDFVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSDGVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSDMVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSDQVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSDSVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSDWVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSDYVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSDAFFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSDAIFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSDALFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSDAMFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSDATFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSDAWFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSDAYFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSDAVKTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSDAVFVDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSDAVFWDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSDAVFTDNW TRLRKQMAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRRRKQMAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRWRKQMAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRFQMAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRLQMAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRMQMAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRRQMAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKAMAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKFMAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKIMAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKKMAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKLMAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKMMAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKRMAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKVMAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKWMAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKYMAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQFAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQIAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQKAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQLAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQQAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQRAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQWAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMFVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMIVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMKVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMLVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMMVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMQVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMRVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMVVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMWVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMYVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMAAK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMAIK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMALK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVR KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK RYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK WYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KFLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KWLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLASILNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLFSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLISILNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLMSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLSSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLVSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLWSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNNILNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNRILNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNWILNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNYILNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSLLNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSSLNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSWLNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSYLNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSIFNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSIINHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSIWNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILW——作為VIP的類似物，選擇根據(jù)以下式的化合物HSDAVFTX1X2Y X3RLRKQMAVK KYLNSILN，其中X1、X2和X3可代表任何氨基酸，——2-m個(gè)氨基酸可相互獨(dú)立地用它們相應(yīng)的D-氨基酸或者其他L-或D-氨基酸交換，其中m與上述定義相同，
——至少一個(gè)氨基酸(X)m相互獨(dú)立地用其他非天然的氨基酸或者氨基酸衍生物交換，——至少一個(gè)氨基酸(X)m相互獨(dú)立地用其他非天然的氨基酸或者氨基酸衍生物交換，例如萘丙氨酸、環(huán)己基丙氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、α-氨基己二酸、α-氨基丁酸、β-丙氨酸、β-環(huán)己基丙氨酸、鳥氨酸、肌氨酸或δ-羥基賴氨酸，——作為VIP的類似物，選擇以下式的化合物X1SDAVX2TDNX3TRLRKQMAVKKX4LNSILN，其中X1、X2、X3和X4可代表非天然的氨基酸或氨基酸衍生物，例如萘丙氨酸、環(huán)己基丙氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、α-氨基己二酸、α-氨基丁酸、β-丙氨酸、β-環(huán)己基丙氨酸、鳥氨酸、肌氨酸或δ-羥基賴氨酸，——所有氨基酸(X)m用它們相應(yīng)的D-氨基酸交換，——選擇逆合成氨基酸序列作為血管活性腸肽的片段、部分序列、衍生物或類似物，——選擇其中2-m個(gè)氨基酸用相應(yīng)的D-氨基酸交換的逆合成氨基酸序列作為血管活性腸肽序列的片段、部分序列、衍生物或類似物，其中m與上述定義相同，——選擇以下氨基酸序列作為血管活性腸肽的片段、部分序列、衍生物或類似物rlrkqmavkkylnsiln rlrkqmavkkylnsil rlrkqmavkkylnsilrkqmavkkylnsiln lrkqmavkkylnsil lrkqmavkkylnsirkqmavkkylnsilnrkqmavkkylnsilrkqmavkkylnsikqmavkkylnsiln kqmavkkylnsil kqmavkkylnsiqmavkkylnsiln qmavkkylnsil qmavkkylnsimavkkylnsiln mavkkylnsil mavkkylnsiavkkylnsilnavkkylnsilavkkylnsiRLRKQMAvKKyLNSILN RLRKQMAvKKyLNSIL RLRKQMAvKKyLNSILRKQMAvKKyLNSILN LRKQMAvKKyLNSIL LRKQMAvKKyLNSIRKQMAvKKyLNSILNRKQMAvKKyLNSILRKQMAvKKyLNSIKQMAvKKyLNSILN KQMAvKKyLNSIL KQMAvKKyLNSIQMAvKKyLNSILN QMAvKKyLNSIL QMAvKKyLNSIMAvKKyLNSILN MAvKKyLNSIL MAvKKyLNSIAvKKyLNSILNAvKKyLNSILAvKKyLNSI——選擇以下氨基酸序列作為促生長(zhǎng)素抑制素的片段、部分序列、衍生物或類似物
——選擇以下氨基酸序列作為神經(jīng)降壓肽的片段、部分序列、衍生物或類似物pGlu-LYQNKPRRPFIL pGlu-LYENKPRRPYIpGlu-LYENKPRRPyIL pGlu-LYQNKPRRPfIL pGlu-LYENKPRRPYpGlu-LYQNKPRRPYIL pGlu-LYENKPRRPWIL pGlu-LYENKPRRPpGlu-LYQNKPRRPyIL pGlu-LYENKPRRPwIL pGlu-LYENKPRRpGlu-LYENKPRRPFIL pGlu-LYQNKPRRPWIL pGlu-LYENKPRpGlu-LYENKPRRPfIL pGlu-LYQNKPRRPwIL pGlu-LYENKPNKPRRPYIL NKPRRPyIL NKPRRPfIL NKPRRPwILKPRRPYIL KPRRPyIL KPRRPfIL KPRRPwILPRRPYIL PRRPyIL PRRPfIL PRRPwILRRPYILRRPyILRRPfILRRPwIL通式I的術(shù)語包括氨基酸序列的常規(guī)語言。N-端總是在左側(cè)，而C-端總是在右側(cè)(根據(jù)H-(X)m-OH未被取代，或者為酰胺時(shí)，H-(X)m-NH2)。所用氨基酸的單個(gè)字母縮寫參見M.Bodanszky，PeptideChemistry-A Practical Textbook，第2版，Springer-Verlag Heidelberg 1993，第3頁。大寫字母表示具有L-構(gòu)型的氨基酸(天然氨基酸)，小寫字母代表D-氨基酸，二硫鍵(環(huán)肽)用相應(yīng)字母之間的連線表示(C＝半胱氨酸或高半胱氨酸)。逆合成的序列是表示，在合成中，與給定的天然序列相比氨基酸的序列被顛倒，也就是說，合成由原始N-端氨基酸開始，并產(chǎn)生直至原始C-端氨基酸的序列。
VIP的類似物使用取代分析來測(cè)定(見實(shí)施例43)。特別優(yōu)選的VIP類似物是以下化合物His-Trp-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO1)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Phe-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO2)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Lys-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO3)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Gln-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO4)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Arg-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO5)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Trp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO6)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Arg-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO7)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Arg-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO8)。
與放射標(biāo)記的物質(zhì)相比，根據(jù)本發(fā)明的物質(zhì)具有各種優(yōu)點(diǎn)。熒光染料可隨時(shí)按需要激發(fā)以發(fā)射熒光。不存在連續(xù)的信號(hào)，其使用具有相應(yīng)半衰期的分解作用作為基礎(chǔ)。因此，可隨時(shí)根據(jù)需要選擇診斷時(shí)間，并可經(jīng)常根據(jù)需要重復(fù)，而且不會(huì)受到同位素半衰期的限制。患者不暴露于任何離子輻射中，而且所使用的光輻射在所用劑量下是無害的。光學(xué)檢測(cè)技術(shù)使得檢測(cè)達(dá)到幾個(gè)光子的高靈敏度，而且因此在靈敏度方面可與放射診斷相媲美。
已有人描述了使用染料生物分子結(jié)合物通過近紅外輻射(NIR輻射)進(jìn)行診斷的方法(WO 96/17628)。己證明本發(fā)明特別有利的是用自動(dòng)固相合成法能夠以有利的產(chǎn)率和高純度制備肽結(jié)合物。足以令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，可使用各種攜帶羧基的茚菁化合物作為氨基酸類似物，而且賴氨酸的N-端基團(tuán)和氨基都可偶聯(lián)在固相(樹脂)上。在斷裂樹脂并進(jìn)行色譜純制后，所得的染料-肽結(jié)合物具有大于95％的純度。新的偶聯(lián)方法能夠使鹵代酰基染料偶聯(lián)在氨基酸半胱氨酸或高半胱氨酸上，它們可替換天然VIP序列的任何氨基酸。
在使用用于激發(fā)熒光的光時(shí)，基礎(chǔ)問題是光的有限穿透深度，其在VIS時(shí)低于幾毫米，但是在NIR時(shí)可為數(shù)厘米。對(duì)于穿透深度，在表面組織疾病以及軟組織時(shí)，檢測(cè)法沒有任何問題。因此，本發(fā)明的主題是乳房X射線照相法，其中使用根據(jù)本發(fā)明的化合物通過檢測(cè)熒光或者未吸收的輻射診斷患病組織。本發(fā)明更具體的主題是根據(jù)本發(fā)明的化合物在內(nèi)窺鏡檢查法中的應(yīng)用，所述內(nèi)窺鏡檢查法例如是結(jié)腸鏡、支氣管鏡、食管內(nèi)窺鏡，其中診斷接近表面的組織中的變化。在內(nèi)窺鏡診斷中通常使用白光進(jìn)行直接肉眼觀察。根據(jù)本發(fā)明的化合物通過產(chǎn)生組織特異性的信號(hào)，特別是在診斷早熟但不可肉眼檢測(cè)的組織變化(如結(jié)腸發(fā)育異常)時(shí)，對(duì)診斷方法具有決定性的改善。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，在患有化學(xué)誘導(dǎo)的發(fā)育異常及結(jié)腸癌的大鼠的腸道中霧化根據(jù)本發(fā)明的偶聯(lián)染料的化合物后，隨后沖洗并實(shí)施內(nèi)窺鏡熒光診斷(激發(fā)740nm，在760nm以上檢測(cè))，使得可以檢測(cè)結(jié)腸中熒光增加的組織區(qū)域。
因此，本發(fā)明的主題還在于使用根據(jù)本發(fā)明的化合物進(jìn)行內(nèi)窺鏡熒光診斷的方法，特別是用于診斷胃腸道。在此情況下，優(yōu)選靜脈、或者通過霧化局部地向組織輸送一種或多種物質(zhì)，并照射相應(yīng)光譜范圍的光以電子激發(fā)所用的染料。記錄反射的熒光輻射或者由染料發(fā)射出的熒光輻射。優(yōu)選的方法是，在大的表面范圍照射組織，并通過CCD照相機(jī)成像局部解析熒光輻射，或者用光導(dǎo)纖維對(duì)待成像的組織區(qū)域進(jìn)行光柵掃描，然后用計(jì)算機(jī)處理所得的信號(hào)并處理成合成圖象。在此情況下，光譜和/或相選擇性以及以靜態(tài)和/或時(shí)間分辨方式檢測(cè)并評(píng)估熒光。所得的熒光圖象可與白光圖象同時(shí)產(chǎn)生，而且在一個(gè)圖中相互疊加產(chǎn)生用于數(shù)據(jù)評(píng)估。
根據(jù)本發(fā)明的化合物的合成可類似于文獻(xiàn)中已知的方法進(jìn)行。在聚合物樹脂中以固相合成法制備肽。具體細(xì)節(jié)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。文獻(xiàn)Peptide Chemistry-A Practical Textbook(M.Bodanszky)，第2版，Springer-Verlag Heidelberg 1993；Anti-Cancer Drug Design 12，145-167，1997；J.Am.Chem.Soc.117，11821-2，1995。
染料是單獨(dú)制備的，然后作為肽的固相合成的一部分，將染料偶聯(lián)在肽上，接著從樹脂上斷裂并純制，由此得到根據(jù)本發(fā)明的化合物。優(yōu)選的是那些包含羧基的染料，其在用常規(guī)試劑活化后偶聯(lián)在肽的氨基上，特別是賴氨酸的ε-氨基或者N-端肽氨基。另外，含有鹵烷基或鹵?；娜玖蟽?yōu)選偶聯(lián)在肽的硫醇基上，特別是氨基酸半胱氨酸或高半胱氨酸。
合成多亞甲基染料的文獻(xiàn)Bioconjugate Chem.4，105-111，1993；Bioconjugate Chem.7，356-62，1996；Bioconjugate Chem.8，751-56，1997；Cytometry 10，11-19，1989和11，418-30，1990；J.Heterocycl.Chem.33，1871-6，1996；J.Org.Chem.60，2391-5，1995；Dyes and Pigments 17，19-27，1991；Dyes and Pigments 21，227-34，1993；J.Fluoresc.3，153-55，1993；Anal.Biochem.217，197-204，1994；US 4981977；US 5688966；US 5808044；WO 97/42976；WO 97/42978；WO 98/22146；WO 98/26077；EP 0800831。
僅包含一個(gè)羧基的染料特別適合于在固相中偶聯(lián)在肽上，特別有利的是通式XVIII的菁染料 其中p代表1、2或3，n代表1、2、3、4或10，R1和R2相互獨(dú)立地代表4-磺基丁基、3-磺基丙基、2-磺基乙基、3-甲基-3-磺基丙基、甲基、乙基、或丙基，而R3代表氫或者基團(tuán)-COOE1、-CONE1E2、-NHCOE1、-NHCONHE1、-NE1E2、-OE1、-OSO3E1、-SO3E1、-SO2NHE1，其中E1和E2相互獨(dú)立地代表氫原子、或者代表甲基或乙基或者C3-C6烷基，該烷基可插入0-2個(gè)氧原子和/或0-1個(gè)羰基，和/或被0-5個(gè)羥基取代；或者通式XIX或XX的菁染料 其中n代表2或3，R1和R2相互獨(dú)立地代表4-磺基丁基、3-磺基丙基或2-磺基乙基，R3代表-COOH基團(tuán)或者以下基團(tuán)中的一種-CONH-(CH2)n-COOH，其中n＝2或3，-CONH-(CH2)n-NCS，其中n＝2或3，-CONH-(CH2)n-NHCO-CH2-X1，其中n＝2或3，而X1＝Cl、Br、I， R4和R5相互獨(dú)立地代表氫原子、甲基或羥基化烷基，如2-羥基乙基、3-羥基丙基、2，3-二羥基丙基、1，3-二羥基-2-丙基、2，3，4-三羥基丁基、1，3，4-三羥基-2-丁基、2，3，4，5，6-五羥基己基，R6代表以下基團(tuán)中的一種-(CH2)m-COOH，其中m＝0-2，-(CH2)m-NCS，其中m＝0-2，而X代表氧原子或硫原子；或者通式XXI的菁染料 其中R1和R2相互獨(dú)立地代表4-磺基丁基、3-磺基丙基或2-磺基乙基，R3代表-COOH基團(tuán)或者以下基團(tuán)中的一種-CONH-(CH2)n-COOH，其中n＝2或3，-CONH-(CH2)n-NCS，其中n＝2或3，-CONH-(CH2)n-NHCO-CH2-X1，其中n＝2或3，而X1＝Cl、Br、I， R4和R5相互獨(dú)立地代表氫原子、甲基或羥基化烷基，如2-羥基乙基、3-羥基丙基、2，3-二羥基丙基、1，3-二羥基-2-丙基、2，3，4-三羥基丁基、1，3，4-三羥基-2-丁基、2，3，4，5，6-五羥基己基。
僅一個(gè)可活化基團(tuán)如羧基或者已經(jīng)活化的基團(tuán)如異硫氰酸酯、鹵烷基或鹵?；膬?yōu)點(diǎn)在于，可進(jìn)行化學(xué)上均勻的偶聯(lián)。鹵?；哂刑貏e的優(yōu)點(diǎn)，即、能夠化學(xué)均勻地偶聯(lián)在半胱氨酸或高半胱氨酸的巰基上。該偶聯(lián)可在溶液中實(shí)施在已脫除保護(hù)基且未鍵合的肽上。通過活化基團(tuán)，在偶聯(lián)于肽上時(shí)有可能不發(fā)生副反應(yīng)。為增加水溶解度，染料中的肽-染料結(jié)合物具有更多的羥基數(shù)量。通過在染料的吲哚系統(tǒng)中定位連接基，另外在吲哚系統(tǒng)的氮原子上還可通過包含磺酸基的基團(tuán)產(chǎn)生足夠的親水性。其結(jié)果是，可用肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)均勻的偶聯(lián)反應(yīng)(見實(shí)施例4-38和44-49)。
本發(fā)明的另一個(gè)主題是用于體內(nèi)診斷患病組織區(qū)域的光診斷劑，其特征在于包含至少一個(gè)通式I的化合物以及常規(guī)輔劑和/或載體及稀釋劑。
以下實(shí)施例用于解釋本發(fā)明。實(shí)施例1-3合成用于固相合成偶聯(lián)于肽的氨基(N-端或ζ-賴氨酸)上的茚菁(indocyanine)染料1-3該合成總地是由1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基-3H-假吲哚和1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基-5-羧基-3H-假吲哚起始(Cytometry10，11-19，1989；Talanta 39，505-510，1992)。實(shí)施例1合成1，1′-二(4-磺基丁基)茚炭菁-5-羧酸鈉鹽(1)將0.8g(4.0mmol)的N，N-二苯基甲脒引入至15ml乙酸酐中，并在室溫下分批地與1.4g(4.2mmol)的1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基-5-羧基-3H-假吲哚混合，在120℃下攪拌30分鐘，然后用水浴冷卻至室溫。接著添加1.2g(4.1mmol)的1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基-3H-假吲哚、1.2g(14.6mmol)的無水乙酸鈉、15ml的乙酸酐和6ml的乙酸。反應(yīng)混合物加熱1小時(shí)至120℃，然后冷卻暗紅色的溶液，并與100ml的乙醚混合。抽濾出沉淀固體。在RP硅膠EUROPREP 60-30 C18，60A，20-45m上進(jìn)行色譜純制(洗脫劑水/MeOH，0-70％MeOH的梯度)。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中從包含產(chǎn)物的部分中除去甲醇，然后將該部分凍干，產(chǎn)量1.5g(58％)，紅色凍干物。實(shí)施例2合成1，1′-二(4-磺基丁基)茚二炭菁-5-羧酸鈉鹽(2)1.2g(4.1mmol)的1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基-3H-假吲哚和1.0g(3.9mmol)的丙二醛-二苯基亞胺鹽酸鹽在15ml的乙酸酐中于120℃下攪拌30分鐘，然后用水浴冷卻至室溫。接著添加1.4g(4.2mmol)的1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基-5-羧基-3H-假吲哚、1.2g(14.6mmol)的無水乙酸鈉、15ml的乙酸酐和6ml的乙酸。反應(yīng)混合物加熱1小時(shí)至120℃，然后冷卻藍(lán)色的溶液，并與100ml的乙醚混合。如實(shí)施例1進(jìn)行處理及純制。產(chǎn)量1.8g(66％)，藍(lán)色凍干物。實(shí)施例3合成1，1＇-二(4-磺基丁基)茚三炭菁-5-羧酸鈉鹽(3)1.2g(4.1mmol)的1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基-3H-假吲哚和1.1g(3.9mmol)的戊烯二醛-二縮苯胺鹽酸鹽在15ml的乙酸酐中于120℃下攪拌30分鐘，然后用水浴冷卻至室溫。接著添加1.4g(4.2mmol)的1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基-5-羧基-3H-假吲哚、1.2g(14.6mmol)的無水乙酸鈉、15ml的乙酸酐和6ml的乙酸。反應(yīng)混合物加熱1小時(shí)至120℃，然后冷卻藍(lán)色的溶液，并與100ml的乙醚混合。如實(shí)施例1進(jìn)行處理及純制。產(chǎn)量1.8g(60％)，藍(lán)色凍干物。
實(shí)施例1-3的化合物的結(jié)構(gòu)繪制在

圖1中。實(shí)施例4-6合成用于固相合成偶聯(lián)于肽的氨基(N-端或ζ-賴氨酸)上的茚菁染料4-6
該合成是如下進(jìn)行的用β-丙氨酸-叔丁基酯使染料1-3酰胺化，然后斷裂叔丁基酯基。
0.5mmol的染料1-3和0.1g(1.0mmol)的三乙胺在20ml二甲基甲酰胺中的溶液在0℃下與0.5mmol的TBTU于10ml二甲基甲酰胺中的溶液混合，然后在0℃下攪拌15分鐘。接著滴加0.11g(0.6mmol)的β-丙氨酸-叔丁基酯鹽酸鹽和0.6mmol的三乙胺在5ml二甲基甲酰胺中的溶液，并在室溫下攪拌反應(yīng)混合物2小時(shí)。添加100ml的乙醚，然后抽濾沉淀的固體，溶解在20ml的二氯甲烷中，與10ml的三氟乙酸混合，并在室溫下攪拌24小時(shí)。真空蒸發(fā)濃縮混合物，然后如實(shí)施例1對(duì)殘留物進(jìn)行色譜純制和凍干，產(chǎn)量0.21g(58％)的4，0.29g(76％)的5，0.28g(72％)的6。實(shí)施例7-9由1-3合成用于固相合成偶聯(lián)于肽的氨基(N-端或ζ-賴氨酸)上的茚菁染料7-9制備方法類似于實(shí)施例4-6，其中使用0.1g(0.6mmol)的甘氨酸-叔丁基酯鹽酸鹽，產(chǎn)量0.25g(68％)的4，0.30g(80％)的5，0.32g(83％)的6。實(shí)施例10-12由1-3合成用于通過偶聯(lián)在半胱氨酸的巰基上而固相合成偶聯(lián)于肽上的茚菁染料10-12該合成是如下進(jìn)行的用3-氨基丙醇使染料1-3酰胺化，然后將醇基轉(zhuǎn)化為溴化物。
在0℃下使0.5mmol染料1-3和0.1g(1.0mmol)三乙胺在20ml二甲基甲酰胺中的溶液與0.5mmol的TBTU在10ml二甲基甲酰胺中的溶液混合，然后在0℃下攪拌15分鐘。接著滴加850mg(1.2mmol)3-氨基丙醇和1.2mmol三乙胺在5ml二甲基甲酰胺中的溶液，并在室溫下攪拌反應(yīng)混合物6小時(shí)。添加100ml的乙醚，然后如實(shí)施例1所述過濾出沉淀固體，進(jìn)行色譜純制并凍干。
在4℃下于4ml二甲基甲酰胺和4ml二氯甲烷的混合物中攪拌0.3mmol中間產(chǎn)物與55mg(0.5mmol)的N-溴代琥珀酰亞胺和130mg(0.5mmol)三苯基膦混合，由此進(jìn)行形成溴化物10-12的反應(yīng)。添加3ml的乙醚，沉淀出產(chǎn)物，過濾，并用作肽偶聯(lián)反應(yīng)中的粗產(chǎn)物。實(shí)施例14-16和18-27樹脂合成VIP-受體結(jié)合肽與染料1-9和13的肽結(jié)合物a)固相肽合成根據(jù)Fmoc策略并類似于標(biāo)準(zhǔn)Fmoc機(jī)器方案(Pept.Res.，36(1990)225)，在50μmol的TentaGel-Sram樹脂(Rapp Polymers，Tuebingen)中合成肽，其中使用偶聯(lián)劑PyBOP(苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷基六氟磷酸鱗)和N-甲基嗎啉。使用以下側(cè)鏈保護(hù)基對(duì)于Cys、His、Asn和Gln用三苯甲基；對(duì)于Asp、Glu、Ser和Thr用叔丁基；對(duì)于Lys和Trp用叔丁氧基羰基；而對(duì)于Arg用五甲基苯并二氫吡喃磺?；?。
用正交保護(hù)基方法實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)于賴氨酸的ζ-氨基上(實(shí)施例24)。作為賴氨酸組分，使用Fmoc-賴氨酸(Dde-OH)，而肽如上所述進(jìn)行合成。在使N-端?；螅?％肼水合物選擇性地?cái)嗔袲de-保護(hù)基。b)染料偶聯(lián)染料連接在N-端部分中或者仍為固相鍵合的肽中的賴氨酸上。在此方面，在600μl二甲基甲酰胺中溶解75μmol的各染料1-9和13(1.5eq)，然后與83μmol的TBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基四氟硼酸尿)及150μmol的N，N-二異丙基乙基胺混合。2分鐘后，將該反應(yīng)混合物添加在攜帶各種肽的樹脂中，并反應(yīng)過夜。用二甲基甲酰胺洗滌樹脂5次，并用二氯甲烷洗滌3次，然后在空氣中干燥。c)保護(hù)基斷裂以及脫掉染料-肽結(jié)合物將1.5ml由750mg苯酚、250μl乙烷二硫醇、500μl硫代苯甲醚和500μl水在10ml三氟乙酸中組成的混合物分別添加在攜帶肽-結(jié)合物的樹脂中，并反應(yīng)4小時(shí)。染料-肽結(jié)合物用冷的叔丁基甲基醚沉淀，用冷的乙醚洗滌6次，溶解在5％乙酸中，然后凍干。在Vydac-C18柱中用RP-HPLC進(jìn)行結(jié)合物的純度分析及純制(梯度水+0.05％TFA/乙腈，5％-60％乙腈，20分鐘，檢測(cè)214和750nm)。
所合成的染料-肽結(jié)合物的結(jié)構(gòu)如下所示。與VIP-受體結(jié)合肽I的染料結(jié)合物實(shí)施例14-16染料1-3與VIP(1-28)的結(jié)合物 n＝1茚炭菁-VIP(1-28)結(jié)合物14n＝2茚二炭菁-VIP(1-28)結(jié)合物15n＝3茚三炭菁-VIP(1-28)結(jié)合物16實(shí)施例17染料12與Cys17-VIP(1-28)的結(jié)合物 茚三炭菁-Cys17-VIP(1-28)結(jié)合物17實(shí)施例18-20染料1-3與VIP(14-28)的結(jié)合物 n＝1茚炭菁-VIP(14-28)結(jié)合物18n＝2茚二炭菁-VIP(14-28)結(jié)合物19n＝3茚三炭菁-VIP(14-28)結(jié)合物20實(shí)施例21-23染料4-6與VIP(14-24)的結(jié)合物 n＝1茚炭菁-β-丙氨酸-VIP(14-24)結(jié)合物21n＝2茚二炭菁-β-丙氨酸-VIP(14-24)結(jié)合物22n＝3茚三炭菁-β-丙氨酸-VIP(14-24)結(jié)合物23實(shí)施例17樹脂合成由VIP-受體結(jié)合肽與染料10-22組成的肽結(jié)合物為通過硫醚鍵將攜帶溴化物的染料10-22化學(xué)選擇性地連接在肽上，必須在肽中插入具有正交保護(hù)基的半胱氨酸或者高半胱氨酸。如實(shí)施例14-16/18-27所述進(jìn)行固相肽合成，并使用成分Fmoc-cys(Mmt)-OH。在二氯甲烷中用1％TFA/5％三異丙基硅烷可斷裂單甲氧基三苯甲基(Mmt)，同時(shí)得到其他側(cè)鏈保護(hù)基。在此方面，用1ml上述溶液分別與樹脂溫育10分鐘，共三次。用二氯甲烷(3×)、DMF(5×)和乙醇(3×)洗滌樹脂后，樹脂與20％碳酸銫溶液(1ml)溫育2分鐘，用水(2×)、乙醇(2×)和DMF(2×)洗滌。將75μmol的各染料10-22(1.5eq)溶解在600μl二甲基甲酰胺中，然后添加在各樹脂中，并重復(fù)該步驟30分鐘。樹脂用二甲基甲酰胺(5×)和二氯甲烷(2×)洗滌5次。在空氣中干燥樹脂后，如上所述斷裂保護(hù)基并脫掉載體。
其他合成的染料-肽結(jié)合物的結(jié)構(gòu)都如下所示。與VIP-受體結(jié)合肽II的染料結(jié)合物實(shí)施例24染料6與Lys25-VIP(14-25)的結(jié)合物 (ε-氨基-茚三炭菁)-Lys25-VIP(14-25)結(jié)合物24實(shí)施例25染料3與D-VIP(14-24)的結(jié)合物 茚三炭菁-D-VIP(14-24)結(jié)合物25實(shí)施例26染料13與D-VIP(14-24)的結(jié)合物 茚三炭菁-5-羧酸葡糖酰胺-D-VIP(14-24)結(jié)合物26實(shí)施例27染料13與逆-D-VIP(14-24)的結(jié)合物 茚三炭菁-5-羧酸葡糖酰胺-逆-D-VIP(14-24)結(jié)合物27實(shí)施例28-32樹脂合成由促生長(zhǎng)素抑制素-受體結(jié)合肽與染料1-9及13組成的肽結(jié)合物總的指示在500mg的TCP-Thr(But)-fmoc-樹脂(Pepchem TuebingenCompany)上進(jìn)行合成，該樹脂的濃度為0.49mmol/g。使用以下臨時(shí)保護(hù)基“逐步”合成肽對(duì)于Thr和Ser用叔丁基，對(duì)于Cys和Asp用三苯甲基，對(duì)于Trp和Lys用Boc。作為縮合試劑，可使用HBTU。
斷裂N-端Fmoc保護(hù)基后，在特殊的合成步驟中縮合染料1-9、13。為此目的，將255mg的樹脂懸浮于約2ml的DMF中，并與0.5mmol的染料、0.5mmol的HBTU和0.17ml的DIEA混合。在室溫下攪拌18小時(shí)，抽濾樹脂，用二氯甲烷洗滌，然后干燥。用95％三氟乙酸以及三異丙基硅烷，并隨后由10％乙酸中凍干，由此從樹脂上斷裂染料-肽結(jié)合物。粗產(chǎn)物用活性炭環(huán)化，并進(jìn)行色譜純制(50×300mm VYDACRP-18，梯度水/乙腈)。
所合成的染料-肽結(jié)合物的結(jié)構(gòu)如下所示。染料與促生長(zhǎng)素抑制素-受體結(jié)合肽的結(jié)合物實(shí)施例28-30染料1-3與pentetreotide的結(jié)合物 n＝1茚炭菁-pentetreotide 28n＝2茚二炭菁-pentetreotide 29n＝3茚三炭菁-pentetreotide 30實(shí)施例31染料3與促生長(zhǎng)素抑制素-14的結(jié)合物 茚三炭菁-促生長(zhǎng)素抑制素-14結(jié)合物31實(shí)施例32染料13與促生長(zhǎng)素抑制素-14的結(jié)合物 茚三炭菁-5-羧酸-葡糖酰胺-促生長(zhǎng)素抑制素-14結(jié)合物32實(shí)施例33-38合成由神經(jīng)降壓肽與染料3組成的肽結(jié)合物類似于實(shí)施例14-27中描述的總方案進(jìn)行所述物質(zhì)的合成。
所合成的染料-肽結(jié)合物的結(jié)構(gòu)如下所示。染料與神經(jīng)降壓肽-受體結(jié)合肽的結(jié)合物實(shí)施例33-35染料7-9與D-Tyr11-神經(jīng)降壓肽(7-13)的結(jié)合物 n＝1茚炭菁-D-Tyr11-神經(jīng)降壓肽(7-13)結(jié)合物33n＝2茚二炭菁-D-Tyr11-神經(jīng)降壓肽(7-13)結(jié)合物34n＝3茚三炭菁-D-Tyr11-神經(jīng)降壓肽(7-13)結(jié)合物35實(shí)施例36染料2與D-Tyr11-神經(jīng)降壓肽的結(jié)合物 (ε-氨基-Lys6-茚二炭菁)-D-Tyr11-神經(jīng)降壓肽結(jié)合物36實(shí)施例37-38染料10-11與D-Tyr11-神經(jīng)降壓肽(5-13)-Cys的結(jié)合物 n＝1茚炭菁-D-Tyr11-神經(jīng)降壓肽(5-13)-Cys結(jié)合物37n＝2茚二炭菁-D-Tyr11-神經(jīng)降壓肽(5-13)-Cys結(jié)合物38實(shí)施例39所合成的染料-肽結(jié)合物的吸收及熒光性質(zhì)在PBS和牛血漿(Perkin Elmer Lambda 2)中測(cè)定最大吸收和消光系數(shù)。在PBS中通過在短鏈側(cè)激發(fā)得到熒光發(fā)射光譜(距最大吸收為約40nm)。
吸收及熒光數(shù)據(jù)總結(jié)于圖4中。在圖5中，以實(shí)施例的方式給出了典型的吸收及熒光發(fā)射光譜。實(shí)施例40使用熒光顯微鏡測(cè)定細(xì)胞成像在人腫瘤細(xì)胞中于體外研究根據(jù)本發(fā)明的化合物的結(jié)合及成像，并表達(dá)血管活性腸肽和/或促生長(zhǎng)素抑制素和/或神經(jīng)降壓肽的受體。為此目的，在1.5ml包含測(cè)試物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)5×105個(gè)細(xì)胞腫瘤。使用不同濃度的物質(zhì)(10nM-10μM)，而且培養(yǎng)時(shí)間也是變化的(1分鐘-24小時(shí))。培養(yǎng)后，使細(xì)胞沉降，并制備顯微鏡制劑。在Zeiss Axiovert135-熒光顯微鏡上進(jìn)行評(píng)估，該熒光顯微鏡裝備有Cy7-(激發(fā)器HQ710/70nm，發(fā)射器810/90nm，分光器750nm LP)、Cy5-(激發(fā)器575-625nm，發(fā)射器660-710nm BP，分光器645nm)和Cy3-濾光器(激發(fā)器546/12nm，發(fā)射器590nm LP，分光器580nm)。所有制劑中，用CCD-照相機(jī)(Visitron RTE/CCD-576)記錄白光和熒光圖象并進(jìn)行數(shù)字儲(chǔ)存。
如下描述所選擇的結(jié)果與10μM茚三炭菁-VIP(1-28)結(jié)合物16培養(yǎng)30分鐘后建立HT29細(xì)胞的顯微鏡白光和熒光圖象(Cy7-濾光器)。在熒光圖象中，檢測(cè)到在所有細(xì)胞上分散非常均勻的熒光。另外，信號(hào)增加的區(qū)域是可見的，這有可能是與血管腔有關(guān)。熒光圖象中的細(xì)胞在它們的空間擴(kuò)展方面與白光圖象是相關(guān)聯(lián)的。
用以下化合物，通過類似的方法得到白光和熒光圖象(Cy7-濾光器)茚三炭菁-VIP(14-28)結(jié)合物20，10μM，HT29細(xì)胞。熒光均勻地分散在細(xì)胞上，與白光圖象良好關(guān)聯(lián)。
茚三炭菁-逆-D-VIP(24-14)結(jié)合物25，10μM，HT29細(xì)胞。熒光均勻地分散在細(xì)胞上，與白光圖象良好關(guān)聯(lián)。
茚三炭菁-pentetreotide結(jié)合物30，10μM，RIN38-VIP1細(xì)胞。在細(xì)胞的膜區(qū)域中熒光具有血管圖形，與白光圖象良好關(guān)聯(lián)。
另外，用以下化合物通過類似的方法得到熒光圖象(-氨基-茚三炭菁)-Lyrs25-VIP(14-25)結(jié)合物24，10μM，RIN38-VIP1細(xì)胞，Cy7-濾光器。熒光圖象是均勻的、細(xì)胞內(nèi)近核熒光。
茚二炭菁-VIP(1-28)結(jié)合物15，10μM，RIN38-VIP1細(xì)胞，Cy5-濾光器。熒光圖象顯示細(xì)胞內(nèi)熒光區(qū)域，在細(xì)胞的膜區(qū)域中具有血管圖形。
茚炭菁-VIP(1-28)結(jié)合物14，10μM，RIN38-VIP1細(xì)胞，Cy3-濾光器。熒光圖象顯示細(xì)胞內(nèi)熒光區(qū)域，在細(xì)胞的膜區(qū)域中具有血管圖形。實(shí)施例41使用體內(nèi)熒光成像在攜帶腫瘤的小鼠中研究腫瘤濃度在攜帶腫瘤的裸鼠中注射后體內(nèi)研究根據(jù)本發(fā)明的化合物的成像性質(zhì)。為此目的，靜脈注射0.1-2μmol/kg的測(cè)試物質(zhì)，然后在0-48小時(shí)的時(shí)間段中觀察腫瘤區(qū)域中的濃度。用波長(zhǎng)為640nm(茚二炭菁)或740nm(茚三炭菁)的近紅外光照射動(dòng)物，由此激發(fā)物質(zhì)的熒光，所述近紅外光是由NdYAG激光產(chǎn)生的。用增強(qiáng)型CCD照相機(jī)在大于700nm但小于800nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)檢測(cè)熒光輻射，并數(shù)字儲(chǔ)存熒光圖象。
如下描述結(jié)果在攜帶腫瘤的裸鼠(右后肋中的HT29腫瘤)中，在給藥0.1μmol/kg的茚三炭精-VIP(14-28)結(jié)合物20之前以及之后1小時(shí)記錄整個(gè)身體的熒光圖象。給藥前的熒光強(qiáng)度是可以忽略的(低自體熒光)。給藥1小時(shí)后，在熒光發(fā)射中，相對(duì)于對(duì)側(cè)肋在腫瘤中產(chǎn)生強(qiáng)度增加約2倍的信號(hào)，而此等發(fā)射則均勻地分散在身體的其余部分中。
在攜帶腫瘤的裸鼠(右后肋中的RIN38-SSTR2腫瘤)中，在給藥0.1μmol/kg的茚三炭精-pentetreotide結(jié)合物30之前以及之后1小時(shí)記錄整個(gè)身體的熒光圖象。給藥前的熒光強(qiáng)度是可以忽略的(低自體熒光)。給藥1小時(shí)后，在熒光發(fā)射中，相對(duì)于對(duì)側(cè)肋在腫瘤中產(chǎn)生強(qiáng)度增加約3倍的信號(hào)，而此等發(fā)射則均勻地分散在身體的其余部分中。
在攜帶腫瘤的裸鼠(右后肋中的HT29腫瘤)中，在給藥0.1μmol/kg的(ε-氨基-茚三炭精)-Lys25-VIP(14-25)結(jié)合物24之前以及之后1小時(shí)記錄整個(gè)受體的熒光圖象。給藥前的熒光強(qiáng)度是可以忽略的(低自體熒光)。給藥1小時(shí)后，在熒光發(fā)射中，相對(duì)于對(duì)側(cè)肋在腫瘤中產(chǎn)生強(qiáng)度增加約1.5倍的信號(hào)。另外，在腎臟中檢測(cè)到增強(qiáng)的熒光信號(hào)。
在攜帶腫瘤的裸鼠(右后肋中的HT29腫瘤)中，在給藥0.2μmol/kg的茚二炭精-VIP(1-28)結(jié)合物15之前以及之后5分鐘記錄整個(gè)受體的熒光圖象。給藥前的熒光強(qiáng)度是可以忽略的(低自體熒光)。給藥1小時(shí)后，在熒光發(fā)射中，相對(duì)于對(duì)側(cè)肋在腫瘤中產(chǎn)生強(qiáng)度增加約1.4倍的信號(hào)。另外，在腎臟中檢測(cè)到增強(qiáng)的熒光信號(hào)。實(shí)施例42染料-肽結(jié)合物在牛血漿中的穩(wěn)定性研究使用HPLC研究根據(jù)本發(fā)明的化合物隨時(shí)間在血漿中的化學(xué)穩(wěn)定性。為此目的，用移液管量取1mM的肽PBS溶液在牛血漿(GraeberCompany，冷凍，用于肝素分析)中，同時(shí)得到30μM的濃度，然后在37℃溫育該溶液。
在各種時(shí)間(0.5、1、2、4、6、24小時(shí))處，1ml血漿溶液用1ml甲醇混合，由此對(duì)樣品進(jìn)行處理，然后離心沉淀的蛋白。
使用HPLC分析上清液，其中在750nm處測(cè)定相對(duì)于0℃下溫育1分鐘后的含量(對(duì)照)的含量。
HPLCBeckmann，二極管陣列檢測(cè)器TIDAS(J & M Company)，350-1000nm；柱Chromasil5μ，250mm×4.5mm；流動(dòng)溶劑A90％水(+0.5％TFA)/10％甲醇B10％水(+0.5％TFA)/90％甲醇梯度10％B-100％B，20分鐘內(nèi)實(shí)施例總結(jié)于圖6中。實(shí)施例43使用斑點(diǎn)合成進(jìn)行VIP的取代分析1、在纖維素上合成肽在纖維素上合成肽(斑點(diǎn)合成)首次由R.Frank和R.Doering于1988年公開，其細(xì)節(jié)描述在R.Frank1(1992)中。在此，使用AGSchneider-Mergener確立的方法2。
纖維素膜進(jìn)行化學(xué)改性，以對(duì)隨后的肽合成形成合適的錨定功能。在此情況下，在氨基官能化的纖維素膜(CAPE膜)3中插入巰基4。溴丙基酯形式的第一個(gè)氨基酸可偶聯(lián)在該巰基上。接著，根據(jù)Fmoc策略可順序地構(gòu)建肽的所有氨基酸。最后，在肽的N-端位置上連接茚二炭菁染料，并脫除所有的側(cè)鏈保護(hù)基。
為能夠研究用于受體結(jié)合的肽，肽必須從纖維素上脫掉。在此方面，所研制的方法是首先從纖維素上斷裂具有真正C-端的肽。1a、纖維素膜的改性·20×30nm纖維素膜(Whatman 50)與甲醇/1.2％全氯乙酸溫育2分鐘，然后凍干。
·在二惡烷/1.2％全氯乙酸中與10％表溴醇溫育3小時(shí)后，與甲醇反應(yīng)30分鐘，并用甲醇洗滌2次。
·用二甲基甲酰胺(DMF)洗滌3次，然后與50％的1，3-二氨基丙烷(v/v)在DMF中溫育過夜。接著，如下進(jìn)行洗滌3×DMF，2×乙醇，2×蒸餾水，2×乙醇，15分鐘5M甲醇鈉，3×甲醇，4×蒸餾水，3×乙醇，1×乙醚。1b、斑點(diǎn)的限定·對(duì)于斑點(diǎn)限定，在15分鐘的反應(yīng)時(shí)間處，在纖維素膜的某些點(diǎn)上用自動(dòng)斑點(diǎn)機(jī)器人(auto-spot robot)222 XL(Abimed，Laugenfeld)雙滴定1.3μl的0.6M Fmoc-β-丙氨酸-Opfp溶液。
·膜用2％乙酸酐溶液?；?分鐘，用20％乙酸酐/10％二異丙基乙基胺?；?0分鐘。
·在斷裂Fmoc保護(hù)基時(shí)，膜用3×DMF洗滌，與20％哌啶溶液溫育10分鐘共2次，然后用5×DMF和1×乙醇洗滌。用溴酚藍(lán)可使游離氨基為可見的。用乙醇重復(fù)洗滌后，干燥膜。1c、Mmt-巰基丙酸與溴丙基酯的偶聯(lián)·0.6M的巰基丙酸在15分鐘的反應(yīng)時(shí)間處雙滴定于限定的斑點(diǎn)中。然后用3×DMF和3×二氯甲烷(DCM)洗滌。
·與10％二氯乙酸/0.5％三氟乙酸溫育2分鐘，然后與10％二氯乙酸/0.5％三氟乙酸/5％三異丁基硅烷溫育5分鐘共3次，由此斷裂Mmt保護(hù)基。進(jìn)行以下洗滌步驟1×DCM，2×乙醇，1×蒸餾水，用10％碳酸銫1-2分鐘，1×蒸餾水，2×乙醇，1×乙醚。
·在0.6M的濃度和15分鐘的反應(yīng)時(shí)間，偶聯(lián)相應(yīng)的Fmoc-溴丙基-氨基酸酯。如1b所述斷裂Fmoc保護(hù)基。1d、氨基酸的偶聯(lián)·在N-甲基吡咯烷酮中重復(fù)移入0.6M的氨基酸溶液，并隨后斷裂Fmoc保護(hù)基，由此構(gòu)建肽。1e、茚二炭菁染料的偶聯(lián)·0.3M的茚二炭菁染料溶液用0.3M的TBTU和0.6M的二異丙基乙基胺活化，然后在15分鐘的反應(yīng)時(shí)間處分4次移液至斑點(diǎn)上。1f、側(cè)鏈保護(hù)基的斷裂·隨后如下處理膜以斷裂側(cè)鏈保護(hù)基90％三氟乙酸/3％三異丙基硅烷/2％蒸餾水/1％苯酚共30分鐘，然后50％三氟乙酸/3％三異丙基硅烷/2％蒸餾水/1％苯酚共2.5小時(shí)。然后用4×二氯甲烷、3×DMF、1×乙醇洗滌。2、從纖維素膜上斷裂肽·沖壓掉斑點(diǎn)，用甲醇洗滌。為進(jìn)行斷裂，與7mM的甲醇鈉甲醇溶液溫育30分鐘。添加37％乙酸，可校正pH。然后在快速真空中干燥肽。
·干燥后，將肽放入蒸餾水中，然后使用反相HPLC和MALDI-TOF進(jìn)行分析。3、細(xì)胞分析及連續(xù)流動(dòng)細(xì)胞計(jì)量·通過染料用光度計(jì)測(cè)定VIP衍生物的濃度。在細(xì)胞分析中，所用肽的最終濃度為150mM。在此情況下，1×105個(gè)RIN38(VAPC1)細(xì)胞與VIP衍生物在37℃下于結(jié)合緩沖液(50mM的tris/HCl，pH7.5，5nM的氯化鎂，1mM的氯化鈣，100mM的氯化鈉，4％BSA)中溫育1小時(shí)。
·細(xì)胞用2×PBS洗滌，移入FACS管中，然后在377g下離心5分鐘。細(xì)胞沉淀物重新懸浮在300μl的Cellfix中，然后在FACS-Calibur(Becton Dickinson)用FL4-透鏡系統(tǒng)測(cè)定。4、評(píng)估·將在連續(xù)流動(dòng)的細(xì)胞計(jì)量中測(cè)定的天然人VIP肽的熒光強(qiáng)度設(shè)定為100％。28個(gè)天然VIP肽的標(biāo)準(zhǔn)偏差為11％。其他VIP衍生物對(duì)此調(diào)節(jié)為100％。
圖7顯示了RIN38 VPAC1細(xì)胞在有150nM染料標(biāo)記的肽存在時(shí)于37℃下溫育1小時(shí)后的相對(duì)熒光強(qiáng)度。百分?jǐn)?shù)的數(shù)據(jù)為相對(duì)于相應(yīng)系列的天然肽。
斑點(diǎn)合成中的文獻(xiàn)1、Frank，R.(1992)Spot SynthesisAn Easy Technique for thePositionally Addressable，Parallel Chemical Synthesis on a MembraneSupport.Tetrahedron 48，9217-9232.
2、Kramer，A.；Schneider-Mergener，J.(1998)Synthesis and Screeningof Peptide Libraries on Continuous Cellulose Membrane Support.Methods inMolecular Biology 87，25-39.
3、Volkmer-Engert，R.；Hoffman，B.；Schneider-Mergener，J.(1997)Tetrahedron Lett.38，1029-1032.
4、Licha，K.；Bhargava，S.；Rheinlaender，C.；Becker，A.；Schneider-Mergener，J；Volkmer-Engert，R.(印刷中)Highly Parallel Nano-Synthesis ofCleavable Peptide-Dye Conjugates on Cellulose Membrane.TetrahedronLett.實(shí)施例44a)5-N-(2，3-二羥基丙基)氨基羰基-1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基(3H)假吲哚將0.9g(2.6mmol)的5-羧基-1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基(3H)假吲哚(Anal.Biochem.217，197，1994)引入至30ml無水N，N-二甲基甲酰胺和3ml吡啶中，然后與1.35g(5.3mmol)的二琥珀酰亞胺基碳酸酯混合。3小時(shí)后，添加0.965g(10.6mmol)的2，3-二羥基丙基胺。在室溫下攪拌過夜，將反應(yīng)物蒸發(fā)至干，然后殘留物用乙醚進(jìn)行吸附性沉淀。抽濾出固體，并在RP材料上進(jìn)行色譜純制。
產(chǎn)量0.82g(理論值的76％)分析(相對(duì)于無溶劑的物質(zhì))計(jì)算C55.32 H6.84 N6.79 S7.77 O23.27實(shí)測(cè)C55.39 H6.95 N6.57 S7.58b)4-[2-[4-氯-7-[5-N-(二羥基丙基)氨基羰基-3，3-二甲基-1-(4-磺酸基丁基)二氫亞吲哚-2-基]-3，5-(丙烷-1，3-二基)-1，3，5-庚三烯-1-基]-5-N-(二羥基丙基)氨基羰基-3，3-二甲基(3H)-indolio]-丁烷磺酸鈉在氬氣中使360mg(1mmol)的N-[5-苯胺基-3-氯-2，4-(丙烷-1，3-二基)-2，4-戊二烯-1-亞基]氯化苯銨、825mg(2mmol)5-N-(2，3-二羥基丙基)氨基羰基-1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基(3H)假吲哚(實(shí)施例44a)和330mg(4mmol)無水乙酸鈉在30ml乙醇中的溶液回流2小時(shí)。蒸餾出乙醇，殘留物進(jìn)行色譜純制。
產(chǎn)量0.58g(理論值的59％)分析(相對(duì)于無溶劑的物質(zhì))計(jì)算C56.17 H6.15 Cl3.60 N6.79 S7.77 O23.27 Na2.34實(shí)測(cè)C55.99 H6.30 Cl3.41 N6.87 S7.64 Na2.17c)4-[2-[4-(4-(2-羧基乙基)苯基氧基)-7-[5-N-(二羥基丙基)氨基羰基-3，3-二甲基-1-(4-磺酸基丁基)二氫亞吲哚-2-基]-3，5-(丙烷-1，3-二基)-1，3，5-庚三烯-1-基]-5-N-(二羥基丙基)氨基羰基-3，3-二甲基(3H)-indolio]-丁烷磺酸鈉，N-羥基琥珀酰亞胺酯在保護(hù)氣體中將225mg(1.4mmol)的3-(4-羥基苯基)丙酸溶解在10ml的無水N，N-二甲基甲酰胺中，然后與65mg(2.7mmol)的氫化鈉(60％，在油中)混合。30分鐘后，添加138mg(0.14mmol)的4-[2-[4-氯-7-[5-N-(二羥基丙基)氨基羰基-3，3-二甲基-1-(4-磺酸基丁基)二氫亞吲哚-2-基]-3，5-(丙烷-1，3-二基)-1，3，5-庚三烯-1-基]-5-N-(二羥基丙基)氨基羰基-3，3-二甲基(3H)-indolio]-丁烷磺酸鈉(實(shí)施例44b)，并攪拌30分鐘。反應(yīng)混合物用干冰淬滅，并蒸發(fā)至干。殘留物通過制備性HPLC純制。在制備活性酯時(shí)，將14mg(120μmol)的N-羥基琥珀酰亞胺和2mg(2.4μmol)的羧酸溶解在200μl的N，N-二甲基甲酰胺中。10分鐘后，添加24mg(120μmol)的二環(huán)己基碳化二亞胺，并在室溫下攪拌過夜。活性酯未經(jīng)純制即用于下一步反應(yīng)中。
類似于實(shí)施例14-16以及18-27a(固相肽合成)的合成方法，在固相中合成VIP類似物HSDAVFWDNY TRLRKQMAVKKYLNSILN。染料4-[2-[4-(4-(2-羧基乙基)苯基氧基)-7-[5-N-(二羥基丙基)氨基羰基-3，3-二甲基-1-(4-磺酸基丁基)二氫亞吲哚-2-基]-3，5-(丙烷-1，3-二基)-1，3，5-庚三烯-1-基]-5-N-(二羥基丙基)氨基羰基-3，3-二甲基(3H)-indolio]-丁烷磺酸鈉根據(jù)實(shí)施例14-16以及18-27b偶聯(lián)在肽上(染料偶聯(lián))，然后根據(jù)實(shí)施例14-16和18-27c(保護(hù)基斷裂以及脫掉染料-肽結(jié)合物)分離并純制該結(jié)合物。d)4-[2-[4-(4-(2-異硫氰酸基乙基)苯基氧基)-7-[5-N-(二羥基丙基)氨基羰基-3，3-二甲基-1-(4-磺酸基丁基)二氫亞吲哚-2-基]-3，5-(丙烷-1，3-二基)-1，3，5-庚三烯-1-基]-5-N-(二羥基丙基)氨基羰基-3，3-二甲基(3H)-indolio]-丁烷磺酸鈉于0℃下將在2ml的N，N-二甲基甲酰胺中的116mg(0.6mmol)的2-(4-羥基苯基)乙基異硫氰酸酯添加在28mg(0.6mmol)氫化鈉(60％，在油中)于4ml無水N，N-二甲基甲酰胺中的懸浮液內(nèi)。30分鐘后，將如此制得的溶液添加在138mg(0.14mmol)的4-[2-[4-氯-7-[5-N-(二羥基丙基)氨基羰基-3，3-二甲基-1-(4-磺酸基丁基)二氫亞吲哚-2-基]-3，5-(丙烷-1，3-二基)-1，3，5-庚三烯-1-基]-5-N-(二羥基丙基)氨基羰基-3，3-二甲基(3H)-indolio]-丁烷磺酸鈉(實(shí)施例44b)中。在室溫下攪拌過夜，然后用干冰淬滅。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸發(fā)至干，殘留物用制備性HPLC純制。
產(chǎn)量85mg(理論值的54％)分析(相對(duì)于無溶劑的物質(zhì))計(jì)算C58.65 H6.09 N6.22 S8.54 O18.47 Na2.04實(shí)測(cè)C58.53 H6.17 N6.11 S8.63 Na1.83類似于實(shí)施例14-16以及18-27a(固相肽合成)的合成方法，在固相中合成VIP類似物HSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN。染料4-[2-[4-(4-(2-異硫氰酸基乙基)苯基氧基)-7-[5-N-(二羥基丙基)氨基羰基-3，3-二甲基-1-(4-磺酸基丁基)二氫亞吲哚-2-基]-3，5-(丙烷-1，3-二基)-1，3，5-庚三烯-1-基]-5-N-(二羥基丙基)氨基羰基-3，3-二甲基(3H)-indolio]-丁烷磺酸鈉偶聯(lián)在肽的N-端位置上，然后根據(jù)實(shí)施例14-16和18-27c(保護(hù)基斷裂以及脫掉染料-肽結(jié)合物)分離并純制該結(jié)合物。
類似地，可由以下成分合成其他對(duì)稱的親水性染料具有羥基烷基取代基的親水性假吲哚衍生物(根據(jù)實(shí)施例44a制備)a)5-N-(2，3-二羥基丙基)-N-甲基氨基羰基-1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基(3H)假吲哚b)5-N-(羥基乙基)-氨基羰基-1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基(3H)假吲哚
c)5-N-(2，3-二羥基丙基)-N-(羥基乙基)氨基羰基-1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基(3H)假吲哚d)5-N，N-二(羥基乙基)-氨基羰基-1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基(3H)假吲哚e)5-N-(2，3，4，5，6-五羥基己基)-氨基羰基-1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基(3H)假吲哚f)5-N-(1，3，4-三羥基丁-2-基)-N-甲基氨基羰基-1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基(3H)假吲哚實(shí)施例45a)5-N-(2，3，4，5，6-五羥基己基)氨基羰基-1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基(3H)假吲哚將0.6g(1.8mmol)的5-羧基-1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基(3H)假吲哚(Anal.Biochem.217，197，1994)引入至20ml無水N，N-二甲基甲酰胺和2ml吡啶中，然后與0.95g(3.6mmol)的二琥珀酰亞胺基碳酸酯混合。2小時(shí)后，添加1.4ml(10mmol)的三乙胺和322mg(1.8mmol)的葡糖胺。在室溫下攪拌過夜，將反應(yīng)物蒸發(fā)至干，然后殘留物用乙醚進(jìn)行吸附性沉淀。抽濾出固體，并在RP材料上進(jìn)行色譜純制。
產(chǎn)量0.67g(理論值的74％)分析(相對(duì)于無溶劑的物質(zhì))計(jì)算C52.58 H6.82 N5.57 S6.38 O28.65實(shí)測(cè)C52.47 H6.91 N5.39 S6.44b)4-[2-[4-氯-7-[5-N-(2，3，4，5，6-五羥基己基)氨基羰基-3，3-二甲基-1-(4-磺酸基丁基)二氫亞吲哚-2-基]-3，5-(丙烷-1，3-二基)-1，3，5-庚三烯-1-基]-3，3-二甲基-5-[N-(2，3，4，5，6-五羥基己基)氨基羰基](3H)-indolio]-丁烷磺酸鈉在氬氣中使180mg(0.5mmol)的N-[5-苯胺基-3-氯-2，4-(丙烷-1，3-二基)-2，4-戊二烯-1-亞基]氯化苯銨、503mg(1mmol)5-N-(2，3，4，5，6-五羥基己基)氨基羰基-1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基(3H)假吲哚(實(shí)施例45a)和165mg(2mmol)無水乙酸鈉在30ml乙醇中的溶液回流2小時(shí)。蒸餾出乙醇，殘留物進(jìn)行色譜純制。
產(chǎn)量0.31g(理論值的53％)分析(相對(duì)于無溶劑的物質(zhì))計(jì)算C54.05 H6.33 Cl3.01 N4.76 S5.44 O24.45 Na1.95實(shí)測(cè)C53.89 H6.20 Cl2.87 N4.83 S5.29 Na1.72c)4-[2-[4-(4-異硫氰酸基硫代苯基氧基)-7-[5-N-(2，3，4，5，6-五羥基己基)氨基羰基-3，3-二甲基-1-(4-磺酸基丁基)二氫亞吲哚-2-基]-3，5-(丙烷-1，3-二基)-1，3，5-庚三烯-1-基]-3，3-二甲基-5-[N-(2，3，4，5，6-五羥基己基)氨基羰基](3H)-indolio]-丁烷磺酸鈉于氬氣下將54mg(0.4mmol)的4-氨基苯硫酚溶解在10ml的無水N，N-二甲基甲酰胺中，然后在室溫下與165mg(0.14mmol)的4-[2-[4-氯-7-[5-N-(2，3，4，5，6-五羥基己基)氨基羰基-3，3-二甲基-1-(4-磺酸基丁基)二氫亞吲哚-2-基]-3，5-(丙烷-1，3-二基)-1，3，5-庚三烯-1-基]-3，3-二甲基-5-[N-(2，3，4，5，6-五羥基己基)氨基羰基](3H)-indolio]-丁烷磺酸鈉(實(shí)施例45b)中。10分鐘后，反應(yīng)混合物用干冰淬滅，并添加210mg(1mmol)的硫代羰基二咪唑。45分鐘后，用乙醚沉淀染料，并通過離心分離固體。純制時(shí)，在RP材料上進(jìn)行色譜分離。
產(chǎn)量78mg(理論值的43％)分析(相對(duì)于無溶劑的物質(zhì))計(jì)算C55.07 H6.01 N5.35 S9.80 O22.01 Na1.76實(shí)測(cè)C54.89 H6.20 N5.24 S9.58 Na1.54類似于實(shí)施例14-16以及18-27a(固相肽合成)的合成方法，在固相中合成VIP類似物HSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN。染料4-[2-[4-(4-異硫氰酸基硫代苯基氧基)-7-[5-N-(2，3，4，5，6-五羥基己基)氨基羰基-3，3-二甲基-1-(4-磺酸基丁基)二氫亞吲哚-2-基]-3，5-(丙烷-1，3-二基)-1，3，5-庚三烯-1-基]-3，3-二甲基-5-[N-(2，3，4，5，6-五羥基己基)氨基羰基](3H)-indolio]-丁烷磺酸鈉偶聯(lián)在肽的N-端位置上，然后根據(jù)實(shí)施例14-16和18-27c(保護(hù)基斷裂以及脫掉染料-肽結(jié)合物)分離并純制該結(jié)合物。
類似地，可由以下成分合成其他對(duì)稱的親水性染料具有羥基烷基取代基的親水性假吲哚衍生物(根據(jù)實(shí)施例44a制備)a)5-N-(2，3-二羥基丙基)-N-甲基氨基羰基-1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基(3H)假吲哚b)5-N-(羥基乙基)-氨基羰基-1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基(3H)假吲哚c)5-N-(2，3-二羥基丙基)-N-(羥基乙基)氨基羰基-1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基(3H)假吲哚d)5-N，N-二(羥基乙基)-氨基羰基-1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基(3H)假吲哚e)5-N-(2，3，4，5，6-五羥基己基)-氨基羰基-1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基(3H)假吲哚f)5-N-(1，3，4-三羥基丁-2-基)-N-甲基氨基羰基-1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基(3H)假吲哚實(shí)施例467-[5-N-(2，3-二羥基丙基)氨基羰基-3，3-二甲基-1-(4-磺酸基丁基)二氫亞吲哚-2-基]-1，3，5-庚三烯-1-基]-3，3-二甲基-5-羧基(3H)-indolio]-丁烷磺酸鈉在120℃下使2.35g(5.71mmol)的5-N-(2，3-二羥基丙基)氨基羰基-1-(4-磺酸基丁基)-2，3，3-三甲基(3H)假吲哚(實(shí)施例44a)和1.57g(5.5mmol)的戊烯二醛二苯胺鹽酸鹽在25ml乙酸酐中的溶液攪拌30分鐘。接著添加2.4g(7.1mmol)的5-羧基-1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基(3H)假吲哚、1.71g的乙酸鈉、22ml的乙酸酐和8.6ml的乙酸。反應(yīng)混合物在120℃下攪拌1小時(shí)，然后冷卻至室溫，并用乙醚沉淀產(chǎn)物。粗產(chǎn)物在RP材料上進(jìn)行色譜分離。
產(chǎn)量1.9g(理論值的40％)分析(相對(duì)于無溶劑的物質(zhì))計(jì)算C54.47 H6.03 N5.03 S7.67 O21.05 Na2.75實(shí)測(cè)C54.26 H6.12 N5.00 S7.49Na2.48類似于實(shí)施例14-16以及18-27a(固相肽合成)的合成方法，在固相中合成VIP類似物HSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN。染料7-[5-N-(2，3-二羥基丙基)氨基羰基-3，3-二甲基-1-(4-磺酸基丁基)二氫亞吲哚-2-基]-1，3，5-庚三烯-1-基]-3，3-二甲基-5-羧基(3H)-indolio]-丁烷磺酸鈉根據(jù)實(shí)施例14-16以及18-27b(染料偶聯(lián))偶聯(lián)在肽的N-端位置上，然后根據(jù)實(shí)施例14-16和18-27c(保護(hù)基斷裂以及脫掉染料-肽結(jié)合物)分離并純制該結(jié)合物。
類似地，可由以下成分合成其他非對(duì)稱的親水性染料具有羥基烷基取代基的親水性假吲哚衍生物(根據(jù)實(shí)施例44a制備)a)5-N-(2，3-二羥基丙基)-N-甲基氨基羰基-1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基(3H)假吲哚b)5-N-(羥基乙基)-氨基羰基-1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基(3H)假吲哚c)5-N-(2，3-二羥基丙基)-N-(羥基乙基)氨基羰基-1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基(3H)假吲哚d)5-N，N-二(羥基乙基)-氨基羰基-1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基(3H)假吲哚e)5-N-(2，3，4，5，6-五羥基己基)-氨基羰基-1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基(3H)假吲哚f)5-N-(1，3，4-三羥基丁-2-基)-N-甲基氨基羰基-1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基(3H)假吲哚具有羧基的假吲哚衍生物a)5-羧基-1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基(3H)假吲哚b)5-羧甲基-1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基(3H)假吲哚
c)5-羧基-1-(3-磺基丙基)-2，3，3-三甲基(3H)假吲哚d)5-羧甲基-1-(3-磺基丙基)-2，3，3-三甲基(3H)假吲哚e)5-羧基-1-(2-磺基乙基)-2，3，3-三甲基(3H)假吲哚f)5-羧甲基-1-(2-磺基乙基)-2，3，3-三甲基(3H)假吲哚用于與上述假吲哚反應(yīng)形成單、二或三羰菁的雙苯胺衍生物a)戊烯二醛二苯胺鹽酸鹽b)丙二醛-二苯基亞胺鹽酸鹽c)N，N-二苯基甲脒d)N-[5-苯胺基-2，4-(丙烷-1，3-二基)-2，4-戊二烯-1-亞基]氯化苯銨e)N-[5-苯胺基-2，4-(乙烷-1，2-二基)-2，4-戊二烯-1-亞基]氯化苯銨f)N-[5-苯胺基-3-氯-2，4-(丙烷-1，3-二基)-2，4-戊二烯-1-亞基]氯化苯銨g)N-[5-苯胺基-3-氯-2，4-(乙烷-1，2-二基)-2，4-戊二烯-1-亞基]氯化苯銨實(shí)施例477-[5-N-(1，3，4-三羥基丁-2-基)-氨基羰基-3，3-二甲基-1-(4-磺酸基丁基)二氫亞吲哚-2-基]-3，5-(2-羧基丙烷-1，3-二基)-1，3，5-庚三烯-1-基]-3，3-二甲基-5-N-(1，3，4-三羥基丁-2-基)-氨基羰基(3H)-indolio]-丁烷磺酸鈉，N-羥基琥珀酰亞胺酯a)4-[2-[4-氯-7-[5-N-(1，3，4-三羥基丁-2-基)-氨基羰基-3，3-二甲基-1-(4-磺酸基丁基)二氫亞吲哚-2-基]-3，5-[2-(甲氧基羰基)丙烷-1，3-二基]-1，3，5-庚三烯-1-基]-3，3-二甲基-5-[N-(1，3，4-三羥基丁-2-基)-氨基羰基](3H)-indolio]-丁烷磺酸鈉于0℃下將5.5ml(10mmol)磷酰氯和6ml的N，N-二甲基甲酰胺添加在0.8g(5mmol)4-(甲氧基羰基)-環(huán)己酮于5ml二氯甲烷中的溶液內(nèi)。然后回流1小時(shí)。蒸餾出二氯甲烷，在不超過5℃的溫度下添加4ml苯胺于10ml甲醇中的溶液。將反應(yīng)混合物傾倒在冰上，添加5ml的濃鹽酸，然后在0℃下使中間產(chǎn)物結(jié)晶5小時(shí)。抽濾出晶體，而且未進(jìn)一步純制即用于下一步的反應(yīng)中。為此目的，將晶體溶解在無水乙醇中，然后添加4.4g(10mmol)的5-N-(1，3，4-三羥基丁-2-基)-N-甲基氨基羰基-1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基(3H)假吲哚(見實(shí)施例45)和0.8g的無水乙酸鈉?；亓?小時(shí)，過濾固體，并蒸發(fā)濾液至干。殘留物進(jìn)行色譜純制。
產(chǎn)量3.25g(理論值的58％)分析(相對(duì)于無溶劑的物質(zhì))計(jì)算C54.90 H6.14 Cl3.18 N5.02 S5.75 O22.94 Na2.06實(shí)測(cè)C54.76 H6.03 Cl2.99 N4.91 S5.60 Na1.83b)7-[5-N-(1，3，4-三羥基丁-2-基)-氨基羰基-3，3-二甲基-1-(4-磺酸基丁基)二氫亞吲哚-2-基]-3，5-(2-羧基丙烷-1，3-二基)-1，3，5-庚三烯-1-基]-3，3-二甲基-5-N-(1，3，4-三羥基丁-2-基)-氨基羰基(3H)-indolio]-丁烷磺酸鈉于氮?dú)?、室溫下?0mg(0.4mmol)氫化鈉和80mg(1.3mmol)乙硫醇在10ml無水N，N二甲基甲酰胺中的混合物攪拌30分鐘。然后與112mg(0.1mmol)的4-[2-[4-氯-7-[5-N-(1，3，4-三羥基丁-2-基)-氨基羰基-3，3-二甲基-1-(4-磺酸基丁基)二氫亞吲哚-2-基]-3，5-[2-(甲氧基羰基)丙烷-1，3-二基]-1，3，5-庚三烯-1-基]-3，3-二甲基-5-N-(1，3，4-三羥基丁-2-基)-氨基羰基(3H)-indolio]-丁烷磺酸鈉(實(shí)施例47a)在3ml的N，N-二甲基甲酰胺中混合。反應(yīng)混合物加熱至100℃共2小時(shí)，然后冷卻至室溫，并用二氧化碳淬滅。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸發(fā)至干，殘留物用熱乙醇萃取。蒸發(fā)萃取液，粗產(chǎn)物進(jìn)行色譜純制。
產(chǎn)量75mg(理論值的67％)分析(相對(duì)于無溶劑的物質(zhì))計(jì)算C56.27 H6.33 N5.25 S6.01 O23.99 Na2.15實(shí)測(cè)C56.13 H6.46 N5.12 S5.87 Na1.88c)7-[5-N-(1，3，4-三羥基丁-2-基)-氨基羰基-3，3-二甲基-1-(4-磺酸基丁基)二氫亞吲哚-2-基]-3，5-(2-羧基丙烷-1，3-二基)-1，3，5-庚三烯-1-基]-3，3-二甲基-5-N-(1，3，4-三羥基丁-2-基)-氨基羰基(3H)-indolio]-丁烷磺酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯，鈉鹽為制備活性酯，將14mg(0.12mmol)的N-羥基琥珀酰亞胺和64mg(0.06mmol)的羧酸溶解在2ml的N，N-二甲基甲酰胺中。15分鐘后，添加25mg(0.12mmol)的二環(huán)己基碳化二亞胺，并在室溫下攪拌過夜。使用制備性HPLC純制活性酯。
產(chǎn)量60mg(理論值的86％)分析(相對(duì)于無溶劑的物質(zhì))
計(jì)算C55.71 H6.06 N6.02 S5.51 O24.73 Na1.97實(shí)測(cè)C55.59 H6.21 N5.93 S5.37 Na1.75類似于實(shí)施例14-16以及18-27a(固相肽合成)的合成方法，在固相中合成VIP類似物HSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN。染料7-[5-N-(1，3，4-三羥基丁-2-基)-氨基羰基-3，3-二甲基-1-(4-磺酸基丁基)二氫亞吲哚-2-基]-3，5-(2-羧基丙烷-1，3-二基)-1，3，5-庚三烯-1-基]-3，3-二甲基-5-N-(1，3，4-三羥基丁-2-基)-氨基羰基(3H)-indolio]-丁烷磺酸鈉根據(jù)實(shí)施例14-16以及18-27b(染料偶聯(lián))偶聯(lián)在肽的N-端位置上，然后根據(jù)實(shí)施例14-16和18-27c(保護(hù)基斷裂以及脫掉染料-肽結(jié)合物)分離并純制該結(jié)合物。實(shí)施例487-[5-N-(1，3，4-三羥基丁-2-基)-氨基羰基-3，3-二甲基-1-(4-磺酸基丁基)二氫亞吲哚-2-基]-3，5-(2-羧基丙烷-1，3-二基)-1，3，5-庚三烯-1-基]-3，3-二甲基-5-N-(1，3，4-三羥基丁-2-基)-氨基羰基(3H)-indolio]-丁烷磺酸鈉a)5-N-(11-氨基十一烷基)氨基羰基-1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基(3H)假吲哚將340mg(1mmol)的5-羧基-1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基(3H)假吲哚(Anal.Biochem.217，197，1994)引入至5ml無水N，N-二甲基甲酰胺和1ml吡啶中，然后與0.5g(2mmol)的碳酸二琥珀酰亞胺基酯混合。3小時(shí)后，添加0.805g(4mmol)的11-氨基十一烷酸。在室溫下攪拌過夜，蒸發(fā)反應(yīng)物至干，殘留物用乙醚進(jìn)行吸附沉淀。抽濾固體，并在RP材料上進(jìn)行色譜純制。
產(chǎn)量0.37g(理論值的71％)分析(相對(duì)于無溶劑的物質(zhì))計(jì)算C62.04 H8.10 N5.36 S6.13 O18.37實(shí)測(cè)C61.88 H8.23 N5.17 S6.02b)7-[5-N-(1，3，4-三羥基丁-2-基)-氨基羰基-3，3-二甲基-1-(4-磺酸基丁基)二氫亞吲哚-2-基]-3，5-(2-羧基丙烷-1，3-二基)-1，3，5-庚三烯-1-基]-3，3-二甲基-5-N-(1，3，4-三羥基丁-2-基)-氨基羰基(3H)-indolio]-丁烷磺酸鈉0.35g(0.67mmol)5-N-(11-氨基十一烷基)氨基羰基-1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基(3H)假吲哚(實(shí)施例48a)和0.18g(0.645mmol)戊烯二醛二縮苯胺在3ml乙酸酐中的溶液在110℃下攪拌20分鐘。添加344mg(0.83mmol)的5-N-(2，3-二羥基丙基)-氨基羰基-1-(4-磺基丁基)-2，3，3-三甲基(3H)假吲哚(44a)、0.2g的乙酸鈉、3ml的乙酸酐和1ml的乙酸。反應(yīng)混合物在110℃下攪拌2小時(shí)，冷卻至室溫，然后用乙醚沉淀產(chǎn)物。粗產(chǎn)物在RP材料上進(jìn)行色譜純制。
產(chǎn)量0.41g(理論值的60％)分析(相對(duì)于無溶劑的物質(zhì))計(jì)算C60.10 H7.02 N5.50 S6.29 O18.84 Na2.26實(shí)測(cè)C59.96 H7.14 N5.33 S6.15 Na2.11類似于實(shí)施例14-16以及18-27a(固相肽合成)的合成方法，在固相中合成VIP類似物HSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN。染料7-[5-N-(1，3，4-三羥基丁-2-基)-氨基羰基-3，3-二甲基-1-(4-磺酸基丁基)二氫亞吲哚-2-基]-3，5-(2-羧基丙烷-1，3-二基)-1，3，5-庚三烯-1-基]-3，3-二甲基-5-N-(1，3，4-三羥基丁-2-基)-氨基羰基(3H)-indolio]-丁烷磺酸鈉根據(jù)實(shí)施例14-16以及18-27b(染料偶聯(lián))偶聯(lián)在肽的N-端位置上，然后根據(jù)實(shí)施例14-16和18-27c(保護(hù)基斷裂以及脫掉染料-肽結(jié)合物)分離并純制該結(jié)合物。
根據(jù)實(shí)施例44a和b可制備根據(jù)本發(fā)明的其他染料，其中可使用以下氨基酸替代實(shí)施例48a中的11-氨基十一烷酸，實(shí)施例46中提到的假吲哚衍生物具有以下羥基烷基取代基a)-f)i.甘氨酸ii.丙氨酸iii.β-丙氨酸iv.4-氨基丁酸v.6-氨基己酸vi.H2N-(CH2CH2O)3CH2COOH(TH 53，20，6977)vii.H2N-(CH2CH2O)4CH2COOH(JOC 63，5，1728，1998)viii.H2N-CH2CH2COO(CH2CH2O)4-CO-CH2COOH(Lett.Pept.Sci.6，135，1999)ix.HCl*H2N-PEG-COOH(MW 4300g/mol；Schearwater PolymersInc.，USA)實(shí)施例494-[2-[4-(4-(N-(4-氮雜-6-溴-5-氧代己基)氨基羰基-乙基)苯基氧基)-7-[5-N-(二羥基丙基)-氨基羰基-3，3-二甲基-1-(4-磺酸基丁基)二氫亞吲哚-2-基]-3，5-(丙烷-1，3-二基)-1，3，5-庚三烯-1-基]-5-N-(二羥基丙基)氨基羰基-3，3-二甲基(3H)-indolio]-丁烷磺酸鈉a)[3-[N-(叔丁氧基羰基)氨基]丙基]-N＇-(溴乙酰基)-酰胺將2.5g(14.4mmol)的[3-[N-(叔丁氧基羰基)氨基]丙基]胺溶解在15ml的二惡烷中，然后在0℃下添加4.4ml的三乙胺，并與3.2g(16mmol)的溴乙?；寤旌?。在室溫下攪拌過夜，然后再添加320mg的溴乙?；?。在室溫下2小時(shí)后，抽濾出沉淀物，蒸發(fā)濃縮溶液，殘留物在乙酸乙酯中處理。用水洗滌，然后在硫酸鈉上干燥有機(jī)相。
產(chǎn)量3.2g(理論值的75％)分析(相對(duì)于無溶劑的物質(zhì))計(jì)算C40.69 H6.49 Br27.07 N9.49 O16.26實(shí)測(cè)C40.50 H6.37 Br26.89 N9.58b)[3-[N-(溴乙?；?氨基]丙基]胺鹽酸鹽在室溫下于乙酸乙酯中使3.1g(10.5mmol)的[3-[N-(叔丁氧基羰基)氨基]丙基]-N′-(溴乙酰基)-酰胺(實(shí)施例49a)與50mmol的1M鹽酸攪拌5小時(shí)。抽濾出產(chǎn)物，然后用乙酸乙酯重新洗滌固體。
產(chǎn)量2.3g(理論值的95％)分析(相對(duì)于無溶劑的物質(zhì))計(jì)算C25.94 H5.22 Cl15.31 Br34.51 N12.10 O18.84實(shí)測(cè)C25.76 H5.41 Cl15.55 Br34.34 N11.97c)4-[2-[4-(4-(N-(4-氮雜-6-溴-5-氧代己基)氨基羰基-乙基)苯基氧基)-7-[5-N-(二羥基丙基)-氨基羰基-3，3-二甲基-1-(4-磺酸基丁基)二氫亞吲哚-2-基]-3，5-(丙烷-1，3-二基)-1，3，5-庚三烯-1-基]-5-N-(二羥基丙基)氨基羰基-3，3-二甲基(3H)-indolio]-丁烷磺酸鈉將121mg(0.1mmol)的4-[2-[4-(4-(2-羧基乙基)苯基氧基)-7-[5-N-(二羥基丙基)氨基羰基-3，3-二甲基-1-(4-磺酸基丁基)二氫亞吲哚-2-基]-3，5-(丙烷-1，3-二基)-1，3，5-庚三烯-1-基]-5-N-(二羥基丙基)氨基羰基-3，3-二甲基(3H)-indolio]-丁烷磺酸鈉，N-羥基琥珀酰亞胺酯(實(shí)施例44c)溶解在0.5ml的N，N-二甲基甲酰胺中，然后與0.06ml的三乙胺和70mg(0.3mmol)的[3-[N-(溴乙酰基)氨基]丙基]胺鹽酸鹽(實(shí)施例49b)混合。
在60℃下攪拌4小時(shí)，然后冷卻至室溫，并用乙醚沉淀產(chǎn)物。抽濾固體，并用乙醚洗滌。
產(chǎn)量0.11mg(理論值的80％)分析(相對(duì)于無溶劑的物質(zhì))計(jì)算C56.17 H6.18 Br6.13 N6.44 S4.92 Na1.76 O18.40實(shí)測(cè)C55.96 H6.26 Br6.01 N6.27 S4.81 Na1.53類似于實(shí)施例14-16以及18-27a(固相肽合成)的合成方法，在固相中合成VIP類似物HSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILN。染料4-[2-[4-(4-(N-(4-氮雜-6-溴-5-氧代己基)氨基羰基-乙基)苯基氧基)-7-[5-N-(二羥基丙基)-氨基羰基-3，3-二甲基-1-(4-磺酸基丁基)二氫亞吲哚-2-基]-3，5-(丙烷-1，3-二基)-1，3，5-庚三烯-1-基]-5-N-(二羥基丙基)氨基羰基-3，3-二甲基(3H)-indolio]-丁烷磺酸鈉根據(jù)實(shí)施例17偶聯(lián)在肽的N-端位置上，然后根據(jù)實(shí)施例14-16和18-27c(保護(hù)基斷裂以及脫掉染料-肽結(jié)合物)分離并純制該結(jié)合物。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)名稱柏林自由大學(xué)診斷研究所有限公司(B)街道Spandauer Damm 130(C)城市柏林(E)國(guó)家德國(guó)(F)郵政編碼(ZIP)D-14050(G)電話(030)-30390412(H)傳真(030)-30390499(ii)發(fā)明名稱作為光學(xué)診斷用造影劑的短鏈肽-染料結(jié)合物(iii)序列數(shù)量8(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC compatible(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patentln Release#1.0，Version#1.25(EPO)(v) 目前申請(qǐng)數(shù)據(jù)申請(qǐng)?zhí)?vi)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度28個(gè)氨基酸(B)類型肽(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)(ii)分子類型肽(iii)假說否(vi)原始來源合成(xi)序列描述SEQ ID NO1His-Trp-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn(3)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)氨基酸(B)類型肽(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)(ii)分子類型肽(iii)假說否(vi)原始來源合成(xi)序列描述SEQ ID NO2His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Phe-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn(4)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度28個(gè)氨基酸(B)類型肽(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)(ii)分子類型肽(iii)假說否(vi)原始來源合成(xi)序列描述SEQ ID NO3His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Lys-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn(5)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)氨基酸(B)類型肽(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)(ii)分子類型肽(iii)假說否(vi)原始來源合成(xi)序列描述SEQ ID NO4His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Gln-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-GlnMet-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn(6)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度28個(gè)氨基酸(B)類型肽(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)(ii)分子類型肽(iii)假說否(vi)原始來源合成(xi)序列描述SEQ ID NO5His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Arg-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn(7)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)氨基酸(B)類型肽(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)(ii)分子類型肽(iii)假說否(vi)原始來源合成(xi)序列描述SEQ ID NO6His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Trp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn(8)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度28個(gè)氨基酸(B)類型肽(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)(ii)分子類型肽(iii)假說否(vi)原始來源合成(xi)序列描述SEQ ID NO7His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Arg-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn(9)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)氨基酸(B)類型肽(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)(ii)分子類型肽(iii)假說否(vi)原始來源合成(xi)序列描述SEQ ID NO8His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Arg-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn
權(quán)利要求
1.通式(I)的肽-多亞甲基染料結(jié)合物及其生理相容鹽A1-(X)m-A2(I)其中X代表具有D或L構(gòu)型的α-、β-或γ-氨基酸；m代表5-30的數(shù)，其中所產(chǎn)生的氨基酸序列(X)m可為直鏈或者通過兩個(gè)半胱氨酸或高半胱氨酸之間的二硫鍵或者在N-和C-端之間的酰胺化而環(huán)化，并代表血管活性腸肽(VIP)、促生長(zhǎng)素抑制素或神經(jīng)降壓肽的氨基酸序列，或者代表VIP、促生長(zhǎng)素抑制素或神經(jīng)降壓肽的片段、部分序列、衍生物或類似物；A1代表氫原子、乙?；蚓哂凶疃?0個(gè)碳原子的烷基，該烷基可任選地被1-3個(gè)羧基和/或1-6個(gè)羥基取代，或者代表具有2-30個(gè)-CH2CH2O-單元的聚(氧乙烯)基團(tuán)，或者代表選自于多亞甲基染料的染料分子，該染料在380-1200nm的范圍內(nèi)具有至少一個(gè)最大吸收；A2代表羥基、氨基或者選自于多亞甲基染料的染料分子，該染料在380-1200nm的范圍內(nèi)具有至少一個(gè)最大吸收；其條件是A1或A2基團(tuán)中至少一個(gè)代表選自于多亞甲基染料的染料分子，而且該染料在380-1200nm的范圍內(nèi)具有至少一個(gè)最大吸收，其中如果A1和/或A2代表選自于多亞甲基染料的染料分子，而且該染料在380-1200nm的范圍內(nèi)具有至少一個(gè)最大吸收，則A1連接在N-端氨基上，而A2連接在氨基酸序列(X)m中任意位置處的氨基酸賴氨酸的氨基或者氨基酸絲氨酸的羥基上。
2.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，染料分子A1和/或A2代表菁、squarilium、croconium、部花菁或氧雜菁染料。
3.如權(quán)利要求1或2所述的化合物，其特征在于，染料分子A1和/或A2代表以下通式II的菁染料或squarilium染料 其中D代表相應(yīng)于以下通式III-VI的片段，其中用星號(hào)標(biāo)記的位置表示與B的連接位 B代表相應(yīng)于以下通式VII-XII的片段 R1和R2代表E1，R3代表氟、氯、溴或碘原子或者硝基或者基團(tuán)-COOE1、-CONE1E2、-NHCOE1、-NHCONHE1、-NE1E2、-OE1、-OSO3E1、-SO3E1、-SO2NHE1、-E1，其中E1和E2相互獨(dú)立地代表氫原子、C1-C4磺基烷基、飽和或不飽和、直鏈或支鏈C1-C50烷基鏈，其中該鏈或其一部分可任選地形成一個(gè)或多個(gè)芳香或飽和環(huán)C5-C6單元或者二環(huán)C10單元，而且C1-C50烷基鏈中可插入0-15個(gè)氧原子和/或0-3個(gè)羰基和/或被0-5個(gè)羥基取代，R4代表氫原子、氟、氯、溴、碘原子或者支鏈或直鏈C1-C10烷基鏈，b代表2或3的數(shù)，X和Y相互獨(dú)立地代表O、S、Se、-CH＝CH-或者C(CH3)2，L代表以下式的基團(tuán) 其中n代表1-10的數(shù)。
4.如權(quán)利要求1-3之一所述的化合物，其特征在于，染料分子A1和/或A2代表茚炭菁、茚二炭菁和茚三炭菁染料。
5.如權(quán)利要求4所述的化合物，其特征在于，染料分子A1和/或A2代表以下通式XIII或XIV的茚炭菁染料、茚二炭菁染料或茚三炭菁染料 其中p代表1、2或3，n代表1、2、3、4或10，R1和R2相互獨(dú)立地代表4-磺基丁基、3-磺基丙基、2-磺基乙基、3-甲基-3-磺基丙基、甲基、乙基、或丙基，而R3代表氫、氯、溴或碘原子或者硝基或者基團(tuán)-COOE1、-CONE1E2、-NHCOE1、-NHCONHE1、-NE1E2、-OE1、-OSO3E1、-SO3E1、-SO2NHE1，其中E1和E2相互獨(dú)立地代表氫原子、或者代表甲基、乙基或者C3-C6烷基，這些烷基可插入0-2個(gè)氧原子和/或0-1個(gè)羰基，和/或被0-5個(gè)羥基取代，或者E1和E2代表具有2-30個(gè)-CH2CH2O-單元的聚(氧乙烯)二醇基團(tuán)。
6.如權(quán)利要求4所述的化合物，其特征在于，染料分子A1和/或A2代表以下通式XIII或XIV的茚炭菁染料、茚二炭菁染料或茚三炭菁染料 其中p代表1、2或3，n代表1、2或4，R1和R2相互獨(dú)立地代表4-磺基丁基或3-磺基丙基，而R3代表氫、或者基團(tuán)-COOE1或-CONHE1，其中E1相互獨(dú)立地代表氫原子、或者代表甲基、乙基或者C3-C6烷基，這些烷基可插入0-2個(gè)氧原子和/或0-1個(gè)羰基，和/或被0-5個(gè)羥基取代。
7.如權(quán)利要求4所述的化合物，其特征在于，染料分子A1和/或A2代表以下通式XV或XVI的茚三炭菁染料 其中n代表2或3，R1和R2相互獨(dú)立地代表4-磺基丁基、3-磺基丙基或2-磺基乙基，R3代表基團(tuán)-CONH-肽、-CONH-(CH2)m-CONH-肽、-CONH-(CH2)n-NH-CS-NH-肽或者-CONH-(CH2)n-NHCO-CH2-肽，其中m＝1-10，而n＝2或3，或者R3代表以下基團(tuán) R4和R5相互獨(dú)立地代表氫原子、甲基或羥基化烷基，R6代表以下基團(tuán)之一-(CH2)m-CONH-肽其中m＝0-2，-(CH2)m-NH-CS-NH-肽其中m＝0-2，而X代表氧原子或硫原子。
8.如權(quán)利要求4所述的化合物，其特征在于，染料分子A1和/或A2代表以下通式XVII的茚三炭菁染料 其中R1和R2相互獨(dú)立地代表4-磺基丁基、3-磺基丙基或2-磺基乙基，R3代表基團(tuán)-CONH-肽、-NH-CS-NH-肽或者-CONH-(CH2)n-NHCO-CH2-肽，其中n＝2或3，或者R3代表以下基團(tuán) R4和R5相互獨(dú)立地代表氫原子、甲基或羥基化烷基。
9.如權(quán)利要求7或8所述的化合物，其特征在于，所述羥基化烷基為2-羥基乙基、3-羥基丙基、2，3-二羥基丙基、1，3-二羥基-2-丙基、2，3，4-三羥基丁基、1，3，4-三羥基-2-丁基、2，3，4，5，6-五羥基己基。
10.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，(X)m代表天然的人血管活性腸肽的序列，其相應(yīng)于以下序列HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN或者由5-30個(gè)氨基酸組成的血管活性腸肽的片段、部分序列、衍生物或者類似物。
11.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，(X)m代表促生長(zhǎng)素抑制素的氨基酸序列，其相應(yīng)于以下序列 或者由5-20個(gè)氨基酸組成的促生長(zhǎng)素抑制素的片段、部分序列、衍生物或者類似物。
12.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，(X)m代表神經(jīng)降壓肽的氨基酸序列，其相應(yīng)于以下序列焦谷氨酸-LYENKPRRPYIL或者由5-20個(gè)氨基酸組成的神經(jīng)降壓肽的片段、部分序列、衍生物或者類似物。
13.如權(quán)利要求10所述的化合物，其特征在于，血管活性腸肽的片段、部分序列、衍生物或者類似物是選自于以下氨基酸序列RLRKQMAVKKYLNSILN RLRKQMAVKKYLNSIL RLRKQMAVKKYLNSILRKQMAVKKYLNSILNLRKQMAVKKYLNSIL LRKQMAVKKYLNSIRKQMAVKKYLNSILN RKQMAVKKYLNSILRKQMAVKKYLNSIKQMAVKKYLNSILN KQMAVKKYLNSIL KQMAVKKYLNSIQMAVKKYLNSILN QMAVKKYLNSIL QMAVKKYLNSIMAVKKYLNSILNMAVKKYLNSIL MAVKKYLNSIAVKKYLNSILN AVKKYLNSILAVKKYLNSIRLRKQMAVKKYLNS RLRKQMAVKKYLN RLRKQMAVKKYLLRKQMAVKKYLNS LRKQMAVKKYLN LRKQMAVKKYLRKQMAVKKYLNSRKQMAVKKYLN RKQMAVKKYLKQMAVKKYLNS KQMAVKKYLNKQMAVKKYLQMAVKKYLNS QMAVKKYLN QMAVKKYLMAVKKYLNS MAVKKYLN MAVKKYLAVKKYLNSAVKKYLN AVKKYL
14.如權(quán)利要求10所述的化合物，其特征在于，VIP肽的類似物是選自于以下氨基酸序列FSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNISDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNLSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHFDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHHDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHIDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHLDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHMDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHQDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHTDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHVDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHWDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHYDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSAAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSEAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSFAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSHAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSIAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSLAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSMAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSWAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSDFVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSDGVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSDMVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSDQVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSDSVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSDWVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSDYVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSDAFFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSDAIFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSDALFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSDAMFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSDATFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSDAWFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSDAYFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSDAVKTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSDAVFVDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSDAVFWDNY TRLRKQMAVK KYLNSILNHSDAVFTDNW TRLRKQMAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRRRKQMAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRWRKQMAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRFQMAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRLQMAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRMQMAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRRQMAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKAMAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKFMAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKIMAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKKMAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKLMAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKMMAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKRMAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKVMAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKWMAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKYMAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQFAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQIAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQKAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQLAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQQAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQRAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQWAVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMFVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMIVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMKVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMLVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMMVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMQVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMRVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMVVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMWVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMYVK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMAAK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMAIK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMALK KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVR KYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK RYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK WYLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KFLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KWLNSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLASILNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLFSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLISILNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLMSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLSSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLVSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLWSILNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNNILNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYINRILNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNWILNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNYILNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSLLNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSSLNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSWLNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSYLNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSIFNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSIINHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSIWNHSDAVFTDNY TRLRKQMAVK KYLNSILW
15.如權(quán)利要求10所述的化合物，其特征在于，VIP的類似物是選自于根據(jù)以下式的化合物HSDAVFTX1X2YX3RLRKQMAVKKYLNSILN，其中X1、X2和X3可代表任何氨基酸。
16.如前述任一權(quán)利要求所述的化合物，其特征在于，2-m個(gè)氨基酸可相互獨(dú)立地用它們相應(yīng)的D-氨基酸或者其他L-或D-氨基酸交換，其中m與上述定義相同。
17.如前述任一權(quán)利要求所述的化合物，其特征在于，至少一個(gè)氨基酸(X)m相互獨(dú)立地用其他非天然的氨基酸或者氨基酸衍生物交換。
18.如權(quán)利要求17所述的化合物，其特征在于，所述非天然的氨基酸或者氨基酸衍生物選自于以下組中萘丙氨酸、環(huán)己基丙氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、α-氨基己二酸、α-氨基丁酸、β-丙氨酸、β-環(huán)己基丙氨酸、鳥氨酸、肌氨酸或δ-羥基賴氨酸。
19.如前述任一權(quán)利要求所述的化合物，其特征在于，VIP的類似物選自于以下式的化合物X1SDAVX2TDNX3TRLRKQMAVKKX4LNSILN，其中X1、X2、X3和X4可代表非天然的氨基酸或氨基酸衍生物。
20.如權(quán)利要求19所述的化合物，其特征在于，所述非天然的氨基酸或氨基酸衍生物選自于以下組中萘丙氨酸、環(huán)己基丙氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、α-氨基己二酸、α-氨基丁酸、β-丙氨酸、β-環(huán)己基丙氨酸、鳥氨酸、肌氨酸或δ-羥基賴氨酸。
21.如前述任一權(quán)利要求所述的化合物，其特征在于，所有氨基酸(X)m用它們相應(yīng)的D-氨基酸交換。
22.如前述任一權(quán)利要求所述的化合物，其特征在于，血管活性腸肽的片段、部分序列、衍生物或類似物選自于逆合成氨基酸序列。
23.如前述任一權(quán)利要求所述的化合物，其特征在于，血管活性腸肽序列的片段、部分序列、衍生物或類似物選自于其中2-m個(gè)氨基酸用相應(yīng)的D-氨基酸交換的逆合成氨基酸序列，其中m與上述定義相同。
24.如權(quán)利要求10所述的化合物，其特征在于，血管活性腸肽的片段、部分序列、衍生物或類似物選自于以下氨基酸序列rlrkqmavkkylnsiln rlrkqmavkkylnsil rlrkqmavkkylnsilrkqmavkkylnsilnlrkqmavkkylnsil lrkqmavkkylnsirkqmavkkylnsiln rkqmavkkylnsil rkqmavkkylnsikqmavkkylnsiln kqmavkkylnsilkqmavkkylnsiqmavkkylnsiln qmavkkylnsil qmavkkylnsimavkkylnsilnmavkkylnsil mavkkylnsiavkkylnsiln avkkylnsil avkkylnsiRLRKQMAvKKyLNSILN RLRKQMAvKKyLNSIL RLRKQMAvKKyLNSILRKQMAvKKyLNSILN LRKQMAvKKyLNSIL LRKQMAvKKyLNSIRKQMAvKKyLNSILNRKQMAvKKyLNSILRKQMAvKKyLNSIKQMAvKKyLNSILN KQMAvKKyLNSIL KQMAvKKyLNSIQMAvKKyLNSILN QMAvKKyLNSIL QMAvKKyLNSIMAvKKyLNSILN MAvKKyLNSIL MAvKKyLNSIAvKKyLNSILNAvKKyLNSILAvKKyLNSI
25.如權(quán)利要求11所述的化合物，其特征在于，促生長(zhǎng)素抑制素的片段、部分序列、衍生物或類似物選自于以下氨基酸序列
26.如權(quán)利要求12所述的化合物，其特征在于，神經(jīng)降壓肽的片段、部分序列、衍生物或類似物選自于以下氨基酸序列pGlu-LYQNKPRRPFIL pGlu-LYENKPRRPYIpGlu-LYENKPRRPyIL pGlu-LYQNKPRRPfIL pGlu-LYENKPRRPYpGlu-LYQNKPRRPYIL pGlu-LYENKPRRPWIL pGlu-LYENKPRRPpGlu-LYQNKPRRPyIL pGlu-LYENKPRRPwIL pGlu-LYENKPRRpGlu-LYENKPRRPFIL pGlu-LYQNKPRRPWIL pGlu-LYENKPRpGlu-LYENKPRRPfIL pGlu-LYQNKPRRPwIL pGlu-LYENKPNKPRRPYIL NKPRRPyIL NKPRRPfIL NKPRRPwILKPRRPYIL KPRRPyIL KPRRPfIL KPRRPwILPRRPYIL PRRPyIL PRRPfIL PRRPwILRRPYILRRPyILRRPfILRRPwIL
27.如前述權(quán)利要求之一所述的化合物在以下方面的應(yīng)用使用光學(xué)檢測(cè)法體內(nèi)診斷腫瘤、其他患病組織區(qū)域或者腺癌，或者使用內(nèi)窺鏡在胃腸道、食管、支氣管、膀胱或子宮頸中體內(nèi)熒光診斷腫瘤、腫瘤細(xì)胞和/或炎癥組織，或者使用光學(xué)乳房X射線攝影術(shù)(乳房的透照或光學(xué)體層攝影)體內(nèi)熒光診斷和/或吸附診斷乳腺癌。
28.使用如權(quán)利要求1所述的化合物進(jìn)行內(nèi)窺鏡體內(nèi)熒光診斷的方法，其中通過靜脈或者通過霧化在胃腸道、食管、膀胱中向患者給藥所述化合物，或者通過吸入將所述化合物送入支氣管中，在霧化時(shí)，通過沖洗除去未結(jié)合的、過量部分的化合物，而內(nèi)窺鏡研究是如下進(jìn)行的用選自于380-1200nm光譜范圍的激發(fā)光進(jìn)行局部激發(fā)，然后位置依賴性地檢測(cè)染料所發(fā)射的特殊熒光輻射。
29.用于體內(nèi)診斷患病組織區(qū)域的光學(xué)診斷劑，其包含至少一種如權(quán)利要求1所述的化合物以及常規(guī)輔劑和/或載體和稀釋劑。
30.通式XVIII的菁染料 其中p代表1、2或3，n代表1、2、3、4或10，R1和R2相互獨(dú)立地代表4-磺基丁基、3-磺基丙基、2-磺基乙基、3-甲基-3-磺基丙基、甲基、乙基、或丙基，而R3代表氫或者基團(tuán)-COOE1、-CONE1E2、-NHCOE1、-NHCONHE1、-NE1E2、-OE1、-OSO3E1、-SO3E1、-SO2NHE1，其中E1和E2相互獨(dú)立地代表氫原子、或者代表甲基、乙基或者C3-C6烷基，這些烷基可插入0-2個(gè)氧原子和/或0-1個(gè)羰基，和/或被0-5個(gè)羥基取代。
31.通式XIX或XX的菁染料 其中n代表2或3，R1和R2相互獨(dú)立地代表4-磺基丁基、3-磺基丙基或2-磺基乙基，R3代表-COOH基團(tuán)或者以下基團(tuán)中的一種-CONH-(CH2)n-COOH，其中n＝2或3，-CONH-(CH2)n-NCS，其中n＝2或3，-CONH-(CH2)n-NHCO-CH2-X1，其中n＝2或3，而X1＝Cl、Br、I， R4和R5相互獨(dú)立地代表氫原子、甲基或羥基化烷基，如2-羥基乙基、3-羥基丙基、2，3-二羥基丙基、1，3-二羥基-2-丙基、2，3，4-三羥基丁基、1，3，4-三羥基-2-丁基、2，3，4，5，6-五羥基己基，R6代表以下基團(tuán)中的一種-(CH2)m-COOH，其中m＝0-2，-(CH2)m-NCS，其中m＝0-2，-(CH2)m-CONH-肽，其中m＝0-2，-(CH2)m-NH-CS-NH-肽，其中m＝0-2，而X代表氧原子或硫原子。
32.通式XXI的菁染料 其中R1和R2相互獨(dú)立地代表4-磺基丁基或3-磺基丙基，R3代表-COOH基團(tuán)或者以下基團(tuán)中的一種-CONH-(CH2)n-COOH，其中n＝2或3，-CONH-(CH2)n-NCS，其中n＝2或3，-CONH-(CH2)n-NHCO-CH2-X1，其中n＝2或3，而X1＝Cl、 R4和R5相互獨(dú)立地代表氫原子、甲基或羥基化烷基，如2-羥基乙基、3-羥基丙基、2，3-二羥基丙基、1，3-二羥基-2-丙基、2，3，4-三羥基丁基、1，3，4-三羥基-2-丁基、2，3，4，5，6-五羥基己基。
33.VIP的類似物，其特征在于具有以下序列His-Trp-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO1)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Phe-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO2)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Lys-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO3)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Gln-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO4)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Arg-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO5)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Trp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO6)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Arg-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO7)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Arg-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO8)。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于腫瘤診斷的化合物,該化合物由染料與短鏈肽的結(jié)合物組成,而所述肽是由血管活性腸肽、促生長(zhǎng)素抑制素或神經(jīng)降壓肽衍生的。本發(fā)明還涉及這些化合物作為光學(xué)診斷劑的應(yīng)用以及包含這些化合物的診斷劑。
文檔編號(hào)C07K7/08GK1351505SQ00806087
公開日2002年5月29日 申請(qǐng)日期2000年3月28日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月9日
發(fā)明者凱·利夏, 安德烈亞斯·貝克爾, 沃爾夫哈德·澤姆勒, 貝爾特拉·維登曼, 卡斯滕·黑森紐斯, 魯?shù)婪颉の譅柨四鞲裉? 延斯·施奈德－默根納, 薩拉·巴爾加瓦 申請(qǐng)人:柏林自由大學(xué)診斷研究所有限公司