專利名稱：人乳腺癌muc－1抗原基因工程疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因工程重組蛋白疫苗，特別是涉及一種預(yù)防和治療人乳腺癌的基因工程疫苗。
粘蛋白(mucins)是表達在乳腺癌細胞表面的一種蛋白質(zhì)，和腫瘤細胞的侵襲力相關(guān)的粘蛋白被稱為MUC1。過度表達的MUC1可以減弱細胞和細胞間的相互作用，促進細胞間的解離和瘤細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移。乳腺癌細胞表達的MUC1分子具有很強的免疫原性(Segal-Eiras A，et al.Breast cancer associated mucina review.Allergol Immunopathol(Madr)1997 Jul-Aug；25)，被認為是免疫細胞攻擊的靶點。因此，采用MUC1分子制成的疫苗可能對乳腺癌有預(yù)防和治療作用。在這方面，已有人做了一些工作Brossart P等用加載MUC1細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位(PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA)多肽的人樹突狀細胞體外免疫可誘導(dǎo)出乳腺癌細胞特異性的CTL(Brossart P.et al，Iddentification of HLA-A2-rrestricted T cell epitopes derived from theMUC1 tumor antigen for broadly applicable vaccine therapies.Blood 1999 Jun 15；93(12)4309-17)。Lees CJ等用MUC-1 mannan(一種自酵母細胞壁分離出來的多聚甘露糖)偶聯(lián)物免疫小鼠誘導(dǎo)了MHC I類抗原限制的CTL，此CTL可殺傷乳腺癌細胞(Lees CJ，et al.Theeffect of T1 and T2 cytokines on the cytotoxic T cell response to mannan-MUC1.CancerImmunol Immunother 2000Feb；48(11)644-52)。Reddish M等將由16個氨基酸組成的MUC1多肽(GVTSAPDTRPAPGSTA)和KLH(匙孔槭血藍素)的偶聯(lián)物免疫16位乳腺癌轉(zhuǎn)移的病人，在7位病人誘導(dǎo)出了對表達MUC1腫瘤細胞有殺傷作用的MH-C I限制的CTL(Reddish M，et al.Anti-MUC-1class I restrieted CTLs in metastatic breast cancer patientsimmunized with a synthetic MUC1 peptide，Int J Cancer 1998 Jun 10；76(6)817-23)。Apostolopoulous V等用MUC1多肽(20氨基酸殘基)-Mannan融合蛋白免疫動物可誘導(dǎo)特異性CTL，使受免疫動物產(chǎn)生對接種腫瘤細胞的保護性免疫力(Apostolopoulous V，et al.Cyclosphosphamide enhances the CTL precursor frequency in mice immunized with MUC1-mannan fusion protein(M-FP)，J Immunotherapy，1998 Mar；21(2)109-13)。Karanikas V等采用MUC1-mannan融合蛋白免疫25位乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌和直腸癌患者，在2人誘導(dǎo)了T淋巴細胞的增生(Karanikas V.et al.Antibody and T cell responses of patients withadenocarcinoma immunized with mannan-MUC1 fusion protein.J Clin Invest 1997 Dec1；100(11)2783-92)。Goydos JS等以BCG為佐劑，用150個氨基酸殘基的MUC1合成肽免疫63個乳腺腺癌患者，誘導(dǎo)出MUC1特異性CTL(Goydos JS，et al.A phase I trial of asynthetic mucin peptide vaccine.Induction of specific immune reactivity in patients withadenocarcinoma)。
細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)是人體殺傷腫瘤細胞的最高效的免疫細胞。任何一種激發(fā)機體抗腫瘤免疫的疫苗是否有效，決定于這種疫苗是否能激發(fā)腫瘤特異性CTL。外源性的蛋白類腫瘤抗原在免疫人體后，通常被抗原提呈細胞攝取、加工，進入MHC II類提呈途徑，激發(fā)體液免疫反應(yīng)(Heikema A，Agsteribbe E，Wilschut J，Huckriede A.Generation of heat shock protein-based vaccines by intracellular loading of gp96with antigenic peptides.Immunol Lett 1997 Jun 1；57(1-3)69-74)，但不能有效激活腫瘤特異性的CTL的產(chǎn)生，因而不能產(chǎn)生有效的腫瘤預(yù)防和治療作用。因此，賦予MUC1特異性激活CTL的性質(zhì)就成為研究以MUC-1為抗原的、預(yù)防和治療人乳腺癌疫苗的一個技術(shù)關(guān)鍵。
熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)是存在于多種生物體內(nèi)的一個分子伴侶蛋白質(zhì)家族。在免疫應(yīng)答的過程中，熱休克蛋白可表現(xiàn)如下三種基本的功能1、協(xié)助抗原性物質(zhì)進入包括樹突狀細胞在內(nèi)的抗原提呈細胞；2、在抗原提呈細胞中和加工處理的抗原物質(zhì)相互作用使之進入MHC I類抗原提呈途徑，進而激活抗原特異性CTL；3、刺激樹突狀細胞表達協(xié)同刺激分子(如B7等)和分泌細胞因子。
近年的研究表明，HSP可使非共鍵結(jié)合的腫瘤抗原在抗原提呈細胞內(nèi)加工后和MHC I類分子結(jié)合并提呈在其表面，有效地激活CTL去高效殺傷表達特異性腫瘤抗原的腫瘤細胞。注射從自體腫瘤提取的熱休克蛋白-抗原肽復(fù)合物可抑制荷瘤小鼠原發(fā)腫瘤的生長、降低腫瘤的轉(zhuǎn)移率，延長荷瘤小鼠的生存時間(Tamura Y，Peng P，Liu K，Daou M，SrivastavaPK.Immunotherapy of tumors with autologous tumor-derived heat shock protein preparations.Science 1997 Oct 3；278(5335)117-20)。
本發(fā)明的目的是將結(jié)核桿菌(BCG)熱休克蛋白65(HSP65)基因和人MUC-1抗原細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位基因融合在一起，研制一種對人乳腺癌有預(yù)防和治療作用的基因工程重組疫苗。
本發(fā)明將結(jié)核桿菌(BCG)熱休克蛋白65(BCG HSP65)的編碼基因和人MUC-1抗原細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位基因相連接，連接方式是結(jié)核桿菌HSP65位于5’端，MUC-1抗原細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位基因連接于BCG HSP65的3’端。在BCGHSP65-MUC-1抗原細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位基因的3’端連接6聚組氨酸編碼序列，得到重組融合蛋白疫苗。編碼所述融合蛋白的基因序列是SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；所述融合蛋白的結(jié)構(gòu)是SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。所述的人MUC-1抗原細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位基因序列是SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
本發(fā)明的疫苗的制備方法是1、獲取結(jié)核桿菌(BCG)65KD熱休克蛋白(HSP65)的編碼基因1)培養(yǎng)結(jié)核桿菌(BCG)2)提取結(jié)核桿菌基因組DNA3)用PCR方法自結(jié)核桿菌分離熱休克蛋白65(HSP65)結(jié)構(gòu)基因4)PCR產(chǎn)物的克隆5)PCR產(chǎn)物的序列分析2、構(gòu)建HSP-65和人MUC-1抗原細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位基因的融合基因3、克隆HSP-65和人MUC-1抗原細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位基因的融合基因1)用NcoI和HindIII消化PCR產(chǎn)物。
2)消化產(chǎn)物經(jīng)脂糖凝膠電泳分離。
3)切下瓊脂糖凝膠上的DNA電泳帶。
4)將回收的PCR產(chǎn)物以NcoI和HindIII切點克隆入原核細胞表達載體(pET-28a(+)質(zhì)粒)。
5)將含HSP-65基因的重組pET-28a(+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌。4、測定HSP-65和人MUC-1抗原細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位基因的序列。5、表達HSP-65和人MUC-1抗原細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位基因的融合基因。6、純化HSP-65和人MUC-1抗原細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位融合蛋白。7、分離HSP-65和人MUC-1抗原細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位基因融合蛋白。8、鑒定HSP-65和人MUC-1抗原細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位基因融合蛋白的純度。
此融合蛋白即為結(jié)核桿菌熱休克蛋白65-人MUC-1抗原細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位基因融合蛋白基因工程疫苗。
實施例1 獲取卡介苗結(jié)核桿菌(BCG)65KD熱休克蛋白(HSP65)的編碼基因1、卡介苗結(jié)核桿菌來源于長春生物制品研究所。
2、采用蘇通馬鈴薯培養(yǎng)基培養(yǎng)卡介苗結(jié)核桿菌，培養(yǎng)的溫度為37-39℃，生長出的卡介苗結(jié)核桿菌呈現(xiàn)干皺淺黃色的菌膜。收集菌膜，從中提取卡介苗結(jié)核桿菌基因組DNA。(提取結(jié)核桿菌基因組DNA的方法參照Molecular Cloning一書(J.Sambrook，Isolation of high-molecular-weight DNA from mammalian cells，9.16-9.22，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Molecular cloning，1989)。)
3、采用PCR方法自結(jié)核桿菌分離熱休克蛋白65(HSP65)結(jié)構(gòu)基因。采用的5’端引物序列為5’CCATG GCC AAG ACA ATT GCG3’，3’端引物序列為5’ACC CAA TTC GCTAGC CAT ATG GAA ATC CAT GCC ACC CAT 3’。
所述PCR操作程序是在一500μl微量離心管中加入下列試劑模板cDNA 5μl(mmol/L)10×PCR緩沖液(含氯化鎂)5μldNTPs(10mmol/L)1μl5’端和3’端引物(0.01mmol/L)各0.5μlTaq DNA聚合酶(5u/μl)0.25μl加去離子水至終體積50μl混合后加入礦物油3滴反應(yīng)條件94C，30″；55℃，1’；72℃，2’，30個循環(huán)周期后，72℃延伸10分鐘。
4、PCR產(chǎn)物的克隆采用TA克隆方法克隆PCR產(chǎn)物，方法見文獻(于永利，麻彤輝，楊貴貞TA克隆及雙鏈DNA測序，介紹一種快速克隆及分析PCR產(chǎn)物的方法，中國免疫學(xué)雜志，1994，10(1)5)。
5、PCR產(chǎn)物的序列分析按常規(guī)方法(J.Sambrook，Polyacrylamide gel electrophoresis 1.21-1.32，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Molecular cloning，1989)提取質(zhì)粒，采用雙脫氧末端終止法，對插入片段進行序列測定。
實施例2 構(gòu)建HSP-65和人MUC-1抗原細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位基因的融合基因采用PCR方法合成HSP-65和人MUC-1抗原細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位基因的融合基因，模板為結(jié)核桿菌65KD熱休克蛋白(HSP)的編碼基因(濃度為0.01pmol/L)，PCR引物的為，5’端引物序列為5’ttc gcc atg gcc aag aca att gcg 3’，3’端引物的序列為5’ggc cgc aag ctt cag agc cgg acg gtt gtc cgg agc aga ggt aac acc gtg agc cgg cgg agcggt aga acc cgg agc cgg acg ggt gtc cgg agc aga ggt aac acc gtg agc cgg cgg agc ggt aga acc gaattc gct agc cat atg caa atc 3’反應(yīng)條件為94℃，30″；55℃，1’；72℃，4’30個循環(huán)周期后，72℃延伸10分鐘。
實施例3 HSP-65和人MUC-1抗原細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位基因融合基因的克隆1、用NcoI和HindIII在37℃消化PCR產(chǎn)物，時間為2小時。
2、消化產(chǎn)物瓊經(jīng)脂糖凝膠電泳分離。電泳的條件是1％瓊脂糖凝膠，1×TAE緩沖液，150-200mA，電泳0.5-1小時。20×TAE緩沖液0.8mol/L Tris base0.4mol/L NaOAc0.04mol/L Na2 EDTA用冰醋酸調(diào)pH8.3。
3、在紫外燈下觀察并切下瓊脂糖凝膠上的DNA電泳帶。將含DNA區(qū)帶的瓊脂糖凝膠切下，置-70℃冷凍15分鐘，然后在65℃水浴中使膠融化；加入等倍體積TE-飽合酚，劇烈振蕩30秒鐘，然后-70℃冷凍15分鐘；室溫融化后，12,000rpm離心5分鐘，將上層液相移至另一管中，用2-2.5倍乙醇沉淀、洗滌和干燥DNA。
4、將回收的PCR產(chǎn)物克隆入經(jīng)限制性內(nèi)切酶NcoI和HindIII消化的原核細胞表達載體pET-28a(+)質(zhì)粒(美國Novagen公司)的6聚組氨酸(histidine)密碼子的上游。
質(zhì)粒DNA的消化反應(yīng)1μg質(zhì)粒DNA1μl 10×緩沖液(見Promega Corporation產(chǎn)品說明書)。1μl限制性內(nèi)切酶NcoI(10單位/μl)1μl限制性內(nèi)切酶HindIII(10單位/μl)用雙蒸水補齊至10μl混合后37℃溫育30-120分鐘。
連接反應(yīng)質(zhì)粒DNA(0.5μg/μl)2μlDNA插入片段(300ng/μl)5μl10×連接緩沖液(見Protocols and Applications Guide，p57，Promega Corporation，Second Edition，1991)1μlT4 DNA連接酶1μl用雙蒸水補齊至10μl混合后置14-16℃水浴6-12小時。
5、將含HSP-65基因的重組pET-28a(+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌。感受態(tài)細胞的制備a、將大腸桿菌在LB瓊脂培養(yǎng)基上劃線，37℃培養(yǎng)12-16小時；b、次日從瓊脂平板上取一單菌落于2ml LB培養(yǎng)基中，37℃以225rpm速度震蕩培養(yǎng)12-16小時；c、取1ml上述培養(yǎng)物接種于100ml LB培養(yǎng)基中，37℃以225rpm的速度震蕩培養(yǎng)直至OD值為0.5左右(大約3小時)；d、將菌液冰浴2小時，然后2,500Xg，4℃離心20分鐘收集菌體；e、加入100ml冰冷的Trituration緩沖液(100mmol/L CaCl2，70mmol/L MgCl2，40mmol/L醋酸鈉，pH5.5)，混勻，置冰上45分鐘；f、1,800Xg，4℃離心10分鐘，棄上清，加入10ml冰冷的Trituration緩沖液懸浮細胞；g.按每份200ul分裝，4℃可保存1-2周。若需長期保存，可加甘油至終濃度為15％，置-70℃?zhèn)溆谩?br> 轉(zhuǎn)化方法a、將200ul感受態(tài)細胞置冰上融化，然后加入3ul DMSO或β-巰基乙醇，混合后，加入3-5μl連接反應(yīng)液(含重組質(zhì)粒)，溫和混勻，置冰上30分鐘；b、42℃ 45秒，然后迅速放回冰中1-2分鐘；c、加入2ml LB培養(yǎng)液，37℃以225rpm的速度搖蕩培養(yǎng)1小時；d、4,000Xg離心10秒鐘，棄上清，用200ul LB培養(yǎng)液重懸菌體；e、將菌液鋪于含有適當抗生素的LB瓊脂培養(yǎng)板上，涂勻，室溫放置20-30分鐘，倒置于37℃孵箱中培養(yǎng)12-16小時。用限制性內(nèi)切酶消化的方法鑒定重組克隆。
f、質(zhì)粒和菌株的保存質(zhì)粒冰凍保存于-20℃。菌株在含20-50％甘油培養(yǎng)液中保存于-20℃或-70℃。
HSP-65和人MUC-1抗原細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位基因的融合基因的測序(采用雙脫氧末端終止法，具體方法見文獻于永利，麻彤輝，楊貴貞.TA克隆及雙鏈DNA測序介紹一種快速克隆及分析PCR產(chǎn)物的方法.中國免疫學(xué)雜志，1994，10(1)5)結(jié)果表明，所得到的HSP-65和人MUC-1抗原細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位基因的融合基因和設(shè)計的完全一致。
實施例4 HSP-65和人MUC-1抗原細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位基因的融合基因的表達1、將單菌落的細菌接種于50ml LB培養(yǎng)基中，于250ml三角燒瓶中，37℃水浴震蕩培養(yǎng)至OD600為0.6。
2、入IPTG使其終濃度為0.4mM，37℃水浴震蕩培養(yǎng)2-3小時。
3、三角燒瓶于冰上5分鐘，4℃離心5分鐘(5000xg)。
4、吸棄上清，收集細菌，立即使用或凍存。
實施例5 HSP-65和人MUC-1抗原細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位融合蛋白的純化1、將大腸桿菌細胞(3g濕重)于室溫下解凍。組織經(jīng)組織破碎器短暫勻漿后，重懸于20ml含0.2％脫氧膽酸鈉(DOC)的緩沖液A。
緩沖液A(1000ml)的配制終濃度1mol/L Tris.HCL(pH7.9)50ml 50mmol/L0.5mol/LEDTA 1ml 0.5mmol/L5mol/L NaCL 10ml 50mmol/L100％甘油50ml 5％2、用臺式超聲細胞破碎儀(SANYO，MSE SONIPREP 150)，設(shè)8個循環(huán)和50％的時間間隔，在冰浴中超聲90秒破菌，攪拌10-20min。
3、加DOC，使終濃度為0.2％(即，加約240ul的20％脫氧膽酸鈉(DOC)?；靹?，靜置10min。20％脫氧膽酸鈉(DOC)貯存液應(yīng)提前1天配制，配方為10g無水DOC，溶于水中，調(diào)體積至50ml。得粗制裂解物(A)4、13000rpm，4℃離心10min。輕輕傾出上清。
5、加18ml緩沖液A和2ml 20％DOC貯存液于包涵體沉淀。用組織破碎器充分重懸沉淀，室溫下靜置至少10分鐘。將懸液于4℃離心10min，13000rpm。
6、重復(fù)步驟5。
7、加39.4ml緩沖液A和0.6ml 20％十二烷基肌氨酸鈉(SKL)儲液(SKL凈濃度為0.3％)。劇烈攪動使沉淀慢慢溶解。靜置至少30分鐘。
十二烷基肌氨酸鈉(SKL)儲液10g無水十二烷基肌氨酸鈉(SKL)，溶于H2O中，調(diào)體積至50ml。
8、將懸液于4℃離心10min，13000rpm。
9、用緩沖液A+0.3％SKL稀釋溶解的蛋白質(zhì)使其濃度為1mg/ml。用緩沖液A將溶解的蛋白質(zhì)稀釋10倍，使其濃度為0.1mg/ml，SKL的終濃度為0.03％。
10、在4℃溶解的蛋白質(zhì)制備物(體積約為400ml)對緩沖液A(體積約為4000ml)透析8小時，同時充分攪拌。然后換新鮮緩沖液并重復(fù)。
11、從透析袋(口徑1cm)中移出經(jīng)透析的蛋白質(zhì)溶液，4℃、8000rpm離心20min，去除所有的的聚集物。留取上清，做鑷-Saphrose-4-B層析分離HSP-65和前列腺特異性抗原(PSA)的T細胞表位的融合基因融合蛋白。
12、采用常規(guī)的SDS-PAGE方法(J.Sambrook，Polyacrylamide gelelectrophoresis 6.36-6.49，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Molecularcloning，1989)。鑒定HSP-65和前列腺特異性抗原(PSA)的T細胞表位的基因融合蛋白的純度，純度為98％。
實施例6 體內(nèi)抑制MCF-7細胞生長實驗一、材料1、MCF-7細胞MCF7是人乳腺癌細胞系細胞(American Type Culture Collection，ATCC)，表達MUC-1分子，可在小鼠形成原位實體腫瘤。
2、實驗動物6周的雌性BALB/c，疫苗組和對照組各20只。
3、實驗方法1)采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MCF7細胞。在DMEM培養(yǎng)基中含10％的滅活胎牛血清，2mML-谷胱甘肽，100單位/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素。在注射之前，用無血清DMEM將細胞洗三次。每只小鼠注射1×107個MCF7細胞，注射部位是小鼠兩肩胛骨間皮下。在6周以后，測量小鼠腫瘤塊基底部的面積。
2)在接種腫瘤30天前和15天前，疫苗組分別腹腔注射100μg人乳腺癌基因工程疫苗；對照組分別腹腔注射同疫苗組同體積生理鹽水。
4、實驗結(jié)果及結(jié)論動物腫瘤塊基底部面積的平均值疫苗組為61mm2，對照組為300mm2。
結(jié)論該人乳腺癌基因工程疫苗能明顯抑制人乳腺癌細胞在小鼠體內(nèi)生長。
序列表SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長度1800個堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(iii)序列描述SEQ ID NO11 ATGGCCAAGA CAATTGCGTA CGACGAAGAG GCCCGTCGCG GCCTCGAGCG GGGCTTGAAC 6061 GCCCTCGCCG ATGCGGTAAA GGTGACATTG GGCCCCAAGG GCCGCAACGT CGTCCTGGAA 120121 AAGAAGTGGG GTGCCCCCAC GATCACCAAC GATGGTGTGT CCATCGCCAA GGAGATCGAG 180181 CTGGAGGATC CGTACGAGAA GATCGGCGCC GAGCTGGTCA AAGAGGTAGC CAAGAAGACC 240241 GATGACGTCG CCGGTGACGG CACCACGACG GCCACCGTGC TGGCCCAGGC GTTGGTTCGC 300301 GAGGGCCTGC GCAACGTCGC GGCCGGCGCC AACCCGCTCG GTCTCAAACG CGGCATCGAA 360361 AAGGCCGTGG AGAAGGTCAC CGAGACCCTG CTCAAGGGCG CCAAGGAGGT CGAGACCAAG 420421 GAGCAGATTG CGGCCACCGC AGCGATTTCG GCGGGTGACC AGTCCATCGG TGACCTGATC 480481 GCCGAGGCGA TGGACAAGGT GGGCAACGAG GGCGTCATCA CCGTCGAGGA GTCCAACACC 540541 TTTGGGCTGC AGCTCGAGCT CACCGAGGGT ATGGGGTTCG ACAAGGGCTA CATCTCGGGG 600601 TACTTCGTGA CCGACCCGGA GCGTCAGGAG GCGGTCCTGG AGGACCCCTA CATCCTGCTG 660661 GTCAGCTCCA AGGTGTCCAC TGTCAAGGAT CTGCTGCCGC TGCTCGAGAA GGTCATCGGA 720721 GCCGGTAAGC CGCTGCTGAT CATCGCCGAG GACGTCGAGG GCGAGGCGCT GTCCACCCTG 780781 GTCGTCAACA AGATCCGCGG CACCTTCAAG TCGGTGGCGG TCAAGGCTCC CGGCTTCGGC 840841 GACCGCCGCA AGGCGATGCT GCAGGATATG GCCATTCTCA CCGGTGGTCA GGTGATCAGC 900901 GAAGAGGTCG GCCTGACGCT GGAGAACGCC GACCTGTCGC TGCTAGGCAA GGCCCGCAAG 960961 GTCGTGGTCA CCAAGGACGA GACCACCATC GTCGAGGGCG CCGGTGACAC CGACGCCATC 10201021 GCCGGACGAG TGGCCCAGAT CCGCCAGGAG ATCGAGAACA GCGACTCCGA CTACGACCGT10801081 GAGAAGCTGC AGGAGCGGCT GGCCAAGCTG GCCGGTGGTG TCGCGGTCAT CAAGGCCGGT11401141 GCCGCCACCG ACGTCGAACT CAAGGAGCGC AAGCACCGCA TCGAGGATGC GGTTCGCAAT12001201 GCCAAGGCCG CCGTCGAGGA GGGCATCGTC GCCGGTGGGG GTGTGACGCT GTTGCAAGCG12601261 GCCCCGACCC TGGACGAGCT GAAGCTCGAA GGCGACGAGG CGACCGGCGC CAACATCGTG1320 SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)長度599個氨基酸殘基(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)序列描述SEQ ID NO21 Met Ala Lys Thr Ihr Ala Tyr Asp Glu Glu Ala Arg Arg Gly Leu 1516 Glu Arg Gly Leu Asn Ala Leu Ala Asp Ala Val Lys Val Thr Leu 3031 Gly Pro Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Glu Lys Lys Trp Gly Ala 4546 Pro Thr Ihr Thr Asn Asp Gly Val Ser Ile Ala Lys Glu Ile Glu 606l Leu Glu Asp Pro Tyr Glu Lys Ile Gly Ala Glu Leu Val Lys Glu 7576 Val Ala Lys Lys Thr Asp Asp Val Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr 9091 Ala Thr Val Leu Ala Gln Ala Leu Val Arg Glu Gly Leu Arg Asn 105106 Val Ala Ala Gly Ala Asn Pro Leu Gly Leu Lys Arg Gly Ile Glu 120121 Lys Ala Val Glu Lys Val Thr Glu Thr Leu Leu Lys Gly Ala Lys 135136 Glu Val Glu Thr Lys Glu Gln Ile Ala Ala Thr Ala Ala Ile Ser 150151 Ala Gly Asp Gln Ser Ile Gly Asp Leu Ile Ala Glu Ala Met Asp 165166 Lys Val Gly Asn Glu Gly Val Ile Thr Val Glu Glu Ser Asn Thr 180181 Phe Gly Leu Gln Leu Glu Leu Thr Glu Gly Met Arg Phe Asp Lys 195196 Gly Tyr Ile Ser Gly Tyr Phe Val Thr Asp Pro Glu Arg Gln Glu 210211 Ala Val Leu Glu Asp Pro Tyr Ile Leu Leu Val Ser Ser Lys Val 225226 Ser Thr Val Lys Asp Leu Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val Ile Gly 240241 Ala Gly Lys Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Asp Val Glu Gly Glu 255256 Ala Leu Ser Thr Leu Val Val Asn Lys Ile Arg Gly Thr Phe Lys 270271 Ser Val Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala 285286 Met Leu Gln Asp Met Ala Ile Leu Thr Gly Gly Gln Val Ile Ser 300301 Glu Glu Val Gly Leu Thr Leu Glu Asn Ala Asp Leu Ser Leu Leu 315316 Gly Lys Ala Arg Lys Val Val Val Thr Lys Asp Glu Thr Thr Ile 330331 Val Glu Gly Ala Gly Asp Thr Asp Ala Ile Ala Gly Arg Val Ala 345346 Gln Ile Arg Gln Glu Ile Glu Asn Ser Asp Ser Asp Tyr Asp Arg 360361 Glu Lys Leu Gln Glu Arg Leu Ala Lys Leu Ala Gly Gly Val Ala 375376 Val Ile Lys Ala Gly Ala Ala Thr Glu Val Glu Leu Lys Glu Arg 390391 Lys His Arg Ile Glu Asp Ala Val Arg Asn Ala Lys Ala Ala Val 405406 Glu Glu Gly Ile Val Ala Gly Gly Gly Val Thr Leu Leu Gln Ala 420421 Ala Pro Thr Leu Asp Glu Leu Lys Leu Glu Gly Asp Glu Ala Thr 435436 Gly Ala Asn Ile Val Lys Val Ala Leu Glu Ala Pro Leu Lys Gln 450451 Ile Ala Phe Asn Ser Gly Leu Glu Pro Gly Val Val Ala Glu Lys 465466 Val Arg Asn Leu Pro Ala Gly His Gly Leu Asn Ala Gln Thr Gly 480481 Val Tyr Glu Asp Leu Leu Ala Ala Gly Val Ala Asp Pro Val Lys 495496 Val Thr Arg Ser Ala Leu Gln Asn Ala Ala Ser Ile Ala Gly Leu 510511.Phe Leu Thr Thr Glu Ala Val Val Ala Asp Lys Pro Glu Lys Glu 525526 Lys Ala Ser Val Pro Gly Gly Gly Asp Met Gly Gly Met Asp Phe 540541.His Met Ala Ser Glu Phe Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly 555556 Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala 570571 Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn Arg Pro Ala 585586 Leu Lys leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His His 600SEQ ID NO3信息(i)序列特征(A)長度120個堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(iii)序列描述SEQ ID NO3
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防和治療人乳腺癌的基因工程重組蛋白疫苗，其特征是該疫苗含有將結(jié)核桿菌(卡介苗)熱休克蛋白65(BCG HSP65)的編碼基因和人乳腺癌細胞表達的MUC1抗原細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位基因相連接而得到的基因工程重組融合蛋白；編碼所述融合蛋白的基因序列是SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1所述的基因工程重組蛋白疫苗，其中所述融合蛋白的結(jié)構(gòu)是SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1所述的基因工程重組蛋白疫苗，其中所述將結(jié)核桿菌熱休克蛋白65的編碼基因和人乳腺癌細胞表達的MUC1抗原細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位基因相連接的方式是結(jié)核桿菌HSP 65位于5’端，人乳腺癌細胞表達的MUC1抗原細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位基因連接于BCG HSP65的3’端，在BCG HSP65-MUC-1細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位基因的3’端連接6聚組氨酸編碼序列。
4.權(quán)利要求1所述的基因工程重組蛋白疫苗，其特征是所述的人乳腺癌細胞表達的MUC1抗原細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位基因序列是SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種對人乳腺癌有明確的預(yù)防和治療作用的基因工程疫苗。這種疫苗是將結(jié)核桿菌(卡介苗)熱休克蛋白65(BCG HSP65)的編碼基因和人乳腺癌細胞表達的MUC1抗原細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位基因融合在一起,在大腸桿菌表達的HSP－MUC1抗原CTL表位融合蛋白。本發(fā)明的疫苗可有效地預(yù)防和治療乳腺癌。
文檔編號C07K14/435GK1368384SQ0110261
公開日2002年9月11日 申請日期2001年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月8日
發(fā)明者于永利, 李慧 申請人:北京迪威華宇生物技術(shù)有限公司