專利名稱：增加基于抗體的融合蛋白的循環(huán)半衰期的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及融合蛋白。更特定的，本發(fā)明涉及增加基于抗體的融合蛋白的循環(huán)半衰期。
背景技術(shù)：
治療人類疾病的抗體的使用已經(jīng)很好地建立，隨著遺傳工程的引入變得越來越復(fù)雜。已開發(fā)了幾種技術(shù)提高抗體的，功用。這些包括(1)通過細(xì)胞融合產(chǎn)生“雜交瘤”，或由產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，分子克隆抗體重(H)鏈和輕(L)鏈而產(chǎn)生的單克隆抗體；(2)其它分子與抗體接合以將它們傳遞到體內(nèi)優(yōu)選部位，如，放射性同位素、毒性藥物、蛋白毒素和細(xì)胞因子；(3)處理抗體效應(yīng)物功能以增加或減少生物活性；(4)其它蛋白如毒素和細(xì)胞因子與抗體在基因水平連接以產(chǎn)生基于抗體的融合蛋白；和(5)一組或多組抗體聯(lián)合區(qū)在基因水平連接以產(chǎn)生雙特異性抗體。
蛋白可通過使用本領(lǐng)域已知的化學(xué)或遺傳操作方法連接起來。參見，如，Gillies等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8914281432(1992)；和美國專利號5,650,150。
然而，重組產(chǎn)生的基于抗體的融合蛋白的功用可能受其在體內(nèi)被從循環(huán)中快速清除的限制。例如，已表明抗體-細(xì)胞因子融合蛋白在體內(nèi)的循環(huán)半衰期明顯低于游離抗體。當(dāng)檢測多種抗體-細(xì)胞因子融合蛋白時(shí)，Gillies等報(bào)道了所有檢測的融合蛋白的α期(分配期)半衰期少于1.5小時(shí)。的確，大多數(shù)基于抗體的融合蛋白兩個(gè)小時(shí)被清除至游離抗體血清濃度的10％。參見，例如，Gillies等，BIOCONJ.CHEM.4230-235(1993)。近來，已表明與Fc受體結(jié)合親和力降低之基于抗體的融合蛋白的半衰期增加。也表明與Fc受體結(jié)合親和力降低妨礙抗體效應(yīng)物的某些功能，如抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)，但不妨礙其它功能如補(bǔ)體固定或抗原結(jié)合。參見Gillies等，Cancer Res.59(9)2159-66(1999)。
有些情況下，例如癌癥或病毒疾病的治療中，期望維持抗體效應(yīng)物的功能和長的循環(huán)半衰期。因此，本領(lǐng)域需要增加基于抗體的融合蛋白的體內(nèi)循環(huán)半衰期的另外方法。
發(fā)明概述免疫球蛋白G(IgG)分子與多種類型的細(xì)胞受體包括特異性針對IgG類抗體的三類Fcγ受體(FcγR)，即FcγRI、FcγRII和FcγRIII相互作用。它們也與FcRp類受體以pH依賴性方式相互作用，在中性pH少量結(jié)合或不結(jié)合，但在pH 6.0時(shí)高度結(jié)合。
抗體的血清半衰期受抗體所結(jié)合Fc受體(FcR)和Fc保護(hù)受體(FcRp)能力的影響。免疫球蛋白融合蛋白的血清半衰期也受例如結(jié)合到這種受體之能力的影響(Gillies等，Cancer Res.592159-66(1999))。
本發(fā)明公開了令人驚奇的觀察結(jié)果，在含有免疫球蛋白(Ig)部分和非免疫球蛋白(非Ig)部分的融合蛋白內(nèi)，接近兩者的連接部分的氨基酸改變戲劇性地增加該融合蛋白的血清半衰期。這個(gè)觀察結(jié)果令人驚奇，因?yàn)榘被岣淖冇绊懥瞬煌贔c區(qū)與Fc受體和Fc保護(hù)受體相互作用的表面的蛋白表面。此外，甚至在已知Fc受體和Fc保護(hù)受體不主要決定融合蛋白的血清半衰期的情況下，本發(fā)明的氨基酸改變也具有它們的這種作用。因此，本發(fā)明的氨基酸改變可以和影響與Fc受體和/或Fc保護(hù)受體相互作用的氨基酸改變相組合以達(dá)到協(xié)同作用。
本發(fā)明提供了含免疫球蛋白的融合蛋白，其中不同于與Fc受體和Fc保護(hù)受體(FcRp)相互作用的Fc區(qū)表面的位點(diǎn)改變造成血清半衰期的提高。本發(fā)明還提供了血清半衰期提高的具有免疫球蛋白部分和第二個(gè)非免疫球蛋白蛋白之間融合的蛋白的制備方法。
融合蛋白氨基酸序列的改變主要在Ig部分和非Ig部分連接處。相對于Ig重鏈和非Ig蛋白天然產(chǎn)生的序列，融合蛋白的連接區(qū)含有的改變優(yōu)選位于連接點(diǎn)的大約10個(gè)氨基酸內(nèi)。更優(yōu)選，氨基酸改變引起疏水性增加。甚至更優(yōu)選，氨基酸改變包括抗體部分C末端賴氨酸變?yōu)槭杷园被幔绫彼峄蛄涟彼?。在?yōu)選方案中，本發(fā)明的融合蛋白包含Ig重鏈，優(yōu)選位于第二個(gè)非Ig蛋白的N末端。
在本發(fā)明的另一個(gè)方案中，通過改變接觸FcRp的Fc部分的相互作用表面，優(yōu)化融合蛋白與FcRp的結(jié)合親和力。已報(bào)道IgG與FcRp受體結(jié)合的重要序列位于CH2和CH3區(qū)。根據(jù)本發(fā)明，融合蛋白中融合連接的改變和與FcRp相互作用的Fc表面的改變相結(jié)合，產(chǎn)生協(xié)同作用。有些情況下，增加在pH6時(shí)Fc部分與FcRp的相互作用可能有效，降低在pH8時(shí)Fc部分與FcRp的相互作用可能也有效。這種修飾包括接觸Fc受體所需殘基的改變，或通過誘導(dǎo)構(gòu)象改變來改變影響其它重鏈殘基和FcRp受體間接觸的其它改變。因此，在優(yōu)選方案中，通過首先將Ig恒定區(qū)的編碼序列與第二個(gè)非免疫球蛋白的蛋白連接，然后在IgG恒定區(qū)中位于選自或接近Ile 253，His 310和His 435的一個(gè)或多個(gè)氨基酸處引入突變(如點(diǎn)突變、缺失、插入，或基因重排)，得到體內(nèi)循環(huán)半衰期增加的基于抗體的融合蛋白。所得基于抗體的融合蛋白具有比未修飾融合蛋白更長的體內(nèi)循環(huán)半衰期。
在某些情況下，使Fc部分的某些效應(yīng)物功能變異有效。例如，可消除補(bǔ)體固定。此外，在另一組方案中，融合蛋白的Ig成分至少具有與FcγRI，F(xiàn)cγRII或FcγRIII中至少一個(gè)結(jié)合親和力降低的IgG恒定區(qū)部分。例如，可使用IgG的γ4鏈代替γ1。這種改變具有的優(yōu)點(diǎn)是γ4鏈與融合連接處的一個(gè)或多個(gè)突變協(xié)同作用，產(chǎn)生更長的血清半衰期。因此，也可以用IgG2代替IgG1。在本發(fā)明的可供選擇的方案中，融合蛋白包括突變IgG1恒定區(qū)，例如具有Leu234，Leu235，Gly236，Gly237，Asn297或Pro331中一個(gè)或多個(gè)突變或缺失的IgG1恒定區(qū)。在本發(fā)明進(jìn)一步的方案中，融合蛋白包括突變IgG3恒定區(qū)，例如具有Leu281，Leu282，Gly283，Gly284，Asn344，或Pro378中一個(gè)或多個(gè)突變或缺失的IgG3恒定區(qū)。然而，對于有些應(yīng)用，保留Fc受體結(jié)合伴隨的效應(yīng)物功能如ADCC可能有用。
在優(yōu)選方案中，融合蛋白的第二個(gè)非免疫球蛋白部分是細(xì)胞因子。這里使用的術(shù)語“細(xì)胞因子”描述可使具有該種細(xì)胞因子受體的細(xì)胞發(fā)生特異性生物反應(yīng)的天然產(chǎn)生的或重組蛋白，其類似物，和其片段。優(yōu)選的，細(xì)胞因子是可由細(xì)胞產(chǎn)生并分泌的蛋白質(zhì)。優(yōu)選細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素，如白細(xì)胞介素2(IL-2)，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-10，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16和IL-18，造血因子如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)和紅細(xì)胞生成素，腫瘤壞死因子(TNF)如TNFα，淋巴因子如淋巴毒素，代謝過程調(diào)節(jié)劑如leptin，干擾素α、干擾素例如干擾素β和干擾素γ，和細(xì)胞因子。優(yōu)選，本發(fā)明的抗體-細(xì)胞因子融合蛋白顯示細(xì)胞因子生物活性。
在可供選擇的優(yōu)選方案中，融合蛋白的第二個(gè)非免疫球蛋白部分是具有生物活性的配體結(jié)合蛋白。這種配體結(jié)合蛋白可以例如，(1)阻斷受體-配體在細(xì)胞表面的相互作用；或(2)中和在血液液相中分子(如細(xì)胞因子)的生物活性。由此防止它達(dá)到其細(xì)胞靶。優(yōu)選，配體結(jié)合蛋白包括CD4，CTLA-4，TNF受體，或白細(xì)胞介素受體如IL-1和IL-4受體。優(yōu)選，本發(fā)明的抗體-受體融合蛋白顯示配體結(jié)合蛋白的生物活性。
在另一個(gè)可供選擇的優(yōu)選方案中，融合蛋白的第二個(gè)非免疫球蛋白部分是蛋白毒素。優(yōu)選，本發(fā)明的抗體-毒素融合蛋白顯示蛋白毒素的毒素活性。
在其它優(yōu)選方案中，融合蛋白的第二個(gè)非免疫球蛋白部分是激素、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白、體重調(diào)節(jié)劑、血清蛋白、凝集因子、蛋白酶、細(xì)胞外基質(zhì)成分、血管生成因子、抗血管生成因子或另一種分泌蛋白或分泌結(jié)構(gòu)域。例如，CD26、IgE受體、聚合IgA受體、其它抗體受體、因子VIII、因子IX、因子X、TrkA、PSA、PSMA、Flt-3配體、endostatin、制管張素和這些蛋白的結(jié)構(gòu)域。
在其它方案中，第二個(gè)非免疫球蛋白部分是非人或非哺乳動物蛋白。例如，優(yōu)選HIV gpl20、HIV Tat、其它病毒(如腺病毒)和RSV的表面蛋白，其它HIV成分，寄生蟲表面蛋白(如瘧疾抗原)和細(xì)菌表面蛋白。這些非人蛋白可以用作例如抗原，或因?yàn)樗鼈兙哂杏杏没钚?。例如，第二個(gè)非免疫球蛋白部分可以是鏈激酶、葡激酶、尿激酶、組織纖溶酶原激活劑或具有有用酶活性的其它蛋白。
根據(jù)本發(fā)明，非免疫球蛋白部分可以是蛋白的一部分。優(yōu)選，非Ig蛋白部分是基本保留完整蛋白的功能和結(jié)構(gòu)特性的蛋白部分。在優(yōu)選方案中，非Ig蛋白部分是這里描述的蛋白的功能或結(jié)構(gòu)部分。
在優(yōu)選方案中，基于抗體的融合蛋白包括靶抗原特異性的可變區(qū)和恒定區(qū)，二者任何一個(gè)通過肽鍵與第二個(gè)非免疫球蛋白的蛋白連接。恒定區(qū)可以是正常與可變區(qū)相聯(lián)的恒定區(qū)，或不同的一個(gè)，如來自不同物種的可變區(qū)和恒定區(qū)。重鏈可以包括一個(gè)或多個(gè)CH1、CH2或CH3結(jié)構(gòu)域的任何組合。優(yōu)選，重鏈包括CH1、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域，更優(yōu)選，僅有CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)方案中，基于抗體的一種融合蛋白包括與重鏈和輕鏈可變區(qū)融合的Fv區(qū)。也包括在術(shù)語“融合蛋白”中的是具有包括來自不同物種構(gòu)架區(qū)和可變區(qū)(即互補(bǔ)決定區(qū))的結(jié)合域的構(gòu)建體，如Winter等，英國專利號2,188,638中公開?；诳贵w的融合蛋白包括優(yōu)選地顯示抗原結(jié)合特異性的可變區(qū)。在另一個(gè)優(yōu)選方案中，基于抗體的融合蛋白進(jìn)一步包括輕鏈。因此本發(fā)明提供了融合蛋白，其中抗體的抗原結(jié)合特異性和活性與第二個(gè)非免疫球蛋白的蛋白如細(xì)胞因子的有力生物活性結(jié)合。本發(fā)明的融合蛋白可用于將第二個(gè)非免疫球蛋白的蛋白傳遞給體內(nèi)靶細(xì)胞，使第二個(gè)非免疫球蛋白的蛋白可以發(fā)揮局部的生物作用。
在可供選擇的優(yōu)選方案中，基于抗體的融合蛋白包括通過肽鍵與第二個(gè)非免疫球蛋白的蛋白聯(lián)結(jié)的重鏈恒定區(qū)，但不包括重鏈可變區(qū)。因此本發(fā)明進(jìn)一步提供了保留第二個(gè)非免疫球蛋白的蛋白的有力蛋白活性，但缺乏抗體的抗原結(jié)合特異性和活性的融合蛋白。
在優(yōu)選方案中，融合蛋白包括含有二硫鍵聯(lián)結(jié)的至少部分重鏈和第二個(gè)非Ig蛋白的兩個(gè)嵌合鏈。
在優(yōu)選方案中，本發(fā)明的融合蛋白有效治療癌癥、病毒感染、免疫紊亂，和有效增加特殊細(xì)胞類型的生長(包括增生)。
本發(fā)明的特征也包括編碼上述融合蛋白的DNA構(gòu)建體，和這些構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，如骨髓瘤。
這些和其它目的，同這里公開的本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特征一起，將由下面的說明書、附圖和權(quán)利要求變得更加明顯。
附圖簡述

圖1顯示了KS-IL-2融合蛋白和實(shí)施例中描述的含有抗體重鏈C末端賴氨酸部分置換或其它改變的各種突變?nèi)诤系鞍椎乃幋鷦恿W(xué)行為。采用檢測IL-2(圖1A)或人Fc(圖1B)的ELISA測定抗體或融合蛋白的水平。
圖2顯示了帶有γ1或γ4鏈的、在抗體重鏈C末端帶有野生型賴氨酸或賴氨酸-丙氨酸突變的KS-IL-2融合蛋白的藥代動力學(xué)特性。采用檢測IL-2部分的ELISA測定抗體或融合蛋白的水平。
圖3顯示了人抗體與腫瘤壞死因子α(TNFα)融合的藥代動力學(xué)特性。用檢測人Fc區(qū)的ELISA測定融合蛋白的水平。所示的是完整抗體-TNFα融合蛋白(黑色菱形)的水平和另一個(gè)在抗體C末端部分賴氨酸刪除的等同融合蛋白(灰色正方形)的水平。
圖4顯示了抗體-IL-2融合蛋白與富含F(xiàn)cγR類型受體的固定J774細(xì)胞膜的結(jié)合。所示的是結(jié)合無突變KS-IL-12融合蛋白(黑色菱形)和帶有重鏈C末端賴氨酸變?yōu)楸彼嵬蛔兊腒S-IL-12融合蛋白(灰色正方形)。
圖5顯示了抗體-細(xì)胞因子融合蛋白對治療含有CT26結(jié)腸癌細(xì)胞衍生的改造為表達(dá)EpCAM-KS抗原的人皮下腫瘤的Balb/C小鼠的作用。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了Ig和非Ig部分接合處具有一個(gè)或多個(gè)突變的抗體融合蛋白，該突變增加該融合蛋白的循環(huán)半衰期。本發(fā)明的突變?nèi)诤系鞍拙哂袃?yōu)越的性能是它們的血清半衰期提高，但不影響抗體部分與體內(nèi)兩個(gè)已知的藥代動力學(xué)決定受體Fc受體和FcRp的相互作用。
一般來說，本發(fā)明基于抗體的融合蛋白包括連接于非免疫球蛋白(非Ig)蛋白之免疫球蛋白(Ig)蛋白的一部分，使得跨越Ig和非Ig蛋白接合區(qū)的氨基酸序列，與Ig和非Ig蛋白的野生型氨基酸序列相比，具有至少一個(gè)突變。
在一個(gè)方案中，至少一個(gè)突變在Ig部分的C末端區(qū)。在另一個(gè)方案中，至少一個(gè)突變在非Ig蛋白的N末端區(qū)。在進(jìn)一步的方案中，融合蛋白含有在Ig部分C末端區(qū)的至少一個(gè)突變和在非Ig蛋白N末端區(qū)的至少一個(gè)突變。突變可以是點(diǎn)突變、插入、缺失或基因重排。在優(yōu)選方案中，突變增加接合區(qū)的疏水性。例如，用不帶電荷或疏水性氨基酸取代帶電荷或可電離氨基酸(如用Ala，Leu，Gly，Trp或其它不帶電荷或疏水性殘基取代Lys，Arg或其它可電離殘基)的突變。
在可選擇的方案中，間隔肽或接頭肽插在Ig和非Ig蛋白之間。優(yōu)選間隔肽或接頭肽是不帶電荷，更優(yōu)選非極性和或疏水性的。優(yōu)選間隔或接頭肽的長度在1個(gè)和大約100個(gè)氨基酸之間，更優(yōu)選在1個(gè)和大約50個(gè)氨基酸之間，或在1個(gè)和大約25個(gè)氨基酸之間，和甚至更優(yōu)選在1個(gè)和大約15個(gè)氨基酸之間。在本發(fā)明另一個(gè)方案中，融合蛋白的Ig和非Ig部分通過間隔或接頭肽連接，且Ig和非Ig部分之一或兩個(gè)都有至少一個(gè)突變。在本發(fā)明可供選擇的方案中，Ig和非Ig部分被合成的間隔肽分隔，例如PNA間隔肽，優(yōu)選不帶電荷，更優(yōu)選非極性，和或疏水性的。
根據(jù)本發(fā)明，免疫球蛋白(Ig)鏈?zhǔn)敲庖咔虻鞍谆虬勺儏^(qū)或恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白的一部分。優(yōu)選Ig鏈?zhǔn)敲庖咔虻鞍字劓湹囊徊糠?，例如，能夠結(jié)合預(yù)選細(xì)胞類型的免疫球蛋白可變區(qū)。在優(yōu)選方案中，Ig鏈包括靶抗原特異性的可變區(qū)和恒定區(qū)。恒定區(qū)可以是正?？勺儏^(qū)相聯(lián)的恒定區(qū)，或不同的一個(gè)，例如，來自不同物種的可變區(qū)和恒定區(qū)。在更優(yōu)選方案中，Ig鏈包括重鏈。重鏈可包括含有一個(gè)或多個(gè)CH1、CH2或CH3結(jié)構(gòu)域的任何組合。優(yōu)選，重鏈包括CH1、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域，更優(yōu)選，僅有CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)方案中，免疫球蛋白部分包括重鏈和輕鏈可變區(qū)融合的Fv區(qū)。
根據(jù)本發(fā)明，非免疫球蛋白的蛋白包括天然產(chǎn)生的蛋白，它不是免疫球蛋白，或合成或重組的不是免疫球蛋白的蛋白，或上述任何的片段。在優(yōu)選方案中，非免疫球蛋白的蛋白包括功能域如配體結(jié)合域，酶域，調(diào)節(jié)域，或與一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞因子相互作用的域。在可供選擇的方案中，非免疫球蛋白域包括結(jié)構(gòu)域或表位。
在優(yōu)選方案中，Ig鏈通過基因融合與非Ig蛋白連接。優(yōu)選，基因融合是合成的或重組的，且采用標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)合成或分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生。典型地，以部分基因融合構(gòu)建體形式引入突變?？晒┻x擇地，可以使用已知的誘變方法后來引入突變(例如通過使基因融合構(gòu)建體接觸輻射，或化學(xué)或生物誘變)。
根據(jù)本發(fā)明，接合區(qū)是融合蛋白中融合蛋白的Ig和非Ig部分之間接合點(diǎn)周圍的區(qū)域。在優(yōu)選方案中，接合區(qū)包括Ig部分C末端部分和非Ig部分N末端部分。在一個(gè)方案中，接合區(qū)也包括插在Ig和非Ig部分接合點(diǎn)的間隔或接頭肽。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方案，Ig部分的突變在Ig部分C末端部分，優(yōu)選來自Ig部分C末端的大約100個(gè)殘基內(nèi)，更優(yōu)選大約50個(gè)殘基內(nèi)，或大約25個(gè)殘基內(nèi)，甚至更優(yōu)選大約10個(gè)殘基內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方案，非Ig部分的突變在非Ig部分N末端部分，優(yōu)選來自非Ig部分N末端的大約100個(gè)殘基內(nèi)，更優(yōu)選大約50個(gè)殘基內(nèi)，或大約25個(gè)殘基內(nèi)，甚至更優(yōu)選大約10個(gè)殘基內(nèi)。
在本發(fā)明的優(yōu)選方案中，突變在Ig部分的C末端部分，但突變不在Ig蛋白與Fc受體(FcR)或FcRp相互作用的部分。
根據(jù)本發(fā)明的具有突變的抗體融合蛋白，與沒有突變的相應(yīng)融合蛋白的循環(huán)半衰期相比，體內(nèi)循環(huán)半衰期增加?？贵w融合蛋白的循環(huán)半衰期可用檢測發(fā)揮作用時(shí)間的融合蛋白血清水平來測定。實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明本發(fā)明的優(yōu)選突變不依賴于FcR或FcRp的相互作用。首先，增加融合蛋白循環(huán)半衰期的優(yōu)選突變不影響抗體三維結(jié)構(gòu)上結(jié)合FcR或FcRp的部分相互作用表面的區(qū)域。其次，本發(fā)明的優(yōu)選突變可引起血清半衰期提高，甚至在用IgG-γ44鏈去除與FcR的相互作用和藥代動力學(xué)研究FcRp缺陷的β2微球蛋白突變小鼠去除與FcRp的相互作用時(shí)亦然。第三，本發(fā)明的優(yōu)選突變不明顯影響Ig融合蛋白與J774細(xì)胞上FcR的結(jié)合。
定點(diǎn)誘變分析表明與Fc受體相互作用的Fc表面接近CH2結(jié)構(gòu)域的鉸鏈區(qū)。與FcR相互作用的Fc表面區(qū)在三維上與Fc的C末端距離很遠(yuǎn)。相似的分析表明與氨基酸殘基相互作用的FcRp位于CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的交界面。
FcRp與其受體在酸性pH(pH6.0)的結(jié)合親和力比中性或弱堿性pH(pH7.4)時(shí)高得多。這與FcRp在保護(hù)含F(xiàn)c分子如內(nèi)體細(xì)胞內(nèi)在化的抗體中的作用一致。與溶酶體融合后這些細(xì)胞隔室變酸，酸性蛋白酶降解了其蛋白成分。此過程中與結(jié)合FcRp的膜結(jié)合可防止抗體降解，允許它再循環(huán)到細(xì)胞外(回到循環(huán)中)或穿過細(xì)胞層(稱作胞轉(zhuǎn)的過程)。后一過程允許在中腸酸性環(huán)境下消化牛奶后，IgG通過新生兒腸粘膜。
Fc/FcRp復(fù)合體結(jié)構(gòu)表明FcRp與Fc區(qū)的側(cè)面結(jié)合，接觸CH2和CH3結(jié)構(gòu)域，接觸區(qū)域不是特別接近Fc區(qū)的C末端。因此，期望恰好Fc的C末端區(qū)的改變不改變與FcRp的相互作用。
不受任何特殊理論的限制，認(rèn)為根據(jù)本發(fā)明的增加融合蛋白循環(huán)半衰期的融合接合區(qū)的突變也減少蛋白酶切割實(shí)驗(yàn)中融合蛋白的切割，如實(shí)施例15闡述。進(jìn)一步認(rèn)為蛋白酶消化可能助于形成完整蛋白(包括融合蛋白)的消失。因此，抵抗蛋白酶可能直接有助于改善蛋白的藥代動力學(xué)。也進(jìn)一步認(rèn)為蛋白酶消化非變性蛋白涉及蛋白酶接近正確構(gòu)象的暴露序列，和識別氨基酸的特殊序列。因此，影響蛋白的一般構(gòu)象并因此影響蛋白酶接近其切割位點(diǎn)的融合接合區(qū)的突變，可能有助于抵抗蛋白酶并有助于改善藥代動力學(xué)。此外，改變特定蛋白酶識別序列的突變可能有助于抵抗蛋白酶并有助于改善藥代動力學(xué)。
本發(fā)明突變的一個(gè)特征是它們可與抗體部分中的其它突變或置換組合或與Ig部分的其它特性組合，協(xié)同調(diào)節(jié)血清半衰期。例如，本發(fā)明增加抗體融合蛋白循環(huán)半衰期的一個(gè)或多個(gè)突變可與影響該抗體融合蛋白和FcR或FcRp間相互作用的突變組合。
此外，本發(fā)明的突變可用于多種廣泛的抗體部分和多種廣泛的非Ig融合伙伴。免疫球蛋白包括IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。非Ig融合伙伴包括細(xì)胞因子，其它分泌蛋白，酶，或跨膜受體的可溶片段，如配體結(jié)合域。
根據(jù)本發(fā)明，通過Fc部分本身內(nèi)部的修飾可進(jìn)一步加強(qiáng)基于抗體的融合蛋白之體內(nèi)循環(huán)半衰期的增加。這些可以是包括或鄰近Ile253，His310或His435的殘基，或當(dāng)?shù)鞍渍郫B為其3維結(jié)構(gòu)時(shí)能夠影響這些殘基的離子環(huán)境的其它殘基?？蓹z測所得蛋白在pH6和pH7.4-8時(shí)的最佳結(jié)合，以及選擇那些在pH6時(shí)高水平結(jié)合的蛋白和在pH8時(shí)低水平結(jié)合的蛋白用于體內(nèi)。
本發(fā)明的方法和組合物與血管生成抑制劑如PCT/US99/08335(WO99/52562)中公開或與前列腺素抑制劑如PCT/US99/08376(WO99/53958)中公開共同給予是有效的。本發(fā)明的方法和組合物也可用于多種細(xì)胞因子蛋白復(fù)合體，如PCT/US00/21715中公開的。本發(fā)明的方法和組合物與PCT/US99/03966(WO 99/43713)中公開的增加融合蛋白循環(huán)半衰期的其它突變組合也有效。
非限制性合成有效的本發(fā)明方案的方法，以及有效檢測藥代動力學(xué)活動的實(shí)驗(yàn)，體外和臨床前體內(nèi)動物模型在這里的實(shí)施例中描述。優(yōu)選的編碼嵌合鏈的基因構(gòu)建體包括(以5’至3’方向)編碼至少部分免疫球蛋白的DNA片段和編碼第二個(gè)非免疫球蛋白的蛋白的DNA?？晒┻x擇的優(yōu)選基因構(gòu)建體包括(以5’至3’方向)編碼第二個(gè)非免疫球蛋白的蛋白的DNA和編碼至少部分免疫球蛋白的DNA。融合基因裝配或插入表達(dá)載體轉(zhuǎn)染在其中表達(dá)的適當(dāng)受體細(xì)胞。
本發(fā)明也提供了鑒定增加基于抗體的融合蛋白的循環(huán)半衰期的突變的方法。該方法包括將一個(gè)或多個(gè)突變引入跨越基于抗體的融合蛋白Ig部分和非Ig部分的接合區(qū)。測定突變的融合蛋白的循環(huán)半衰期，優(yōu)選通過監(jiān)測其在體內(nèi)作用時(shí)間的血清水平。
在本發(fā)明的一個(gè)方案中，增加基于抗體的融合蛋白的循環(huán)半衰期的突變是減少蛋白酶切割實(shí)驗(yàn)中融合蛋白切割的突變，如實(shí)施例15中討論。優(yōu)選該突變跨越基于抗體的融合蛋白Ig部分和非Ig部分的接合區(qū)(例如，上面討論的接合區(qū)的突變)?？晒┻x擇地，該突變可以是融合蛋白中減少蛋白酶切割和增加融合蛋白循環(huán)半衰期的任何突變，如實(shí)施例16中描述。因此，本發(fā)明提供了一般在蛋白中和優(yōu)選在Ig-細(xì)胞因子融合蛋白中篩選突變的方法，以鑒定增加融合蛋白循環(huán)半衰期的突變。
通過下列非限制性實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明。這里使用的氨基酸數(shù)是指IgG1氨基酸序列。一個(gè)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解融合蛋白包括其它Ig蛋白中相應(yīng)的突變能有效增加它們的循環(huán)半衰期。
因此，這里提出的教導(dǎo)適用于其它Ig分子如IgG2，IgG3，IgG4，IgA，IgM，IgD或IgE。
實(shí)施例免疫細(xì)胞因子的表達(dá)載體在Gillies等，(1998)J.Immunol.1606195-6203中描述。編碼重鏈的人γ1基因中，通過引入一個(gè)沉默突變(TCC變?yōu)門CA)破壞位于翻譯終止密碼子上游280bp的XmaI限制性酶切位點(diǎn)。另一個(gè)沉默突變(TCT變?yōu)門CC)引入重鏈C末端賴氨酸上游Ser密碼三個(gè)殘基，產(chǎn)生序列TCC CCG GGT AAA(SEQ ID No.3)，其中含有一個(gè)新的XmaI位點(diǎn)[Lo at al.，(1998)Protein Engineering11495-500]。在化學(xué)合成構(gòu)建IL-2 cDNA，它含有一個(gè)新的獨(dú)特的PvuII限制性酶切位點(diǎn)[Gillies等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.891428-1432]。在表達(dá)載體中XmaI和PvuII位點(diǎn)是獨(dú)特的，它們利于位于CH3和IL-2 DNA的接合區(qū)的賴氨酸密碼子誘變。
用編碼期望突變的寡核苷酸雙鏈取代免疫細(xì)胞因子表達(dá)載體中的XmaI-PvuII片段獲得賴氨酸密碼子的置換或缺失。在這種情況下，重鏈和輕鏈可變區(qū)來自人源化KS抗體，識別稱作EpCAM(上皮細(xì)胞粘附分子)的人抗原。本發(fā)明使用的寡核苷酸雙鏈的序列列在下面，其中粗體密碼子編碼期望突變，斜體序列CCCGG和CAG分別是XmaI位點(diǎn)的粘末端和PvuII位點(diǎn)的平末端。帶5’羥基末端的寡核苷酸雙鏈用于連接XmaI-PvuII消化表達(dá)載體。使用帶5’羥基末端的寡核苷酸消除寡核苷酸雙鏈的自身連接。
1.)Lys置換為Ala5＇CCG GGT GCA GCA CCT ACT TCA AGT TCT ACA AAGAAA ACA CAG 3＇(SEQ ID NO4)3＇CA CGT CGT GGA TGA AGT TCA AGA TGT rTC TTT TGTGTC5＇(SEQ ID NO5)2.)Lys置換為Arg5＇CCG GGT AGG GCG CCA ACT TCA AGT TCT ACA AAGAAA ACA CAG 3＇(SEQ ID NO6)3＇CA TCC CGC GGT TGA AGT TCA AGA TGT TTC TTT TGTGTC 5＇(SEQ ID NO7)也通過沉默突變引入NarI限制性酶切位點(diǎn)(GGCGCC)以利于重組克隆的篩選。
3.)Lys的缺失5＇CCG GGT GCA CCT ACT TCA AGT TCT ACA AAG AAAACA CAG 3＇(SEQ ID NO8)3＇CA CGT GGA TGA AGT TCA AGA TGT TTC TTT TGT GTC5＇(SEQ ID NO9)4.)Lys置換為Gly5＇CCG GGT GGG GCC CCT ACT TCA AGT TCT ACA AAGAAA ACA CAG 3＇(SEQ ID NO10)3＇CA CCC CGG GGA TGA AGT TCA AGA TGT TTC TTT TGTGTC 5＇(SEQ ID NO11)也通過沉默突變引入ApaI限制性酶切位點(diǎn)(GGGCCC)以利于重組克隆的篩選。
5.)Lys置換為Leu5＇CCG GGT CTG GCG CCA ACT TCA AGT TCT ACA AAGAAA ACA CAG 3＇(SEQ ID NO12)3＇CA GAC CGC GGT TGA AGT TCA AGA TGT TTC TTT TGTGTC5＇(SEQ ID NO13)也通過沉默突變引入NarI限制性酶切位點(diǎn)(GGCGCC)以利于重組克隆的篩選。
6.)Lys置換為AlaAlaAla5＇CCG GGT GCA GCA GCT GCC CCA ACT TCA AGT TCTACA AAG AAA ACA CAG 3’(SEQ ID NO14)3＇CA CGT CGT CGA CGG GGT TGA AGT TCA AGA TGTTTC TTT TGT GTC5＇(SEQ ID NO15)7.)Lys置換為Cys5＇CCG GGTTGC GCACCA ACT TCA AGT TCT ACA AAGAAA ACA CAG 3＇(SEQ ID NO16)
3＇CAACG CGTGGT TGA AGT TCA AGA TGT TTC TTT TGTGTC5＇(SEQ ID NO17)也通過沉默突變引入FspI限制性酶切位點(diǎn)(TGCGCA)以利于重組克隆的篩選。
8.)Lys置換為Asp5＇CCG GGT GAC GCA CCA ACT TCA AGT TCT ACA AAGAAA ACA CAG 3＇(SEQ ID NO18)3＇CA CTG CGT GGT TGA AGT TCA AGA TGT TTC TTT TGTGTC 5＇(SEQ ID NO19)DNA測序證實(shí)含有l(wèi)ys密碼子的各種置換或缺失的重組基因構(gòu)建體。
9.)Lys置換為Cys，帶接頭連接下列接頭(寡核苷酸雙鏈)連接插入huKS-IL-2表達(dá)載體的SmaI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。編碼SphI限制性酶切位點(diǎn)的序列GCATGC利于含有接頭插入的重組體的篩選。
5＇G GCATGC GG 3＇3＇C CGT ACG CC 5＇接頭連接到SmaI位點(diǎn)(CCCGGG)后，融合蛋白接合處的序列變?yōu)镃 CCGGCA TGCGGG GGT AAA(SEQ ID NO20)(接頭序列下劃線)Pro Ala Cys Gly Gly Lys(SEQ ID NO21)因此，接頭在lys殘基的最初位置放入Cys殘基，可能形成二硫鍵。3個(gè)氨基酸殘基(AlaCysGly)推后最初Lys殘基。
10.)編碼6個(gè)氨基酸殘基的接頭下列接頭(寡核苷酸雙鏈)連接插入huKS-IL-2表達(dá)載體的SmaI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。序列GGATCC編碼BamHI限制性酶切位點(diǎn)，利于含有接頭插入的重組體的篩選。
5＇G GGT TCA GGA TCC GGA GG 3＇(SEQ ID NO22)3＇C CCA AGT CCT AGG CCT CC 5＇(SEQ ID NO23)接頭連接到SmaI位點(diǎn)后，融合蛋白接頭處的序列變?yōu)镻roGlySerGlySerGlyGlyGlyLys(SEQ ID NO24)，其中插入的6個(gè)氨基酸被下劃線。
11.)編碼11個(gè)氨基酸的接頭下列接頭(寡核苷酸雙鏈)連接插入huKS-IL-2表達(dá)載體的SmaI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。序列GGATCC編碼BamHI限制性酶切位點(diǎn)，利于含有接頭插入的重組體的篩選。
5＇G GGT TCA GGC TCT GGA TCA GGG TCC GGA TCC GG3＇(SEQID NO25)3＇C CCA AGT CCG AGA CCT AGT CCC AGG CCT AGG CC 5＇(SEQID NO26)接頭連接到SmaI位點(diǎn)后，融合蛋白接頭處的序列變?yōu)镻roGlySerGlySerGlySerGlySerGly SerGlyGlyLys(SEQ ID NO27)，其中插入的11個(gè)氨基酸被下劃線。
12.)Pro置換為Ala5＇CG CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCC GC 3＇(SEQ ID NO28)3＇TC TTC TCG GAG AGG GAC AGG CG 5＇(SEQ ID NO29)13.)Pro置換為Leu5＇CG CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCC CT 3＇(SEQ ID NO30)3＇TC TTC TCG GAG AGG GAC AGG GA 5＇(SEQ ID NO31)12.)Pro置換為Gly5＇CG CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCC GG 3＇(SEQ ID NO32)3＇TC TTC TCG GAG AGG GAC AGG CC 5＇(SEQ ID NO33)實(shí)施例4.hu14.18-(Lvs變?yōu)锳la)-IL-2 DNA的構(gòu)建為了表明Lys置換為AIa對抗體-IL-2融合蛋白藥代動力學(xué)的影響不限于huKS抗體，我們選擇了一個(gè)不同的抗體，人源化14.18(hu14.18)，它識別GD2，在許多人腫瘤細(xì)胞表面過度表達(dá)的神經(jīng)節(jié)苷脂。如上所述構(gòu)建hu14.18-(Lvs變?yōu)锳la)-IL-2的表達(dá)載體。實(shí)施例5.huKS-(Lys缺失)-TNFαDNA的構(gòu)建為了表明Lys殘基對抗體-IL-2融合蛋白藥代動力學(xué)的影響適用于其它細(xì)胞因子，我們選擇了一個(gè)不同的細(xì)胞因子TNFα。Nedwin等在Nucleic Acids Res.(1985)136361-6373中公開了TNFα的完整cDNA序列，Gillies等在Bioconjugate Chem.(1993)4230-235中也描述了抗體-TNFα的表達(dá)?？贵w-TNFα的融合接合處具有序列SerProGlyLys-ValArgSerSerSer(SEQ ID NO34)，其中Val是成熟TNFα的N末端殘基。為了與huKS-TNFα比較，用編碼Lys殘基缺失的誘變引物，采用套式(overlapping)PCR方法[Daugherty等，(1991)Nucleic Acids Res.192471-2476]構(gòu)建編碼huKS-(Lys缺失)-TNFα的DNA。因此所得huKS-(Lys缺失)-TNFα的表達(dá)載體編碼融合蛋白接合處的肽序列SerProGly-ValArgSerSerSer(SEQ ID NO35)。根據(jù)新發(fā)明的這個(gè)融合蛋白的另外修飾可以包括去除TNF氨基末端序列中的Arg殘基以進(jìn)一步降低接合區(qū)的總體電荷。實(shí)施例6.huKS-(EU)-(Lys變?yōu)锳la)-IL-2 DNA的構(gòu)建上面實(shí)施例中提及的所有抗體-細(xì)胞因子融合蛋白都基于骨髓瘤H鏈代表的某個(gè)異型人IgG1，KOL。為了表明Lys置換為Ala對抗體-IL-2融合蛋白藥代動力學(xué)的影響不限于KOL，我們選擇了一個(gè)骨髓瘤H鏈代表的不同IgG1異型，EU。EU異型在恒定區(qū)中3個(gè)氨基酸殘基與KOL異型不同。EU異型在CH1末含有Lys-229，在CH3起始含有Asp-356和Leu-358。KOL異型在相應(yīng)位置含有Arg-229，Glu-356和Met-358。采用套式PCR方法，通過誘變KOL DNA得到編碼EU異型的DNA。然后，用所得EU DNA取代KOL DNA相應(yīng)片段產(chǎn)生生產(chǎn)huKS-(EU)-(Lys變?yōu)锳la)-IL-2的表達(dá)載體。實(shí)施例7.細(xì)胞轉(zhuǎn)染和蛋白表達(dá)對于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，使用Lipofectamine Plus(Life Technologies，Gaithersburg，MD)根據(jù)供應(yīng)商的方案通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染將質(zhì)粒導(dǎo)入嬰倉鼠腎(BHK)。
為了得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆，電穿孔將質(zhì)粒DNA導(dǎo)入小鼠骨髓瘤NS/0細(xì)胞。NS/0細(xì)胞在補(bǔ)充10％胎牛血清，2mM谷酰胺和青霉素/鏈霉素的Dulbecco改良Eagle＇s培養(yǎng)基中生長。約5×106個(gè)細(xì)胞用PBS洗滌一次，并重懸于0.5ml PBS中。然后，10μg線性質(zhì)粒DNA與細(xì)胞在基因脈沖小室(0.4cm電極間距，BioRad)中在冰上孵育10分鐘。用基因脈沖標(biāo)記儀(BioRad，Hercules，CA)電穿孔，設(shè)置在0.25V和500μF。允許細(xì)胞復(fù)蘇10分鐘。在冰上，它們重懸于生長培養(yǎng)基中后，接著鋪在兩個(gè)96孔板上。在轉(zhuǎn)染后兩天加入的100nM氨甲喋呤(MTX)存在下生長篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆。每隔3天飼養(yǎng)細(xì)胞兩到三次以上，在2至3周出現(xiàn)抗MTX克隆?？笷c-ELISA檢測克隆的上清，鑒定高產(chǎn)量者。分離產(chǎn)量高細(xì)胞，在含100nM氨甲喋呤的生長培養(yǎng)基中繁殖。
對于凝膠電泳測定常規(guī)特性，在蛋白A瓊脂糖(Protein ASepharose)(Repligen，Cambridge，MA)上捕獲在條件培養(yǎng)基中的抗體-細(xì)胞因子融合蛋白，然后在煮沸含或不含2-巰基乙醇的蛋白樣本緩沖液中洗脫。在SDS凝膠電泳后，考馬斯染色顯影蛋白條帶。在SDS-PAGE上，抗體重鏈-IL-2和輕鏈分別具有明顯大約67和28kD的MW。
對于純化，在硫酸鈉緩沖液(100mM NaH2PO4，pH3，和150mMNaCl)中洗脫結(jié)合在蛋白A瓊脂糖(Protein A Sepharose)上的融合蛋白。然后用0.1N NaOH立即中和這些洗脫液。
實(shí)施例8.ELISA步驟用ELISA測定抗MTX克隆和其它檢測樣本上清中蛋白產(chǎn)物的濃度。抗huFc ELISA由使用山羊抗人IgG(抗重鏈和輕鏈)的捕獲步驟和使用辣根過氧化物酶-偶聯(lián)山羊抗人IgG特異性的F(ab’)2片段的檢測步驟組成。因此，抗huFc ELISA測定作為單獨(dú)抗體或作為細(xì)胞因子融合蛋白的人IgG。為了確定完整抗體-IL-2融合蛋白的濃度，使用IL-2檢測ELISA。它由使用山羊抗人IgG(抗重鏈和輕鏈)的相同捕獲步驟組成，但檢測步驟使用直接抗IL-2的檢測抗體。在有些實(shí)驗(yàn)中，用EPCAM代替捕獲抗體KS-IL-2檢測融合蛋白，因?yàn)镵S抗體識別EPCAM。在有些實(shí)驗(yàn)中，使用市售人IL-2 ELISA檢測試劑盒(R&D Systems)。包括IL-2檢測抗體的所有不同ELISA步驟得到相似的結(jié)果。然而，如比較圖1A和圖1B可見到的，在較后的藥代動力學(xué)時(shí)間點(diǎn)中IL-2免疫反應(yīng)材料與人Fc免疫反應(yīng)材料相比，存在進(jìn)行性損失。這個(gè)作用在藥代動力學(xué)性能最差的融合蛋白最顯著。
抗huFc ELISA在下面詳細(xì)描述。
A.包被平板用5μg/ml AffiniPure山羊抗人IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA)的PBS包被ELISA板，96孔板(Nunc-Immuno plate Maxisorp)中每孔100μl。蓋上包被的平板并在4℃孵育過夜。然后，用0.05％ Tween(Tween 20)的PBS洗滌平板4次，用1％BSA/1％山羊血清的PBS封閉。與封閉緩沖液在37℃孵育2小時(shí)后，用0.05％ Tween的PBS洗滌4次平板，在紙巾上輕打干燥。
B.檢測樣本和二抗的孵育檢測樣本在樣本緩沖液中稀釋至適當(dāng)濃度，樣本緩沖液是含有1％BSA/1％山羊血清/0.05％ Tween的PBS。用嵌合抗體(帶有人Fc)制得標(biāo)準(zhǔn)曲線，抗體濃度已知。為了制得標(biāo)準(zhǔn)曲線，對樣本緩沖液做系列稀釋得到范圍從125ng/mL至3.9ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線。稀釋的樣本和標(biāo)準(zhǔn)加入平板，每孔100μl，平板在37℃孵育2小時(shí)。孵育后，用0.05％ Tween的PBS洗滌平板8次。然后每孔加入100μl二抗，辣根過氧化物酶-偶聯(lián)山羊抗人 IgG F(ab’)2片段，F(xiàn)c特異性片段(Jackson Immuno Research)，稀釋至樣本緩沖液中大約1∶120,000。確定每批HRP耦聯(lián)抗人IgG的二抗的精確稀釋度。在37℃孵育2小時(shí)后，用0.05％ Tween的PBS洗滌平板8次。
C.顯影底物溶液加入平板，每孔100μl。30mg OPD(O-苯二胺二鹽酸鹽，1片)溶于15mL 0.025M檸檬酸/0.05M Na2HPO4緩沖液中，pH5，它含有0.03％新鮮加入的H2O2，制備得到底物溶液。允許顏色在室溫黑暗中顯影30分鐘。顯影時(shí)間改變，依賴于每批和每批包被平板、二抗等的可變性。觀察標(biāo)準(zhǔn)曲線中顏色顯影以確定何時(shí)停止反應(yīng)。加入4N H2SO4終止反應(yīng)，每孔100μl。平板閱讀器閱讀平板，設(shè)置490和650nm，編程從490nm OD中減去650nm的背景OD。實(shí)施例9.融合蛋白接合處帶有改變的抗體-細(xì)胞因子融合蛋白的藥代動力學(xué)行為給Balb/c小鼠靜脈內(nèi)注射后檢測融合蛋白的藥代動力學(xué)行為。后眼眶出血收集小鼠血液，Eppendorf微離心管中保存在4℃。有些情況下，用兩種不同的ELISA方法在各種時(shí)間點(diǎn)測定血液中存留的人抗體的量和第二個(gè)融合的非Ig蛋白的量?？晒┻x擇地，Western雜交分析藥代動力學(xué)時(shí)間點(diǎn)推斷非Ig部分的存在。
使用在前實(shí)施例中描述的技術(shù)，給小鼠注射KS(γl)-IL-2融合成熟蛋白，確定對血清半衰期的影響。有些結(jié)果在圖1和圖2中顯示。此外，測定抗體具有不同結(jié)合特異性的IgG(γl)-IL-2融合的抗體重鏈C末端賴氨酸缺失的影響。14.18(Lys→Ala)-IL-2的藥代動力學(xué)性能優(yōu)于14.18-IL-2，程度類似KS(Lys→Ala)-IL-2與KS-IL-2相比提高的程度。
對于抗體-IL-2融合，影響重鏈C末端賴氨酸的突變對藥代動力學(xué)特性的影響等級是(從最好至最差)Lys→Leu～Lys→Ala～Lys→Ala3＞Lys→(缺失)＞Lys→Asp～Lys→Gly＞Lys→(無改變)～Lys→Cys＞Lys→Arg。
與KS-TNFα相比，KS(Lys→缺失)-TNFα的藥代動力學(xué)特性明顯提高(圖3)。KS-TNFα融合蛋白的藥代動力學(xué)曲線罕見，因?yàn)楫?dāng)用Fc ELISA測定人抗體水平時(shí)，在前30分鐘內(nèi)，被檢蛋白水平急劇下跌，隨后人Fc反應(yīng)性材料水平緩慢增加。這個(gè)作用可重復(fù)性高。
當(dāng)用Western雜交分析藥代動力學(xué)樣本時(shí)，發(fā)現(xiàn)人Fc交叉反應(yīng)材料是完整抗體的形式；TNF部分已被切掉和丟失。然而，C末端賴氨酸缺失的KS-TNFα融合蛋白的類似分析表明這個(gè)蛋白主要以完整形式幸存，TNF仍存在。
此外，KS-TNFα融合蛋白表達(dá)，其中成熟TNFα序列的前八個(gè)氨基酸缺失。缺失的KS-TNFα融合蛋白的藥代動力學(xué)特性優(yōu)于具有完整成熟TNF序列的相應(yīng)蛋白。這可能是由于在成熟TNF+2位點(diǎn)的增加接合區(qū)疏水性的帶電荷Arg殘基被去除。
KOL至EU，改變重鏈恒定區(qū)KS(Lys→Ala)-IL-2和KS-IL-2對二者任何一個(gè)蛋白的藥代動力學(xué)特性無影響。
總之，這些結(jié)果表明接合處突變引起Ig融合蛋白藥代動力學(xué)特性的明顯提高。在多種抗體，和多種Ig蛋白與Ig部分融合中可見到這個(gè)作用。實(shí)施例10.組合融合接合處Ig型從γ1變?yōu)棣?的突變導(dǎo)致FcRp單獨(dú)作用的血清半衰期協(xié)同增加人γ4 Fc區(qū)與Fc受體結(jié)合差。結(jié)果，包含γ4 Fc區(qū)的融合蛋白與具有γ1鏈的融合蛋白相比，通常具有優(yōu)越的藥代動力學(xué)特性。為了探尋接合處突變是否通過對Fc受體的相互作用，F(xiàn)cRp的相互作用，或二者兼有而影響藥代動力學(xué)，檢測FcRP正?；蛉毕莸男∈蠛谢虿缓雍咸幫蛔兊暮?和γ4融合蛋白的藥代動力學(xué)特性。這些藥代動力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果在圖2顯示。
圖2顯示了KS(γl)-IL-2融合蛋白，KS(γ4)-IL-2融合蛋白，KS(γl)(Lys變?yōu)锳la)-IL-2融合蛋白和KS(γ4)(Lys變?yōu)锳la)-IL-2融合蛋白的藥代動力學(xué)行為。檢測了正常小鼠和β2微球蛋白缺陷的突變小鼠。
這些數(shù)據(jù)表明，在正常小鼠中，通過在抗體部分C末端導(dǎo)入Lys變?yōu)锳la的突變，提高了IgG-γ1抗體-IL-2融合蛋白的藥代動力學(xué)特性。類似地，抗體部分C末端導(dǎo)入Lys變?yōu)锳la的突變，提高了IgG-γ4抗體-IL-2融合蛋白的藥代動力學(xué)特性。這些數(shù)據(jù)表明接合處突變能提高由于Fc受體結(jié)合下降造成藥代動力學(xué)改善的融合蛋白的藥代動力學(xué)特性。
圖2也顯示了給FcRp的主要亞單位-β2微球蛋白缺乏的突變小鼠注射相同蛋白的藥代動力學(xué)特性(Junghans和Anderson，Proc.NatAcad.Sci.(1996)935512-5516)。因此，這些突變小鼠FcRp活性缺陷。結(jié)果，這種突變小鼠的抗體分解代謝比正常小鼠快大約10倍。
圖2的數(shù)據(jù)表明β2微球蛋白突變小鼠中KS(γl)-IL-2抗體，KS(γ1)-IL-2融合蛋白，KS(γ4)-IL-2融合蛋白，KS(γ1)(Lys變?yōu)锳la)-IL-2融合蛋白和KS(γ4)(Lys變?yōu)锳la)-IL-2融合蛋白的分解代謝均比野生型小鼠更快。然而，兩個(gè)小鼠株中這些蛋白的血清半衰期的相對順序也如是未融合抗體的藥代動力學(xué)最好，其后是KS(γ4)(Lys變?yōu)锳la)-IL-2融合蛋白，KS(γl)(Lys變?yōu)锳la)-IL-2融合蛋白，KS(γ4)-IL-2融合蛋白，KS(γ1)-IL-2融合蛋白的藥代動力學(xué)特性最差。如果接合處突變僅僅通過改變?nèi)诤系鞍着cFcRp的相互作用才具有其作用的話，那么FcRP功能不存在時(shí)，接合處突變應(yīng)該對藥代動力學(xué)沒有影響。實(shí)施例11.完整抗體接合區(qū)突變對血清半衰期沒有影響改造C末端賴氨酸變?yōu)楸彼?，使編碼完整未融合的KS抗體重鏈的基因突變。用上述方法表達(dá)并純化野生型和突變型KS，比較藥代動力學(xué)特性。發(fā)現(xiàn)野生型和突變抗體的藥代動力學(xué)行為不能區(qū)別。實(shí)施例12.含或不含融合接合處突變的抗體融合蛋白的Fc受體結(jié)合使用標(biāo)準(zhǔn)步驟，檢測KS-IL-2和KS(K-A)-IL-2與Fc受體的結(jié)合。沒有發(fā)現(xiàn)突變的作用。如上述表達(dá)和純化融合蛋白，檢測它們結(jié)合固定的表達(dá)Fc受體的J774細(xì)胞的能力。結(jié)果在圖4中顯示。實(shí)施例13.用含有接合處突變的抗體-細(xì)胞因子融合蛋白治療哺乳動物結(jié)腸癌為了檢測接合處突變的抗體-細(xì)胞因子融合蛋白對于治療哺乳動物結(jié)腸癌是否有優(yōu)勢，實(shí)施下列實(shí)驗(yàn)。CT26是來自Balb/C小鼠的結(jié)腸癌細(xì)胞系。通過標(biāo)準(zhǔn)基因工程技術(shù)，改造該細(xì)胞系表達(dá)能被KS抗體識別的抗原-人上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)；這些細(xì)胞術(shù)語稱作CT26/EpCAM細(xì)胞(Gillies等，Journal of Immunology(1998)1606195-6203)。
Balb/C小鼠皮下接種2×106CT26/EpCAM細(xì)胞。當(dāng)腫瘤達(dá)到大約50-200立方毫米體積時(shí)，將小鼠隨機(jī)分為7只小鼠的三組進(jìn)行進(jìn)一步研究。在第0天，用PBS，大約10微克含IgGl重鏈(KS-IL2γl)的KS-IL2，或前面實(shí)施例中描述的大約10微克含IgGl重鏈和Lys突變?yōu)锳la的KS-IL2(KS-IL2γl[Lys變?yōu)锳la])處理帶腫瘤小鼠。給小鼠靜脈內(nèi)注射，每天一次，共五天。用測徑器測量腫瘤大小。
一個(gè)這種實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在圖5中顯示。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，KS-IL2γl使很多但不是所有腫瘤的體積明顯減小。在7只KS-IL2γl處理的動物中有6只，在第21天腫瘤仍可測量。然而，KS-IL2γl[Lys變?yōu)锳la]處理的動物，腫瘤萎縮，以致到第21天，所有7只動物的腫瘤均不能測量，到第16天，7只小鼠只有2只具有可測量的腫瘤。在圖5中，黑色菱形表示在第0，1，2，3和4天，作為對照的用PBS注射小鼠的平均腫瘤體積。實(shí)心圓表示用10微克KS-IL2γl處理小鼠的平均腫瘤體積。進(jìn)行靜脈內(nèi)注射。x軸表示首次注射后過去的天數(shù)；y軸以立方毫米表示平均腫瘤體積。實(shí)施例14.用含接合處突變的抗體-細(xì)胞因子融合蛋白處理的哺乳動物的轉(zhuǎn)移抑制為了檢測抗體-細(xì)胞因子融合蛋白是否能夠抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移生長，實(shí)施下列實(shí)驗(yàn)。Lewis肺癌(LLC)是來自C57/B16小鼠的肺腫瘤細(xì)胞系。通過標(biāo)準(zhǔn)基因工程技術(shù)，改造該細(xì)胞系表達(dá)能被KS抗體識別的抗原-人上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)；這些細(xì)胞術(shù)語稱作LLC/EpCAM細(xì)胞。
C57/B16小鼠靜脈內(nèi)注射1×106LLC/EpCAM細(xì)胞。五天后，小鼠隨機(jī)分為6只小鼠的三組，并用PBS，大約20微克KS-IL2，或大約20微克KS-Ala-IL2(Ig部分C末端Lys變?yōu)锳la的KS-IL2])處理。第24天對轉(zhuǎn)移定量。如下表表示，PBS處理組大量轉(zhuǎn)移至肺。用KS-γl-IL2處理的動物轉(zhuǎn)移數(shù)量明顯降低。然而，用KS-γl-Ala-IL2處理的動物比用KS-γl-IL2處理的動物轉(zhuǎn)移更少，有一只動物根本沒有檢測到轉(zhuǎn)移。
處理組轉(zhuǎn)移數(shù)量肺重量(g)PBS＞250，＞250，＞250，＞250， 0.92+/-0.14＞250，＞250KS-yl-IL2 62，37，18，17，11，9 0.27+/-0.04KS-yl-Ala-IL2 4，4，3，3，1，0 0.25+/-0.02總之，實(shí)施例13和14闡明了抗體-細(xì)胞因子融合蛋白能抑制發(fā)生轉(zhuǎn)移和原發(fā)部位腫瘤細(xì)胞生長。此外，結(jié)果表明抗體-細(xì)胞因子融合蛋白能抑制各種不同腫瘤類型，如結(jié)腸癌和肺癌造成的疾病。此外，按照本發(fā)明的接頭區(qū)至少一個(gè)氨基酸改變的抗體-細(xì)胞因子融合蛋白比接頭區(qū)無氨基酸改變的抗體-細(xì)胞因子融合蛋白在抑制轉(zhuǎn)移和腫瘤生長中更有效。實(shí)施例15.接合處突變抵抗蛋白酶的抗體融合蛋白的試驗(yàn)為了探尋接合處突變的抗體-細(xì)胞因子融合蛋白對蛋白酶消化更敏感或更不敏感，用各種蛋白酶在各種時(shí)間處理純化的KS-IL2和KS-Ala-IL2，用SDS-PAGE分析所得產(chǎn)物。
在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用0.1mU或0.4mU Cathepsin D(Enzyme Systems，Livermore，California)對4微克KS-IL2和KS-Ala-IL2在37℃處理大約16小時(shí)并用SDS-PAGE分析。使用根據(jù)制造商指導(dǎo)的緩沖液條件。當(dāng)用0.4mU Cathepsin D處理KS-IL2時(shí)，大約50％ KS-IL2重鏈轉(zhuǎn)換為多種較低分子量的形式。主要消化產(chǎn)物具有稍低于KS-IL2重鏈但遠(yuǎn)大約KS重鏈的分子量。這個(gè)結(jié)果表明大多數(shù)Cathepsin D切割不在重鏈-IL2接合處發(fā)生。
相反，當(dāng)KS-Ala-IL2與0.4mU Cathepsin D在相同條件下孵育時(shí)，Cathepsin D切割的程度大大降低，主要可檢測到一條具有主要KS-IL2降解產(chǎn)物分子量的條帶。
在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用25mU或50mU Cathepsin L(EnzymeSystems，Livermore，California)對4微克KS-IL2和KS-Ala-IL2在37℃處理大約16小時(shí)并用SDS-PAGE分析。使用根據(jù)制造商指導(dǎo)的緩沖液條件。當(dāng)用50mU Cathepsin L處理KS-IL2時(shí)，幾乎所有KS-IL2重鏈轉(zhuǎn)換為多種較低分子量的形式。主要消化產(chǎn)物的分子量與KS重鏈大約相等。這個(gè)結(jié)果表明大多數(shù)Cathepsin L切割在重鏈-IL2接合處附近或在重鏈-IL2接合處發(fā)生。
相比之下，當(dāng)KS-Ala-IL2與50mU Cathepsin L在相同條件下孵育時(shí)，Cathepsin L切割的程度大大降低，一條具有主要KS-IL2降解產(chǎn)物分子量的條帶仍是觀察到的主要分子量種。
在第三個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用0.04mU，0.1mU或0.2mU纖溶酶(Sigma，St.Louis，Minnesota)對4微克KS-IL2和KS-Ala-IL2在37℃處理大約16小時(shí)并用SDS-PAGE分析。使用根據(jù)制造商指導(dǎo)的緩沖液條件。當(dāng)用0.04mU纖溶酶處理KS-IL2時(shí)，大約3/4KS-IL2重鏈轉(zhuǎn)換為較低分子量的形式，具有比KS重鏈多大約30個(gè)氨基酸的明顯分子量。當(dāng)用0.2mU纖溶酶處理KS-IL2時(shí)，基本所有的KS-IL2重鏈轉(zhuǎn)換為較低分子量的形式，具有比KS重鏈多大約30個(gè)氨基酸的明顯分子量。這些結(jié)果表明纖溶酶切割KS-IL2在接近重鏈-IL2接合處發(fā)生，但不在重鏈-IL2接合處。
相比之下，當(dāng)KS-Ala-IL2與0.04mU纖溶酶在相同條件下孵育時(shí)，纖溶酶切割的程度幾乎檢測不到。當(dāng)KS-Ala-IL2與0.02mU纖溶酶孵育時(shí)，檢測到一些未切割的產(chǎn)物。此外，當(dāng)用纖溶酶切割KS-Ala-IL2時(shí)，比KS-IL2重鏈多大約90個(gè)氨基酸分子量大小的種蓄積到明顯程度；用纖溶酶消化KS-IL2，這個(gè)+90種可能被切割為較低分子量+30種，因此不那蓄積。然而，Lys突變?yōu)锳la使完整KS-IL2在纖溶酶存在下明顯穩(wěn)定。每種情況下，在所用條件下，抗體輕鏈不被切割。
總之，這些結(jié)果表明Lys突變?yōu)锳la使普遍抵抗蛋白酶切割，甚至對于不在突變部位的切割。不受任何特定理論的限制，Lys突變?yōu)锳la可使KS的IL-2部分變得更加抵抗蛋白酶。蛋白酶可能在抗體融合蛋白的藥代動力學(xué)特性中起著重要的作用。例如，當(dāng)抗體融合蛋白被含有Fc受體的細(xì)胞接受并運(yùn)輸?shù)皆缙趦?nèi)體，可能抗體部分抵抗使用的蛋白水解條件，但融合伙伴部分更敏感，導(dǎo)致抗體融合蛋白部分或全部消化。實(shí)施例16.使用蛋白酶消化估計(jì)抗體融合蛋白的突變這個(gè)實(shí)施例提供了提高蛋白藥代動力學(xué)特性的一般方法。檢測蛋白的藥代動力學(xué)特性及其對蛋白酶的敏感性。產(chǎn)生變異體蛋白并檢測對蛋白水解的抵抗。然后檢測那些對蛋白水解抵抗增強(qiáng)的變異體的藥代動力學(xué)特性。發(fā)現(xiàn)藥代動力學(xué)特性提高的抵抗蛋白水解蛋白的比例高于變異體蛋白占總體的比例。一些藥代動力學(xué)特性提高的變異體蛋白具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換，這種置換經(jīng)檢測編碼序列可推斷不能引起蛋白結(jié)構(gòu)的深刻改變，例如導(dǎo)入N連接糖基化位點(diǎn)。
變異體蛋白的產(chǎn)生可以通過例如表達(dá)構(gòu)建體誘變并分離表達(dá)各個(gè)變異體蛋白的克隆。使用各種誘變技術(shù)的任何一個(gè)，包括定點(diǎn)誘變，隨機(jī)誘變，PCR誘變和從相關(guān)序列產(chǎn)生雜種序列的誘變技術(shù)。
對于這些試驗(yàn)，使用細(xì)胞內(nèi)蛋白酶有效，如內(nèi)體蛋白酶。不受任何特定理論的限制，據(jù)信某些蛋白，尤其是不被腎過濾清除的蛋白的藥代動力學(xué)由胞吞發(fā)生蛋白水解決定。
使用細(xì)胞外蛋白酶，如胰蛋白酶、糜蛋白酶、其它消化蛋白酶、其它血清蛋白酶如凝集因子和組織特異性蛋白酶也有效。例如，使用腫瘤特異性蛋白酶檢測突變體蛋白，鑒定藥代動力學(xué)特性和在腫瘤微環(huán)境內(nèi)穩(wěn)定性提高的變異體。在另一個(gè)實(shí)施例中，檢測待口服傳送的蛋白對胃腸道存在的酶的抵抗性，如胰蛋白酶和糜蛋白酶。發(fā)現(xiàn)對胃腸道酶抵抗性增強(qiáng)的變異體蛋白的藥代動力學(xué)特性提高，如AUC(曲線下的面積)更大。
例如，誘變產(chǎn)生編碼含有部分或全部抗體的融合蛋白的表達(dá)構(gòu)建體。產(chǎn)生克隆，表達(dá)相應(yīng)的蛋白，獨(dú)立或以小量混合檢測蛋白對蛋白酶的相對敏感性。然后檢測蛋白酶抵抗性增強(qiáng)的變異體抗體融合蛋白的藥代動力學(xué)特性，大量抵抗蛋白酶的抗體融合蛋白突變體的藥代動力學(xué)特性提高。測序編碼提高的變異體融合蛋白的核酸，發(fā)現(xiàn)一些提高的變異體在除融合蛋白接合處之外的位點(diǎn)含有突變，引起抵抗蛋白水解增強(qiáng)和藥代動力學(xué)提高的表型。
等同物本發(fā)明可以以其它特殊形式體現(xiàn)而不背離其精神或主要特性。因此認(rèn)為前述方案在所有方面闡述這里描述的本發(fā)明，而不是限制它。因此本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求表示，而不由前述說明書表示，而且意指其中包含權(quán)利要求等同的意思和范圍內(nèi)的所有改變。
引入?yún)⒖嘉墨I(xiàn)這里公開的每篇專利文件和科技出版物以其完整形式通過參考文獻(xiàn)引入本申請中。
序列表<110>Lexigen Pharmaceuticals Corp.<120>增加基于抗體的融合蛋白的循環(huán)半衰期<130>LEX-011PC<150>US 60/181,768<151>2000-02-11<160>35<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>Ig-IL-2接合區(qū)序列<400>1Ser Pro Gly Lys Ala Pro Thr1 5<210>2<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>Ig C-末端序列<400>2Ser Pro Gly Lys1<210>3<211>12<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成序列<400>3tccccgggta aa 12<210>4<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成序列<400>4ccgggtgcag cacctacttc aagttctaca aagaaaacac ag42<210>5<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成序列<400>5ctgtgttttc tttgtagaac ttgaagtagg tgctgcac 38<210>6<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成序列<400>6ccgggtaggg cgccaacttc aagttctaca aagaaaacac ag42<210>7<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成序列<400>7ctgtgttttc tttgtagaac ttgaagttgg cgccctac 38<210>8<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成序列<400>8ccgggtgcac ctacttcaag ttctacaaag aaaacacag39<210>9<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成序列<400>9ctgtgttttc tttgtagaac ttgaagtagg tgcac35<210>10<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成序列<400>10ccgggtgggg cccctacttc aagttctaca aagaaaacac ag42<210>11<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成序列<400>11ctgtgttttc tttgtagaac ttgaagtagg ggccccac 38<210>12<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成序列<400>12ccgggtctgg cgccaacttc aagttctaca aagaaaacac ag42<210>13<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成序列<400>13ctgtgttttc tttgtagaac ttgaagttgg cgccagac 38<210>14<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成序列<400>14ccgggtgcag cagctgcccc aacttcaagt tctacaaaga aaacacag 48<210>15<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成序列<400>15ctgtgttttc tttgtagaac ttgaagttgg ggcagctgct gcac 44<210>16<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成序列<400>16ccgggttgcg caccaacttc aagttctaca aagaaaacac ag42<210>17<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成序列<400>17ctgtgttttc tttgtagaac ttgaagttgg tgcgcaac 38<210>18<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成序列<400>18ccgggtgacg caccaacttc aagttctaca aagaaaacac ag42<210>19<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成序列<400>19ctgtgttttc tttgtagaac ttgaagttgg tgcgtcac 38<210>20<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成序列<220><221>CDS<222>(2)..(19)<400>20c ccg gca tgc ggg ggt aaa 19Pro Ala Cys Gly Gly Lys1 5<210>21<211>6<212>PRT<213>人工序列<400>21Pro Ala Cys Gly Gly Lys1 5<210>22<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成序列<400>22gggttcagga tccggagg 18<210>23<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成序列<400>23cctccggatc ctgaaccc 18<210>24<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成序列<400>24Pro Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Lys1 5<210>25<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成序列<400>25gggttcaggc tctggatcag ggtccggatc cgg 33<210>26<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成序列<400>26ccggatccgg accctgatcc agagcctgaa ccc 33<210>27<211>14<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成序列<400>27Pro Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Lys1 5 10<210>28<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成序列<400>28cgcagaagag cctctccctg tccgc 25<210>29<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成序列<400>29gcggacaggg agaggctctt ct 22<210>30<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成序列<400>30cgcagaagag cctctccctg tccct 25<210>31<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成序列<400>31agggacaggg agaggctctt ct 22<210>32<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成序列<400>32cgcagaagag cctctccctg tccgg 25<210>33<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成序列<400>33ccggacaggg agaggctctt ct 22<210>34<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>Ig-TNF接合區(qū)序列<400>34Ser Pro Gly Lys Val Arg Ser Ser Ser1 5<210>35<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>Ig-(缺失Lys)-TNF融合序列<400>35Ser Pro Gly Val Arg Ser Ser Ser1 權(quán)利要求
1.一種基于抗體的融合蛋白，其包含通過接合點(diǎn)連接非Ig蛋白之免疫球蛋白(Ig)鏈，其中所述基于抗體的融合蛋白在所述Ig鏈或所述非Ig蛋白中包含從所述接合點(diǎn)的10個(gè)氨基酸內(nèi)的氨基酸改變，其中所述基于抗體的融合蛋白與無所述氨基酸改變的相應(yīng)基于抗體的融合蛋白相比，具有較長的體內(nèi)循環(huán)半衰期。
2.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中氨基酸改變增加了所述基于抗體的融合蛋白的疏水性。
3.權(quán)利要求1或2的融合蛋白，其中所述Ig鏈位于所述非Ig蛋白的N末端。
4.權(quán)利要求1、2或3的融合蛋白，其中所述改變改變了Ig鏈的C末端氨基酸。
5.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述非Ig蛋白是分泌蛋白。
6.權(quán)利要求5的融合蛋白，其中所述非Ig蛋白是所述分泌蛋白的成熟形式。
7.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中Ig鏈包含部分Ig重鏈。
8.權(quán)利要求7的基于抗體的融合蛋白，其中所述Ig鏈包含至少IgG2或IgG4恒定區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域。
9.權(quán)利要求7的基于抗體的融合蛋白，其中所述Ig鏈至少包含選自Leu234，Leu235，Gly236，Gly237，Asn297和Pro331中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的突變或缺失的部分IgG1恒定區(qū)。
10.權(quán)利要求7的基于抗體的融合蛋白，其中所述Ig鏈至少包含選自Leu281，Leu282，Gly283，Gly284，Asn344和Pro378中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的突變或缺失的部分IgG3恒定區(qū)。
11.權(quán)利要求7的基于抗體的融合蛋白，其中所述Ig鏈具有免疫球蛋白保護(hù)受體的結(jié)合親和力。
12.權(quán)利要求7的基于抗體的融合蛋白，其中所述Ig鏈對選自FcγRI、FcγRII和FcγRIII的Fc受體結(jié)合親和力明顯降低。
13.權(quán)利要求7的基于抗體的融合蛋白，其中所述非Ig蛋白選自細(xì)胞因子、配體結(jié)合蛋白和蛋白毒素。
14.權(quán)利要求13的基于抗體的融合蛋白，其中所述細(xì)胞因子選自腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素和淋巴因子。
15.權(quán)利要求14的基于抗體的融合蛋白，其中所述腫瘤壞死因子是腫瘤壞死因子α。
16.權(quán)利要求14的基于抗體的融合蛋白，其中所述白細(xì)胞介素是白細(xì)胞介素-2。
17.權(quán)利要求14的基于抗體的融合蛋白，其中所述淋巴因子是淋巴毒素或集落刺激因子。
18.權(quán)利要求11的基于抗體的融合蛋白，其中所述集落刺激因子是粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子。
19.權(quán)利要求13的基于抗體的融合蛋白，其中所述配體結(jié)合蛋白選自CD4，CTLA-4，TNF受體和白細(xì)胞介素受體。
20.一種增加基于抗體的融合蛋白的循環(huán)半衰期的方法，所述蛋白具有通過接合點(diǎn)連接非Ig蛋白之Ig鏈，該方法包括在所述接合點(diǎn)或接合點(diǎn)附近置換、缺失、插入或其它改變氨基酸的步驟。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述融合蛋白包含部分重鏈。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述融合蛋白至少包含IgG2或IgG4恒定區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域。
23.權(quán)利要求20、21或22的方法，其中所述融合蛋白包含具有影響與Fc保護(hù)受體相互作用的突變的重鏈部分。
24.所述Ig鏈和所述非Ig蛋白之間包含接頭的權(quán)利要求1的融合蛋白。
25.權(quán)利要求4、5、6或7的融合蛋白，其中所述改變是一個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換。
26.一種基于抗體的融合蛋白，其包含a)包含Ig鏈的第一種多肽，和b)包含非Ig蛋白的第二種多肽，其中所述第一種多肽與所述第二種多肽連接產(chǎn)生具有至少一個(gè)突變的接合區(qū)，且其中所述融合蛋白比接合區(qū)無所述突變的融合蛋白具有更長的循環(huán)半衰期。
27.權(quán)利要求26的融合蛋白，其中所述突變在所述第一種多肽的C末端部分。
28.權(quán)利要求26的融合蛋白，其中所述突變在所述第二種多肽的N末端部分。
29.權(quán)利要求26的融合蛋白，包含所述第一種多肽C末端部分的第一個(gè)突變和所述第二種多肽N末端部分第二個(gè)突變。
30.權(quán)利要求27或29的融合蛋白，其中所述C末端部分包含所述第一種多肽的1和100之間的C末端氨基酸。
31.權(quán)利要求30的融合蛋白，其中所述C末端部分包含所述第一種多肽的1和10之間的C末端氨基酸。
32.權(quán)利要求28或29的融合蛋白，其中所述N末端部分包含所述第二種多肽的1和100之間的N末端氨基酸。
33.權(quán)利要求32的融合蛋白，其中所述N末端部分包含所述第二種多肽的1和10之間的N末端氨基酸。
34.權(quán)利要求26的融合蛋白，其中所述Ig是IgG1。
35.權(quán)利要求26的融合蛋白，其中所述突變選自點(diǎn)突變、缺失、插入和重排。
36.權(quán)利要求34的融合蛋白，其中所述第一種多肽C末端殘基突變?yōu)闊o可離子化側(cè)鏈的氨基酸。
37.權(quán)利要求36的融合蛋白，其中所述C末端殘基是非賴氨酸的氨基酸。
38.權(quán)利要求26的融合蛋白，其中所述接合區(qū)由第一種多肽C末端區(qū)和所述第二種多肽的N末端區(qū)組成，且其中所述突變存在于所述C末端和N末端區(qū)之一。
39.權(quán)利要求26的融合蛋白，其中接合區(qū)包含間隔肽或接頭肽。
40.權(quán)利要求39的融合蛋白，其中所述突變由所述第一種和第二種多肽間存在間隔肽或接頭肽組成。
41.權(quán)利要求26的融合蛋白，其中所述突變是在不與FcR或FcRp相互作用的區(qū)域。
42.一種鑒定突變的方法，所述突變增加具有Ig部分和非Ig部分的基于抗體的融合蛋白之循環(huán)半衰期，該方法包括步驟a)將突變引入跨越Ig部分和非Ig部分的區(qū)域；b)比較含有和不含突變的基于抗體的融合蛋白的血清半衰期；和c)選擇增加基于抗體的融合蛋白血清半衰期的突變。
43.一種包含根據(jù)權(quán)利要求42的方法鑒定的突變之基于抗體的融合蛋白。
44.一種治療疾病的方法，包括給患者施用權(quán)利要求26的基于抗體的融合蛋白的步驟。
45.權(quán)利要求1、26或36的融合蛋白，其具有在所述接合處或附近通過添加或置換引入的疏水性或非極性氨基酸。
46.權(quán)利要求45的融合蛋白，其中所述氨基酸選自Leu，Ala，Trp和Gly。
47.權(quán)利要求48的融合蛋白，其中所述氨基酸是Ala。
全文摘要
公開了用于增加基于抗體的融合蛋白循環(huán)半衰期的組合物和方法。公開的方法和組合物依賴于改變基于抗體的融合蛋白中抗體部分和融合的蛋白部分之間的接合區(qū)的氨基酸序列。接合區(qū)帶有氨基酸序列改變的基于抗體之融合蛋白當(dāng)施予哺乳動物時(shí)，具有更長的循環(huán)半衰期。公開的方法和組合物對于降低哺乳動物腫瘤大小和轉(zhuǎn)移特別有效。
文檔編號C07K16/00GK1406249SQ01805863
公開日2003年3月26日 申請日期2001年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月11日
發(fā)明者S·D·吉里斯, C·伯格, 勞健明 申請人:默克專利股份有限公司