專利名稱：免疫刺激性寡脫氧核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫刺激性寡脫氧核酸分子(ODN)以及含有這種ODN的藥物組合物。
疫苗比任何其它醫(yī)學(xué)干預(yù)手段能挽救更多的生命(和節(jié)省更多的資源)(Nossal，1998)。由于實行了世界范圍的接種疫苗計劃，所以許多致命疾病的發(fā)生率已被大大地降低。盡管這一計劃對整個一組有代表性的疾病，例如肺結(jié)核、白喉、百日咳、麻疹和破傷風(fēng)是有效的，但是還沒有針對于眾多的包括大多數(shù)病毒感染如AIDS在內(nèi)的傳染性疾病有效的疫苗。也沒有針對包括瘧疾或癌癥在內(nèi)的每年引起無數(shù)患者失去生命的其它傳染性的或非傳染性疾病的有效疫苗。另外，抗生素抗性細菌和微生物的快速涌現(xiàn)需要采用一種選擇合理的利用疫苗的治療方法。最后，傳染性疾病，而不是心血管疾病或癌癥或損傷仍然是引起世界范圍內(nèi)死亡和殘疾的最大原因這一事實也說明對疫苗有著極大的需要(Bloom和Widdus，1998)。
從免疫學(xué)的觀點出發(fā)，如今疫苗領(lǐng)域中存在的一個主要問題是傳統(tǒng)疫苗(和/或含在這些制劑中的免疫調(diào)節(jié)化合物)被設(shè)計用來誘導(dǎo)高水平的抗體(Harrow和Lane，1988)。然而，抗體本身在預(yù)防包括由病毒、胞內(nèi)細菌、某些寄生蟲引起的多數(shù)病癥和癌癥在內(nèi)的許多疾病方面是無效的。這類疾病的實例是，但不限于，上述的HIV病毒或瘧疾中的瘧原蟲。在眾多的實驗系統(tǒng)中表明對于這些適應(yīng)征來說包括T細胞在內(nèi)的免疫系統(tǒng)的細胞臂，而不是體液臂是重要的。因此，為了克服傳統(tǒng)疫苗的局限性需要新的改進技術(shù)。重點必需放在有效誘導(dǎo)包括抗原特異性T細胞在內(nèi)的細胞免疫系統(tǒng)的技術(shù)上，所述T細胞能夠識別在被病原體感染的細胞上表達的分子。理想的是，將疫苗設(shè)計成既誘導(dǎo)能區(qū)分病變的和/或被感染的細胞與正常細胞的T細胞，又同時誘導(dǎo)由可識別胞外區(qū)室中的病原體的B細胞分泌的抗體。
幾種制備出來的疫苗由減毒的活生物體組成，其中存在恢復(fù)到有毒的野生型病毒株的風(fēng)險。尤其是在無免疫應(yīng)答的宿主中，這會成為一種威脅生命的方案?；蛘撸捎谶@些亞單位疫苗本身通常沒有效力，所以疫苗以一種源自病原體的抗原與誘導(dǎo)或加強針對這些抗原的免疫應(yīng)答的化合物(這些化合物通常被稱作佐劑)的組合形式進行給藥。
盡管對于上述疫苗作為有效醫(yī)學(xué)治療手段不存在疑問，但是由于其復(fù)雜性，仍然存在著可能產(chǎn)生嚴重副作用的缺點，例如含在疫苗中的抗原與由被接種個體的細胞表達的分子發(fā)生交叉反應(yīng)。另外，難以滿足管理機構(gòu)，例如世界衛(wèi)生組織(WHO)、食品和藥物管理局(FDA)及其它們的歐洲相應(yīng)機構(gòu)對疫苗組合物和免疫誘導(dǎo)機制的準確說明的現(xiàn)有要求。
抗原呈遞細胞屬于天然免疫系統(tǒng)，它已經(jīng)進化為與微生物接觸后早期第一道限制傳染的宿主防御系統(tǒng)(Hoffmann等，1999)。天然免疫系統(tǒng)的細胞識別在它們的靶向物上表達的模式或相對非特異性結(jié)構(gòu)而不識別被適應(yīng)性免疫系統(tǒng)識別的更復(fù)雜的、特異性結(jié)構(gòu)(Hoffmann等，1999)。天然免疫系統(tǒng)的細胞的實例是巨噬細胞和樹突細胞以及粒細胞(例如嗜中性粒細胞)，自然殺傷細胞等。相反，適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的細胞識別T細胞的包括肽在內(nèi)的特異性抗原結(jié)構(gòu)以及B細胞的肽和三維結(jié)構(gòu)。適應(yīng)性免疫系統(tǒng)比天然免疫系統(tǒng)的特異性更強和更復(fù)雜并且經(jīng)反復(fù)暴露于給定病原體/抗原而變得更好。在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)方面，天然免疫系統(tǒng)更老并且已經(jīng)在非常原始的生物體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)。然而，由于除了控制病原體外，天然免疫系統(tǒng)的細胞，即APC，還可致敏適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的細胞并因而引發(fā)導(dǎo)致入侵物清除的特異性免疫應(yīng)答，所以在抗原暴露初期，天然免疫系統(tǒng)是至關(guān)重要的。總之，天然免疫系統(tǒng)的細胞以及具體地是APC在免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)期由于下列原因起著關(guān)鍵性的作用a)依靠原始模式識別系統(tǒng)控制感染和b)致敏適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的細胞，從而引發(fā)導(dǎo)致入侵病原體或其它靶向物清除的特異性免疫應(yīng)答和免疫記憶(Roitt等，1998)。這些機制對于清除或控制腫瘤細胞也相當重要。
如上所述，天然免疫系統(tǒng)的細胞識別在它們的相應(yīng)靶向物上表達的模式。實例是革蘭氏陰性菌的脂多糖(LPS)、分枝桿菌的糖脂、革蘭氏陽性菌的脂磷壁酸質(zhì)、酵母菌的甘露聚糖和病毒的雙鏈RNA(Hoffmann等，1999)。另外，它們可以識別諸如腫瘤細胞上的被改變的蛋白糖基化作用的模式。
最新發(fā)現(xiàn)描述了作為被哺乳動物的天然免疫系統(tǒng)(但是也可能被適應(yīng)性免疫系統(tǒng))識別的另外一種模式的原生動物或低等真核生物的DNA(如果不是全部的脊椎動物也可能是大多數(shù))(Krieg，1996；Lipford等，1998)。
可能是由于病原體與宿主DNA之間存在著結(jié)構(gòu)和序列使用方面的差異，所以所述免疫系統(tǒng)識別包括細菌在內(nèi)的低等生物。具體地說，源自于非脊椎動物或在某一個堿基中含有非甲基化的胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸(CpG)的合成短鏈ODN形式的短鏈DNA被作為靶向物(Krieg等，1995)。CpG基元以預(yù)期頻率出現(xiàn)在細菌的DNA中，但是出現(xiàn)在脊椎動物DNA中的頻率相當?shù)?LipLord等，1998；Pisetsky，1999)。另外，非脊椎動物(即細菌)的CpG基元不被甲基化而脊椎動物的CpG序列被甲基化。細菌DNA與脊椎動物DNA之間的這些差異使得脊椎動物能將非脊椎動物的DNA識別為一個危險信號。
含有天然CpG的DNA，ODN以及被硫代磷酸基取代(硫代磷酸殘基取代磷酸基)的含有CpG基元的ODN不僅是免疫細胞增殖和體液免疫應(yīng)答的有效激活劑(Krieg等，1995)，而且還刺激強烈的細胞免疫應(yīng)答(被記載在Lipford等的綜述中，1998)。含有非甲基化的CpG基元的DNA/ODN能夠直接激活單核細胞(樹突細胞，巨噬細胞)和B細胞。同樣地，自然殺傷(NK)細胞不能被直接激活，但卻能對由它們的IFN-γ產(chǎn)生量明顯增加的單核細胞產(chǎn)生的IL-12(白細胞介素12)發(fā)生應(yīng)答(Chace等，1997)。結(jié)果，通過CpG DNA誘導(dǎo)單核細胞和NK細胞能夠促進對Thl-型應(yīng)答的誘導(dǎo)以及促進細胞毒T細胞的發(fā)育。
已知基于肌苷和胞嘧啶的核糖核酸，如聚肌苷酸-聚胞苷酸(聚IC)促進Thl-特異性免疫應(yīng)答。已知刺激巨噬細胞產(chǎn)生細胞因子如IL-lα和IL-12(Manetti等，1995)，還已知作為一種有效的干擾素1型誘導(dǎo)物(Manetti等，1995)和一種有效的NK細胞刺激物(Cavanaugh等，1996)。
然而，這一效果被嚴格地限制在含有肌苷和胞苷殘基的核糖核酸(WO98/16247)。
本發(fā)明人的研究結(jié)果表明含有非甲基化的CpG基元的ODN，盡管在刺激免疫系統(tǒng)方面是有效的，但是也具有本質(zhì)的缺點，尤其是在特異性方面(高本底)和產(chǎn)生副作用方面，如高系統(tǒng)性TNF-α的產(chǎn)生。已知高系統(tǒng)性TNF-α的釋放能夠引起中毒性休克綜合癥，該綜合癥能夠引起患病患者的死亡。
因此本發(fā)明的一個目的是提供合適的新型ODN，該ODN沒有像基于CpG序列的ODN那么明顯的副作用。另一個目的是降低含有已知ODN的藥物組合物的副作用以及提供安全和有效的耐受性良好的藥物組合物，該組合物具有適合于動物，尤其是包括人類在內(nèi)的哺乳動物接種的自動免疫接種調(diào)節(jié)特性。
這個目的通過具有式(I)結(jié)構(gòu)的免疫刺激寡脫氧核酸分子實現(xiàn) 任何X是O或S，其中任何NMP是一種選自脫氧腺苷-、脫氧鳥苷-、脫氧肌苷-、脫氧胞苷-、脫氧尿苷-、脫氧胸苷-、2-甲基-脫氧肌苷-、5-甲基-脫氧胞苷-、脫氧假尿苷-、脫氧核糖嘌呤-、2-氨基-脫氧核糖嘌呤-、6-S-脫氧鳥嘌呤-、2-二甲基-脫氧鳥苷或N-異戊烯基-脫氧腺苷一磷酸或一硫代磷酸的2’脫氧核苷一磷酸或一硫代磷酸，NUC是一種選自脫氧腺苷-、脫氧鳥苷-、脫氧肌苷-、脫氧胞苷-、脫氧尿苷、脫氧胸苷-、2-甲基-脫氧肌苷-、5-甲基-脫氧胞苷、脫氧假尿苷-、脫氧核糖嘌呤-、2-氨基-脫氧核糖嘌呤-、6-S-脫氧鳥嘌呤-、2-二甲基-脫氧鳥苷或N-異戊烯基-脫氧腺苷的2’脫氧核苷，a和b是從0至100的整數(shù)，條件是a+b介于4和150之間，B和E是核酸分子的5’或3’端的常用基團。
令人驚奇的是，證明了含有脫氧肌苷殘基的ODN(I-ODNs)具有一種與含有CpG基元的ODN相當?shù)拿庖哒{(diào)節(jié)作用或者甚至在許多情況下比含有CpG基元的ODN的免疫調(diào)節(jié)作用強。而且，針對一種給定的抗原或抗原片段，本發(fā)明的ODN比CpG ODN產(chǎn)生特異性更強的免疫應(yīng)答。另外，本發(fā)明的ODN降低了對不利副反應(yīng)的誘導(dǎo)，尤其是對系統(tǒng)性TNF-α或IL-6的誘導(dǎo)。
然而，已經(jīng)記載了含有肌苷的RNA分子如聚-IC或WO98/16247中提到的分子具有一定的免疫刺激作用，令人驚奇的是證明了含有脫氧肌苷殘基的脫氧核酸分子可能是良好的免疫刺激ODN。
另外，本發(fā)明的I-ODN與基于特定CpG基元的ODN相反-不依賴于特定的基元或如對CpG寡核苷酸所述的回文序列(參見例如EP 0 468520 A2，WO96/02555，WO98/18810，WO98/37919，WO98/40100，WO98/52581，WO99/51259和WO99/56755，全部被引入本文作參考)。因此，本發(fā)明的一組I-ODN可以優(yōu)選地含有一種CI基元(因此這些引用參考文獻中記載的ODN是本發(fā)明ODN優(yōu)選的實施方案，其中一個或多個鳥苷殘基被脫氧肌苷殘基所取代)。由于含有一個不存在于CI或IC中的肌苷的I-ODN也具有免疫刺激特性，所以對于其主要的免疫刺激特性來說它不是必需的。
因此本發(fā)明的I-ODN是一種含有一個優(yōu)選地以單鏈形式提供的脫氧肌苷殘基的DNA分子。
本發(fā)明的I-ODN可以通過重組方法來分離或化學(xué)合成。在后一種情況下，本發(fā)明的I-ODN還可以含有被修飾的寡核苷酸，如膦酸甲酯或其它基于磷的被修飾的寡核苷酸如磷酸三酯、氨基磷酸酯和二硫代磷酸酯，所述被修飾的寡核苷酸可以利用標準的化學(xué)轉(zhuǎn)化方法來進行合成。也可以使用其它不基于磷的被修飾的寡核苷酸(Stirchak等，3月17日(1989)，6129-6141)，然而，一磷酸化合物或一硫代磷酸化合物是本發(fā)明優(yōu)選使用的2’脫氧核苷一磷酸。
本發(fā)明I-ODN的NMP優(yōu)選地選自脫氧腺苷-、脫氧鳥苷-、脫氧肌苷-、脫氧胞苷、脫氧尿苷-、脫氧胸苷-、2-甲基-脫氧肌苷-、5-甲基-脫氧胞苷一磷酸或一硫代磷酸(通常，所述磷酸或硫代磷酸基團在脫氧核糖的5’端)。然而對于基于CpG基元的ODN來說必須是該基元未被甲基化，令人驚奇地是本發(fā)明的ODN就不是這種情況，例如其中2-甲基-脫氧肌苷或5-甲基-脫氧胞苷殘基對本發(fā)明ODN的免疫刺激特性不具有通常的負面影響?；蛘?，取代2-脫氧形式的NMP，其它的基團，尤其是惰性基團如-F、-NH2、-CH3、尤其是CH3也可以存在于核糖基團的2-位上。當然，對于本發(fā)明的I-ODN來說，-OH和SH基團不能存在于核糖的2’-位上，尤其是不能存在于肌苷NMP的核糖殘基的2’-位上。
本發(fā)明ODN的長度在現(xiàn)有技術(shù)中所用的標準的ODN的長度范圍內(nèi)。因此，總長度在4以下和150以上的分子表現(xiàn)出逐步降低的免疫刺激潛力。優(yōu)選的ODN含有10至60，特別是15至40個堿基(核苷)，意味著在這些優(yōu)選的實施方案中，式I中的a+b在10至60的范圍內(nèi)，優(yōu)選地在15至40的范圍內(nèi)。
然而，現(xiàn)有技術(shù)中記載的具有免疫刺激性的含有肌苷和胞苷的核糖核酸分子是大分子并且是分子量遠遠大于200000的還不太明確的多核酸(一種可從Sigma化學(xué)品公司購買的聚肌苷-聚胞苷酸具有220000至460000的分子量(至少500-1000個C+I殘基))。本發(fā)明的分子是長度短得多且產(chǎn)品的長度和組成相當明確的、能夠高度重現(xiàn)的DNA分子。
進一步優(yōu)選地是式I所示的I-ODN的含有脫氧肌苷的NMP是一種具有1至4個硫原子的一硫代磷酸并且由于這種ODN對核酸酶的抗性較高，所以其它的NMP，尤其是其它所有的NMP也以核苷一硫代磷酸的形式存在(本發(fā)明中明確了“一硫代磷酸”中的“一”是指磷酸基，即每個NMP中含有一個磷酸基團(一個磷原子))。優(yōu)選地，在本發(fā)明的NMP中，X1和X2中的至少一個是S以及X3和X4中的至少一個是O。優(yōu)選地，X3和X4是O。(X3可以(由于合成NMP)源自例如磷酸基基團或源自NMP-核糖的3’-基團)。
優(yōu)選地本發(fā)明的ODN含有以下序列hhh wdi dhh hnhh hhh wdi nhh hhh hhh wn，nhh wdi din hhh hdi ndi nh，nhh hhh wdi dhh hhh hhh wn或nhh wdi did hhh hdi ddi dh，其中任何n是一種選自脫氧腺苷-、脫氧鳥苷-、脫氧胞苷-或脫氧胸苷-一磷酸或一硫代磷酸的2’-脫氧核苷一磷酸或一硫代磷酸，任何h是一種選自脫氧腺苷-、脫氧胞苷-或脫氧胸苷-一磷酸或一硫代磷酸的2’-脫氧核苷一磷酸或一硫代磷酸，i是脫氧肌苷-一磷酸或一硫代磷酸，任何w是一種選自脫氧腺苷-或脫氧胸苷-一磷酸或一硫代磷酸的2’-脫氧核苷一磷酸或一硫代磷酸，和任何d是一種選自脫氧腺苷-、脫氧鳥苷-或脫氧胸苷-一磷酸或一硫代磷酸的2’-脫氧核苷一磷酸或一硫代磷酸。
如上所述，一種特定的基元(諸如CpG或一個回文序列)對于本發(fā)明的I-ODN不是必需的。然而，含有一個CI基元的ODN是優(yōu)選的以致于在一個優(yōu)選的實施方案中，式I所示的ODN含有至少一個與一個2’-脫氧肌苷一磷酸或一硫代磷酸3’-相鄰的2’-脫氧胞苷一磷酸或一硫代磷酸從而形成這種5’-CI 3’-基元。
本發(fā)明優(yōu)選的ODN含有一個或多個以下序列g(shù)acitt，iacitt，gaictt，iaictt，其中a是脫氧腺苷-一磷酸或-一硫代磷酸，g是脫氧鳥苷-一磷酸或-一硫代磷酸，i是脫氧肌苷-一磷酸或-一硫代磷酸，c是脫氧胞苷-一磷酸或-一硫代磷酸，和t是脫氧胸苷-一磷酸或-一硫代磷酸。
本發(fā)明的I-ODN特別適合于在藥學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用，例如作為一種藥物被施用于動物或人。它們尤其適合作為一種免疫刺激劑，特別是在疫苗組合物中使用或與疫苗組合物共同使用。
因此，本發(fā)明還涉及一種含有本發(fā)明ODN的藥物組合物。
由于本發(fā)明的一種優(yōu)選藥物組合物是一種疫苗，所以該組合物除含有本發(fā)明的ODN外，還應(yīng)當含有一種抗原。尤其是由于ODN具有免疫刺激活性，所以通過所述抗原與本發(fā)明的ODN的結(jié)合，大大增強了該抗原激發(fā)被接種個體的保護/免疫應(yīng)答的潛力。
一種疫苗可以含有各種不同的抗原?？乖膶嵗峭耆珳缁畹纳矬w如滅活的病毒或細菌、真菌、原生動物或者甚至是癌細胞?？乖€可以由這些生物體/組織、蛋白質(zhì)，或以它們最簡單的形式，肽的亞片段組成?？乖部梢砸蕴腔鞍谆螂牡男问奖幻庖呦到y(tǒng)所識別并且還可以是或含有多糖或脂類。由于例如細胞毒T細胞(CTL)識別通常與主要組織相容性復(fù)合體(MHC)結(jié)合的8-11個氨基酸長度的短肽形式的抗原(Rammensee等，免疫遺傳學(xué)(Immunogenetics)41，(1995)，178-228)，所以可以使用短肽。B細胞識別比大約15個氨基酸更長的肽(Harrow等，冷泉港(Cold Spring Harbor)冷泉港實驗室(Cold Spring Harbor Laboratory)，(1988))。通過與T細胞表位進行比較，B細胞抗原的三維結(jié)構(gòu)對于被抗體識別也可能起著重要的作用。為了獲得持續(xù)的、抗原-特異性免疫應(yīng)答，佐劑能夠幫助激發(fā)包括免疫系統(tǒng)必需所有細胞的免疫級聯(lián)。佐劑主要作用于所謂的抗原呈遞細胞(APC)，但它們的作用方式不受限制。這些細胞通常首先遇到所述的抗原，接著將被加工的或未被修飾的抗原呈遞給免疫效應(yīng)子。還可能涉及中間體細胞類型。在產(chǎn)生的免疫應(yīng)答過程中，只有具有合適特異性的效應(yīng)細胞被激活。所述佐劑還可以局部地保留抗原以及共同注射的其它因子。另外，所述佐劑可以對其它免疫細胞起到一種化學(xué)吸引劑的作用或?qū)γ庖呦到y(tǒng)局部地或全部地起到一種刺激劑作用。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，T細胞表位被用作抗原?；蛘撸琓細胞表位與B細胞表位的結(jié)合也可能是優(yōu)選的。
被用于本發(fā)明組合物中的抗原不是關(guān)鍵的。根據(jù)本發(fā)明，當然也可以使用不同抗原的混合物，優(yōu)選地，來源于一種病毒或一種細菌病原體或來源于真菌或寄生蟲的蛋白質(zhì)或肽被用作這種抗原(包括衍生化的抗原或糖基化的或脂化的抗原或多糖或脂類)。另一個優(yōu)選的抗原來源是腫瘤抗原。優(yōu)選的病原體選自人免疫缺陷病毒(HIV)、甲型肝炎病毒和乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒(HCV)、勞斯肉瘤病毒(RSV)、埃-巴二氏病毒(EBV)、流感病毒、輪狀病毒、金黃色葡萄球菌、肺炎衣原體、砂眼衣原體、結(jié)核分枝桿菌、肺炎鏈球菌、炭疽桿菌、霍亂弧菌、瘧原蟲屬某種(Pl.惡性瘧原蟲，Pl.間日瘧原蟲等)、曲霉屬某種或白色念珠菌?？乖部梢允怯砂┘毎磉_的分子(腫瘤抗原)。衍生過程可以包括從病原體/癌細胞中純化一種特異性蛋白質(zhì)，激活病原體以及這種蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)水解或化學(xué)衍生化或穩(wěn)定化。腫瘤抗原(癌癥疫苗)或自身免疫抗原也可以以同樣的方式被用于本發(fā)明的藥物組合物中。利用這種組合物可以進行腫瘤疫苗接種或自身免疫疾病的治療。
對于肽抗原來說，肽模擬物(mimitope)/激動劑/超激動劑/拮抗劑或某些位點發(fā)生了變化而不影響免疫學(xué)特性的肽或非肽模擬物/激動劑/超激動劑/拮抗劑(被記載在Sparbier和Walden的綜述中，1999)的用途被包含在本發(fā)明中。肽抗原還可以包括在肽抗原的羧基端或氨基端的延伸以便促進與聚陽離子化合物或免疫刺激化合物之間的相互作用。為了治療自身免疫疾病可以使用肽拮抗劑。
抗原還可以被衍生化從而包括使抗原呈遞能力以及抗原靶向抗原呈遞細胞能力增強的分子。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述藥物組合物適合于提供對與自身免疫疾病有關(guān)的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段和肽的耐受性。用于該實施方案中的抗原足以耐受免疫系統(tǒng)或下調(diào)針對與自身免疫過程有關(guān)的表位產(chǎn)生的免疫應(yīng)答。
優(yōu)選地，本發(fā)明的所述藥物組合物，尤其是疫苗形式的組合物，還含有一種聚陽離子聚合物，優(yōu)選地是一種聚陽離子肽，尤其是聚精氨酸、聚賴氨酸或一種抗微生物肽。
被用于本發(fā)明的聚陽離子化合物可以是任何具有WO 97/30721中記載的特有效果的聚陽離子化合物。優(yōu)選的聚陽離子化合物選自堿性多肽、有機聚陽離子化合物、堿性聚氨基酸或其混合物。這些聚氨基酸應(yīng)當具有一條至少4個氨基酸殘基長度的鏈(參見Goldman等描述的他福新(1983))。特別優(yōu)選的是含有肽鍵的物質(zhì)，如聚賴氨酸、聚精氨酸和在8個以上，尤其是20個以上氨基酸殘基的范圍內(nèi)含有20％以上，特別是50％以上的堿性氨基酸的多肽或其混合物。其它優(yōu)選的聚陽離子化合物及其藥物組合物被記載在WO 97/30721(例如聚乙烯亞胺)和WO 99/38528中。優(yōu)選地，這些多肽含有20至500個氨基酸殘基，尤其是30至200個殘基。
這些聚陽離子化合物可以通過化學(xué)或重組技術(shù)來制備或來源于自然界。
陽離子(多)肽還可以是聚陽離子抗微生物肽，該肽具有Ganz和Lehrer，1999；Hancock，1999中記載的特性。這些(多)肽可以來源于原核生物或動物或植物，或者可以通過化學(xué)或重組技術(shù)進行制備(Andreu和Rivas，1998；Ganz和Lehrer，1999；Simmaco等，1998)。肽還可以屬于防御素類(Ganz，1999；Ganz和Lehrer，1999)。這種肽的序列可以，例如在國際互聯(lián)網(wǎng)網(wǎng)址為http//www.bbcm.univ.trieste.it/-tossi/pagl.html下的抗微生物序列數(shù)據(jù)庫中找到。
這種宿主防御肽或防御物也是本發(fā)明聚陽離子聚合物的一種優(yōu)選形式。通常，一種作為終產(chǎn)物對適應(yīng)性免疫系統(tǒng)能起活化作用(或下調(diào)作用)的化合物，優(yōu)選地由APC介導(dǎo)(包括樹突細胞)，被用作聚陽離子聚合物。
作為本發(fā)明的特別優(yōu)選的聚陽離子物質(zhì)是由cathelicidin產(chǎn)生的抗微生物肽或其衍生物(A 1416/2000，被引入本文作參考)，尤其是來源于哺乳動物，優(yōu)選地來源于人、?；蛐∈蟮腸athelicidin的抗微生物肽、或神經(jīng)活性化合物如(人)生長激素。
來源于自然界的聚陽離子化合物包括HIV-REV或HIV-TAT(產(chǎn)生的陽離子肽、觸足肽、脫乙酰殼多糖或殼多糖的其它衍生物)或來源于由生物化學(xué)或重組方法制備的那些肽或蛋白質(zhì)的肽。其它優(yōu)選的聚陽離子化合物是cathelin或與cathelin相關(guān)的或由cathelin衍生的物質(zhì)。例如，鼠cathelin是一種具有氨基酸序列為NH2-RLAGLLRKGGEKIGEKLKKIGOKIKNFFQKLVPQPE-COOH的肽。相關(guān)的或衍生的cathelin物質(zhì)含有至少具有15-20個氨基酸殘基的cathelin序列的全部或部分序列。衍生化可以包括采用20個常規(guī)氨基酸以外的氨基酸取代或修飾天然氨基酸。而且，可以將其它的陽離子殘基引進這類cathelin分子中。這些cathelin分子優(yōu)選地是與抗原和本發(fā)明的致免疫的ODN結(jié)合。然而，令人驚奇地是這些cathelin分子被證明還可以作為抗原的一種有效佐劑而不需要加入其它的佐劑。因此有可能將這類cathelin分子作為疫苗配制品中的有效佐劑，同時加入或不加入其它的免疫刺激物質(zhì)。
本發(fā)明使用的另一種優(yōu)選的聚陽離子物質(zhì)是一種至少含有2個由3至7個疏水氨基酸的連接區(qū)間隔的KLK-基元的合成肽(A 1789/2000，被引入本文作參考)。
非常驚奇地是本發(fā)明的藥物組合物的免疫刺激效果遠遠高出每一單種組分的效果加合后期望得到的效果或者甚至高于OND或聚陽離子的效果與抗原的效果加合后期望得到的效果。
式I中的B和E是核酸分子的5’和/或3’端的常用基團。這種基團的實例對于本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員來說容易得到(參見例如″寡核苷酸和類似物-實用方法(Oligonucleotides and Analogues-APractical Approach)″(1991)，Eckstein編輯，牛津大學(xué)出版社)。本發(fā)明的I-ODN的B和/或E優(yōu)選獨立地選自于-H、-CH3、-COCH3、-OH、-CHO、磷酸基、硫代磷酸基、硫酸基或硫代硫酸基或磷酸烷基，尤其是具有一個長度為C1-C6的烷基和/或具有一個末端氨基的磷酸烷基(所述氨基可以例如被用于進一步標記本發(fā)明的I-ODN，例如-PO4-(CH2)n-NH2或-PO4-(CH2)n-NH-標記物)。特別優(yōu)選的B是核苷酸，尤其是上述的2’脫氧核苷酸(即沒有磷酸或硫代磷酸基團)?；蛘哌@些基團還可以含有連接其它分子，尤其是載體分子或標記物的接頭。對于其中ODN與固體表面或顆?；驑擞浳锏冗B接的這種形式的ODN也可以作為B和/或E基團的一部分。
當然，任何離子化(鹽)形式或互變異構(gòu)形式的式I分子被包括在式I中。
本發(fā)明的藥物組合物還可以含有其它的活性成分(藥物活性物質(zhì))，尤其是能在疫苗結(jié)合物中使用的物質(zhì)。這種其它活性成分的優(yōu)選實施方案是細胞因子、抗炎物質(zhì)、抗微生物物質(zhì)或其混合物。
當然，本發(fā)明的藥物組合物還可以含有輔助物質(zhì)，尤其是一種藥用載體，緩沖物質(zhì)、穩(wěn)定劑或其混合物。
這些成分在該藥物組合物中的相對用量主要取決于個體抗原的需要以及取決于應(yīng)該被施用該組合物的動物/人。因此，本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選地含有一種或多種本發(fā)明的ODN，優(yōu)選地含有1pg至10g，優(yōu)選地含有1ng至1g，更優(yōu)選地含有100ng至10mg，特別優(yōu)選地含有10mg至1mg。所述抗原以及所述聚陽離子聚合物可以采用相似的劑量進行施用，每次接種1至10,000mg的抗原和0.1至1,000mg的聚陽離子是優(yōu)選的。
可以采用一周、兩周或一個月的間隔將有效量的本發(fā)明組合物施用于一名患者，例如一名接種疫苗的受試者。采用該組合物進行治療的患者還可以重復(fù)接種或只接種一次。本發(fā)明的一種優(yōu)選的用途是自動免疫接種，尤其是針對對特定抗原沒有抵抗力的人或動物進行的自動免疫接種。
本發(fā)明的組合物的施用途徑不是很關(guān)鍵，例如皮下、肌內(nèi)、皮內(nèi)或透皮注射與口服同樣適用。
本發(fā)明的組合物也可以單獨施用，例如與所述抗原/聚陽離子組合物分開，通過單獨注射所述的免疫刺激物質(zhì)來施用。因此本發(fā)明還涉及一種包括以一種含有所述抗原和所述聚陽離子聚合物的組合物作為一種組分和以一種含有所述免疫刺激或趨化性物質(zhì)的組合物作為第二種組分的試劑盒。
所述組分可以在同一位點或時間進行施用，然而，也可以在不同的位點或不同的時間或不同的時間段進行施用。還可以分別改變所述組合物或組分的全身或局部用藥。
下列實施例以及附圖詳細地描述了本發(fā)明，當然本發(fā)明并不局限于此。


圖1表示注射了OVA257-264、聚-L-精氨酸(pR60)和含有脫氧肌苷I的寡脫氧核苷酸(I-ODN)或CpG 1668后，針對由卵清蛋白產(chǎn)生的肽OVA257-264的免疫應(yīng)答。將所示的混合物注射進小鼠的后爪墊內(nèi)。四天后，采用OVA257-264對外流的淋巴結(jié)細胞進行體外刺激。24小時后，利用ELISPOT分析方法測定產(chǎn)生IFN-g的細胞數(shù)目。分析結(jié)果以斑點數(shù)目/1×106淋巴結(jié)細胞來表示。
圖2表示注射了OVA257-264、聚-L-精氨酸(pR60)和含有I的寡脫氧核苷酸(I-ODN)或CpG 1668后，對系統(tǒng)TNF-a產(chǎn)生的誘導(dǎo)作用。將所示的混合物注射進小鼠的后爪墊內(nèi)。注射后1小時，從尾靜脈中抽血并制備血清。利用ELISA方法測定血清中的TNF-a的濃度。
圖3表示注射了OVA257-264、聚-L-精氨酸(pR60)和含有脫氧肌苷I的寡脫氧核苷酸(I-ODN)、CpG 1668或GpC后，針對由卵清蛋白產(chǎn)生的肽OVA257-264的免疫應(yīng)答。將所示的混合物注射進小鼠的后爪墊內(nèi)。四天后，采用OVA257-264、一種不相關(guān)的肽mTRP2181-188(小鼠酪氨酸酶相關(guān)蛋白-2，VYDFFVWL)或pR60對外流的淋巴結(jié)細胞進行體外刺激。24小時后，利用ELISPOT分析方法測定產(chǎn)生IFN-g的細胞數(shù)目。分析結(jié)果以具有三份樣品產(chǎn)生的標準差的斑點數(shù)目/1×106淋巴結(jié)細胞來表示。
圖4表示注射了OVA257-264、聚-L-精氨酸(pR60)和含有I的寡脫氧核苷酸(I-ODN)、GpC或CpG 1668后，對系統(tǒng)TNF-a產(chǎn)生的誘導(dǎo)作用。將所示的混合物注射進小鼠的后爪墊內(nèi)。注射后1小時，從尾靜脈中抽血并制備血清。利用特異于細胞因子的ELISA方法測定血清中的TNF-a和IL-6的濃度。
圖5表示注射了TRP-2、聚-L-精氨酸、CpG 1668或含有隨機20--聚體序列的脫氧肌苷后，針對由卵清蛋白產(chǎn)生的肽OVA257-264的免疫應(yīng)答。將所示的混合物注射進小鼠的后爪墊內(nèi)。四天后，采用TRP-2、一種不相關(guān)的肽OVA257-264或pR60對外流的淋巴結(jié)細胞進行體外刺激。24小時后，利用ELISPOT分析方法測定產(chǎn)生IFN-g的細胞數(shù)目。分析結(jié)果以具有三份樣品產(chǎn)生的標準差的斑點數(shù)目/1×106淋巴結(jié)細胞來表示。
圖6表示與由黑素瘤產(chǎn)生的肽一起聯(lián)合注射I-ODN和聚-L-精氨酸(pR60)。
圖7表示與由黑素瘤產(chǎn)生的肽一起聯(lián)合注射I-ODN和聚-L-精氨酸(pR60)后降低了對系統(tǒng)TNF-a和IL-6的誘導(dǎo)作用。
圖8表示與由黑素瘤產(chǎn)生的肽一起聯(lián)合注射10-聚體I-ODN和pR60。
圖9表示聯(lián)合施用了卵清蛋白(OVA)和寡-dIC26-聚體和PR后增強了OVA-特異性IgG抗體的產(chǎn)生。將所示的混合物皮下注射進小鼠的后爪墊內(nèi)。在注射后的第24和115天，收集血清并通過ELISA方法篩選OVA-特異性IgG2a(A)和IgG1(B)抗體。所述結(jié)果以抗體滴度來表示。
實施例在所有實施例中都使用了被硫代磷酸基取代的ODN(用硫代磷酸殘基取代了磷酸基，在下文中被稱作″被硫代磷酸基取代的寡脫氧核苷酸″)，這是由于這種ODN對核酸酶表現(xiàn)出較高的抗性(Ballas等，1996；Krieg等，1995；Parronchi等，1999)。
實施例1聯(lián)合注射不同的I-ODN和聚-L-精氨酸(pR60)協(xié)同增強了針對由卵清蛋白產(chǎn)生的肽的免疫應(yīng)答。
小鼠 C57BI/6(Harlan/Olac)肽利用常規(guī)的固相F-moc化學(xué)合成方法合成OVA257-264-肽(SIINFEKL)，一種MHCI類(H-2Kb)-限定的雞卵清蛋白的表位(Rotzschke等，1991)，利用HPLC進行純化以及通過質(zhì)譜分析純度。
劑量300mg/小鼠聚-L-精氨酸60(pR60) 平均聚合度為60個精氨酸殘基的聚-L-精氨酸；SIGMA化學(xué)品公司劑量100mg/小鼠CpG-ODN 1668 通過NAPS GmbH，Gottingen合成被硫代磷酸基取代的含有CpG基元的ODNtcc atg acg ttc ctg atg ct。
劑量5nmol/小鼠I-ODN 1 通過NAPS GmbH，Gttingen合成被硫代磷酸基取代的含有脫氧肌苷的ODNtcc ati aci ttc ctg atg ct。
劑量5nmol/小鼠I-ODN 2 通過NAPS GmbH，Gttingen合成含有脫氧肌苷的ODNtcc atg acittcctg atg ct。
劑量5nmol/小鼠I-ODN 3 通過NAPS GmbH，Gottingen合成被硫代磷酸基取代的含有脫氧肌苷的ODNtcc ati aci ttc cti ati ct。
劑量5nmol/小鼠實驗組(每組5只小鼠)1.OVA257-2642.OVA257-264+pR603.OVA257-264+CpG 16684.OVA257-264+I-ODN 15.OVA257-264+I ODN 26.OVA257-264+I-ODN 37.OVA257-264+CpG 1668+pR608.OVA257-264+I-ODN 1+pR609.OVA257-264+I-ODN 2+pR6010.OVA257-264+I-ODN 3+pR60在0天將總體積為100ml的含有上述化合物的溶液注射進每個后爪墊中(每個爪墊注射50ml)。注射后4天將所述動物處死并且收獲腘淋巴結(jié)。淋巴結(jié)通過一個70mm細胞滲濾器并用含有5％胎牛血清(FCS，SIGMA化學(xué)品公司)的DMEM培養(yǎng)基(GIBCO BRL)沖洗兩次。用DMEM/5％FCS將細胞調(diào)整到3×106細胞/ml。根據(jù)所記載的內(nèi)容(Miyahira等，1995)對三份樣品進行IFN-g ELISPOT分析。該方法是一種被普遍用來對抗原-特異性T細胞進行定量的方法。用背景對照培養(yǎng)基、OVA257-264-肽或伴刀豆凝集素A(Con A)對淋巴細胞進行體外刺激。對代表單個產(chǎn)生IFN-g的T細胞的斑點進行計數(shù)。被Con A刺激后所檢測到的斑點數(shù)高的(沒有顯示數(shù)據(jù))表明所使用的淋巴細胞的狀態(tài)良好。圖1給出了針對每個小鼠實驗組的斑點數(shù)目/1×106細胞。
注射后1小時，從尾靜脈中取血，然后制備血清以便利用ELISA方法測定對系統(tǒng)TNF-a的誘導(dǎo)作用(圖2)。
實施例2用脫氧肌苷取代鳥苷使非致免疫的GpC-序列轉(zhuǎn)化成高度致免疫的序列，尤其是當與聚-L-精氨酸(pR60)聯(lián)合施用時。
小鼠 C57BI/6(Harlan/Olac)肽利用常規(guī)的固相F-moc化學(xué)合成方法合成OVA257-264-肽(SIINFEKL)，一種MHC I類(H-2Kb)-限定的雞卵清蛋白的表位(Rotzschke等，1991)，利用HPLC進行純化以及通過質(zhì)譜分析純度。
劑量300μg/小鼠聚-L-精氨酸60(pR60)平均聚合度為60個精氨酸殘基的聚-L-精氨酸；SIGMA化學(xué)品公司劑量100μg/小鼠CpG-ODN 1668通過NAPS GmbH，Gttingen合成被硫代磷酸基取代的含有CpG基元的ODNtcc atg acg ttc ctg atgct。
劑量5nmol/小鼠GpC-ODN 通過NAPS GmbH，Gttingen合成被硫代磷酸基取代的含有一種非致免疫的GpC基元的ODNtcc atgagcttc ctg atg ct。
劑量5nmol/小鼠I-ODN 9 通過NAPS GmbH，Gttingen合成被硫代磷酸基取代的含有脫氧肌苷的ODNtcc atg aic ttc ctg atg ct。
劑量5nmol/小鼠I-ODN 10通過NAPS GmbH，Gttin gen合成被硫代磷酸基取代的含有脫氧肌苷的ODNtcc ati aic ttc cti atict。
劑量5nmol/小鼠實驗組(每組5只小鼠)OVA257-264VA257-264+pR60OVA257-264+CpG 1668OVA257-264+GpCOVA257-264+I ODN 9
OVA257-264+I-ODN 10OVA257-264+CpG 1668+pR 60OVA257-264+GpC+pR 60OVA257-264+I-ODN 9+pR 60OVA257-264+I-ODN 10+pR 60在0天將總體積為100μl的含有上述化合物的溶液注射進每個后爪墊中(每個爪墊注射50μl)。注射后4天將所述動物處死并且收獲腘淋巴結(jié)。淋巴結(jié)通過一個70μm細胞滲濾器并用含有5％胎牛血清(FCS，SIGMA化學(xué)品公司)的DMEM培養(yǎng)基(GIBCO BRL)沖洗兩次。用DMEM/5％FCS將細胞調(diào)整到3×106細胞/ml。根據(jù)所記載的內(nèi)容(Miyahira等，1995)對三份樣品進行IFN-g ELISPOT分析。該方法是一種被普遍用來對抗原-特異性T細胞進行定量的方法。用培養(yǎng)基(對照)、OVA257-264-肽、一種不相關(guān)的肽mTRP-2181-188(鼠酪氨酸酶相關(guān)蛋白-2，VYDFFVWL)、pR60和伴刀豆凝集素A(Con A)對淋巴細胞進行體外刺激。對代表單個產(chǎn)生IFN-g的T細胞的斑點進行計數(shù)并從所有樣品中減去對照斑點的數(shù)目。被Con A刺激后所檢測到的斑點數(shù)高的(沒有顯示數(shù)據(jù))表明所使用的淋巴細胞的狀態(tài)良好。圖3給出了針對每個小鼠實驗組的斑點數(shù)目/1×106細胞，給出了被體外刺激的三份樣品的標準差。注射后1小時，從尾靜脈中取血，然后制備血清以便利用特異于細胞因子的ELISA方法測定對系統(tǒng)TNF-a和IL-6的誘導(dǎo)作用(圖4)。
實施例3聯(lián)合注射含有脫氧肌苷的隨機20-聚體序列與一種由黑素瘤產(chǎn)生的肽能夠誘導(dǎo)針對所述肽產(chǎn)生的強烈免疫應(yīng)答，該應(yīng)答通過共同施用聚-L-精氨酸(pR60)還可以被進一步增強。
小鼠 C57BI/6(Harlan/Olac)肽 利用常規(guī)的固相F-moc化學(xué)合合方法合成TRP-2-肽(VYDEFVWL)，一種MHC I類(H-2Kb)-限定的小鼠酪氨酸酶相關(guān)蛋白-2的表位(Bllom等，1997)，利用HPLC進行純化以及通過質(zhì)譜分析純度。
劑量300μg/小鼠聚-L-精氨酸60(pR60)平均聚合度為60個精氨酸殘基的聚-L-精氨酸；SIGMA化學(xué)品公司劑量100μg/小鼠CpG-ODN 1668 通過NAPS GmbH，Gttingen合成被硫代磷酸基取代的含有CpG基元的ODNtcc atg acg ttc ctg atg ct。
劑量5nmol/小鼠wdi通過NAPS GmbH，Gttingen合成被硫代磷酸基取代的ODNnhh hhh wdinhh hhh hhh wn。
劑量5nmol/小鼠wdidin 通過NAPS GmbH，Gttingen合成被硫代磷酸基取代的ODNnhh hhhwdi nhh hhh hhh wn。
劑量5nmol/小鼠
wdid 通過NAPS GmbH，Gttingen合成被硫代磷酸基取代的ODNnhh hhhwdi dhh hhh hhh wn。
劑量5nmol/小鼠wdidid通過NAPS GmbH，Gttingen合成被硫代磷酸基取代的ODNnhh wdi didhhh hdi ddi dh。
劑量5nmol/小鼠實驗組(每組5只小鼠)1.TRP-22.TRP-2+pR603.TRP-2+CpG 16684.TRP-2+wdi5.TRP-2+wdidin6.TRP-2+wdid7.TRP-2+wdidid8.TRP-2+CpG 1668+pR609.TRP-2+wdi+pR6010.TRP-2+wdidin+pR6011.TRP-2+wdid+pR6012.TRP-2+wdidid+pR60在0天將總體積為100μl的含有上述化合物的溶液注射進每個后爪墊中(每個爪墊注射50μl)。注射后4天將所述動物處死并且收獲腘淋巴結(jié)。淋巴結(jié)通過一個70μm細胞滲濾器并用含有5％胎牛血清(FCS，SIGMA化學(xué)品公司)的DMEM培養(yǎng)基(GIBCO BRL)沖洗兩次。用DMEM/5％FCS將細胞調(diào)整到3×106細胞/ml。根據(jù)所記載的內(nèi)容(Miyahira等，1995)對三份樣品進行IFN-g ELISPOT分析。該方法是一種被普遍用來對抗原-特異性T細胞進行定量的方法。用培養(yǎng)基(對照)、TRP-2-肽、一種不相關(guān)的OVA257-264-肽、pR60和伴刀豆凝集素A(Con A)對淋巴細胞進行體外刺激。對代表單個產(chǎn)生IFN-g的T細胞的斑點進行計數(shù)并從所有樣品中減去對照斑點的數(shù)目。被Con A刺激后所檢測到的斑點數(shù)高的(沒有顯示數(shù)據(jù))表明所使用的淋巴細胞的狀態(tài)良好。圖5給出了針對每個小鼠實驗組的斑點數(shù)目/1×106細胞，給出了被體外刺激的三份樣品的標準差。
實施例4聯(lián)合注射I-ODN與聚-L-精氨酸(pR60)能夠協(xié)同加強針對由黑素瘤產(chǎn)生的肽的免疫應(yīng)答。
實驗組(每組5只小鼠)1.TRP-2181-1882.TRP-2181-188+pR603.TRP-2181-188+CpG 16684.TRP-2181-188+I-ODN 25.TRP-2181-188+CpG 1668+pR606.TRP-2181-188+I-ODN 2+pR60在0天將總體積為100μl的含有上述化合物的溶液注射進每個后爪墊中(每個爪墊注射50μl)。注射后4天將所述動物殺死并且收獲腘淋巴結(jié)。淋巴結(jié)通過一個70μm細胞滲濾器并用含有50％胎牛血清(FCS，SIGMA化學(xué)品公司)的DMEM培養(yǎng)基(GIBCO BRL)沖洗兩次。用DMEM/5％FCS將細胞調(diào)整到3×106細胞/ml。根據(jù)所記載的內(nèi)容(Miyahira等，1995)對三份樣品進行IFN-γ ELISPOT分析。該方法是一種被普遍用來對抗原-特異性T細胞進行定量的方法。用背景對照培養(yǎng)基、TRP-2181-188-肽、一種不相關(guān)的OVA257-264-肽和伴刀豆凝集素A(ConA)對淋巴細胞進行體外刺激。對代表單個產(chǎn)生IFN-γ的T細胞的斑點進行計數(shù)并從所有樣品中減去對照斑點的數(shù)目。被Con A刺激后所檢測到的斑點數(shù)高的(沒有顯示數(shù)據(jù))表明所使用的淋巴細胞的狀態(tài)良好。圖6給出了針對每個小鼠實驗組的斑點數(shù)目/1×106細胞，給出了被體外刺激的三份樣品的標準差。
注射后1小時，從尾靜脈中取血，然后制備血清以便利用特異性的ELISA方法測定對系統(tǒng)TNF-a和IL-6的誘導(dǎo)作用(圖7)。
實施例5聯(lián)合注射隨機10-聚體I-ODN與聚-L-精氨酸(pR60)能夠協(xié)同加強針對由黑素瘤產(chǎn)生的肽的免疫應(yīng)答。
實驗組(每組5只小鼠)1.TRP-2181-1882.TRP-2181-188+pR603.TRP-2181-188+CpG 16684.TRP-2181-188+ODN 175.TRP-2181-188+CpG 1668+pR606.TRP-2181-188+ODN 17+pR60在0天將總體積為100μl的含有上述化合物的溶液注射進每個后爪墊中(每個爪墊注射50μl)。注射后4天將所述動物殺死并且收獲腘淋巴結(jié)。淋巴結(jié)通過一個70μm細胞滲濾器并用含有5％胎牛血清(FCS，SIGMA化學(xué)品公司)的DMEM培養(yǎng)基(GIBCO BRL)沖洗兩次。用DMEM/5％FCS將細胞調(diào)整到3×106細胞/ml。根據(jù)所記載的內(nèi)容(Miyahira等，1995)對三份樣品進行IFN-γ ELISPOT分析。該方法是一種被普遍用來對抗原-特異性T細胞進行定量的方法。用背景對照培養(yǎng)基、TRP-2181-188-肽、一種不相關(guān)的OVA257-264-肽和伴刀豆凝集素A(ConA)對淋巴細胞進行體外刺激。對代表單個產(chǎn)生IFN-γ的T細胞的斑點進行計數(shù)并從所有樣品中減去對照斑點的數(shù)目。被Con A刺激后所檢測到的斑點數(shù)高的(沒有顯示數(shù)據(jù))表明所使用的淋巴細胞的狀態(tài)良好。圖8給出了針對每個小鼠實驗組的斑點數(shù)目/1×106細胞，給出了被體外刺激的三份樣品的標準差。
小鼠 C57BI/6(Harlan/Olac)肽利用常規(guī)的固相F-moc化學(xué)合成方法合成TRP-2-肽(VYDEFVWL)，一種MHC I類(H-2Kb)-限定的小鼠酪氨酸酶相關(guān)蛋白-2的表位(Bllom等，1997)，利用HPLC進行純化以及通過質(zhì)譜分析純度。
劑量100μg/小鼠聚-L-精氨酸60(pR60) 平均聚合度為60個精氨酸殘基的聚-L-精氨酸；SIGMA化學(xué)品公司劑量100μg/小鼠CpG-ODN 1668 通過NAPS GmbH，Gttin gen合成被硫代磷酸基取代的含有CpG基元的ODNtcc atg acg ttc ctg atgct。
劑量5nmol/小鼠ODN 17通過NAPS GmbH，Gttingen合成被硫代磷酸基取代的含有脫氧肌苷的ODNhhh wdi dhh h。
(h＝CAT，w＝AT，d＝GAT)劑量10nmol/小鼠小鼠 C57BI/6(Harlan/Olac)肽 利用常規(guī)的固相F-moc化學(xué)合成方法合成TRP-2-肽(VYDEFVWL)，一種MHC I類(H-2Kb)-限定的小鼠酪氨酸酶相關(guān)蛋白-2的表位(Bllom等，1997)，利用HPLC進行純化以及通過質(zhì)譜分析純度。
劑量100μg/小鼠聚-L-精氨酸60(pR60)平均聚合度為60個精氨酸殘基的聚-L-精氨酸；SIGMA化學(xué)品公司劑量100μg/小鼠CpG-ODN 1668 通過NAPS GmbH，Gttingen合成被硫代磷酸基取代的含有CpG基元的ODNtcc atg acg ttc ctg atg ct。
劑量5nmol/小鼠I-ODN2 通過NAPS GmbH，Gttingen合成被硫代磷酸基取代的含有脫氧肌苷的ODNtcc atg aci ttc ctg atg ct。
劑量5nmol/小鼠實施例6聯(lián)合施用寡-脫氧IC26-聚體和聚-L-精氨酸(pR)能夠增強特異于卵清蛋白(OVA)的體液免疫應(yīng)答。
小鼠 C57BI/6(Harlan/Olac)卵清蛋白(OVA) 雞蛋的卵清蛋白，等級V，SIGMA化學(xué)品公司，A-5503，批號54H7070劑量50μg/小鼠聚-L-精氨酸60(pR60)平均聚合度為60個精氨酸殘基的聚-L-精氨酸；SIGMA化學(xué)品公司P-4663，批號68H5903劑量100μg/小鼠寡-脫氧IC，26-聚體 通過批準的亞磷酰胺化學(xué)方法以(寡-dIC26-聚體)4μmol的規(guī)模合成寡-dIC26-聚體并且通過HPLC純化(NAPS Gottingen，德國)。
劑量5nmol/小鼠實驗組(每組4只小鼠)1.OVA+寡-dIC26-聚體+pR2.OVA+寡-dIC26-聚體3.OVA+pR4.OVA在0天將總體積為100μl的含有上述化合物的溶液注射進每個后爪墊中(每個爪墊注射50μl)。注射后第24天，收集血清并利用ELISA方法篩選存在的OVA-特異性抗體。這些結(jié)果表明當與采用OVA與寡-dIC和pR中的單獨一種物質(zhì)注射相比較時，OVA與寡-dIC和pR進行聯(lián)合注射能夠增強OVA-特異性IgG抗體的產(chǎn)生(圖13A，B)。有趣地是，當單獨一次注射OVA與寡-dIC/pR時，IgG2a和IgG1兩者的滴度都增大了，表明同時涉及到了Th1和Th2細胞。然而，115天后，在被注射了OVA和寡-dIC/pR的小鼠的血清中仍然能夠檢測到增高的IgG2a水平。
這些數(shù)據(jù)表明聯(lián)合注射OVA與寡-dIC和pR能夠增強OVA-特異性體液免疫應(yīng)答。該應(yīng)答的特征是在早期，由Th1和Th2兩者誘導(dǎo)的同型抗體產(chǎn)生，但在晚期，主要是由Th1誘導(dǎo)的抗體產(chǎn)生。
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權(quán)利要求
1.具有式(I)結(jié)構(gòu)的免疫刺激寡脫氧核酸分子(ODN)， 任何X是O或S，其中任何NMP是一種選自脫氧腺苷-、脫氧鳥苷-、脫氧肌苷-、脫氧胞苷-、脫氧尿苷-、脫氧胸苷-、2-甲基-脫氧肌苷-、5-甲基-脫氧胞苷-、脫氧假尿苷-、脫氧核糖嘌呤-、2-氨基-脫氧核糖嘌呤-、6-S-脫氧鳥嘌呤-、2-二甲基-脫氧鳥苷或N-異戊烯基-脫氧腺苷一磷酸或一硫代磷酸的2’脫氧核苷一磷酸或一硫代磷酸，NUC是一種選自脫氧腺苷-、脫氧鳥苷-、脫氧肌苷-、脫氧胞苷-、脫氧尿苷、脫氧胸苷-、2-甲基-脫氧肌苷-、5-甲基-脫氧胞苷、脫氧假尿苷-、脫氧核糖嘌呤-、2-氨基-脫氧核糖嘌呤-、6-S-脫氧鳥嘌呤-、2-二甲基-脫氧鳥苷或N-異戊烯基-脫氧腺苷的2’脫氧核苷，a和b是從0至100的整數(shù)，條件是a+b介于4和150之間，B和E是核酸分子的5’或3’端的常用基團。
2.如權(quán)利要求1所述的ODN，其中任何NMP選自脫氧腺苷-、脫氧鳥苷-、脫氧肌苷-、脫氧胞苷、脫氧尿苷-、脫氧胸苷-、2-甲基-脫氧肌苷-、5-甲基-脫氧胞苷一磷酸或一硫代磷酸。
3.如權(quán)利要求1或2所述的ODN，其特征在于a+b在10至60之間，優(yōu)選地在15至40之間。
4.如權(quán)利要求1至3中任意一項權(quán)利要求所述的ODN，其特征在于X1和X2中的至少一個是S并且X3和X4中的至少一個是O以及優(yōu)選地任何NMP是核苷一硫代磷酸。
5.如權(quán)利要求1至4中任意一項權(quán)利要求所述的ODN，其特征在于它含有以下序列hhh wdi dhh hnhh hhh wdi nhh hhh hhh wn，nhh wdi din hhh hdi ndi nh，nhh hhh wdi dhh hhh hhh wn或nhh wdi did hhh hdi ddi dh，其中任何n是一種選自脫氧腺苷-、脫氧鳥苷-、脫氧胞苷-或脫氧胸苷-一磷酸或一硫代磷酸的2’-脫氧核苷一磷酸或一硫代磷酸，任何h是一種選自脫氧腺苷-、脫氧胞苷-或脫氧胸苷-一磷酸或一硫代磷酸的2’-脫氧核苷一磷酸或一硫代磷酸，i是脫氧肌苷-一磷酸或一硫代磷酸，任何w是一種選自脫氧腺苷-或脫氧胸苷-一磷酸或一硫代磷酸的2’-脫氧核苷一磷酸或一硫代磷酸，和任何d是一種選自脫氧腺苷-、脫氧鳥苷-或脫氧胸苷-一磷酸或一硫代磷酸的2’-脫氧核苷一磷酸或一硫代磷酸。
6.如權(quán)利要求1至5中任意一項權(quán)利要求所述的ODN，其特征在于它含有至少一種與2’-脫氧肌苷一磷酸或一硫代磷酸3’-相鄰的2’-脫氧胞苷一磷酸或一硫代磷酸。
7.如權(quán)利要求1至6中任意一項權(quán)利要求所述的ODN，其特征在于它含有以下序列g(shù)acitt，iacitt，gaictt，iaictt，其中a是脫氧腺苷-一磷酸或-一硫代磷酸，g是脫氧鳥苷-一磷酸或-一硫代磷酸，i是脫氧肌苷-一磷酸或-一硫代磷酸，c是脫氧胞苷-一磷酸或-一硫代磷酸，和t是脫氧胸苷-一磷酸或-一硫代磷酸。
8.如權(quán)利要求1至7中任意一項權(quán)利要求所述的ODN，其特征在于它含有以下序列wdi，wdid，wdidin或，wdidid，其中w，d，i和n的定義如上。
9.如權(quán)利要求1至8中任意一項權(quán)利要求所述的ODN，其特征在于B和E獨立地選自-H、-CH3、-COH、-COCH3、-OH、-CHO、-PO4、-PSO3、-PS2O2、-PS3O、-PS4、-SO3、-PO4-(CH2)1-6-NH2或-PO4-(CH2)1-6-NH-標記物。
10.如權(quán)利要求1至9中任意一項權(quán)利要求所述的ODN作為一種藥物，尤其是作為一種免疫刺激劑的用途。
11.含有如權(quán)利要求1至9中任意一項權(quán)利要求所述的ODN的藥物組合物。
12.含有如權(quán)利要求1至9中任意一項權(quán)利要求所述的ODN和一種抗原的藥物組合物。
13.如權(quán)利要求11或12所述的藥物組合物，其特征在于它還含有一種聚陽離子聚合物，優(yōu)選地是一種聚陽離子肽，尤其是聚精氨酸，聚賴氨酸或一種抗微生物肽，尤其是一種由cathelicidin產(chǎn)生的抗微生物肽或，或一種生長激素，尤其是一種人生長激素。
14.如權(quán)利要求11至13中任一權(quán)利要求所述的藥物組合物，其特征在于它還含有其它的活性成分，尤其是細胞因子，抗炎物質(zhì)，抗微生物物質(zhì)或其混合物。
15.如權(quán)利要求11至14中任一權(quán)利要求所述的藥物組合物，其特征在于它還含有輔助物質(zhì)，尤其是一種藥用載體、緩沖物質(zhì)、穩(wěn)定劑或其混合物。
16.如權(quán)利要求11至15中任一權(quán)利要求所述的藥物組合物，其特征在于它還含有1ng至1g，優(yōu)選地100ng至10mg，尤其是10mg至1mg的一種或多種權(quán)利要求1至9中任一權(quán)利要求所述的ODN。
17.權(quán)利要求1至9中任一權(quán)利要求所述的ODN用于制備一種疫苗的用途。
全文摘要
記載了一種具有式(I)結(jié)構(gòu)的免疫刺激寡脫氧核酸分子(ODN)以及一種含有這種ODN的藥物組合物，式(I)中任何NMP是一種選自脫氧腺苷－、脫氧鳥苷－、脫氧肌苷－、脫氧胞苷－、脫氧尿苷－、脫氧胸苷－、2－甲基－脫氧肌苷－、5－甲基－脫氧胞苷－、脫氧假尿苷－、脫氧核糖嘌呤－、2－氨基－脫氧核糖嘌呤－、6－S－脫氧鳥嘌呤－、2－二甲基－脫氧鳥苷或N－異戊烯基－脫氧腺苷一磷酸或一硫代磷酸的2’脫氧核苷一磷酸或一硫代磷酸，NUC是一種選自脫氧腺苷－、脫氧鳥苷－、脫氧肌苷－、脫氧胞苷－、脫氧尿苷、脫氧胸苷－、2－甲基－脫氧肌苷－、5－甲基－脫氧胞苷、脫氧假尿苷－、脫氧核糖嘌呤－、2－氨基－脫氧核糖嘌呤－、6－S－脫氧鳥嘌呤－、2－二甲基－脫氧鳥苷或N－異戊烯基－脫氧腺苷的2’脫氧核苷，任何X是O或S，a和b是從0至100的整數(shù)，條件是a+b介于4和150之間，B和E是核酸分子的5’或3’端的常用基團。
文檔編號C07H19/24GK1434723SQ01810797
公開日2003年8月6日 申請日期2001年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月8日
發(fā)明者W·施密狄特, K·林格諾, C·舍拉克, A·艾格耶德 申請人:英特塞爾生物醫(yī)藥研究發(fā)展股份公司