專利名稱：一種貫葉連翹提取物的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種從貫葉連翹或其同屬其它植物中制備含金絲桃素類、貫葉金絲桃素和黃酮類三大活性成分，且活性成分總含量≥50％的提取物的方法。
背景技術：
貫葉連翹(又稱貫葉金絲桃)Hypericum perforatum L.是藤黃科金絲桃屬植物。金絲桃素、貫葉金絲桃素與黃酮類化合物是其抗抑郁或抗焦慮的主要活性成分或藥效成分。貫葉連翹提取物在德國已經(jīng)臨床用于治療中、輕度抑郁癥。
金絲桃素(Hypericin)具有抗病毒、抗腫瘤、抗抑郁等藥理作用。分子量504.43，為藍黑色針狀結晶(吡啶—含HCl甲醇)，熔點320℃(分解)，易溶于吡啶或其他有機胺類呈橙紅色并帶紅色熒光，不溶于多數(shù)有機溶劑，可溶于堿性水溶液。對光、氧不穩(wěn)定。天然金絲桃素的植物來源主要是金絲桃屬植物，包括貫葉連翹Hypericum perforatum L.、連州小連翹H.lianzhouense、趕山鞭H.attenuatum、小連翹H.erectum、滇南金絲桃Hypericum austroyunnanicum，等。
貫葉金絲桃素(Hyperforin)具有抗抑郁和抗菌作用。Muller等證明貫葉金絲桃素在納摩爾濃度(10-9mol/l)水平不但能抑制5-HT，NE，DA的再攝取，而且還能誘導皮質β-腎上腺素受體表達的負調控。和其他傳統(tǒng)的5-HT，NE抑制劑不同的是，貫葉金絲桃素能抑制所有三種單胺。Bhattacharya等研究表明，貫葉金絲桃素與抗抑郁藥及抗焦慮藥在動物抑郁的實驗模型中的活性類似，貫葉金絲桃素能提高在強迫游泳實驗和非幫助學習實驗中動物抗抑郁的能力。其分子量536.77，熔點79~80℃，對光、熱和空氣不穩(wěn)定，易氧化。
貫葉連翹中黃酮類化合物含量為9.25％，多以甙類形式存在，主要包括黃酮醇甙、黃酮醇、雙黃酮、原花青素和咕噸酮類。黃酮醇甙有金絲桃甙、蘆丁、異槲皮甙、槲皮甙，黃酮醇有槲皮素，以及山奈黃素(kaempferol)、楊梅黃素(myricetin)。黃酮醇類，尤其黃酮醇甙元具有解痙活性，而且顯示明顯的體外MAO-A(單胺氧化酶-A)抑制作用，如槲皮素、山奈黃素和槲皮甙。黃酮類，尤其是不含3-OH的黃酮類，能與benzodiazepin受體結合，推測貫葉連翹中的黃酮類也以這種方式發(fā)揮作用。貫葉連翹中黃酮類化合物的結構與MAO抑制劑類抗抑郁藥toloxtone和溴法羅明(brofaromine)相似。
貫葉連翹中發(fā)現(xiàn)兩種二聚黃酮化合物I3，II8-Biapigenin(0.1-0.5％)和阿曼托黃素(I3’，II8-Biapigenin，0.01-0.05％)。它們僅存于芽和花中，具有中樞鎮(zhèn)靜活性，阿曼托黃素在體外與腦benzodiazepin受體結合，顯示部分激動劑效應，其親和力與地西泮(diazepam)相似。咕噸酮是藤黃科植物的典型成分。貫葉連翹根部含0.01％的kielcorin，葉和莖中含痕量的1，3，6，7-四羥基咕噸酮。1，3，6，7-四羥基咕噸酮在95μmol/L的濃度可99％抑制MAO-A。
目前，貫葉連翹提取物的制備方法有多種，以乙醇為溶劑的提取方法最為常用，該法的缺點是，提取物中金絲桃素的含量低，而原料中金絲桃素的含量隨產地，品種，采集期的不同又有很大差異(0.01-0.06％)，有時難以得到合格產品。用氫氧化鈉溶液的提取方法，盡管有著成本低廉，工藝簡單，環(huán)保等優(yōu)點，但用該提取方法所得到的提取物所含成分的種類與含量與乙醇提取物有很大差別，其藥效尚待進一步驗證。另外還有超聲浸提法，加抗氧化劑法等等，各有其自身優(yōu)點，但他們都有一個共同的缺點，就是金絲桃素的含量低(0.2-0.6％)，絕大部分為無效成分。目前，貫葉連翹提取物的質量控制指標為含金絲桃素類成分不得低于0.3％。這種提取物還達不到中國國家二類新藥原料藥的質量要求，同時也忽視了貫葉金絲桃素類、黃酮類等有效成分在提取物中的價值。因此，有必要對制備方法進行改進，通過有效的方法富集三大類活性成分，使提取物中總活性成分的含量≥50％。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種貫葉連翹提取物的制備方法，從貫葉連翹或其同屬其它植物中提取制備含金絲桃素類、貫葉金絲桃素和黃酮類三大活性成分，且活性成分總含量≥50％的提取物。
本發(fā)明的貫葉連翹提取物的制備方法包括以下步驟(1)取金絲桃屬植物貫葉連翹Hypericum perforatum L.或同屬其它植物地上有花有葉部分或近頂端部分，用含1-5％復合穩(wěn)定劑的極性有機溶劑在低于45℃，并不斷攪拌下浸提1-3次，每次溶劑用量2-10倍生藥量，過濾，合并提取液；所用極性有機溶劑為醇類、酮類、醇水混合物、酮水混合物或酮醇水以任意比例混合物；其中醇類通常為甲醇、乙醇、丙醇或異丙醇，酮類通常為丙酮；所說的復合穩(wěn)定劑為VC或VC的衍生物和VE或VE的衍生物與有機酸的混合體，混合比例為VC或VC的衍生物∶VE或VE的衍生物∶有機酸＝20～200∶20～200∶1(質量比)；其中有機酸通常為檸檬酸、酒石酸或苯甲酸，或它們任意比的混合物；(2)將所得提取液減壓濃縮至含生藥量0.1-0.5克/毫升，加水至含水量為20-60％，用非極性溶劑萃取1-3次，每次用溶劑量1-6倍體積，合并萃取液；所用非極性溶劑為乙醚、烷烴類、環(huán)烷烴類或它們任意比的混合溶劑；其中烷烴類通常為石油醚、正戊烷、正己烷或正庚烷，環(huán)烷烴類通常為環(huán)戊烷或環(huán)己烷；(3)將(2)中萃取后的母液在低于45℃下減壓回收(1)中提取時所用溶劑，然后用揮發(fā)性酸溶液調節(jié)pH為0-4，4-25℃下靜置24-72小時，過濾，取沉淀；將所得沉淀經(jīng)水洗至中性后干燥，得到金絲桃素類和黃酮類成分總含量≥50％的提取物A；所用揮發(fā)性酸為鹽酸或醋酸，或它們之間以任意比混合；(4)將(2)中萃取后的萃取液用pH≥8.5的堿醇溶液堿化后靜置分層，取堿醇層用任意一種酸溶液調pH為0-4；再用非極性溶劑萃取1-3次，每次用溶劑量為1-3倍體積，取非極性溶劑萃取液，在低于45℃下減壓回收溶劑，得到貫葉金絲桃素類總含量≥50％的提取物B；所用堿醇溶液為水可溶性堿的10-80％乙醇溶液；所說的水可溶性堿通常為KOH、NaOH、K2CO3、Na2CO3、KHCO3或NaHCO3；所用非極性有機溶劑為乙醚、烷烴類、環(huán)烷烴類或它們任意比的混合溶劑；其中烷烴類通常為石油醚、正戊烷、正己烷或正庚烷，環(huán)烷烴類通常為環(huán)戊烷或環(huán)己烷；(5)將(3)和(4)中得到的提取物A和提取物B加入1-5％的復合穩(wěn)定劑，在極性有機溶劑中混合均勻，再回收溶劑即得活性成分總含量≥50％的貫葉連翹提取物；所用極性有機溶劑為醇類、酮類、醇水混合物、酮水混合物或酮醇水以任意比例混合物；其中醇類通常為甲醇、乙醇、丙醇或異丙醇，酮類通常為丙酮；所用復合穩(wěn)定劑與步驟(1)中相同。
本發(fā)明所得提取物中的金絲桃素和貫葉金絲桃素的含量測定采用HPLC法，金絲桃素類和黃酮類的含量測定采用紫外—可見分光光度法。
本發(fā)明所得提取物中總金絲桃素含量為1-3％wt，總黃酮含量為30-50％wt，貫葉金絲桃素的含量為20-40％wt。
本發(fā)明所得的貫葉連翹提取物具有顯著的抗抑郁活性，可作為以貫葉連翹為藥材生產的抗抑郁藥物或功能食品的原料。
本發(fā)明與已有技術相比，其特點在于(1)所得提取物含金絲桃素類、貫葉金絲桃素和黃酮類三大活性成分，且活性成分總含量≥50％；(2)本發(fā)明是根據(jù)貫葉連翹中金絲桃素類和黃酮類化合物分子中有多個酚羥基的存在而極性較高，貫葉金絲桃素類分子中有多個異戊二烯取代基的存在而極性較低，從而選擇合適的溶劑從混合提取液中采用兩相萃取的方法將其分離。再分別利用它們的酸堿性進行純化，分別得到高含量金絲桃素類和黃酮類的提取物A和高含量貫葉金絲桃素的提取物B，然后合并兩種提取物而得到三大類活性成分總含量≥50％的貫葉連翹提取物。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發(fā)明作進一步說明。
實施例1取貫葉連翹藥材粉末1100g，用丙酮在室溫并不斷攪拌下浸提3次，溶劑用量依次為4000ml、3000ml、2500ml。過濾，合并提取液，得提取液7800ml。提取液加蒸餾水2300ml后，每次用石油醚5000ml萃取，共萃取2次，合并萃取液。取丙酮水層50℃減壓回收丙酮，水相10％鹽酸酸化至pH＝2，4℃靜置48小時，離心，沉淀水洗至中性后冷凍干燥，得褐色沉淀8.68g。濃縮石油醚相至2200ml，用3000ml 50％乙醇萃取，棄去醇水相。用含3％NaOH的50％乙醇溶液萃取石油醚相，10％鹽酸酸化至pH＝2，用3000ml石油醚萃取酸醇相，共萃取2次，合并石油醚相，45℃以下回收石油醚，得黑色粘稠浸膏12.3g。將褐色沉淀與黑色浸膏混合，丙酮溶解，加入復合穩(wěn)定劑(VC∶VE∶檸檬酸20∶100∶1)0.5g，在低于45℃下減壓回收溶劑并真空干燥，得貫葉連翹提取物。其中含貫葉金絲桃素28.4％，金絲桃素類2.1％，黃酮類32.8％，三者含量總和63.3％。
實施例2取貫葉連翹藥材粉末400g，用含1％復合穩(wěn)定劑(VC∶VE∶檸檬酸100∶50∶1)的丙酮在室溫并不斷攪拌下浸提3次，溶劑用量分別為2000ml、1500ml、1500ml。過濾，合并提取液，得提取液4200ml。提取液加蒸餾水1500ml后，每次用正己烷1000ml萃取，共萃取2次，合并萃取液。取丙酮水層50℃減壓回收丙酮，水相10％鹽酸酸化至pH＝0，4℃靜置72小時，離心，沉淀水洗至中性后真空干燥，得深褐色提取物B.84g。正己烷相加入0.5％維生素E，濃縮至800ml，用600ml 50％乙醇萃取2次，棄去醇水相。用含5％NaHCO3的60％乙醇溶液萃取石油醚相，10％硫酸酸化至pH＝2，用500ml正己烷萃取酸醇相，共萃取2次，合并正己烷相，45℃以下減壓回收正己烷，得黑色粘稠浸膏5.01g。將所得褐色沉淀與黑色浸膏混合，95％乙醇溶解，加入復合穩(wěn)定劑(VC∶VE∶檸檬酸100∶50∶1)0.2g，在低于45℃下減壓回收溶劑并真空干燥，得貫葉連翹提取物。其中含貫葉金絲桃素33.4％，金絲桃素類1.8％，黃酮類41.3％，三者含量總和76.5％。
實施例3取貫葉連翹藥材粉末500g，用含3％穩(wěn)定劑(VC的棕櫚酸酯∶VE∶苯甲酸200∶20∶1)的95％乙醇在室溫并不斷攪拌下浸提3次，溶劑用量分別為2500ml、1800ml、1800ml。過濾，合并提取液，得提取液5200ml。提取液加蒸餾水1800ml后，每次用乙醚980ml萃取，共萃取2次，合并萃取液。醇水層70℃減壓回收乙醇，水相10％鹽酸酸化至pH＝0，4℃靜置72小時，離心，沉淀水洗至中性后冷凍干燥，得深褐色提取物4.56g。乙醚相加入維生素E至含量為1％，用600ml 50％乙醇萃取2次，棄去醇水相。用含5％NaOH的50％乙醇溶液萃取乙醚相，10％鹽酸酸化至pH＝0，用500ml含1％維生素E的正己烷萃取酸醇相，共萃取2次，合并正己烷相，45℃以下減壓回收正己烷，得黑色粘稠浸膏6.96g。將褐色沉淀與黑色浸膏混合，95％乙醇溶解，加入復合穩(wěn)定劑(VC的棕櫚酸酯∶VE∶苯甲酸200∶20∶1)0.35g，在低于45℃下減壓回收溶劑并真空干燥，得貫葉連翹提取物。其中含貫葉金絲桃素24.6％，金絲桃素類0.9％，黃酮類32.9％，三者含量總和58.4％。
實施例4取貫葉連翹藥材粉末500g，用丙酮在室溫并不斷攪拌下浸提3次，溶劑用量分別為2500ml、1800ml、1800ml。過濾，合并提取液，得提取液5100ml。提取液加蒸餾水1800ml后，每次用石油醚1000ml萃取，共萃取2次，合并萃取液。醇水層70℃減壓回收乙醇，水相10％鹽酸酸化至pH＝0，4℃靜置72小時，離心，沉淀水洗至中性后真空干燥，得深褐色提取物3.66g。石油醚相用600ml 50％乙醇萃取2次，棄去醇水相。含5％NaOH的50％乙醇溶液萃取石油醚相，10％鹽酸酸化至pH＝0，用500ml正己烷萃取酸醇相，共萃取2次，合并正己烷相，55℃減壓回收正己烷，得黑色粘稠浸膏5.11g。將褐色沉淀與黑色浸膏混合，95％乙醇溶解，加入復合穩(wěn)定劑(VC∶VE∶苯甲酸50∶200∶1)0.35g，在低于55℃下減壓回收溶劑并真空干燥，得貫葉連翹提取物。其中含貫葉金絲桃素21.3％，金絲桃素類1.6％，黃酮類31.9％，三者含量總和54.8％。
實施例5本發(fā)明所得提取物的抗抑郁活性試驗5.1實驗材料與方法采用大鼠強迫性游泳和小鼠懸尾兩種實驗模型，驗證貫葉連翹提取物的抗抑郁活性。實驗動物為Wistar大鼠，190-210g和NIH種小鼠18-22g由中國廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。
實驗用藥物為本發(fā)明中實施例1所得貫葉連翹提取物，臨用前0.3％CMCNa配制；對照品為鹽酸丙米嗪(上海九福藥業(yè)有限公司)和鹽酸阿米替林(常州四藥制藥有限公司)，臨用前用蒸餾水配制。
我們采用的動物模型是大鼠強迫性游泳實驗和小鼠懸尾實驗。
統(tǒng)計學數(shù)據(jù)用x±SD表示，實驗數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計軟件進行組間t檢驗。
5.2實驗結果(1)對大鼠強迫性游泳的影響阿米替林20mg/kg，i.p.顯著減少大鼠游泳不動時間，同樣，貫葉連翹提取物也能明顯縮短大鼠游泳不動時間。結果見表1。
(2)對小鼠懸尾不動時間的影響i.p.丙米嗪10mg/kg顯著減少小鼠懸尾不動時間，同樣，貫葉連翹提取物也有類似的結果。實驗結果見表2。
表1貫葉連翹提取物對大鼠強迫性游泳不動時間的影響(x±SD)

表2貫葉連翹提取物對小鼠懸尾不動時間的影響(x±SD)

5.3結論強迫性游泳是一種經(jīng)典的抑郁模型，小鼠懸尾實驗是藥物通過影響懸尾小鼠的不動時間來評價其抗抑郁效果的。本發(fā)明所得貫葉連翹提取物在這兩種抑郁模型上均顯示出明顯的抗抑郁作用。
權利要求
1.一種貫葉連翹提取物的制備方法，包括以下步驟(1)取金絲桃屬植物貫葉連翹或同屬其它植物地上有花有葉部分或近頂端部分，用含1-5％復合穩(wěn)定劑的極性有機溶劑在低于45℃，并不斷攪拌下浸提1-3次，每次溶劑用量2-10倍生藥量，過濾，合并提取液；所用極性有機溶劑為醇類、酮類、醇水混合物、酮水混合物或酮醇水以任意比例混合物；所說的復合穩(wěn)定劑為VC或VC的衍生物、VE或VE的衍生物與有機酸的混合體，混合比例為20～200∶20～200∶1質量比；(2)將所得提取液減壓濃縮至含生藥量0.1-0.5克/毫升，加水至含水量為20-60％，用非極性溶劑萃取1-3次，每次用溶劑量1-6倍體積，合并萃取液；所用非極性溶劑為乙醚、烷烴類或環(huán)烷烴類，或它們的任意比混合溶劑；(3)將(2)中萃取后的母液在低于45℃下減壓回收(1)中提取時所用溶劑，然后用揮發(fā)性酸溶液調節(jié)pH為0-4，4-25℃下靜置24-72小時，過濾，取沉淀；將所得沉淀經(jīng)水洗至中性后干燥，得到金絲桃素類和黃酮類成分總含量≥50％的提取物A；所用揮發(fā)性酸為鹽酸或醋酸，或它們之間以任意比混合；(4)將(2)中萃取后的萃取液用pH≥8.5的堿醇溶液堿化后靜置分層，取堿醇層調pH為0-4；再用非極性溶劑萃取1-3次，每次用溶劑量為1-3倍體積，取非極性溶劑萃取液，在低于45℃下減壓回收溶劑，得到貫葉金絲桃素類總含量≥50％的提取物B；所用堿醇溶液為水可溶性堿的10-80％乙醇溶液；(5)將(3)和(4)中得到的提取物A和提取物B加入1-5％的復合穩(wěn)定劑，在極性有機溶劑中混合均勻，再回收溶劑即得含貫葉金絲桃素、金絲桃素類和黃酮類三大活性成分總量≥50％的貫葉連翹提取物；所用極性有機溶劑及復合穩(wěn)定劑與步驟(1)相同。
2.按照權利要求1所述的方法，其特征是所說的極性有機溶劑中的醇類為甲醇、乙醇、丙醇或異丙醇，酮類為丙酮。
3.按照權利要求1所述的方法，其特征是所說的復合穩(wěn)定劑中的有機酸為檸檬酸、酒石酸或苯甲酸，或它們的任意比混合物。
4.按照權利要求1所述的方法，其特征是所說的非極性溶劑中的烷烴類為石油醚、正戊烷、正己烷或正庚烷，環(huán)烷烴類為環(huán)戊烷或環(huán)己烷。
5.按照權利要求1所述的方法，其特征是所說的堿醇溶液所用的水可溶性堿為KOH、NaOH、K2CO3、Na2CO3、KHCO3或NaHCO3。
6.按照權利要求1至5之一所述的方法，其特征是所得的提取物中總金絲桃素含量為1-3％wt，總黃酮含量為30-55％wt，貫葉金絲桃素的含量為20-40％。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從貫葉連翹或其同屬其它植物中制備含金絲桃素類、貫葉金絲桃素和黃酮類三大活性成分，且活性成分總含量≥50％的提取物的方法。利用金絲桃素類、貫葉金絲桃素與黃酮類三個主要有效成分的極性差異，選擇非極性溶劑從極性溶劑總提取液中進行兩相萃取方法將其分離，再利用有效成分的酸堿性差異分別純化，分別得到高含量金絲桃素類和黃酮類的提取物A和高含量貫葉金絲桃素的提取物B。溶解法合并兩種提取物即得到三大類活性成分總含量不低于50％的貫葉連翹提取物。該提取物具有顯著的抗抑郁活性，可作為以貫葉連翹為藥材生產的抗抑郁藥物或功能食品的原料。
文檔編號C07C50/36GK1392129SQ02134380
公開日2003年1月22日 申請日期2002年7月18日 優(yōu)先權日2002年7月18日
發(fā)明者楊得坡, 王發(fā)松, 黃亞東, 胡海燕 申請人:中山大學