專利名稱：苯基取代的三唑及其作為選擇性alk5激酶抑制劑的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及苯基取代的三唑，該三唑?yàn)檗D(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(″TGF″)-β信號(hào)通道的抑制劑，特別是I型或活化素樣激酶(″ALK″)-5受體對(duì)smad2或smad3磷酸化的抑制劑，其制備方法，以及其醫(yī)學(xué)應(yīng)用。
TGF-β1為包括TGF-β、活化素、抑制素、骨形成蛋白及Müllerian抑制物質(zhì)的細(xì)胞因子家族的原型成員，其信號(hào)經(jīng)由一族單層跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶受體轉(zhuǎn)導(dǎo)。這些受體可分為兩類，I型或活化素樣激酶(ALK)受體及II型受體。ALK受體與II型受體的區(qū)別在于ALK受體(a)缺乏富含絲氨酸/蘇氨酸的細(xì)胞內(nèi)尾部，(b)具有絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，I型受體之間該結(jié)構(gòu)域高度同源及(c)擁有稱為GS結(jié)構(gòu)域的共同基序，該序列由富含甘氨酸及絲氨酸殘基的區(qū)域組成。GS結(jié)構(gòu)域位于細(xì)胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域的氨基端，對(duì)由II型受體引起的激活非常關(guān)鍵。數(shù)項(xiàng)研究表明TGF-β的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)同時(shí)需要ALK及II型受體。具體而言，II型受體在TGF-β的存在下磷酸化TGF-β的I型受體-ALK5的GS結(jié)構(gòu)域。ALK5隨后磷酸化位于細(xì)胞質(zhì)的蛋白質(zhì)smad2及smad3的兩個(gè)羧基端絲氨酸。一般而言，據(jù)信在許多物種中，II型受體調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及I型受體調(diào)節(jié)基質(zhì)生成。因而，本發(fā)明優(yōu)選的化合物可選擇性地抑制I型受體，進(jìn)而抑制基質(zhì)生成，而不影響II型受體介導(dǎo)的增殖。
TGF-β1軸的活化及細(xì)胞外基質(zhì)的擴(kuò)張為慢性腎病及血管疾病發(fā)生發(fā)展的早期及持續(xù)性因素。Border W.A.，Noble N.A.，N.Engl.J.Med.，Nov.10，1994；331(19)1286-92。此外，通過(guò)TGF-β1受體ALK5對(duì)smad3的磷酸化作用，TGF-β1在形成纖維連接蛋白、血纖維蛋白溶酶原激活因子抑制劑-1，鞏膜沉積物的成分的形成中發(fā)揮作用。Zhang Y.，F(xiàn)eng X.H.，Derynck R.，Nature，Aug.27，1998；394(6696)909-13；Usui T.，Takase M.，Kaji Y.，SuzukiK.，Ishida K.，Tsuru T.，Miyata K.，Kawabata M.，Yamashita H.，Invest.Ophthalmol. Vis.Sci.，Oct.1998；39(11)1981-9。
腎臟及心血管系統(tǒng)的進(jìn)行性纖維化是罹病及死亡主要原因，也是醫(yī)療成本增加的重要原因。TGF-β1與許多腎臟纖維化疾病有關(guān)。Border W.A.，Noble N.A.，N.Engl.J.Med.，Nov 10，1994；331(19)1286-92。TGF-β1在下述疾病中升高急慢性腎小球腎炎，Yoshioka K.，Takemura T.，Murakami K.，Okada M.，Hino S.，Miyamoto H.，Maki S.，Lab.Invest.，F(xiàn)eb.1993；68(2)154-63，糖尿病腎病，Yamamoto，T.，Nakamura，T.，Noble，N.A.，Ruoslahti，E.，Border，W.A.，(1993) PNAS 901814-1818，同種異體移植物排斥，HIV腎病及血管緊張素誘導(dǎo)的腎病，Border W.A.，Noble N.A.，N.Engl.J.Med，Nov.10，1994；331(19)1286-92。在這些疾病中，TGF-β1的表達(dá)水平與細(xì)胞外基質(zhì)的生成是一致的。三方面的證據(jù)表明了TGF-β1與基質(zhì)生成的因果關(guān)系。第一，在體外，外源性TGF-β1可誘導(dǎo)正常的腎小球、腎小球系膜細(xì)胞及非腎細(xì)胞生成細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，并抑制蛋白酶的活性。第二，對(duì)抗TGF-β1抗體的中和可阻止患腎病大鼠細(xì)胞外基質(zhì)的累積。第三，TGF-β1轉(zhuǎn)基因小鼠或?qū)GF-β1基因轉(zhuǎn)染入正常大鼠腎臟內(nèi)將導(dǎo)致腎小球硬化的快速產(chǎn)生。KoppJ.B.，F(xiàn)actor VM.，Mozes M.，Nagy P.，Sanderson N.，Bottinger E.P.，KlotmanP.E.，Thorgeirsson S.S.，Lab Invest，June 1996；74(6)991-1003。因而，抑制TGF-β1的活性被視為慢性腎病的一種治療措施。
TGF-β1及其受體水平在損傷血管壁中增加，并在氣囊血管成形術(shù)后的新內(nèi)膜形成中得到體現(xiàn)。Saltis J.，Agrotis A.，Bobik A.，Clin Exp PharmacolPhysiol，Mar.1996；23(3)193-200。此外，TGF-β1為平滑肌細(xì)胞(″SMC″)體外遷徙的強(qiáng)大促進(jìn)因素，并且SMC在動(dòng)脈壁上的遷徙促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化及瓣膜術(shù)后再狹窄的病理進(jìn)程。此外，在內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)物與總膽固醇關(guān)系的多變量分析中，TGF-β受體ALK5與總膽固醇相關(guān)(P＜0.001)，Blann A.D.，Wang J.M.，Wilson P.B.，Kumar S.，Atherosclerosi，F(xiàn)eb.1996；120(1-2)221-6。此外，源自人動(dòng)脈粥樣硬化損傷的SMC具有升高的ALK5/TGF-β的II型受體的比例。由于TGF-β1在纖維增生的血管損傷中過(guò)度表達(dá)，受體不同的細(xì)胞將以一種緩慢但不可控的方式生長(zhǎng)，同時(shí)生成過(guò)量的細(xì)胞外基質(zhì)成分，McCaffrey T.A.，Consigli S.，Du B.，F(xiàn)alcone D.J.，Sanborn T.A.，Spokojny A.M.，Bush H.L.，Jr.，J Clin Invest，Dec.1995；96(6)2667-75。TGF-β1被免疫聚集到活性基質(zhì)合成的動(dòng)脈粥樣硬化損傷的非泡沫狀巨噬細(xì)胞，表明在動(dòng)脈粥樣硬化重構(gòu)過(guò)程中，非泡沫狀巨噬細(xì)胞可能以TGF-β依賴性的機(jī)制參與調(diào)節(jié)基質(zhì)基因的表達(dá)。因而，在動(dòng)脈粥樣硬化及再狹窄中，也體現(xiàn)了抑制TGF-β1對(duì)ALK5的作用。
TGF-β也體現(xiàn)在損傷修復(fù)中。在一些模型上使用中和TGF-β1的抗體表明，在痊愈過(guò)程中通過(guò)限制過(guò)度的疤痕形成，抑制TGF-β1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)損傷后功能的恢復(fù)是有益的。例如，在大鼠中，中和TGF-β1及TGF-β2的抗體減少了疤痕形成，改善了新皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)，該過(guò)程是通過(guò)降低單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的數(shù)量，同時(shí)降低表皮纖維連接蛋白及膠原沉積實(shí)現(xiàn)的，Shah M.，J.Cell.Sci.，1995，108，985-1002。此外，TGF-β抗體也促進(jìn)了兔角膜損傷的痊愈，Moller-Pedersen T.，Curr.Eye Res.，1998，17，736-747，促進(jìn)了大鼠胃潰瘍損傷的愈合，Ernst H.，Gut，1996，39，172-175。這些信息強(qiáng)烈地表明，在許多組織中限制TGF-β的活性將是有益的，同時(shí)也表明，在任何伴有長(zhǎng)期TGF-β升高的疾病中，通過(guò)抑制smad2及smad3的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道將是有益的。
TGF-β也體現(xiàn)在腹膜粘連上，Saed G.M.，et al，Wound Repair Regeneration，1999 Nov-Dec，7(6)，504-510。ALK5抑制劑將有助于防治外科手術(shù)后的腹膜及皮下纖維化粘連。
TGFβ1-抗體可防止移植于裸鼠腎腫瘤的生長(zhǎng)，該過(guò)程的機(jī)制據(jù)認(rèn)為是抗血管生成，Ananth，et al，Journal Of The American Society Of NephrologyAbstract，9433A(Abstract)。然而，腫瘤自身對(duì)TGF-β并不敏感，是腫瘤周圍組織對(duì)TGF-β敏感并通過(guò)分泌TGF-β的腫瘤促新血管的生成支持腫瘤的生長(zhǎng)。因而，拮抗TGF-β通道應(yīng)當(dāng)可以阻止腫瘤的轉(zhuǎn)移以降低癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。
令人吃驚的是，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)一類苯基取代的三唑，其為ALK5激酶的選擇性非肽類強(qiáng)抑制劑，因而，其可用于防治各種經(jīng)由ALK5機(jī)制介導(dǎo)的疾病，如慢性腎病、急性腎病、創(chuàng)傷愈合、關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、腎病、充血性心力衰竭、潰瘍、眼病、角膜損傷、糖尿病型腎病、神經(jīng)機(jī)能受損、阿耳茨海默氏病、動(dòng)脈粥樣硬化、腹膜及皮下粘連、任何以纖維化為主要特征的疾病，包括但不限于肺纖維化、肝纖維化及再狹窄。
以纖維化為主要特征的疾病的實(shí)例，包括但不限于乙型肝炎(HBV)、丙型肝炎(HCV)、酒精誘導(dǎo)的肝炎、血色素沉著病及原發(fā)性膽汁性硬化。
本發(fā)明提供了式(I)的化合物或其可藥用鹽
其中R1為萘基或苯基，其任選被一或多個(gè)選自鹵素、-O-C1-6烷基、-S-C1-6烷基、C1-6烷基、C1-6鹵代烷基、-O-(CH2)n-Ph、-S-(CH2)n-Ph、氰基、苯基及CO2R的取代基取代，其中R為氫原子或C1-6烷基，n為0、1、2或3；或R1為與5-7員的芳香環(huán)或非芳香環(huán)相稠合的苯基或吡啶基，其中，該環(huán)系任選包含多達(dá)3個(gè)雜原子，該雜原子獨(dú)立地選自N、O及S，且N可進(jìn)一步任選被C1-6烷基取代，及其中環(huán)系可任選被＝O取代；R2及R3獨(dú)立地選自H、C1-6烷基、C1-6烷氧基、苯基、NH(CH2)n-Ph、NH-C1-6烷基、鹵素、CN、NO2、CONHR及SO2NHR；X1、X2及X3中的兩個(gè)為N，另一個(gè)為NR4，其中R4為氫原子、C1-6烷基、C3-7環(huán)烷基、-(CH2)p-CN、-(CH2)p-CO2H、-(CH2)p-CONHR5R6、-(CH2)pCOR5、-(CH2)q(OR7)2、-(CH2)pOR5、-(CH2)q-CH＝CH-CN、-(CH2)q-CH＝CH-CO2H、-(CH2)p-CH＝CH-CONHR5R6、-(CH2)pNHCOR8或-(CH2)pNR9R10；R5及R6獨(dú)立地為氫原子或C1-6烷基；R7為C1-6烷基；R8為C1-7烷基，或任選取代的芳基、雜芳基、芳基C1-6烷基或雜芳基C1-6烷基；R9及R10獨(dú)立地選自氫原子、C1-6烷基、芳基及芳基C1-6烷基；p為0-4；及q為1-4。
在式(I)化合物的三唑環(huán)中，很明顯，雙鍵應(yīng)在兩個(gè)未取代的氮原子處。
當(dāng)R1為與5-7員的芳香環(huán)或非芳香環(huán)相稠合的吡啶基時(shí)，吡啶環(huán)的氮原子可處于稠合點(diǎn)。優(yōu)選地，R1為任選取代的萘基或苯基。更優(yōu)選地，R1為任選被一或多個(gè)選自鹵素、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基及苯基取代的苯基；或R1為與5-7員的芳香環(huán)或非芳香環(huán)相稠合的苯基或吡啶基，其中，該環(huán)系任選包含多達(dá)3個(gè)雜原子，該雜原子獨(dú)立地選自N、O及S，且N可進(jìn)一步任選被C1-6烷基取代，及其中的環(huán)系可任選被＝O取代；例如R1表示苯并[1，3]二氧環(huán)戊烯基、2，3-二氫苯并[1，4]二氧雜環(huán)己烯基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并[1，2，5]噁二唑基、苯并[1，2，5]噻二唑基、喹噁啉基、二氫苯并呋喃基、苯并咪唑基、C1-6烷基苯并咪唑基、[1，2，4]三唑并[1，5-a]吡啶基、苯并[1，4]噁嗪-3-酮、苯并噁唑基-2-酮或苯并[1，4]噁嗪。最優(yōu)選地，R1表示4-甲氧苯基、3-氟-4-甲氧苯基、3-氯苯基、3-氟-4-甲氧苯基或3-氯-4-甲氧苯基、或R1表示苯并[1，2，5]噻二唑基、[1，2，4]三唑并[1，5-a]吡啶基、二氫苯并呋喃基、2，3-二氫苯并[1，4]二氧雜環(huán)己烯基、苯并咪唑基、C1-6烷基苯并咪唑基、苯并[1，4]噁嗪-3-酮或苯并[1，4]噁嗪基。
優(yōu)選地，R2位于與三唑連接點(diǎn)的間位，R2優(yōu)選為鹵素，例如氯，C1-6烷基或NO2。更優(yōu)選地，R2為鹵素。
R3優(yōu)選為氫原子或鹵素。
優(yōu)選地，本發(fā)明方法應(yīng)用的化合物分子量小于800，更優(yōu)選地，小于600。
本發(fā)明可能提及的具體化合物包括下列化合物及其可藥用鹽6-[5-(3-氯苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶；6-[5-(3-氟苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶；6-[5-(3-硝基苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶；6-[5-(3-甲基苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶；6-[5-(4-氯苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶；6-[5-(4-氟苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶；6-[5-(4-甲基苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶；6-[5-(3，4-二氟苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶；6-[5-(2-氯苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶；6-[5-(3-氯苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-4H-苯并[1，4]噁嗪-3-酮；5-[5-(3-氯苯基)-2H-[1，2，3]-三唑-4-基]-苯并[1，2，5]噻二唑；5-[5-(3-氟苯基)-2H-[1，2，3]-三唑-4-基]-苯并[1，2，5]噻二唑；5-[5-(3-溴苯基)-2H-[1，2，3]-三唑-4-基]-苯并[1，2，5]噻二唑；4-(3-氯苯基)-5-(4-甲氧苯基)-2H-[1，2，3]三唑；4-(3-氟苯基)-5-(4-甲氧苯基)-2H-[1，2，3]三唑；4-(3-氯苯基)-5-(3-氟-4-甲氧苯基)-2H-[1，2，3]三唑；4-(3-氟苯基)-5-(3-氟-4-甲氧苯基)-2H-[1，2，3]三唑；
6-[5-(3-氯苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-1-甲基-1H-苯并咪唑；4-(3-氯苯基)-5-(3-氯-4-甲氧苯基)-2H-[1，2，3]三唑；及4-(3-氟苯基)-5-(3-氯-4-甲氧苯基)-2H-[1，2，3]三唑。
式(I)化合物合適的可藥用鹽包括但不限于無(wú)機(jī)酸鹽，如鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、二磷酸鹽、氫溴酸鹽及硝酸鹽，包括有機(jī)酸鹽，如蘋果酸鹽、馬來(lái)酸鹽、富馬酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、甲磺酸鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽、棕櫚酸鹽、水楊酸鹽及硬脂酸鹽。
本發(fā)明一些化合物可經(jīng)水或有機(jī)溶劑結(jié)晶或重結(jié)晶。有時(shí)可能形成溶劑合物。在此范圍內(nèi)，本發(fā)明包括化學(xué)計(jì)量的溶劑合物，包括水合物以及諸如冷凍干燥過(guò)程中形成的包含不定量水的化合物。
式(I)一些化合物可以光學(xué)異構(gòu)體的形式存在，例如非對(duì)映異構(gòu)體以及各種比率的異構(gòu)體混合物，例如消旋混合物。本發(fā)明包括所有這些形式，尤其包括純凈的異構(gòu)體形式。不同異構(gòu)體形式可以常用的方法將彼此分離或拆分，或任何既定異構(gòu)體可以常用的合成方法或以立體定向合成方法或以不對(duì)稱合成方法得到。
由于式(I)化合物欲用于藥物組合物，易于理解它們都應(yīng)該達(dá)到基本純凈的形式，例如純度至少為60％，更優(yōu)選至少75％，及優(yōu)選至少85％，尤其至少98％(％為重量百分含量)。制備的不純化合物可用于制備用于藥物組合物的更純凈形式；這些不純化合物應(yīng)當(dāng)包含至少1％，更優(yōu)選至少5％及優(yōu)選至少10％的式(I)化合物或其可藥用鹽。
此處使用的術(shù)語(yǔ)″C1-6烷基″，無(wú)論是其自身或?yàn)檩^大基團(tuán)的一部分，例如C1-6烷氧基，指1～6碳原子的直鏈或支鏈基團(tuán)，除鏈長(zhǎng)另有限制，包括但不限于甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、異丁基及叔丁基。
C1-6鹵代烷基可包括一或多個(gè)鹵原子，尤其C1-6鹵烷基，可提及一個(gè)具體實(shí)例為CF3。
此處使用的術(shù)語(yǔ)″鹵″或″鹵素″均指由鹵原子氯、氟、碘，溴衍生的基團(tuán)。
此處使用的術(shù)語(yǔ)″環(huán)烷基″指環(huán)狀基團(tuán)，優(yōu)選包含3～7個(gè)碳，包括但不限于環(huán)丙基、環(huán)戊基及環(huán)己基。
此處使用的術(shù)語(yǔ)″ALK5抑制劑″指一種化合物，并非指抑制性的smads，例如smad6及smad7，與抑制p38或II型受體相比其更優(yōu)選地選擇性地抑制ALK5受體。
此處使用的術(shù)語(yǔ)″ALK5介導(dǎo)的疾病″指任何由ALK5介導(dǎo)(或調(diào)節(jié))的疾病狀態(tài)，例如通過(guò)抑制TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道中的smad2/3的磷酸化而調(diào)節(jié)的疾病。
此處使用的術(shù)語(yǔ)″潰瘍″包括但不限于糖尿病潰瘍、慢性潰瘍、胃潰瘍及十二指腸潰瘍。
式(I)化合物可以本技術(shù)領(lǐng)域公認(rèn)地工藝方法由已知的或商品化的起始原料制備。若起始原料無(wú)法購(gòu)得，可由此處所述的方法合成或由已知工藝制備。
具體而言，式(I)化合物的制備如方案1所示在碘化亞銅的存在下，使用鈀催化劑將芳基溴(I)與三甲基甲硅烷基乙炔偶合，然后堿性條件下用碳酸鉀消除三甲基硅基，將未保護(hù)的末端乙炔(II)在鈀催化下與溴苯(III)反應(yīng)。將生成的二取代乙炔(IV)以三甲基疊氮硅烷處理得到三唑(V)，其可在碳酸鉀存在條件下被合適的烷基化試劑L-R3烷基化，其中L為離去基團(tuán)，如I。所得的異構(gòu)體可以層析的方法分離。
方案1 制備式(I)化合物的細(xì)節(jié)見(jiàn)實(shí)施例。
在制備化合物(I)的過(guò)程中，中間體的活潑官能團(tuán)，例如羥基、羧基及氨基應(yīng)當(dāng)被保護(hù)。各種活潑官能團(tuán)的保護(hù)方法及最終保護(hù)的衍生物的保護(hù)基的離去方法的詳細(xì)討論可參見(jiàn)如Protective Groups in OrganicChemistry，T.W.Greene及P.G.M.Wut，(Wiley-Interscience，New York，2ndedition，1991)。
式(I)化合物可以單獨(dú)制備或制備成至少包括2個(gè)化合物，如5～1,000化合物的化合物庫(kù)，更優(yōu)選包括10～100個(gè)式(I)的化合物。式(I)化合物庫(kù)可以組合的分離及混合(′split及mix′)方法，或以多重平行的液相或固相化學(xué)合成的方法，利用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)進(jìn)行制備。
因而，本發(fā)明另一方面提供了包括至少2個(gè)式(I)化合物或其可藥用鹽的化合物庫(kù)。
本發(fā)明另一方面提供了一種治療哺乳動(dòng)物中由ALK5受體介導(dǎo)的疾病的方法，包括向需要接受此種治療的哺乳動(dòng)物使用有效量的式(I)化合物或其可藥用鹽。
本發(fā)明另一方面提供了一種用于治療的式(I)化合物或其可藥用鹽。
本發(fā)明另一方面提供了式(I)化合物或其可藥用鹽在用于制備治療哺乳動(dòng)物中由ALK5受體介導(dǎo)的疾病的藥物中的用途。
ALK5機(jī)制介導(dǎo)的疾病，包括但不限于慢性腎病、急性腎病、創(chuàng)傷愈合、關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、腎病、充血性心力衰竭、潰瘍、眼病、角膜損傷、糖尿病型腎病、神經(jīng)機(jī)能受損、阿耳茨海默氏病、動(dòng)脈粥樣硬化、腹膜及皮下粘連、任何以纖維化為主要特征的疾病，包括但不限于肺纖維化、肝纖維化、例如乙型肝炎(HBV)、丙型肝炎(HCV)、酒精誘導(dǎo)的肝炎、血色素沉著病及原發(fā)性膽汁性硬化及再狹窄。
術(shù)語(yǔ)“治療”指預(yù)防新或治療性治療。
本發(fā)明另一方面提供了一種抑制哺乳動(dòng)物TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道的方法，例如抑制以I型或活化素樣激酶ALK-5受體介導(dǎo)的smad2或smad3的磷酸化，該方法包括向需要接受此種治療的哺乳動(dòng)物使用有效量的式(I)化合物或其可藥用鹽。
本發(fā)明另一方面提供了一種通過(guò)抑制哺乳動(dòng)物TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道抑制基質(zhì)形成的方法，例如抑制以I型或活化素樣激酶ALK-5受體介導(dǎo)的smad2或smad3的磷酸化，該方法包括向需要接受此種治療的哺乳動(dòng)物使用有效量的式(I)化合物或其可藥用鹽。
式(I)化合物及可藥用鹽可以常用劑型施用，該劑型的制備方法為根據(jù)本領(lǐng)域熟知的常用方法，將式(I)化合物與標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)載體或稀釋劑相組合。這些方法包括混合、制粒及壓制或?qū)⒑线m的成分溶解以制備理想制劑。
本發(fā)明另一方面提供了一種包括式(I)化合物或其可藥用鹽及可藥用載體或稀釋劑的藥物組合物。
本發(fā)明的藥物組合物可配制成適合以任何途徑向包括人的哺乳動(dòng)物給藥的形式，并包括適于口服、局部或胃腸外給藥的形式。
本發(fā)明的組合物可以制成片劑、膠囊劑、粉劑、顆粒劑、錠劑、乳膏劑或液體制劑，如口服、無(wú)菌的胃腸外給藥的溶液或懸液。
本發(fā)明局部使用的制劑可以是諸如軟膏劑、乳膏劑或洗液、眼膏、滴眼液或滴耳液、浸漬敷料及氣霧劑，并可包含適當(dāng)?shù)某Ｓ锰砑觿绶栏瘎?，藥物穿透促進(jìn)劑及膏劑和乳劑中使用的潤(rùn)滑劑。
制劑也可包含一些可合用的常用載體，如乳劑或膏劑基質(zhì)，用于洗液的乙醇或油醇。這些載體的比例為制劑的1％～98％，更常為約80％。
口服使用的片劑及膠囊劑可制成單位劑量的給藥形式，可包含常用的輔料，如粘合劑，如糖漿、阿拉伯膠、明膠、山梨醇、黃芪膠或聚乙烯吡咯烷酮；填充劑，如乳糖、蔗糖、玉米淀粉、磷酸鈣、山梨醇或甘氨酸；制片潤(rùn)滑劑，如硬脂酸鎂、滑石粉、聚乙二醇或硅石；崩解劑，如馬鈴薯淀粉；或可接受的潤(rùn)濕劑，如十二烷基磺酸鈉。片劑可按照正常的熟知的制藥方法包衣?？诜后w制劑可制成諸如水或油的懸液、溶液、乳液、糖漿劑或酏劑形式，或制成干燥產(chǎn)品，用前以水或其它合適的介質(zhì)重構(gòu)。這些液體制劑可包含常用的添加劑，如助懸劑，如山梨醇、甲基纖維素、葡萄糖糖漿、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠或氫化食用脂肪，乳化劑，如卵磷脂、單油酸山梨聚糖或阿拉伯膠；非水介質(zhì)(可包括食用油)，如杏仁油、油脂如甘油、丙二醇或乙二醇；防腐劑，如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸，及必要時(shí)可加入常用的矯味劑或著色劑。
栓劑包括常用的栓劑基質(zhì)、如可可豆油或其它甘油酯。
不經(jīng)腸胃給藥的制劑，使用化合物及無(wú)菌介質(zhì)，優(yōu)選以水制成流體單位劑型。視使用的基質(zhì)及濃度，化合物可混懸或溶解于介質(zhì)里。制備溶液時(shí)，將化合物溶解于注射水中，在裝瓶或安培及封口前，過(guò)濾除菌。
有利地，諸如局部麻醉劑、防腐劑及緩沖劑能夠溶于介質(zhì)中。為了提高穩(wěn)定度，組合物裝瓶后冷凍，再于真空下除去水分，然后將冷凍干燥的粉末封裝，附帶一瓶注射用水用于使用前的液體的配制。胃腸外給藥的懸液的制備基本相同，除化合物是混懸在介質(zhì)中而不是溶解于其中，且不能過(guò)濾除菌。這些化合物的滅菌可在將其混懸于無(wú)菌介質(zhì)前將其暴露于環(huán)氧乙烷氛圍處理。有利地，組合物包含表面活性劑或潤(rùn)濕劑以有利于化合物的均勻分散。
視不同給藥方法，組合物可包含0.1％重量，優(yōu)選10-60％重量的活性物質(zhì)。此處組合物包含單位劑量，每個(gè)劑量單位優(yōu)選包括50-500mg的活性物質(zhì)。用于成人治療的劑量?jī)?yōu)選每天100～3000mg，例如視給藥途徑及給藥頻率每天1500mg。該劑量相當(dāng)于每天1.5～50mg/kg。合適的劑量范圍為每天5～20mg/kg。
本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白式(I)化合物的最佳質(zhì)量及單次給藥間隔將視不同的疾病及嚴(yán)重程度、制劑、給藥途徑及部位、具體受治的哺乳動(dòng)物而定，并且通過(guò)常規(guī)技術(shù)決定這些最佳值。本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員也應(yīng)當(dāng)明白，最佳療程即式(I)化合物在既定時(shí)間內(nèi)每日的給藥次數(shù)可經(jīng)該領(lǐng)域熟練療程規(guī)范的技術(shù)人員利用常規(guī)的療程決定測(cè)試確定。
當(dāng)式(I)化合物或其可藥用衍生物在上述劑量范圍內(nèi)使用時(shí)，無(wú)毒理學(xué)現(xiàn)象產(chǎn)生。
所有出版物，包括但不限于本說(shuō)明書引用的專利及專利申請(qǐng)，其在此處引入作為參考，一如各自單獨(dú)具體引入此處作為參考一樣公開(kāi)充分。
下列實(shí)施例僅用于闡釋本發(fā)明，不能從任何方面限制本發(fā)明的范圍。在實(shí)施例中，質(zhì)譜利用帶有化學(xué)電離(CI)技術(shù)的Hitachi Perkin-ElmerRMU-6E以及帶有電噴霧質(zhì)譜(ES)技術(shù)的Micromass Platform II進(jìn)行測(cè)定。
簡(jiǎn)寫CuI 碘化亞銅DMF 二甲基甲酰胺EtOAc乙酸乙酯MgSO4硫酸鎂NaHCO3碳酸氫鈉Na2SO4硫酸鈉Pd(PPh3)4四(三苯基磷)鈀(O)THF 四氫呋喃TMEDA 四甲基乙二胺制備1N＇-(5-溴-2-氨基吡啶)-N，N-二甲基甲脒
在氬氣保護(hù)下，將5-溴-2-氨基吡啶(9.8g，56.6mmol，1當(dāng)量)溶于干燥DMF(20ml)及二甲基甲酰胺二甲基縮醛(20ml)溶液中。將溶液于130℃下回流16小時(shí)，冷卻后除去溶劑。所得粗品不經(jīng)純化直接用于下一步；m/z[APCIMS]228.0/230.0[M+H]+。
制備26-溴-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶 在氬氣保護(hù)下，將N＇-(5-溴-2-氨基吡啶)-N，N-二甲基甲脒(16.2g，～56.6mmol，1當(dāng)量)溶于甲醇(90ml)及吡啶(10ml)混合溶液中，冷卻至0℃。攪拌下，加入羥胺-O-磺酸(7.3g，75.2mmol，1.3當(dāng)量)得紫色溶液。升至室溫，攪拌16小時(shí)。除去溶劑后，將所得粗品懸于碳酸氫鈉水溶液(200ml)中，以乙酸乙酯萃取(2×200ml)。有機(jī)層以水和食鹽水(各100ml)洗滌后干燥(MgSO4)，除去溶劑。以硅膠快速層析純化，梯度洗脫初始洗脫比例為40-60℃石油醚乙酸乙酯2∶1～直至40-60℃石油醚乙酸乙酯1∶1洗脫得淡黃色固體(5g，44.6％)；1H NMR(250MHz；CDCl3)δ8.77(1H，s)，8.34(1H，s)，7.69(1H，d)，7.65(1H，d)；m/z[APCIMS]198.0/200.0[M+H]+。
制備36-三甲基甲硅烷基乙炔基-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶 將6-溴-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶(5g，25.26mmol，1當(dāng)量)溶于THF(50ml)種，向溶液中充氬氣5分鐘。加入碘化亞銅(0.46g，2.53mmol，0.1當(dāng)量)、二氯雙(三苯基)膦(0.36g，0.51mmol，0.02當(dāng)量)，及三甲基甲硅烷基乙炔(7.14ml，4.96g，50.52mmol，2當(dāng)量)。滴加入二異丙胺(6.78ml，5.1g，50.52mmol，2當(dāng)量)，將所得深紅色懸液于氬氣下攪拌24小時(shí)。以硅藻土過(guò)濾，以大量乙酸乙酯洗滌，除去溶劑。將所得粗品懸于水(200ml)中，以乙酸乙酯萃取(2×200ml)，合并有機(jī)層，水和食鹽水洗(各100ml)，干燥(MgSO4)，除去溶劑。以硅膠快速層析純化，3∶1的40-60℃石油醚∶乙酸乙酯洗脫得淡黃色固體(2.9g，53.3％)。1HNMR(400MHz；CDCl3)δ8.72(1H，s)，8.36(1H，s)，7.69(1H，d)，7.54，(1H，d)，0.28(9H，s)；m/z[APCIMS]216[M+H]+。
制備46-乙炔基-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶 將6-三甲基甲硅烷基乙炔基-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶(2.9g，13.47mmol，1當(dāng)量)溶于甲醇中，然后加入碳酸鉀(5.6g，40.4mmol，3當(dāng)量)。將懸液攪拌2小時(shí)，除去溶劑。將粗品懸于水(100ml)中，以乙酸乙酯(2×100ml)萃取。合并有機(jī)層，分別以水及食鹽水(各50ml)洗滌，干燥(MgSO4)，除去溶劑得呈微桔紅色的固體(1.8g，95％)，不用純化直接用于下一步反應(yīng)。m/z[APCIMS]144.1[M+H]+。
制備56-(3-氯苯基乙炔基)-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶 在攪拌條件下，將6-乙炔基-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶(693mg，4.846mmol)的TMEDA(15ml)及THF(15ml)溶液以氬氣脫氣。加入Pd(PPh3)4(0.253mg，0.219mmol，0.05當(dāng)量)、CuI(100mg，0.524mmol，0.1當(dāng)量)及3-氯碘苯(2.311g，9.69mmol，2當(dāng)量)。在氬氣條件下，升溫至50℃反應(yīng)16小時(shí)。真空除去溶劑，將粗品在乙酸乙酯(3×70ml)與飽和的NaHCO3水溶液(70ml)之間分配。合并乙酸乙酯層，干燥(Na2SO4)，過(guò)濾，減壓濃縮至干。硅膠層析純化，以比例為(4∶6)的乙酸乙酯∶石油溶劑洗脫得(824mg，67％)黃色固體；CIMS254.1[M+H]+。
制備65-溴苯并[1，2，5]噻二唑 向4-溴苯-1，2-二胺(17g，91mmol)中加入氯化亞砜(200ml)。然后加入一滴DMF。氬氣保護(hù)下升溫至80℃，回流反應(yīng)過(guò)夜。將反應(yīng)液冷卻至室溫，并分批加入到裝有在大燒杯中的冰中并以固體碳酸鉀中和。將混合物在乙酸乙酯與水溶液中分配。合并乙酸乙酯層，干燥(MgSO4)，減壓濃縮除去溶劑。目標(biāo)化合物以硅膠層析分離，以比例為90％乙酸乙酯/10％甲醇洗脫得(12g，62％)。1HNMR(250MHz，CDCl3)δ7.61(1H，dd，J＝9，2Hz)，7.82(1H，d，J＝9Hz)，8.16(1H，s)。
制備7(4-溴-2-硝基苯氧基)乙酸乙酯 室溫?cái)嚢柘拢?-溴-2-硝基酚(3.71g，17.0mmol，1.0當(dāng)量)的DMF(80ml)溶液中加入K2CO3(4.70g，34.0mmol，2.0當(dāng)量)固體。將混合物在40℃加熱3小時(shí)，冷卻至室溫后在EtOAc和水中分配。水相以乙酸乙酯多次萃取，并將合并的有機(jī)層，分別以水及食鹽水洗滌，干燥(MgSO4)。濃縮得到黃色固體(5.01g，97％)，無(wú)需純化直接用于下一步。1HNMR(250MHz；CDCl3)δ8.00(1H，d)，7.62(1H，dd)，6.90(1H，d)，4.76(H，s)，4.26(2H，q)，1.29(3H，t)。
制備86-溴-4H-苯并[1，4]噁嗪-3-酮 室溫?cái)嚢钘l件下，向(4-溴-2-硝基苯氧基)乙酸乙酯(4.01g，13.2mmol，1.0當(dāng)量)的冰乙酸(70ml)溶液中加入鐵粉(14.70g，264.0mmol，20.0當(dāng)量)。將混合物于60℃劇烈攪拌4小時(shí)后，冷卻至室溫。將混合物濾過(guò)Kieselguhr墊，乙酸乙酯洗滌，將溶液濃縮至干。將殘留物在乙酸乙酯(3×70ml)與飽和的NaHCO3水溶液(70ml)中分配。水相以乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯層，水洗、干燥(MgSO4)，濃縮得白色的目標(biāo)化合物(2.90g，97％)，無(wú)需純化直接用于下一步反應(yīng)。1HNMR(250MHz；CDCl3)δ10.79(1H，br.s)7.09-7.01(2H，m)，6.91(1H，d)，4.59(2H，s)。
實(shí)施例實(shí)施例16-[5-(3-氯苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶
在氬氣保護(hù)條件下，以疊氮三甲基硅烷(0.32ml，2.42mmol)處理攪拌的6-(3-氯苯基乙炔基)-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶(制備5)(205mg，0.807mmol)的DMF(1.1ml)溶液，并在130℃加熱9小時(shí)。真空濃縮除去DMF，并將混合物在EtOAc和食鹽水中分配。乙酸乙酯層經(jīng)干燥(Na2SO4)，過(guò)濾，濃縮至干。殘留物以硅膠層析純化，以比例為(2∶1)的石油溶劑∶乙酸乙酯至乙酸乙酯洗脫得類白色固體(83mg，35％)。1HNMR(250MHz；CDCl3)δ8.97(1H，S)，8.42(1H，s)，7.84(1H，d)，7.74(1H，dd)，7.62(1H，d)，7.46(3H，m)；沒(méi)有觀察到NH；m/z[ESMS]297[M+H]+。
實(shí)施例26-[5-(3-氟苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶 使用實(shí)施例1類似的方法，以6-(3-氟苯基乙炔基)-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶(171mg，0.722mmol)制備得到目標(biāo)化合物。1HNMR(400MHz；d6-DMSO，游離堿)δ15.49(NH，br.s)，9.03(1H，s)，8.57(1H，s)，7.93(1H，d)，7.70(1H，d)，7.48-7.27(4H，m)；m/z[ESMS]281[M+H]+。
實(shí)施例36-[5-(3-硝基苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶 使用實(shí)施例1類似的方法，以6-(3-硝基苯基乙炔基)-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶(213mg，0.807mmol)制備得到目標(biāo)化合物。1HNMR(400MHz；d6-DMSO，游離堿)δ15.74(NH，br.s)，9.15(1H，s)，8.59(1H，s)，8.40(1H，s)，8.27(1H，d)，7.95(2H，br.s)，7.73(2H，br.s)；m/z[ESMS]308[M+H]+。
實(shí)施例46-[5-(3-甲基苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶 使用實(shí)施例1類似的方法，以6-(3-甲基苯基乙炔基)-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶(188mg，0.805mmol)制備得到目標(biāo)化合物。1HNMR(250MHz，CDCl3，游離堿)δ9.16(1H，s)，8.43(1H，s)，7.79(2H，d)，7.41-7.28(4H，m)，2.38(3H，s)；沒(méi)有觀察到NH；m/z[ESMS]277[M+H]+。
實(shí)施例56-[5-(4-氯苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶 使用實(shí)施例1類似的方法，以6-(4-氯苯基乙炔基)-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶(102mg，0.40mmol)制備得到目標(biāo)化合物。1HNMR(250MHz；CD3OD，游離堿)δ8.83(1H，s)，8.35(1H，s)，7.73(1H，d)，7.69(1H，d)，7.45(2H，d)，7.36(2H，d)，沒(méi)有觀察到NH；[ESMS]297[M+H]+。
實(shí)施例66-[5-(4-氟苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶
使用實(shí)施例1類似的方法，以6-(4-氟苯基乙炔基)-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶(195mg，0.821mmol)制備得到目標(biāo)化合物。1HNMR(400MHz；CDCl3，游離堿)δ13.45(NH，br.s)，9.12(1H，s)，8.44(1H，s)，7.83(1H，d)，7.74(1H，d)，7.57-7.51(2H，m)7.17-7.10(2H，m)；m/z[ESMS]281[M+H]+。
實(shí)施例76-[5-(4-甲基苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶 使用實(shí)施例1類似的方法，以6-(4-甲基苯基乙炔基)-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶(180mg，0.773mmol)制備得到目標(biāo)化合物。1HNMR(400MHz；DMSO，游離堿)δ15.33(NH，br.s)，8.97(1H，s)，8.54(1H，s)，7.91(1H，d)，7.70(1H，d)，7.44(2H，d)7.27(2H，br.s)，2.45(3H，s)；m/z[ESMS]277[M+H]+。
實(shí)施例86-[5-(3，4-二氟苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶 使用實(shí)施例1類似的方法，以6-(3，4-二氟苯基乙炔基)-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶(139mg，0.545mmol)制備得到目標(biāo)化合物。1HNMR(250MHz；CDCl3，游離堿)δ9.01(1H，s)，8.43(1H，s)，7.83(1H，d)，7.70(1H，d)，7.49-7.40(1H，m)，7.19-7.30(2H，m)，沒(méi)有觀察到NH；m/z[ESMS]299[M+H]+。
實(shí)施例96-[5-(2-氯苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶
使用實(shí)施例1類似的方法，以6-(2-氯苯基乙炔基)-[1，2，4]三唑并[1，5-α]吡啶(189mg，0.746mmol)制備得到目標(biāo)化合物。1HNMR(400MHz；d6-DMSO，游離堿)δ15.63(1H，br.s)，8.74(1H，s)，8.51(1H，s)，7.91(1H，d)，7.68-7.52(5H，m)，m/z[ESMS]297[M+H]+。
實(shí)施例106-[5-(3-氯苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-4H-苯并[1，4]噁嗪-3-酮 攪拌條件下，向6-(3-氯苯基乙炔基)-4H-苯并[1，4]噁嗪-3-酮(0.311g，1.15mmol，1.0當(dāng)量)的干燥DMF(1.5ml)溶液中，加入(三甲基硅烷基)疊氮化合物(0.397g，3.45mmol，3.0當(dāng)量)。混合物以氬氣脫氣5分鐘，然后于密封管中在110℃共加熱72個(gè)小時(shí)。24小時(shí)后，再加入(三甲基硅烷基)疊氮化合物(0.397g，3.45mmol，3.0當(dāng)量)?；旌衔锢鋮s后，在乙酸乙酯與水溶液中分配。水相以乙酸乙酯多次萃取后，合并乙酸乙酯層，分別以水及食鹽水洗滌，干燥(MgSO4)。濃縮得到固體，再經(jīng)硅膠快速層析分離，以50％EtOAc-石油醚至EtOAc梯度洗脫得黃色固體產(chǎn)物(0.063g，17％)。1HNMR(250MHz；DMSO-d6)(NMR，在室溫非常寬)δ10.80(1H，br.s)，7.55-7.35(4H，m)，7.20-6.90(3H，m)，4.63(2H，s)，沒(méi)有觀察到三唑的NH；m/z[ESMS]327.2[M+H]+。
實(shí)施例115-[5-(3-氯苯基-2H-[1，2，3]-三唑-4-基]-苯并[1，2，5]噻二唑
使用實(shí)施例10類似的方法，以5-(3-氯苯基乙炔基)-苯并[1，2，5]噻二唑制備得到目標(biāo)化合物。1HNMR(400MHz，CDCl3)8.22(1H，s)，8.01(1H，d)，7.80(1H，d)，7.37(3H，m)，7.17(1H，t)，沒(méi)有觀察到NH。
實(shí)施例125-[5-(3-氟苯基-2H-[1，2，3]-三唑-4-基]-苯并[1，2，5]噻二唑 使用實(shí)施例10類似的方法，以5-(3-氟苯基乙炔基)-苯并[1，2，5]噻二唑制備得到目標(biāo)化合物。1HNMR(400MHz，CDCl3)8.24(1H，s)，8.04(1H，d)，7.84(1H，d)，7.35(3H，m)，7.15(1H，t)，沒(méi)有觀察到NH。
實(shí)施例135-[5-(3-溴苯基-2H-[1，2，3]-三唑-4-基]-苯并[1，2，5]噻二唑 使用實(shí)施例10類似的方法，以5-(3-溴苯基乙炔基)-苯并[1，2，5]噻二唑制備得到目標(biāo)化合物。1HNMR(400MHz，CDCl3)8.24(1H，s)，8.02(1H，d)，7.80(1H，s)，7.56(1H，d)，7.45(1H，d)，7.26(1H，t)，沒(méi)有觀察到NH；m/z[APCIMS]358/360[M+H+]。
實(shí)施例144-(3-氯苯基)-5-(4-甲氧苯基)-2H-[1，2，3]三唑 使用實(shí)施例10類似的方法，以3-(4-甲氧苯基乙炔基)氯苯制備得到目標(biāo)化合物。1HNMR(400MHz，CDCl3)7.61(1H，m)，7.46(3H，m)，7.30(2H，m)，6.93(2H，m)，3.84(3H，s)，沒(méi)有觀察到NH；m/z[APCIMS]286.2[M+H+]。
實(shí)施例154-(3-氟苯基)-5-(4-甲氧苯基)-2H-[1，2，3]三唑
使用實(shí)施例10類似的方法，以3-(4-甲氧苯基乙炔基)氟苯制備得到目標(biāo)化合物。1HNMR(250MHz，CDCl3)7.47(2H，d)，7.35(3H，m)，6.95(1H，m)，6.92(2H，d)，3.85(3H，s)，沒(méi)有觀察到NH；m/z[APCIMS]270.2[M+H+]。
實(shí)施例164-(3-氯苯基)-5-(3-氟-4-甲氧苯基)-2H-[1，2，3]三唑 使用實(shí)施例10類似的方法，以3-(3-氟-4-甲氧苯基乙炔基)氟苯制備得到目標(biāo)化合物。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ7.60(1H，s)，7.37(5H，m)，6.97(1H，t)，3.92(3H，s)，沒(méi)有觀察到NH；m/z[APCIMS]304.1[M+H+]。
實(shí)施例174-(3-氟苯基)-5-(3-氟-4-甲氧苯基)-2H-[1，2，3]三唑 使用實(shí)施例10類似的方法，以3-(3-氟-4-甲氧苯基乙炔基)-氟苯制備得到目標(biāo)化合物。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ7.33(5H，m)，7.09(1H，m)，6.97(1H，t)，3.93(3H，s)，沒(méi)有觀察到NH；m/z[APCIMS]288.2[M+H+]。
實(shí)施例186-[5-(3-氯苯基)-1H-[1，2，3]三唑-4-基]-1-甲基-1H-苯并咪唑
使用實(shí)施例10類似的方法，以6-(3-氯苯基乙炔基)-1-甲基-1H-苯并咪唑制備得到目標(biāo)化合物。1HNMR(HCl鹽，400MHz，MeOH)δ9.45(1H，s)，8.13(1H，s)，7.89(1H，d)，7.76(1H，d)，7.55(1H，s)，7.44-7.37(3H，m)，4.12(3H，s)，沒(méi)有觀察到NH)；m/z[APCIMS]267[M+H+]。
實(shí)施例194-(3-氯苯基)-5-(3-氯-4-甲氧苯基)-2H-[1，2，3]三唑 使用實(shí)施例10類似的方法，以3-(3-氯-4-甲氧苯基乙炔基)氯苯制備得到目標(biāo)化合物。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ7.60(1H，d)，7.50(1H，d)，7.34(4H，m)，6.93(1H，t)，3.92(3H，s)，沒(méi)有觀察到NH。
實(shí)施例204-(3-氟苯基)-5-(3-氯-4-甲氧苯基)-2H-[1，2，3]三唑 使用實(shí)施例10類似的方法，以3-(3-氯-4-甲氧苯基乙炔基)氟苯(500mg，1.92mmol，1當(dāng)量)制備得到目標(biāo)化合物。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ7.57(1H，d)，7.46(1H，dd)，7.25(3H，m)，7.1(1H，t)，6.94(1H，d)，3.93(3H，s)，沒(méi)有觀察到NH。
生物學(xué)數(shù)據(jù)本發(fā)明化合物的生物活性可采用下述方法測(cè)定評(píng)估ALK5激酶磷酸化smad3的方法向Basic Flash-Plates(NEN Life Sciences)中吸入100微升0.1摩爾碳酸氫鈉(pH7.6)溶液，每100微升包被緩沖液包括150納克谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶-smad3融合蛋白。將板封閉，于室溫溫育10-24小時(shí)。然后將板以200微升包被緩沖液(0.1摩爾碳酸氫鈉)洗滌兩次，空氣中干燥2-4小時(shí)。
向磷酸化反應(yīng)的各孔中加入90微升包含50毫摩爾HEPES緩沖液(pH7.4)；5毫摩爾MgCl2；1毫摩爾CaCl2；1毫摩爾二硫蘇糖醇；100微摩爾三磷酸鳥苷；0.5微Ci/孔γ33P-三磷酸腺苷(NEN Life Sciences)及400納克融合蛋白，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶位于ALK5激酶結(jié)構(gòu)域氮端(GST-ALK5)。背景計(jì)數(shù)時(shí)不加入任何GST-ALK5。在不同的化合物存在下，通過(guò)測(cè)定酶活性評(píng)估ALK5抑制劑。板于30℃溫育3小時(shí)。溫育后，吸出除去測(cè)定緩沖液，各孔皆以200微升冷10毫摩爾焦磷酸鹽的磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次，洗滌完畢將板吹干。然后，利用Packard Top Count計(jì)數(shù)。
熒光各向異性激酶結(jié)合測(cè)定將激酶、熒光配體及各種濃度的測(cè)試化合物一起溫育，直至達(dá)到熱力學(xué)平衡，條件為在無(wú)測(cè)試化合物條件下，熒光配體顯著地為酶結(jié)合的(＞50％)，在足夠濃度(＞10×Ki)的強(qiáng)效抑制劑存在條件下，測(cè)得未結(jié)合的熒光配體的各向異性與結(jié)合值不同。
激酶濃度優(yōu)選≥1×Kf。所需的熒光配體濃度視使用的儀器及熒光以及物理化學(xué)性質(zhì)而定。使用的濃度必須低于激酶的濃度，優(yōu)選低于激酶濃度的一半。常規(guī)的方法為將所有組分溶于組成為50mM HEPE，pH7.5、1mM CHAP、1mM DTT、10mM MgCl2、2.5％DMSO緩沖溶液中。
ALK5酶濃度4nM熒光配體濃度1nM測(cè)試化合物濃度0.1nM-100uM將組分在10ul微升終體積中在LJL HE 384 B型黑色微量滴定板中溫育直至達(dá)到平衡(5-30分鐘)。
在LJL Acquest中讀取熒光各向異性。
定義Ki＝抑制劑結(jié)合的離解常數(shù)Kf＝熒光配體結(jié)合的離解常數(shù)熒光配體為下列化合物 其衍生自5-[2-(4-氨基甲基苯基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-4-基]-2-氯苯酚及若丹明綠。
基質(zhì)標(biāo)記物的抑制Northern Blot方法酶測(cè)定中確定的活性數(shù)據(jù)按照如下得到A498腎上皮腫瘤細(xì)胞系自ATCC處獲得，生長(zhǎng)于EMEM培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基加有10％胎牛牛血清、青霉素(5units/ml)及鏈霉素(5ng/ml)。當(dāng)A498細(xì)胞在100mm皿中生長(zhǎng)接近融合時(shí)，24小時(shí)不加入血清，以化合物預(yù)處理4小時(shí)后，加入10ng/ml TGF-β(R&D System，Inc.，Minneapolis MN)。將細(xì)胞接觸TGF-β124小時(shí)后，以酸苯酚/氯仿提取細(xì)胞RNA(Chomczynski及Sacchi，1987)。將10微克的總RNA以瓊脂糖凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至尼龍膜(Gene Screen，NEN Life Science，Boston MA)上。將膜用32P標(biāo)記cDNA探針(Stratagene，LaJolla，CA)檢測(cè)纖維連接蛋白mRNA。將膜暴露于磷顯影板，所觀察的帶以Image Quant軟件(MolecularDynamic，Sunnyvale，CA)定量。
基質(zhì)標(biāo)記物的抑制Western Blot方法酶測(cè)定中確定的活性數(shù)據(jù)按照如下得到當(dāng)細(xì)胞在瓶中接近融合時(shí)，不加血清過(guò)夜，以TGF-β及化合物處理。處理24小時(shí)或48小時(shí)后以冰冷的磷酸緩沖鹽溶液洗滌，然后向板中加入500微升2X載樣緩沖液，刮擦下的細(xì)胞收集于微離心管中。(2X載樣緩沖液100mM Tris-Cl，pH6.8、4％十二烷基磺酸鈉、0.2％溴酚藍(lán)、20％甘油、5％β-巰基乙醇)。將細(xì)胞在管中裂解并渦旋。樣品煮沸10分鐘后，將20微升樣品加入至7.5％聚乙酰胺凝膠(BioRad)并電泳。
通過(guò)半干印跡將在凝膠上大小分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝基纖維素膜上。將膜在含5％奶粉的磷酸緩沖液(PBS)及Tween-20中4℃封閉過(guò)夜。以PBS/Tween洗滌膜3次后，室溫下以一級(jí)抗體溫育4小時(shí)。以PBS/Tween洗滌膜3次后，室溫下以二級(jí)抗體溫育1小時(shí)。最后，以Amersham的ECL檢測(cè)試劑盒使信號(hào)顯色。
本發(fā)明化合物一般顯示出調(diào)節(jié)ALK5受體的活性，IC50值為0.0001～10μM。
權(quán)利要求
1.式(I)的化合物或其可藥用鹽 其中R1為萘基或苯基，其任選被一或多個(gè)選自鹵素、-O-C1-6烷基、-S-C1-6烷基、C1-6烷基、C1-6鹵代烷基、-O-(CH2)n-Ph、-S-(CH2)n-Ph、氰基、苯基及CO2R的取代基取代，其中R為氫原子或C1-6烷基，n為0、1、2或3；或R1為與5-7員的芳香環(huán)或非芳香環(huán)相稠合的苯基或吡啶基，其中，該環(huán)系任選包含多達(dá)3個(gè)雜原子，該雜原子獨(dú)立地選自N、O及S，且N可進(jìn)一步任選被C1-6烷基取代，及其中環(huán)系可任選被＝O取代；R2及R3獨(dú)立地選自H、C1-6烷基、C1-6烷氧基、苯基、NH(CH2)n-Ph、NH-C1-6烷基、鹵素、CN、NO2、CONHR及SO2NHR；X1、X2及X3中的兩個(gè)為N，另一個(gè)為NR4，其中R4為氫原子、C1-6烷基、C3-7環(huán)烷基、-(CH2)p-CN、-(CH2)p-CO2H、-(CH2)p-CONHR5R6、-(CH2)pCOR5、-(CH2)q(OR7)2、-(CH2)pOR5、-(CH2)q-CH＝CH-CN、-(CH2)q-CH＝CH-CO2H、-(CH2)p-CH＝CH-CONHR5R6、-(CH2)pNHCOR8或-(CH2)pNR9R10；R5及R6獨(dú)立地為氫原子或C1-6烷基；R7為C1-6烷基；R8為C1-7烷基，或任選取代的芳基、雜芳基、芳基C1-6烷基或雜芳基C1-6烷基；R9及R10獨(dú)立地選自氫原子、C1-6烷基、芳基及芳基C1-6烷基；p為0-4；及q為1-4。
2.權(quán)利要求1所述的化合物，其中R1為任選被鹵素取代的苯基，或R1為與5-7員的芳香環(huán)或非芳香環(huán)相稠合的苯基或吡啶基，其中，該環(huán)系任選包含多達(dá)3個(gè)雜原子，該雜原子獨(dú)立地選自N、O及S，且N可進(jìn)一步任選被C1-6烷基取代，及其中的環(huán)系可任選被＝O取代。
3.權(quán)利要求2所述的化合物，其中，R1表示4-甲氧苯基、3-氟-4-甲氧苯基、3-氯苯基、3-氟-4-甲氧苯基或3-氯-4-甲氧苯基，或R1表示苯并[1，2，5]噻二唑基、[1，2，4]三唑并[1，5-a]吡啶基、二氫苯并呋喃基、2，3-二氫苯并[1，4]二氧雜環(huán)己烯基、苯并咪唑基、C1-6烷基苯并咪唑基、苯并[1，4]噁嗪-3-酮或苯并[1，4]噁嗪基。
4.前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的化合物，其中，R2位于與三唑連接點(diǎn)的間位。
5.前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的化合物，其中，R2為鹵素、C1-6烷基或NO2。
6.實(shí)施例1～20中任何一例所定義的式(I)化合物或其可藥用鹽。
7.一種藥物組合物，其包括前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的化合物，或其可藥用鹽及可藥用載體或稀釋劑。
8.權(quán)利要求1～6中任何一項(xiàng)所述的式(I)化合物，或其可藥用鹽或溶劑合物，其用于治療。
9.權(quán)利要求1～6中任何一項(xiàng)所述的式(I)化合物或其可藥用鹽在制備治療哺乳動(dòng)物中由ALK5受體介導(dǎo)的疾病的藥物中的用途。
10.一種抑制哺乳動(dòng)物TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道的方法，包括向需要接受此種治療的哺乳動(dòng)物使用治療有效劑量的權(quán)利要求1～6中任何一項(xiàng)所述的式(I)化合物或其可藥用鹽。
11.一種治療疾病的方法，包括向需要接受此種治療的哺乳動(dòng)物使用治療有效劑量的權(quán)利要求1～6中任何一項(xiàng)所述的式(I)化合物或其可藥用鹽，所述疾病選自慢性腎病、急性腎病、創(chuàng)傷愈合、關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、腎病、充血性心力衰竭、潰瘍、眼病、角膜損傷、糖尿病型腎病、神經(jīng)機(jī)能受損、阿耳茨海默氏病、動(dòng)脈粥樣硬化、腹膜及皮下粘連、任何以纖維化為主要特征的疾病，包括但不限于肺纖維化、肝纖維化、例如乙型肝炎(HBV)、丙型肝炎(HCV)、酒精誘導(dǎo)的肝炎、血色素沉著病及原發(fā)性膽汁性硬化及再狹窄。
12.一種抑制哺乳動(dòng)物的基質(zhì)形成方法，包括向需要接受此種治療的哺乳動(dòng)物使用治療有效劑量的權(quán)利要求1～6中任何一項(xiàng)所述的化合物或其可藥用鹽。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了式(1)所述的苯基取代的三唑及其鹽和溶劑化物，其中R
文檔編號(hào)C07D413/04GK1608065SQ02825914
公開(kāi)日2005年4月20日 申請(qǐng)日期2002年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月15日
發(fā)明者拉拉米·M·加斯特, 約翰·D·哈林, 杰格·P·希爾, 托馬斯·D·海特曼, 安德魯·H·佩恩 申請(qǐng)人:史密絲克萊恩比徹姆公司