專利名稱：從黃細(xì)心中分離黃酮糖苷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從黃細(xì)心中分離出生物活性黃酮糖苷(eupalitin)的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及一種能夠高產(chǎn)率地分離具有抗骨質(zhì)疏松活性如結(jié)構(gòu)式1所示的生物活性黃酮糖苷(3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷)的方法，是通過提取黃細(xì)心的粉狀樹葉實現(xiàn)的。
發(fā)明背景黃細(xì)心Linn.(Syn.Boerhavia repens Linn.，Boerhaviaprocumbens Roxb.；Family Nyctaginaceae)，通俗地稱作“Punarnava”，在印度草醫(yī)學(xué)中是一種重要的返老還童藥。它廣泛地分布在整個印度，在雨季是很茂盛的?？罩胁糠纸又?，但在來年又復(fù)活或萌芽[Sivarajan，V.V.and Balachandran，I.Ayurvedicdrugs and their plant sources；Oxford & IBH publishing Co.Ltd.，New Delhi，1994]。干燥成熟的全部植物構(gòu)成了印度草藥藥典[Handa，S.S.，Deepak，M.and Mangal，A.K.Indian Herbal Pharmacopoeia，Regional Research Laboratory，Jammu & Indian DrugManufacturers Association，Mumbai，1998，Vol.1]，它也描述了其顯著的宏觀和微觀特征。
生物多樣性，黃細(xì)心的種族聯(lián)系[Anand，R.K.Flora and Fauna1，167-170(1995).Medicinal & Aromatic Plants Abstracts 18，2620(1996)]和變異[Mathur，A.and Bhandari，M.M.Geobios NewReports，2，35-38(1983).Medicinal & Aromatic Plants Abstracts5，0643(1983)，Varma，S.K.Biological Bulletin of India 5，50-52(1983).Medicinal & Aromatic Plants Abstracts 6，0467(1984)]和在Nyctaginaceae中的化學(xué)分類學(xué)結(jié)果[Bramadhayalaselvam，A.and Rajasekaran，K.Journal ofEconomic and Taxonomic Botany，18，499-500(1994)]，業(yè)已經(jīng)進(jìn)行討論。許多魚藤酮已經(jīng)從植物中分離出來[Ahmed，M.，Datta，B.K.and Rouf，A.S.S.Phytochemistry 29，1709-1710(1990)；Kadota，S.，Lami，N.，Tezuka，Y.and Kikuchi，T.Chemical andPharmaceutical Bulletin 37，3214-3220(1989)；Lami，N.，Kadota，S.，Tezuka，Y.and Kikuchi，T.Chemical and PharmaceuticalBulletin 38，1558-1562(1990)；Lami，N.，Kadota，S.and Kikuchi，T.Chemical and Pharmaceutical Bulletin 39，1863-1865(1991)]。這些包括一系列黃細(xì)心酮(boeravinones)，即黃細(xì)心酮A(boeravinone A)，黃細(xì)心酮B(boeravinone B)，黃細(xì)心酮C(boeravinone C)，黃細(xì)心酮D(boeravinone D)，黃細(xì)心酮E(boeravinone E)和黃細(xì)心酮F(boeravinone F)。黃細(xì)心堿苷(Punarnavoside)，一種酚類糖苷，據(jù)報導(dǎo)是存在于樹根之中[Jain，G.K.and Khanna，N.M.Indian Journal of Chemistry 28B，163-166(1989)；Seth，R.K.，Khanna，M.，Chaudhary，M.Singh，S.andSarin，J.P.S.Indian Drugs 23，583-584(1986)]。
源自所述黃細(xì)心草整個植物的三黃酮醇糖苷，即黃酮糖苷3-O-β-D-半乳糖吡喃糖基-(1-->2)-β-D-葡糖吡喃糖苷，黃酮糖苷3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷和6-甲氧基山萘酚3-O-β-D-(1-->6)刺槐糖苷[Li，J.，Li，H.，Kadota，S.And Namba，T.Journal of NaturalProducts 59，1015-1018(1996)]和一種C-甲基黃酮，已經(jīng)從黃細(xì)心樹根中分離出來[Indian Journal of Chemistry 23B，682-684(1984)]。還從黃細(xì)心樹根中分離出兩種木聚糖，即鵝掌楸苷和丁香脂素單-β-D糖苷[Lami，N.，Kadota，S.，Kikuchi，T.and Momose，Y.Chemical and Pharmaceutical Bulletin 39.1551-1555(1991)]。源自所述植物的嘌呤核苷次黃嘌呤9-L-阿拉伯糖[Ojewole，J.A.O.and Adesina，S.K.Fitoterapia 56，31-36(1985)]、二氫三甲基環(huán)癸并呋喃酮-borhavine[Ahmed，B.and Yu，C.P.Phytochemistry 31，4382-4384(1992)]和植物甾醇類[Kadota，S.，Lami，N.，Tezuka，Y.and Kikuchi，T.Chemical andPharmaceutical Bulletin 37，3214-3220(1989)；Kadota，S.，Lami，N.，Tezuka，Y.and Kikuchi，T.Journal of PharmaceuticalScience 76，S201(1987)]的存在，已經(jīng)有了報導(dǎo)。
黃細(xì)心的護(hù)肝性能，已經(jīng)被不同研究人員所研究并證實[Chakraborti，K.K.and Handa，S.S.Indian Drugs 27，161-166(1989)；Chandan，B.K.，Sharma，A.K.and Anand，K.K.Journalof Ethanopharmacology 31，299-307(1991)；Rawat，A.K.，Mehrotra，S.，Tripathi，S.C.and Shome，U.Journal ofEthanopharmacology 56，61-66(1997)；De，S.，Ravishankar，B.and Bhavsar，G.C.Indian Drugs 30，355-363(1993)]。所述植物具有潛在的抗溶血和抗炎活性，且被推薦用于治療IUD月經(jīng)過多[Barthwal，M.and Srivastava，K.Advances in Contraception 7，67-77(1991)；Barthwal，M.and Srivastava，K.Advances inContraception 6，113-124(1990)]。黃細(xì)心還報導(dǎo)具有降血壓性能[Ramabhimaiah，S.，Stal in，D.and Kalaskar，N.J.Indian drugs21，343-344(1984)]，因為其血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制作用[Aftab，K.，Usmani，S.B.and Ahmad，S.I.Hamdard Medicus 39，44-54(1996)；Medicinal & Aromatic Plants Abstracts 18，2920(1996)]和Ca2+通道封閉效應(yīng)[Hansen，K.，Nyman，U.Smith，U.W.，Andersen，A.，Gudiksen，L.Rajasekharan，S and Pushpangadan，P.Glimpses ofIndian Ethnopharmacology(ed.Pushpangadan，P.)263-273(1995)]可能是可靠的。在腎炎綜合癥中該藥的藥效，已經(jīng)在大白鼠中[Singh，A.，Singh，R.H.，Singh，R.G.，Mi sra，N.，Vrat，S.，Prakash，M.and Singh，N.Indian Drugs 26，10-13(1988)]以及人體中[Singh，R.P.，Shukla，K.P.，Pandey，B.L.，Singh，R.G.，Usha and Singh，R.H.Journal of Research and Education in Indian Medicine 11，29-36(1992)]得到證實。純化提取所述植物提高了淀粉酶[Goswami，P.and Sharma，T.C.Journal of Research in Ayurveda and Siddha13，48-55(1992)]和ATP酶[Goswami，P.and Sharma，T.C.Journalof Research in Ayurveda and Siddha 13，135-140(1992)]的活性，但是降低了生物體外過氧化氫酶的活性。所述植物的根還具有抗痙攣性能[Adesina，S.K.Quarterly Journal of Crude Drug Research17，84-86(1979)；Akah，P.A.And Nwambie，A.I.Fitoterapia64，42-44(1993)]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，所述藥物缺乏tetratogeniceffect[Singh，A.，Singh，R.G.，Singh，R.H.，Misra，N.andSingh，N.Planta Medica 57，315-316(1991)]。Punarnavoside對于猴子具有抗溶血纖活性[Jain，G.K.and Khanna，N.M.IndianJournal of Chemistry 28B，163-166(1989)]。鵝掌楸苷封閉青蛙心臟單細(xì)胞的Ca2+通道[Lami，N.，Kadota，S.，Kikuchi，T.andMomose，Y.Chemical and Pharmaceutical Bulletin 39，1551-1555(1991)]和次黃嘌呤9-L-阿拉伯糖苷在老鼠和貓中產(chǎn)生抑制劑和負(fù)變時性作用(negative chronotropic effect)[Ojewole，J.A.O.and Adesina，S.K.Fitoterapia 56，31-36(1985)]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，一種源自黃細(xì)心草整個植物的甲醇提取物，可以抑制在組織培養(yǎng)中由甲狀旁腺激素(PTH)引發(fā)的骨吸收[Li，J.，Li，H.，Kadota，S.And Namba，T.Journal of Natural Products 59，1015-1018(1996)]。所述甲醇提取物的生物活性指導(dǎo)分級分離，顯示了在正丁醇可溶部分的活度。從所述正丁醇可溶部分中分離出黃酮糖苷3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷，發(fā)現(xiàn)它對在組織培養(yǎng)中由甲狀旁腺激素(PTH)引發(fā)的骨吸收具有顯著的抑制作用(p＜0.001)。由黃酮糖苷3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷所顯示的活性，在同樣條件下，大于7-異丙氧基異黃酮(一種臨床使用的天然產(chǎn)物衍生物，在日本和意大利，用于治療骨質(zhì)疏松)表現(xiàn)出的活性。
所述化合物黃酮糖苷3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷，是由Li等人按下述方法[Li，J.，Li，H.，Kadota，S.and Namba，T.Journal ofNatural Products 59，1015-1018(1996)]分離出來的將陰干的黃細(xì)心草整個植物(1.2kg)切成小塊，用甲醇回流3h(900ml×2)。整個濾液在減壓下進(jìn)行蒸發(fā)，得到一種黑綠色物質(zhì)，并將這種提取物懸浮在蒸餾水中，并依次采用氯仿和正丁醇進(jìn)行分配。所述正丁醇可溶部分采用預(yù)備TLC進(jìn)行重復(fù)純化，得到黃酮糖苷3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷(14.4mg，0.0012％)。
Li等人方法具有下述主要缺點1.該方法采用黃細(xì)心草整個植物，它含有較低的數(shù)量。
2.采用甲醇回流6小時，不足以完全提取出黃酮糖苷3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷。
3.甲醇提取物懸浮在蒸餾水中，并依次采用氯仿和正丁醇進(jìn)行分配。在采用氯仿進(jìn)行分配時，黃酮糖苷3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷也可以分配到氯仿層之中，從而降低了來自丁醇部分的結(jié)構(gòu)式1化合物的最終產(chǎn)率。
4.所述化合物采用昂貴、繁重且費時的預(yù)備薄層層析法進(jìn)行純化，得到很少量的黃酮糖苷3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷(14.4mg，0.0012％)。這種分離方法是繁重且是不經(jīng)濟(jì)的，對于工業(yè)生產(chǎn)黃酮糖苷3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷來說是不能接受的。
在我們的高齡化社會，骨質(zhì)疏松是一個重要問題。骨質(zhì)疏松會導(dǎo)致較老年人口的骨折，尤其是在絕經(jīng)后婦女之中。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，有許多天然原藥具有治療骨病的潛在用途。由于黃酮糖苷3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷較7-異丙氧基異黃酮(一種臨床使用的用于此目的的天然產(chǎn)物衍生物)具有更好的抗-骨質(zhì)疏松活性，所以，人們需要大量的黃酮糖苷3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷。
采用由Li等人所開發(fā)的方法[Li，J.，Li，H.，Kadota，S.andNamba，T.Journal of Natural Products 59，1015-1018(1996)]，僅能分離出很少量的這種化合物(從1.2kg的黃細(xì)心草干燥整個植物僅能得到14.4mg)。因此，人們急切需要開發(fā)一種有效且低耗時的方法，用于大規(guī)模分離黃酮糖苷3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷，使得其易于獲得，以作進(jìn)一步研究。
發(fā)明目的本發(fā)明的主要目的是提供一種用于從黃細(xì)心分離出具有結(jié)構(gòu)式1的生物活性的黃酮糖苷3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷的方法。
本發(fā)明的另一個目的是識別黃細(xì)心的植物部分，所述植物部分能夠提供最大產(chǎn)率的結(jié)構(gòu)式1的黃酮糖苷3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷。
本發(fā)明的又一個目的是提供一種新穎的用于分離黃酮糖苷(3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷)的方法，其中，所述方法簡便易行且能夠快速分離出想要的產(chǎn)物。
本發(fā)明的又一個目的是提供一種方法，其中，是使用一種非常經(jīng)濟(jì)的原材料，它在自然界是大量存在的。
本發(fā)明的又一個目的，是提供一種方法，它可以理想地按比例擴大，而且不用指派任何現(xiàn)有技術(shù)(它需要昂貴、繁重且耗時的預(yù)備薄層層析)中繁重的用于純化和分離所述化合物的層析步驟。
發(fā)明概述本發(fā)明的上述和其它目的，可通過采用此外所述的黃酮糖苷3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷提取方法而實現(xiàn)，所述方法的產(chǎn)率大于現(xiàn)有技術(shù)中從黃細(xì)心粉狀樹葉報導(dǎo)的產(chǎn)率300倍。
因此，本發(fā)明提供了一種用于從黃細(xì)心分離出具有結(jié)構(gòu)式1的黃酮糖苷3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷的方法，它包括(a)使所述植物材料粉末化，(b)采用一種質(zhì)子溶劑制備一種所述粉狀植物材料的提取物，
(c)濃縮在上述步驟(b)中得到的提取物，(d)連續(xù)用有機溶劑磨碎上述所述濃縮提取物，以提高其極性，得到一種富含生物活性的部分，(e)采用甲醇結(jié)晶和重結(jié)晶所述生物活性部分，得到黃酮糖苷3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷， 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述植物材料是選自所述植物的空中部分。
在本發(fā)明的又一種實施方式中，所述植物材料是選自由黃細(xì)心的樹葉和莖及其組合所組成的組。
在本發(fā)明的又一種實施方式中所述用于步驟(b)中提取的質(zhì)子溶劑是選自由精餾酒精、甲醇和水合甲醇所組成的組。
在本發(fā)明的又一種實施方式中，所述用于步驟(d)中的有機溶劑是選自由己烷、氯仿、醋酸乙酯、甲醇、乙醇和水合甲醇所組成的組。
在本發(fā)明的又一種實施方式中，從黃細(xì)心分離出結(jié)構(gòu)式1的3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷的方法，包括在玻璃滲濾器或索格利特萃取器中，于一種選自由精餾酒精、甲醇和水合甲醇所組成的組中的極性溶劑之中，提取所述的其粉狀樹葉，通過采用一種選自由己烷、二氯甲烷、氯仿和醋酸乙酯所組成的組中的有機溶劑的磨碎，除去多脂的非極性成分，得到富含生物活性部分，采用極性溶劑進(jìn)行結(jié)晶，得到3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷(1)，其數(shù)量為0.25-0.5％w/w。
發(fā)明的詳細(xì)說明本發(fā)明的方法克服了現(xiàn)有技術(shù)的缺點，這是因為1.采用了收集自此處所確定的特定地點的空中部分，如黃細(xì)心的樹葉(含有最大數(shù)量的所述化合物，它可通過分析在三年內(nèi)收集到的所述植物的樣品而確定)。
2.所述方法規(guī)定了熱連續(xù)提取(索格利特提取)，可保證完全提取結(jié)構(gòu)式1的化合物。由于結(jié)構(gòu)式1的化合物不能充分溶解于甲醇之中，現(xiàn)有技術(shù)方法導(dǎo)致不完全的提取。
3.規(guī)定了采用己烷和氯仿對由精餾酒精提取得到的殘余物進(jìn)行磨碎，在其中，結(jié)構(gòu)式1的化合物不會分配到氯仿層中，從而保證在分離的磨碎之后的精餾酒精部分中結(jié)構(gòu)式1的整體提取化合物的存在。
4.所述化合物通過從所述3的磨碎之后得到的殘余物中直接結(jié)晶而進(jìn)行純化，使得其最為簡便、最為快速、非常經(jīng)濟(jì)易行，適合工業(yè)利用的按比例擴大，是一種新穎的分離結(jié)構(gòu)式1化合物的方法，其產(chǎn)率可達(dá)0.4％，它大于Li等人所報導(dǎo)產(chǎn)率的300倍。
骨質(zhì)疏松是我們高齡化社會的一個重要問題。骨質(zhì)疏松會導(dǎo)致較老年人口的骨折，尤其是在絕經(jīng)后婦女之中。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，有許多天然原藥具有治療骨病的潛在用途。由于3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷較7-異丙氧基異黃酮(一種臨床使用的用于此目的的天然產(chǎn)物衍生物)具有更好的抗-骨質(zhì)疏松活性，所以，人們需要大量的黃酮糖苷3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷。采用由Li等人所開發(fā)的方法[Li，J.，Li，H.，Kadota，S.and Namba，T.Journal of Natural Products59，1015-1018(1996)]，僅能分離出很少量的這種化合物(從1.2kg的黃細(xì)心草干燥整個植物僅能得到14.4mg)。
對收集自印度的八個植物地理不同地區(qū)的黃細(xì)心的整個植物樣品中的黃酮糖苷3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷(1)的數(shù)量進(jìn)行初步篩選，表明具有明顯的數(shù)量差異(表1)。
表1不同黃細(xì)心樣品和Jammu樣品的不同部分中黃酮糖苷3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷(1)的HPLC測量結(jié)果。

an＝3，平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為0.000-0.005；ND＝未檢測。
我們有趣地發(fā)現(xiàn)，Jammu樣品具有最大的數(shù)量(幾乎為隨后含有最大數(shù)量樣品即Ramgarh樣品的二倍)。而且，還發(fā)現(xiàn)化合物1是集中在樹葉之中(為存在于莖中數(shù)量的5倍)，在根中則不存在。
所述結(jié)果還使得在抑制PTH-刺激的骨吸收的黃細(xì)心任何進(jìn)一步研究中對于含有已知數(shù)量結(jié)構(gòu)式1化合物的標(biāo)準(zhǔn)化提取物的需要，顯得更加重要。而且，所述樹葉提取物，是優(yōu)于整個植物的提取物的，由于前者富含生物活性成分黃酮糖苷3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷(1)。
所述用于從黃細(xì)心分離出具有結(jié)構(gòu)式1的生物活性黃酮糖苷3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷的方法，它包括(a)采用已知方法，使所述植物材料粉末化，(b)采用常規(guī)方法濃縮所述醇的提取物，(c)連續(xù)用有機溶劑磨碎上述所述提取物，以提高其極性，得到一種富含生物活性的部分，(d)采用常規(guī)方法，用甲醇進(jìn)行結(jié)晶和重結(jié)晶，得到黃酮糖苷3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷。
化合物1的表征化合物1是以黃色無定形固體得到的，[α]D-26.6(c 0.03，甲醇)。結(jié)構(gòu)式1化合物的UV光譜具有類黃酮的特征譜帶(譜帶I-342nm，譜帶-II-270nm)。譜帶-I在添加甲氧基鈉時紅移(+45nm)，表明在3位存在有羥基。在6.88(2H，d，J＝9Hz)和8.11(2H，d，J＝9Hz)的1H NMR信號，很明顯地表明在B環(huán)上除了4’OH存在沒有其它取代。所述1H NMR光譜還揭示了存在有兩個甲氧基(δ3.75，3.93，3H每個，s)、一個位于5位的羥基(δ12.56，br s)和一個異頭糖質(zhì)子(δ5.41，1H，d，J＝7.5Hz)。糖的13C信號的文獻(xiàn)對比，導(dǎo)致其身份為半乳糖[Markham，K.R.；Chari，V.M.Carbon-13 NMRspectroscopy of flavonoids.In The flavonoidsAdvances inResearch；Harborne，J.B.；Mabry.T.J.，Eds；Chapman & HallLondon，1982；Chapter 2，pp 19-134]。研究發(fā)現(xiàn)化合物1的分子量為492(源自FAB MS)，糖苷配基分子量為330(源自EI-MS)。這樣，糖苷配基具有三個羥基，其中之一是連接到半乳糖上，兩個甲氧基則通過形成乙酸己酯而得以證實。由于在5位和4’位的自由羥基已經(jīng)確定，所以，在三個位置的糖苷連接是很明顯的。兩個甲氧基的位置，確定為C-6位和C-7位，由于所述質(zhì)子的NMR信號(δ6.86，1H，s)，在5-OH乙?；瘯r，沒有給出任何移動，從而排除了其存在于6位的可能性。而且，在δ92.0(C-6)、60.9(6-OCH3)和57.3(7-OCH3)處的13C信號，與提議的在B環(huán)相似取代數(shù)值是一致的[Horie，T.；Ohtsuru，Y.；Shibata，K.；Yamashita，K.；Tsukayama，M.；Kawamura，Y.Phytochemistry 47，865-874(1998)]。
因此，化合物1的結(jié)構(gòu)可以推斷為5，4’-二羥基-6，7-二甲氧基-黃酮醇-3-O-β-D-半乳糖苷(黃酮糖苷或3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷)。從Jammu樣品的樹葉得到更高產(chǎn)率的化合物1，還可進(jìn)一步由1996年、1998年和1999年在Jammu收集到的所述植物得到的化合物1的相似產(chǎn)率(～0.2-0.4％)的事實而得到證實和被標(biāo)準(zhǔn)化。所述植物在雨季之中和之后(七月～十月)，在Jammu地區(qū)是非常豐富的，易于獲得。另一方面，自印度其它地方收集的樣品，則含有較少量的化合物1，這可由HPLC(表1)測得，從而使得它們不能合適且經(jīng)濟(jì)地作為分離化合物1的原材料。
因此，所述原材料(黃細(xì)心)收集地點、提取和化合物1的分離方法，已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化以獲得到所述化合物的最大產(chǎn)率。這種簡便新穎的方法，特別適用于所有從所述植物中快速分離出所述化合物。
所述用于從黃細(xì)心分離出生物活性的黃酮糖苷3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷(1)的方法，它包括(a)使所述植物材料粉末化，(b)通過在一個索格利特抽提器中熱連續(xù)提取制備一種所述粉狀植物材料的醇類提取物，(c)濃縮所述醇類提取物，(d)連續(xù)用己烷、二氯甲烷、氯仿或醋酸乙酯磨碎(磨碎是表示用所述溶劑搖動所述提取物)所述醇類提取物，得到一種富含生物活性的部分，(e)采用極性溶劑進(jìn)行結(jié)晶和重結(jié)晶，得到黃酮糖苷3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷。
通過本發(fā)明方法，采用自合適地區(qū)收集到的原材料，所述植物中含有最大數(shù)量的化合物1的部分，不需要采用繁重的色譜層析方法，所得到的化合物產(chǎn)率，將近是文獻(xiàn)中所報導(dǎo)產(chǎn)率(它是采用一種不適合分離大量所述成分的繁重且耗時的預(yù)備薄層層析的方法)的300倍。
下面將通過實施例對本發(fā)明作詳細(xì)的說明，但是，它不應(yīng)該理解為是對本發(fā)明范圍的限制。
實施例1在一個索格利特抽提器中，采用熱連續(xù)提取方法，采用精餾酒精，對陰干的粉狀黃細(xì)心樹葉(1kg)進(jìn)行提取，持續(xù)32小時。所述精餾酒精在減壓下進(jìn)行蒸發(fā)，得到一種黑綠色物質(zhì)，連續(xù)地采用己烷、氯仿和醋酸乙酯對這種提取物進(jìn)行磨碎。剩余的殘余物溶解在甲醇中，并放置冰箱中過夜，過濾分離所述固體，采用甲醇進(jìn)行結(jié)晶，得到黃酮糖苷3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷(4.0g)。
實施例2在一個索格利特抽提器中，采用熱連續(xù)提取方法，采用甲醇，對陰干的粉狀黃細(xì)心樹葉(1kg)進(jìn)行提取，持續(xù)32小時。所述甲醇在減壓下進(jìn)行蒸發(fā)，得到一種黑綠色物質(zhì)，連續(xù)地采用己烷、氯仿和醋酸乙酯對這種提取物進(jìn)行磨碎。剩余的殘余物溶解在甲醇中，并放置冰箱中過夜，過濾分離所述固體，采用甲醇進(jìn)行結(jié)晶，得到黃酮糖苷3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷(3.5g)。
實施例3采用精餾酒精(4×41)，對陰干的粉狀黃細(xì)心樹葉(1kg)進(jìn)行滲濾，持續(xù)64小時。所述精餾酒精在減壓下進(jìn)行蒸發(fā)，得到一種黑綠色物質(zhì)，連續(xù)地采用己烷、氯仿和醋酸乙酯對這種殘余物進(jìn)行磨碎。剩余的殘余物溶解在甲醇中，并放置冰箱中過夜，過濾，分離所述固體，采用甲醇進(jìn)行結(jié)晶，得到黃酮糖苷3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷(2.8g)。
實施例4在一個索格利特抽提器中，采用熱連續(xù)提取方法，采用精餾酒精，對陰干的粉狀黃細(xì)心莖(1kg)進(jìn)行提取，持續(xù)32小時。所述精餾酒精在減壓下進(jìn)行蒸發(fā)，得到一種黑綠色物質(zhì)，連續(xù)地采用己烷、氯仿和醋酸乙酯對這種提取物進(jìn)行磨碎。剩余的殘余物溶解在甲醇中，并放置冰箱中過夜，過濾分離所述固體，采用甲醇進(jìn)行結(jié)晶，得到黃酮糖苷3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷(0.7g)。
實施例5在一個索格利特抽提器中，采用熱連續(xù)提取方法，采用精餾酒精，對陰干的粉狀黃細(xì)心空中部分(1kg)進(jìn)行提取，持續(xù)32小時。所述精餾酒精在減壓下進(jìn)行蒸發(fā)，得到一種黑綠色物質(zhì)，連續(xù)地采用己烷、氯仿和醋酸乙酯對這種提取物進(jìn)行磨碎。剩余的殘余物溶解在甲醇中，并放置冰箱中過夜，過濾分離所述固體，采用甲醇進(jìn)行結(jié)晶，得到黃酮糖苷3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷(1.2g)。
實施例6采用80％水合甲醇(4×41)，對陰干的粉狀黃細(xì)心樹葉(1kg)進(jìn)行滲濾，持續(xù)64小時。所述溶劑在減壓下進(jìn)行蒸發(fā)，得到一種黑綠色物質(zhì)，連續(xù)地采用己烷、氯仿和醋酸乙酯對這種殘余物進(jìn)行磨碎。剩余的殘余物溶解在甲醇中，并放置冰箱中過夜，過濾，分離所述固體，采用甲醇進(jìn)行結(jié)晶，得到黃酮糖苷3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷(3.0g)。
優(yōu)點1.這是一種新穎的方法，通過該方法我們可分離出黃酮糖苷3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷。
2.這種簡便的方法特別適用于所述從所述植物中快速分離出所述化合物。
3.該方法使用非常經(jīng)濟(jì)有效的原材料，它在自然界是大量存在的。
4.用于所述方法中的觀念可使得其對于按比例擴大變得理想且易行的。
5.所述方法提供了有保證的產(chǎn)率，由于它業(yè)已經(jīng)就植物原料的收集地點實現(xiàn)了標(biāo)準(zhǔn)化。
6.所述沒有指派用于純化和分離化合物的任何繁重的層析方法，而先前報導(dǎo)的方法則涉及昂貴、繁重且耗時的預(yù)備薄層層析法，且僅能得到很少量的結(jié)構(gòu)式1的化合物。
7.所述方法提供的產(chǎn)率為文獻(xiàn)中報導(dǎo)的產(chǎn)率的300倍。
權(quán)利要求
1.一種用于從黃細(xì)心中分離出結(jié)構(gòu)式1的3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷的方法，它包括(a)使所述植物材料粉末化，(b)采用一種質(zhì)子溶劑制備一種所述粉狀植物材料的提取物，(c)濃縮在上述步驟(b)中得到的提取物，(d)連續(xù)用有機溶劑磨碎上述所述濃縮提取物，以提高其極性，得到一種富含生物活性的部分，(e)采用甲醇結(jié)晶和重結(jié)晶所述生物活性部分，得到3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷，
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其中所述植物材料是選自所述植物的空中部分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其中所述植物材料選自由黃細(xì)心的樹葉和莖及其組合所組成的組。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其中所述用于步驟(b)中提取的質(zhì)子溶劑是選自精餾酒精、甲醇和水合甲醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其中所述用于步驟(d)中的有機溶劑是選自由己烷、氯仿、醋酸乙酯、甲醇、乙醇和水合甲醇所組成的組。
6.一種如權(quán)利要求1所述的從黃細(xì)心中分離出結(jié)構(gòu)式1的3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷的方法，所述方法包括在玻璃滲濾器或索格利特萃取器中，于一種選自由精餾酒精、甲醇和水合甲醇所組成的組中的極性溶劑之中，對其粉狀樹葉進(jìn)行提取，通過采用一種選自由己烷、二氯甲烷、氯仿和醋酸乙酯所組成的組中的有機溶劑的磨碎，除去多脂的非極性成分，得到富含生物活性部分，采用極性溶劑進(jìn)行結(jié)晶，得到3-O-β-D-半乳糖吡喃糖苷(1)，其數(shù)量為0.25-0.5％w/w。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種能夠高產(chǎn)率地分離具有抗骨質(zhì)疏松活性由結(jié)構(gòu)式1所示的生物活性的黃酮糖苷(3－O－β－D－半乳糖吡喃糖苷)方法，是通過提取黃細(xì)心的粉狀樹葉實現(xiàn)的。
文檔編號C07H17/00GK1515583SQ0311961
公開日2004年7月28日 申請日期2003年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月13日
發(fā)明者迪帕克·蒙德基納捷德, 利拉·拉姆·馬納漢斯, 拉凱什·莫里, 蘇克德夫·斯瓦米·漢達(dá), 莫里, 夫 斯瓦米 漢達(dá), 拉姆 馬納漢斯, 迪帕克 蒙德基納捷德 申請人:科學(xué)與工業(yè)研究委員會