專利名稱：高密度異養(yǎng)培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因小球藻來(lái)生產(chǎn)兔防御素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高密度異養(yǎng)培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因小球藻來(lái)生產(chǎn)兔防御素的方法。
背景技術(shù)：
人們對(duì)小球藻的研究歷史較長(zhǎng)，但把小球藻作為新型表達(dá)系統(tǒng)來(lái)研究?jī)H是近年來(lái)才開展的工作。到目前為止，有關(guān)外源基因在小球藻中能穩(wěn)定表達(dá)的報(bào)道不多。中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所孫勇如等將兔防御素NP-1基因?qū)胄∏蛟澹乖摶蜃鳛橐环N組成型蛋白得到了穩(wěn)定的表達(dá)(孫勇如，付榮昭，曹光誠(chéng)，等。防御素基因的植物表達(dá)載體質(zhì)粒。中國(guó)專利.C12N15/63，1126760，1996-07-17；孫勇如，陳穎，馬江生，等。轉(zhuǎn)基因小球藻的高效生物反應(yīng)器。中國(guó)專利.C12N15/79，1203277，1998-12-30)。這是外源蛋白在小球藻中成功表達(dá)的首例報(bào)道。
防御素在臨床上具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值，但迄今尚無(wú)有效的制備方法。兔防御素(NP-1)是防御素中抗菌譜最廣的一種。轉(zhuǎn)NP-1基因小球藻有望成為防御素制備的有效方法。鑒于NP-1的潛在應(yīng)用價(jià)值和小球藻的實(shí)用價(jià)值，轉(zhuǎn)NP-1基因小球藻在海水育苗、海水養(yǎng)殖、飼料添加劑、保健品及食品添加劑等行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景；此外，小球藻作為一種新型的表達(dá)系統(tǒng)具有誘人的應(yīng)用前景。
鑒于轉(zhuǎn)NP-1基因小球藻的潛在應(yīng)用，高密度大規(guī)模培養(yǎng)是該轉(zhuǎn)基因小球藻成功邁向?qū)嶋H應(yīng)用的關(guān)鍵技術(shù)之一。中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所孫勇如等采用Knop混合營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基在搖瓶中混合營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)轉(zhuǎn)NP-1基因小球藻，但培養(yǎng)效率不高，最高細(xì)胞密度僅為1.5g/L左右，無(wú)法獲得足夠量的的轉(zhuǎn)基因小球藻細(xì)胞以開展轉(zhuǎn)基因小球藻的應(yīng)用研究。
微藻培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)模式有三種光自養(yǎng)培養(yǎng)、混合營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)和異養(yǎng)培養(yǎng)。異養(yǎng)培養(yǎng)是實(shí)現(xiàn)微藻高密度培養(yǎng)的有效方法。目前文獻(xiàn)中報(bào)道的轉(zhuǎn)基因微藻的培養(yǎng)大多采用光自養(yǎng)培養(yǎng)，這種培養(yǎng)方式存在細(xì)胞密度底、培養(yǎng)過程難以放大等缺點(diǎn)。迄今，異養(yǎng)培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因微藻未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此有必要開展轉(zhuǎn)基因小球藻高密度培養(yǎng)研究。
實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小球藻高密度培養(yǎng)可從三個(gè)方面著手一是確定最佳的營(yíng)養(yǎng)模式，二是選擇合適的培養(yǎng)基，三是建立合適的培養(yǎng)工藝。申請(qǐng)人的另一項(xiàng)發(fā)明專利已給出了適合異養(yǎng)培養(yǎng)轉(zhuǎn)NP-1基因小球藻的培養(yǎng)基，因此有必要對(duì)轉(zhuǎn)NP-1基因小球藻的最佳營(yíng)養(yǎng)模式和培養(yǎng)工藝進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于解決如何使轉(zhuǎn)NP-1基因小球藻在保持單位細(xì)胞NP-1表達(dá)量不變的情況下其細(xì)胞密度有顯著地提高。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明者確認(rèn)轉(zhuǎn)NP-1基因小球藻的最適營(yíng)養(yǎng)模式為異養(yǎng)，并進(jìn)一步提供了一種高密度異養(yǎng)培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因小球藻來(lái)生產(chǎn)兔防御素的方法，該方法包括a).在生物反應(yīng)器中加入pH為5.0～7.0的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基由KNO30.5～3克/升、酵母粉3～11克/升、葡萄糖5～30克/升以及少量無(wú)機(jī)鹽、微量元素和水組成，按工作體積的5～15％接入轉(zhuǎn)兔防御素基因小球藻種培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25～30℃，pH小于8.5，控制溶氧在20％以上，至轉(zhuǎn)基因小球藻細(xì)胞密度最高時(shí)結(jié)束培養(yǎng)；b).從步驟a)所得培養(yǎng)物中純化得到兔防御素。
本發(fā)明建立的高密度培養(yǎng)工藝，適合于NP-1基因在小球藻中穩(wěn)定表達(dá)。用本發(fā)明方法異養(yǎng)培養(yǎng)轉(zhuǎn)NP-1基因小球藻，每升細(xì)胞密度可達(dá)17～40g/L，在NP-1表達(dá)量變化不大的情況下，大大提高藻體的培養(yǎng)密度可大大提高兔防御素的產(chǎn)量，從而為該轉(zhuǎn)基因藻的成功應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。此外，本發(fā)明方法操作方便，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1為實(shí)施例1中營(yíng)養(yǎng)模式的實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。圖中-△-表示光自養(yǎng)培養(yǎng)的細(xì)胞密度；-□-表示異養(yǎng)培養(yǎng)的細(xì)胞密度；-■-表示混合營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)的細(xì)胞密度。
圖2為實(shí)施例2中確定最適硝酸鉀濃度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。圖中，△表示0.1g/L▲為0.5g/L；◇為0.9g/L；●為1.3g/L；○為1.7g/L；□為2.1g/L；■為對(duì)照。
圖3為實(shí)施例2中確定最適硝酸鉀補(bǔ)加濃度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。圖中-●-表示培養(yǎng)過程中補(bǔ)加硝酸鉀(硝酸鉀濃度維持在0.9g/L)的細(xì)胞密度；-○-培養(yǎng)過程中不補(bǔ)加硝酸鉀的細(xì)胞密度；-■-培養(yǎng)過程中補(bǔ)加硝酸鉀(硝酸鉀濃度維持在0.9g/L)的NP-1表達(dá)量；-□-培養(yǎng)過程中不補(bǔ)加硝酸鉀的NP-1表達(dá)量。
圖4為實(shí)施例3中確定最適葡萄糖補(bǔ)加濃度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。圖中實(shí)線為利用Haldane模型擬合的曲線，散點(diǎn)為實(shí)測(cè)值。
圖5為實(shí)施例4中5L生物反應(yīng)器的實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。圖中-■-采用本發(fā)明的異養(yǎng)培養(yǎng)工藝的細(xì)胞密度，27.8g/L；-●-采用本發(fā)明的異養(yǎng)培養(yǎng)工藝的NP-1表達(dá)量。
圖6為實(shí)施例5中15L生物反應(yīng)器的實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。圖中-■-采用本發(fā)明的異養(yǎng)培養(yǎng)工藝的細(xì)胞密度，34.2g/L；-●-采用本發(fā)明的異養(yǎng)培養(yǎng)工藝的NP-1表達(dá)量。
具體實(shí)施方案本發(fā)明涉及一種高密度異養(yǎng)培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因小球藻來(lái)生產(chǎn)兔防御素的方法，該方法包括a).在生物反應(yīng)器中加入pH為5.0～7.0的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基由KNO3 0.5～3克/升、酵母粉3～11克/升、葡萄糖5～30克/升以及少量無(wú)機(jī)鹽、微量元素和水組成，按工作體積的5～15％接入轉(zhuǎn)兔防御素基因小球藻種培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25～30℃，pH小于8.5，控制溶氧在20％以上，至轉(zhuǎn)基因小球藻細(xì)胞密度最高時(shí)結(jié)束培養(yǎng)；b).從步驟a)所得培養(yǎng)物中純化得到兔防御素。
在本發(fā)明所用的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基的各組分可在一定范圍內(nèi)變化而不會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)基因小球藻的細(xì)胞密度有很大影響。例如，作為無(wú)機(jī)氮源的KNO3的圍為0.5～3克/升，作為有機(jī)氮源的酵母粉可在3～11克/升之間，作為碳源的葡萄糖可在5～30克/升之間，因此這些組分的用量不應(yīng)受實(shí)施例的限制。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，培養(yǎng)基中還應(yīng)加入少量無(wú)機(jī)鹽，例如硫酸鎂、氯化鈉、碳酸鈣、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀等，以及少量微量元素如Mn、Zn、B、I、M、Cu、Co等。在本發(fā)明中，較佳的微量元素組分宜選自H3BO5、ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O、(NH4)6MoO24·4H2O、CuSO4·5H2O。
在一個(gè)具體方案中，所述培養(yǎng)基基本上由以下成分組成KNO30.5～3克/升、酵母粉3～11克/升、葡萄糖5～30克/升、KH2PO40.1～0.3克/升、Ca(NO3)20.15～0.45克/升、MgSO4·7H2O 0.01～0.1克/升、KCl 0.05～0.15克/升、FeCl30.005～0.03克/升；微量元素0.5～3ml，其中微量元素的組成為H3BO40.061克/升、ZnSO4·7H2O 0.287克/升、MnSO4·H2O 0.169克/升、(NH4)6MoO24·4H2O0.01235克/升、CuSO4·5H2O 0.00249克/升；水。
在一個(gè)更佳的方案中，所述培養(yǎng)基的組成為葡萄糖15g/L，KNO30.9g/L，酵母粉9g/L，KH2PO40.13g/L，Ca(NO3)20.2g/L，MgSO4·7H2O 0.05g/L，KCl 0.06g/L，F(xiàn)eCl30.01g/L，H3BO40.061mg/L，ZnSO4·7H2O 0.287mg/L，MnSO4·H2O 0.169mg/L，(NH4)6MoO24·4H2O 0.01235mg/L，CuSO4·5H2O 0.00249mg/L。
在根據(jù)上述配方配制成培養(yǎng)基組合物后，可將所述培養(yǎng)基的pH為5.0～7.0，并在115-120℃下高壓滅菌15～20分鐘。
在將上述培養(yǎng)基加入生物反應(yīng)器中后，加水(宜是自來(lái)水)至工作體積的60～80％后滅菌。然后，當(dāng)溫度降至25～30℃時(shí)，按工作體積的5～15％接入轉(zhuǎn)基因小球藻開始異養(yǎng)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度25～30℃，控制溶氧在20％以上，pH小于8.5。
為了能獲得更高的細(xì)胞密度，可在接種后上述條件下培養(yǎng)36～60h時(shí)開始添加補(bǔ)料液，之后每隔6～14小時(shí)添加補(bǔ)料液。培養(yǎng)直至轉(zhuǎn)NP-1基因小球藻細(xì)胞密度最高時(shí)結(jié)束培養(yǎng)。補(bǔ)料液的濃度宜較高，目的是使培養(yǎng)液體積不至于補(bǔ)料而太大。
在一個(gè)較佳的實(shí)施方案中，補(bǔ)料的組分為葡萄糖和KNO3。葡萄糖的補(bǔ)加濃度可根據(jù)Haldane模型加以確定。根據(jù)本發(fā)明，葡萄糖補(bǔ)料濃度在6～10g/L時(shí)比生長(zhǎng)速率達(dá)到最大。KNO3溶液的補(bǔ)加濃度宜為0.9g/L，因?yàn)樵诖藵舛认?，轉(zhuǎn)兔防御素基因小球藻的細(xì)胞密度較高，NP-1表達(dá)量也較高。
補(bǔ)料母液要分開滅菌。在補(bǔ)料過程中若出現(xiàn)溶氧迅速下跌的現(xiàn)象，可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速，使溶氧保持在一定水平上，因?yàn)槿苎醪蛔銜?huì)抑制藻細(xì)胞的生長(zhǎng)甚至出現(xiàn)藻體自溶的現(xiàn)象，從而影響轉(zhuǎn)NP-1基因小球藻細(xì)胞密度的進(jìn)一步提高。在培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)當(dāng)注意pH不宜過高，因?yàn)閜H太高了藻細(xì)胞不易生長(zhǎng)。當(dāng)pH高于8.5時(shí)，宜用例如10％的硫酸調(diào)節(jié)pH。
在培養(yǎng)結(jié)束后，可采用已知的常規(guī)方法從所得培養(yǎng)物中純化分離得到兔防御素。
下面將通過實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例中的具體數(shù)值和手段。
實(shí)施例1異養(yǎng)作為最適營(yíng)養(yǎng)模式在250ml搖瓶中裝入100ml Knop混合營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，分別進(jìn)行轉(zhuǎn)NP-1基因小球藻光自養(yǎng)、異養(yǎng)及混合營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)。光自養(yǎng)培養(yǎng)和混合營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)的入射光強(qiáng)為3klx。接種量為0.207g/L，溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間72小時(shí)。如圖1所示，光自養(yǎng)的最大細(xì)胞密度(△)為0.6g/L，異養(yǎng)的最大細(xì)胞密度(□)為1.52g/L，混合營(yíng)養(yǎng)的最大細(xì)胞密度(■)為1.17g/L。光自養(yǎng)的NP-1表達(dá)量(用單細(xì)胞的抑菌圈直徑表示)為17.4mm，異養(yǎng)的NP-1表達(dá)量為19.4～21.3mm，混合營(yíng)養(yǎng)的NP-1表達(dá)量為20.1～21.8mm(見下表1)。因此，選擇異養(yǎng)作為轉(zhuǎn)NP-1基因小球藻的最適營(yíng)養(yǎng)模式。
表1培養(yǎng)時(shí)間 抑菌圈直徑(mm)(h)混合營(yíng)養(yǎng)異養(yǎng) 光自養(yǎng)23 21.820.838 21.619.647 21.620.158 21.219.470 20.121.3 17.4實(shí)施例2KNO3補(bǔ)加濃度的確定在250ml搖瓶中裝入100ml下述培養(yǎng)基，氮源KNO30.9 酵母粉9碳源葡萄糖15無(wú)機(jī)鹽KH2PO40.13Ca(NO3)20.2MgSO4·7H2O0.05 KCl0.06FeCl30.01微量元素(mg/L)H3BO40.061ZnSO4·7H2O0.287MnSO4·H2O0.169 (NH4)6MoO24·4H2O0.01235CuSO4·5H2O0.00249只是將培養(yǎng)基中KNO3的濃度分別變?yōu)?.1g/L、0.5g/L、0.9g/L、1.3g/L、1.7g/L、2.1g/L，并以不添加KNO3的培養(yǎng)基做對(duì)照。當(dāng)細(xì)胞密度較低時(shí)，在培養(yǎng)基中添加硝酸鉀與否不影響轉(zhuǎn)NP-1基因小球藻的生長(zhǎng)；從67h開始，添加不同濃度的硝酸鉀對(duì)轉(zhuǎn)基因藻的生長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用，細(xì)胞密度比對(duì)照有了明顯的提高。培養(yǎng)到96h，按照硝酸鉀濃度由低到高的順序?qū)?yīng)的生物量分別為3.78g/L、4.86g/L、5.11g/L、5.28g/L、5.41g/L、5.21g/L，而對(duì)照只有3.29g/L(見圖2)。添加不同濃度的硝酸鉀對(duì)轉(zhuǎn)基因小球藻中NP-1表達(dá)量的影響列在下表2中。
表2KNO3初始濃度(g/L) 0 0.1 0.5 0.91.31.72.1抑菌圈直徑(mm) 21.922.221.521 17 17.9 17.9由表2可見，當(dāng)硝酸鉀濃度在0.1g/L～0.9g/L時(shí)，抑菌圈直徑變化較小，當(dāng)硝酸鉀濃度超過0.9g/L時(shí)，抑菌圈直徑從21mm下降到17mm左右，因此從轉(zhuǎn)基因藻的細(xì)胞密度和NP-1表達(dá)量來(lái)看，硝酸鉀的添加濃度以0.5-0.9g/L為宜，更佳的為0.9g/L。在此濃度下，藻細(xì)胞的密度為對(duì)照的1.55倍，而抑菌圈直徑(即NP-1的表達(dá)量)基本不變。
從圖3可以看出，在培養(yǎng)過程中補(bǔ)加硝酸鉀不影響轉(zhuǎn)NP-1基因小球藻生長(zhǎng)和NP-1表達(dá)，因此確定生物反應(yīng)器培養(yǎng)時(shí)硝酸鉀的最佳補(bǔ)加濃度為0.9g/L。
實(shí)施例3葡萄糖補(bǔ)加濃度的確定在250ml搖瓶中裝入100ml如實(shí)施例2所示的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中KNO3濃度0.9g/L，同時(shí)改變培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度為1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L，以研究葡萄糖濃度對(duì)轉(zhuǎn)NP-1基因小球藻生長(zhǎng)的影響。
圖4給出了初始葡萄糖濃度和轉(zhuǎn)NP-1基因小球藻比生長(zhǎng)速率之間的關(guān)系。由該圖可見，當(dāng)初始葡萄糖濃度不同時(shí)，轉(zhuǎn)基因小球藻的比生長(zhǎng)速率也不同。高濃度的葡萄糖會(huì)抑制轉(zhuǎn)NP-1基因小球藻的生長(zhǎng)，使其比生長(zhǎng)速率較小。高濃度的葡萄糖對(duì)生長(zhǎng)的抑制作用是因?yàn)槠咸烟菨舛容^高時(shí)，葡萄糖的吸收與能量轉(zhuǎn)換受到了限制。當(dāng)初始葡萄糖濃度為70g/L時(shí)，比生長(zhǎng)速率達(dá)到最小，僅為0.0293h-1。當(dāng)葡萄糖濃度為7g/L時(shí)，比生長(zhǎng)速率達(dá)到最大值0.0696h-1。通過曲線擬合，得到轉(zhuǎn)NP-1基因小球藻的Haldane方程μ=0.088*S0.98+S+S2/39.68]]>其中μm＝0.088h-1，KS＝0.98g/L，Ki＝39.68g/L；最優(yōu)葡萄糖濃度為Smi＝6.24g/L，相應(yīng)的比生長(zhǎng)速率μmi＝0.0669h-1。由圖4可見，葡萄糖濃度在6～10g/L時(shí)，轉(zhuǎn)基因藻的比生長(zhǎng)速率維持在較高的水平上。由此可見，在生物反應(yīng)器異養(yǎng)培養(yǎng)轉(zhuǎn)NP-1基因小球藻過程中的葡萄糖濃度應(yīng)控制在6～10g/L范圍內(nèi)。
實(shí)施例45L生物反應(yīng)器培養(yǎng)在5L生物反應(yīng)器中加入實(shí)施例2中的培養(yǎng)基，加自來(lái)水至3.5L后滅菌，然后當(dāng)溫度降至28℃時(shí)按工作體積的10％接入轉(zhuǎn)NP-1基因小球藻，開始異養(yǎng)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件溫度為28℃，轉(zhuǎn)速?gòu)慕臃N時(shí)的200r/min逐漸調(diào)整到培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的400r/min，空氣流量為1∶1，pH小于8.5，控制溶氧在40％以上。接種后60h時(shí)開始添加補(bǔ)料液，之后每隔12小時(shí)添加KNO3，使其濃度為0.9g/L；每隔8～12小時(shí)補(bǔ)加葡萄糖，使其濃度為7～10g/L。如圖5所示，131小時(shí)后轉(zhuǎn)NP-1基因小球藻細(xì)胞密度(■)達(dá)到27.8g/L，之后細(xì)胞密度下降，結(jié)束培養(yǎng)。
實(shí)施例515L生物反應(yīng)器培養(yǎng)在15L生物反應(yīng)器中加入實(shí)施例2中的培養(yǎng)基，加自來(lái)水至10L后滅菌，然后當(dāng)溫度降至28℃時(shí)按工作體積的10％接入轉(zhuǎn)NP-1基因小球藻，開始異養(yǎng)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件溫度為28℃，轉(zhuǎn)速?gòu)慕臃N時(shí)的200r/min逐漸調(diào)整到培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的450r/min，空氣流量為1∶1，pH小于8.5，控制溶氧在30％以上。接種后60h時(shí)開始添加補(bǔ)料液，之后每隔12小時(shí)添加KNO3，使其濃度為0.9g/L；每隔8～12小時(shí)補(bǔ)加葡萄糖，使其濃度為7～10g/L，133h轉(zhuǎn)NP-1基因小球藻細(xì)胞密度(■)達(dá)到34.2g/L，結(jié)束培養(yǎng)。
根據(jù)上述實(shí)施例可以看出，本發(fā)明的高密度培養(yǎng)方法在NP-1表達(dá)量基本不變的情況下大大提高了細(xì)胞密度，為該轉(zhuǎn)NP-1基因小球藻的成功應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.一種高密度異養(yǎng)培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因小球藻來(lái)生產(chǎn)兔防御素的方法，其特征在于，該方法包括a).在生物反應(yīng)器中加入pH為5.0～7.0的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基由KNO30.5～3克/升、酵母粉3～11克/升、葡萄糖5～30克/升以及少量無(wú)機(jī)鹽、微量元素和水組成，按工作體積的5～15％接入轉(zhuǎn)兔防御素基因小球藻種培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25～30℃，pH小于8.5，控制溶氧在20％以上，至轉(zhuǎn)基因小球藻細(xì)胞密度最高時(shí)結(jié)束培養(yǎng)；b).從步驟a)所得培養(yǎng)物中純化得到兔防御素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，可在接種后36～60h時(shí)補(bǔ)料，之后每隔6～14小時(shí)補(bǔ)料。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述補(bǔ)料是加入葡萄糖及KNO3溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖的補(bǔ)料濃度為6-10克/升。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述KNO3溶液的補(bǔ)加濃度為0.9克/升。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，當(dāng)培養(yǎng)液的pH高于8.5時(shí)，可用10％體積的硫酸進(jìn)行調(diào)節(jié)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基基本上由以下成分組成KNO30.5～3克/升、酵母粉3～11克/升、葡萄糖5～30克/升、KH2PO40.1～0.3克/升、Ca(NO3)20.15～0.45克/升、MgSO4·7H2O 0.01～0.1克/升、KCl 0.05～0.15克/升、FeCl30.005～0.03克/升；微量元素0.5～3ml，其中微量元素的組成為H3BO40.061克/升、ZnSO4·7H2O 0.287克/升、MnSO4·H2O 0.169克/升、(NH4)6MoO24·4H2O 0.01235克/升、CuSO4·5H2O 0.00249克/升；水。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的異養(yǎng)培養(yǎng)工藝，其特征在于培養(yǎng)基采用自來(lái)水配制。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種高密度異養(yǎng)培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因小球藻來(lái)生產(chǎn)兔防御素的方法，包括a).在生物反應(yīng)器中加入pH為5.0～7.0的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基由KNO
文檔編號(hào)C07K16/14GK1473846SQ0314219
公開日2004年2月11日 申請(qǐng)日期2003年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月11日
發(fā)明者李元廣, 韓興梅, 王偉, 沈國(guó)敏, 魏曉東, 魏鴻剛 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)