專利名稱：在蛋白質(zhì)如病原性/傳染性蛋白質(zhì)中誘導(dǎo)構(gòu)象轉(zhuǎn)變的方法
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背景技術(shù)：
雖然蛋白質(zhì)折疊的中心范例(Anfinsen，C.B.(1973)蛋白鏈折疊的指導(dǎo)原則Principles That Govern Folding of Protein Chains.Science，181，223-230)，蛋白質(zhì)的氨基酸序列編碼其獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)得到了充分證實(shí)，但由于最近發(fā)展的“朊病毒”的概念使其共性受到了質(zhì)疑。如首先由Griffith(Griffith，J.S.(1967)自復(fù)制和羊瘙癢病Self-replication andscrapie.Nature，215，1043-1044)以通用術(shù)語所提出的，引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)退化的傳染性羊瘙癢病物質(zhì)的生化特性顯示了疾病傳播所必需的成分是蛋白質(zhì)(Prusiner，S.B.(1982)導(dǎo)致羊瘙癢病的新的蛋白質(zhì)傳染性顆粒Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie.Science，216，136-144)。朊病毒增殖進(jìn)一步包括由稱為PrPC的細(xì)胞型朊病毒蛋白向有毒性的羊瘙癢病形式PrPSc的轉(zhuǎn)變，通過PrPSc作為模板用于PrPC形成新的PrPSc分子推動(dòng)了這一轉(zhuǎn)變(Prusiner，S.B.(1987)朊病毒和神經(jīng)變性疾病Prions and neurodegenerative diseases.N Engl J Med，317，1571-1581)。這種“唯蛋白質(zhì)”假說暗示同樣的多肽序列，在不存在任何翻譯后修飾的情況下，能夠采用兩種明顯不同的穩(wěn)定的蛋白質(zhì)構(gòu)象。因而，對(duì)于朊病毒來說有可能，盡管沒有證實(shí)，它們違背了蛋白折疊的中心范例。有一些間接的證據(jù)即其它因子可能涉及構(gòu)象轉(zhuǎn)變過程(Prusiner，S.B.(1998)朊病毒Prions.Proc Natl Acad Sci USA，95，13363-13383)，該過程包括一種由α螺旋變?yōu)棣抡郫B二級(jí)結(jié)構(gòu)的顯著改變。盡管有人提出一種假定的“因子X”可能作為一種分子伴侶而起作用，但其化學(xué)特性卻一直未得到鑒定(Zahn，R.(1999)朊病毒傳播和分子伴侶Prion propagationand molecular chaperones.Q Rev Biophys，32，309-370)。因而“因子X”可能是一種蛋白質(zhì)、一種脂質(zhì)、另一種生物大分子或其組合。
對(duì)于PrPSc促進(jìn)細(xì)胞同工型的轉(zhuǎn)變的分子機(jī)制已提出兩種通用的模型(見

圖1)。關(guān)于PrPSc形成的“晶核形成”或“結(jié)籽”模型(Jarrett，J.T.和Lans-bury，P.T.，Jr.(1993)淀粉體的“一維結(jié)晶”為引入種晶一種在阿爾茨海默癥和羊瘙癢病中的致病機(jī)制？Seeding″one-dimensionalcrystallization″of amyloida pathogenic mechanism in Alzheimer′sdisease and scrapie？Cell，73，1055-1058)提出PrPC和PrPSc處于快速建立的平衡態(tài)中，并且PrPSc的構(gòu)象只有在陷入于晶體樣的晶種內(nèi)時(shí)才是熱動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定的(見圖1A)。該建議的過程類似于充分描述了特性的成核依賴的蛋白質(zhì)聚合作用的其它過程，包括微管裝配、鞭毛裝配以及鐮狀紅細(xì)胞血紅蛋白原纖維的形成，其中動(dòng)力學(xué)勢(shì)壘是由單分子周圍成核所致。為闡明指數(shù)式轉(zhuǎn)變速率，必須假定聚集物不斷地分裂以產(chǎn)生增加的堆積表面，盡管分裂的機(jī)制還有待于解釋。PrPSc形成的“模板輔助”或“異二聚體”的模型(Prusiner，S.B.，Scott，M.，F(xiàn)oster，D.，Pan，K.M.，Groth，D.，Mirenda，C.，Torchia，M.，Yang，S.L.，Serban，D.，Carlson，G.A.等(1990)轉(zhuǎn)基因研究暗示了羊瘙癢病朊病毒復(fù)制中同源PrP同工型之間存在相互作用Transgenetic studies implicate inter-actions betweenhomologous PrP isoforms in scrapie prion replication.Cell，63，673-686)提出PrPC在一定程度上是未折疊的并在作為模板起作用的PrPSc分子的作用下重折疊(見圖1B)。在沒有通過預(yù)先存在的PrPSc催化的情況下，高的能量勢(shì)壘被假定使得這種轉(zhuǎn)變不可能發(fā)生。構(gòu)象變化被認(rèn)為是通過PrPC-PrPSc異二聚體分解為兩個(gè)PrPSc分子進(jìn)行動(dòng)力學(xué)控制的，且能被視為是一種繼Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)自動(dòng)催化之后的一種誘導(dǎo)裝配的酶反應(yīng)。一旦轉(zhuǎn)變開始啟動(dòng)其就引起一種指數(shù)式的轉(zhuǎn)變級(jí)聯(lián)，與此同時(shí)PrPSc二聚體快速地解聚為單體。模板輔助模型的一個(gè)缺點(diǎn)是它沒有解釋為什么在增殖后PrPSc會(huì)聚集為蛋白質(zhì)原纖維。Manfred Eigen曾進(jìn)行過朊病毒的兩種建議的疾病機(jī)制的比較動(dòng)力學(xué)分析(Eigen，M.(1996)Prionics或朊病毒疾病的動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)Prionics or the kinetic basis of prion diseases.Biophysical Chemistry，63，A1-A18)。他發(fā)現(xiàn)大體而言兩種模型在邏輯上都是可行的，但是它們作用過程中的條件似乎是過于狹窄且不切實(shí)際。自動(dòng)催化的模板輔助模型需要協(xié)同效應(yīng)以啟動(dòng)，但接著其在現(xiàn)象上變得與成核模型無法區(qū)分，該成核模型也是一種(被動(dòng)的)自動(dòng)催化的形式。盡管這兩種機(jī)制依然可能在兩種單體蛋白質(zhì)構(gòu)象的哪一種是有利的平衡態(tài)的問題上產(chǎn)生不一致，但它們二者都需要一種聚集態(tài)作為最終在平衡上有利的形式以及假定類似朊病毒蛋白質(zhì)的病理形式。Eigen推斷需要更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)來判斷兩種模型的哪一種是正確的。原則上，對(duì)于朊病毒增殖的兩種模型都沒有排除可能的通過“因子X”的協(xié)同作用。
對(duì)一種朊病毒疾病的機(jī)理的理解需要細(xì)胞型和病理型朊病毒蛋白的三維結(jié)構(gòu)的詳細(xì)知識(shí)。只有兩種蛋白的結(jié)構(gòu)都得到了解釋，那么才能夠理解轉(zhuǎn)變是如何發(fā)生的。在體內(nèi)，“健康的”朊病毒蛋白通過一種糖基化肌醇磷酯錨和稱為脂質(zhì)筏的膜結(jié)構(gòu)域部分而附于細(xì)胞表面(Vey，M.，Pilkuhn，S.，Wille，H.，Nixon，R.，DeArmond，S.J.，Smart，E.J.，Anderson，R.G.，Taraboulos，A.和Prusiner，S.B.(1996)細(xì)胞的亞細(xì)胞共區(qū)域化和在細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷類似膜結(jié)構(gòu)域中的羊瘙癢病朊病毒蛋白Subcellularcolocalization of the cellular and scrapie prion proteins incaveolae-like membranous domains.Proc Natl Acad Sci U S A，93，14945-14949)。近來的結(jié)構(gòu)研究集中在使用核磁共振(NMR)波譜法研究來自不同物種的可溶性重組朊病毒蛋白。這些研究顯示了哺乳動(dòng)物PrPC由兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域組成一個(gè)柔性無序的N端尾部，它包含殘基23-120，以及殘基121-230的一個(gè)井狀結(jié)構(gòu)的C末端球狀結(jié)構(gòu)域，它富含α螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)及包含一種少量反平行的β折疊(Lopez Garcia，F(xiàn).，Zahn，R.，Riek，R.和Wüthrich，K.(2000)牛朊病毒蛋白的NMR結(jié)構(gòu)NMR structureof the bovine prion protein.Proc Natl Acad Sci U S A，97，8334-8339)。當(dāng)PrPC轉(zhuǎn)變成PrPSc后，代表在哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物朊病毒蛋白中最保守序列的殘基90-120(Wopfner，F(xiàn).，Weidenhofer，G.，Schneider，R.，vonBrunn，A.，Gilch，S.，Schwarz，T.F.，Werner，T.和Schatzl，H.M.(1999)分析27種哺乳動(dòng)物和9種鳥類的朊病毒蛋白揭示了朊病毒蛋白的柔性區(qū)域的高保守性Analysis of 27 mammalian and 9 avian prion proteinsreveals high conservation of flexible regions of the prion protein.J Mol Biol，289，1163-1178)，變得抗蛋白酶K的處理(Prusiner，S.B.，Groth，D.F.，Bolton，D.C.，Kent，S.B.和Hood，L.E.(1984)一種主要的羊瘙癢病朊病毒蛋白的純化和結(jié)構(gòu)研究Purification andstructural studies of a major scrapie prion protein.Cell，38，127-134)，暗示該多肽片段結(jié)構(gòu)變化了。有進(jìn)一步的證據(jù)即PrPC的構(gòu)象轉(zhuǎn)變伴隨著β折疊二級(jí)結(jié)構(gòu)的大量的增加(Pan，K.M.，Baldwin，M.，Nguyen，J.，Gasset，M.，Serban，A.，Groth，D.，Mehlhorn，I.，Huang，Z.，F(xiàn)letterick，R.J.，Cohen，F(xiàn).E.等.(1993)α螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)棣抡郫B在形成羊瘙癢病朊病毒蛋白的過程中起重要作用Conversion of alpha-helices into beta-sheets features in the formation of the scrapie prion proteins.ProcNatl Acad Sci USA，90，10962-10966)。
在現(xiàn)有技術(shù)中觀察到的問題清楚地定義不同類型的PrP的構(gòu)象特性對(duì)于闡釋所述轉(zhuǎn)變和疾病機(jī)制是決定性的。由于大多數(shù)測(cè)定蛋白質(zhì)構(gòu)象的高效方法依賴于預(yù)先排除了聚集物的可溶的均質(zhì)樣品的研究，對(duì)于朊病毒來說證明這是挑戰(zhàn)性的。到目前為止，病原性的朊病毒蛋白還沒有進(jìn)行過詳細(xì)的結(jié)構(gòu)分析。它們形成淀粉樣蛋白原纖維的趨勢(shì)阻止了用于X射線研究的晶體的生長(zhǎng)，而且用于結(jié)構(gòu)測(cè)定的液體核磁共振波譜法到目前為止僅能夠應(yīng)用于最高具有40kDa分子量的蛋白。然而，該原纖維太大了而且此外是不可溶的。固體核磁共振當(dāng)前是在原子分辨率上對(duì)淀粉樣蛋白原纖維中的PrPSc進(jìn)行分析的唯一技術(shù)，但要應(yīng)用到生物大分子上，這種技術(shù)仍然需要巨大的發(fā)展。
一個(gè)朊病毒疾病研究中的科學(xué)突破期望于朊病毒蛋白的可溶性聚集物的生產(chǎn)和結(jié)構(gòu)鑒定。依據(jù)朊病毒復(fù)制的普遍模型該寡聚的PrP聚集物對(duì)于細(xì)胞型重折疊為具有傳染性的瘙癢病型是重要的，并且有一些證據(jù)即因子X可能參與這一過程(Prusiner，1998)。PrPSc的可溶性復(fù)合物以及PrPC/PrPSc聚集物對(duì)于在溶液中的任何生物化學(xué)或光譜技術(shù)都是有吸引力的靶目標(biāo)。因而，發(fā)展一種從重組PrPC到PrPSc的構(gòu)象傳遞方法將具有眾多潛在的應(yīng)用。
較早地以重組PrP進(jìn)行的轉(zhuǎn)變研究已經(jīng)顯示了沒有獲得規(guī)則的蛋白質(zhì)原纖維在酸性pH下并且在高濃度尿素存在時(shí)，mPrP(121-231)轉(zhuǎn)變成一種可溶性的富含β折疊的同工型(Hornemann，S.和Glockshuber，R.(1998)通過酸性pH誘導(dǎo)朊病毒蛋白結(jié)構(gòu)域PrP(121-231)的一種洋瘙癢病類似未折疊中間態(tài)A scrapie-like unfolding intermediate of the prion proteindomain PrP(121-231)induced by acidic pH.Proc Natl Acad Sci U S A，95，6010-6014)，而hPrP(90-231)在鹽酸胍存在時(shí)轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N富含β折疊的同工型，其形成原纖維樣聚集物(Swietnicki，W.，Morillas，M.，Chen，S.G.，Gambetti，P和Surewicz，W.K.(2000)重組人朊病毒蛋白huPrP90-231的聚集作用和原纖維化Aggregation and fibrillization ofthe recombinant human prion protein huPrP90-231.Biochemistry，39，424-431)。但是，這些聚集物的超結(jié)構(gòu)沒有被充分地解釋，并且沒有報(bào)道過它們是否顯示淀粉樣蛋白的典型生物物理特性。在不存在去污劑的還原條件下也已經(jīng)獲得了hPrP(91-231)的不規(guī)則的原纖維樣聚集物(Jackson，G.S.，Hosszu，L.L.，Power，A.，Hill，A.F.，Kenney，J.，Saibil，H.，Craven，C.J.，Waltho，J.P.，Clarke，A.R.和Collinge，J.(1999)單體人朊病毒蛋白在天然的和原纖維基因狀構(gòu)象之間的可逆轉(zhuǎn)變Reversibleconversion of monomeric human prion protein between native andfibrilogenic conformations.Science，283，1935-1937)。
幾種不同的神經(jīng)變性疾病如阿爾茨海默癥、帕金森癥和克-雅氏病都涉及具有高含量的β折疊二級(jí)結(jié)構(gòu)的特異性蛋白質(zhì)或肽的形成，它賦予對(duì)于蛋白質(zhì)/肽聚集和稱為淀粉樣蛋白的極不可溶的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外沉淀物的形成的高趨向性。有越來越多的本領(lǐng)域權(quán)威小組所發(fā)表的證據(jù)即它是這種“β蛋白”的寡聚物形式，并且不需要淀粉樣蛋白的典型的大聚集物，該大聚集物是造成引發(fā)神經(jīng)變性疾病發(fā)病的原因。
發(fā)明目的和概述因此，本發(fā)明的一個(gè)目的就是提供一種由重組的和/或天然的蛋白質(zhì)產(chǎn)生病原性/傳染性蛋白質(zhì)的方法。通過權(quán)利要求1的特征得以實(shí)現(xiàn)該目的。本發(fā)明的具體實(shí)施方案包括涉及神經(jīng)變性疾病的蛋白質(zhì)或聚集物的相應(yīng)方法，所述神經(jīng)變性疾病包括傳播性海綿狀腦病(TSE)、阿爾茨海默癥、多發(fā)性硬化癥和帕金森病，以及產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)聚集物。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供通過這些方法獲得的蛋白質(zhì)的應(yīng)用，包括研究在受控制的條件下PrPC向PrPSc轉(zhuǎn)變的不同相；篩選用于開發(fā)a)對(duì)抗傳播性海綿狀腦病的潛在治療方法，或b)新的用于診斷傳播性海綿狀腦病的檢測(cè)方法的配體；開發(fā)特異性結(jié)合(PrPSc)的抗體；以及使用核磁共振波譜法或X-射線測(cè)定的PrPSc的三維結(jié)構(gòu)作為配體設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供應(yīng)用本發(fā)明的方法，以開發(fā)抗傳播性海綿狀腦病如人克-雅氏病(CJD)的潛在治療方法；開發(fā)特異性結(jié)合(PrPSc)的抗體；以及使用核磁共振波譜法或X-射線測(cè)定的PrPSc的三維結(jié)構(gòu)作為配體設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的具體實(shí)施方案和額外的特征闡述于從屬權(quán)利要求中。
本發(fā)明包括一種用于產(chǎn)生重組PrP、PrPβ的可溶的、寡聚的富含β折疊的構(gòu)象變體的體外方法，所述變體聚集成淀粉樣蛋白原纖維PrPβf，類似于在羊瘙癢病相關(guān)原纖維和朊病毒棒體中的病原型PrPSc。由PrP向PrPβ的轉(zhuǎn)變于pH5.0下在bicellar溶液中發(fā)生，所述bicellar溶液含有二已酰-磷酸膽堿和二肉豆蔻酰-磷脂的等摩爾混合物，以及小百分比的帶負(fù)電荷的二肉豆蔻酰-磷酸絲氨酸。該方法適用于所有PrP受測(cè)的物種，包括人類、牛、駝鹿、豬、狗和鼠PrP。使用N末端截短的人PrP片段hPrP(90-230)、hPrP(96-230)、hPrP(105-230)和hPrP(121-230)，我們顯示了柔性肽片段105-120對(duì)于PrPβ是必需的。PrP的二聚化是轉(zhuǎn)變的限速步驟，其依賴于氨基酸序列。人和牛的PrP二聚化的自由焓為大約130kJ/mol，其它被研究的物種為在260和320kJ/mol之間。因此，提出的體外轉(zhuǎn)變測(cè)試方法允許在分子水平上研究傳播性海綿狀腦病的不同相。
附圖簡(jiǎn)述以下附圖用于證明現(xiàn)有的技術(shù)以及本發(fā)明。
根據(jù)本發(fā)明的方法的優(yōu)選的實(shí)施方案將也將通過附圖來解釋，而這不應(yīng)限制本發(fā)明的范圍。
圖1對(duì)于PrPSc促進(jìn)細(xì)胞同功型轉(zhuǎn)變的分子機(jī)制提出的兩種通用模型(Zahn，R.(1999)圖1A“晶核形成”或“結(jié)籽”模型；圖1B“模板輔助”或“異二聚體”模型；圖2在bicellar溶液中通過紫外CD所揭示的重組mPrP(23-231)向PrPβ的構(gòu)象轉(zhuǎn)變圖2A PrP重折疊為富含β折疊形式的PrPβ；圖2B當(dāng)用5％二肉豆蔻酰-磷酸甘油(DMPG)取代DMPS時(shí)所觀察到的構(gòu)象變化；圖2C在中性bicelles中加熱蛋白質(zhì)，即在不存在DMPS和DMPG時(shí)不誘導(dǎo)二級(jí)結(jié)構(gòu)改變；圖2D在中性bicelles中加熱蛋白質(zhì)，即在無脂質(zhì)緩沖液中不誘導(dǎo)二級(jí)結(jié)構(gòu)改變；圖3人重組PrP向PrPβ的轉(zhuǎn)變對(duì)于N端“尾部”長(zhǎng)度的依賴性；圖4A在轉(zhuǎn)變緩沖液中測(cè)量的鼠PrP轉(zhuǎn)變動(dòng)力學(xué)作為摩爾橢圓率在226nm處的改變值；圖4B在不同溫度下相對(duì)于PrP濃度測(cè)定的起始轉(zhuǎn)變速率的雙對(duì)數(shù)曲線；圖5 Prp向PrPβ轉(zhuǎn)變的溫度依賴性
圖5A鼠PrP的轉(zhuǎn)變動(dòng)力學(xué)；圖5B小鼠、人、牛和駝鹿的埃林坐標(biāo)圖，其上繪制有相對(duì)于反向絕對(duì)溫度的對(duì)數(shù)標(biāo)度。
圖6蛋白酶K消化后重組小鼠PrP(23-230)的十二烷基磺酸鈉電泳；圖6A PrPβf-聚集物；圖6B未轉(zhuǎn)變的PrP；圖7 PrP向PrPβ轉(zhuǎn)變的機(jī)理模型；圖8通過CLUSTAL W算法得到的哺乳動(dòng)物PrP序列的序列比對(duì)。
發(fā)明詳述以住曾對(duì)在大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)的重組PrP與脂質(zhì)的相互作用進(jìn)行過研究。在大量帶負(fù)電荷脂質(zhì)存在時(shí)，觀察到蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)向更多α螺旋(Morillas，M.，Swietnicki，W.，Gambetti，P.和Surewicz，W.K.(1999)膜環(huán)境改變了重組人朊病毒蛋白的構(gòu)象結(jié)構(gòu)Membrane environmentalters the conformational structure of the recombinant human prionprotein.J Biol Chem，274，36859-36865)或β折疊結(jié)構(gòu)(Sanghera，N.和Pinheiro，T.J.(2002)朊病毒蛋白結(jié)合到脂質(zhì)膜及對(duì)朊病毒轉(zhuǎn)變的暗示Binding of prion protein to lipid membranes and implications for prionconversion.J Mol Biol，315，1241-1256)的改變，盡管在這些研究中沒有報(bào)道過PrP聚集成病原性的淀粉樣蛋白原纖維。在產(chǎn)生或穩(wěn)定淀粉樣聚集物和富含β折疊的中間態(tài)PrP的嘗試中，我們研究了在bicellar溶液中的重組蛋白質(zhì)。Bicelles是由二肉豆蔻酰-磷酸甘油(DMPC)、二肉豆蔻酰磷酸絲氨酸(DMPS)和二已酰-磷酸膽堿(DHPC)的混合物組成的盤狀脂質(zhì)顆粒。Bicelles的長(zhǎng)鏈磷脂形成一種液晶態(tài)的雙分子層部分，它被一圈短鏈磷脂所包環(huán)繞，保護(hù)長(zhǎng)?；湶慌c水接觸(Vold，R.R.和Prosser，R.S.(1996)磁定向的磷脂雙分子層膠束用于多肽結(jié)構(gòu)研究。理想的bicelle存在嗎？Magnetically oriented phospholipid bilayered micelles forstructural studies of polypeptides.Does the ideal bicelle exist？Journal of Magnetic Resonance Series B，113，267-271)。在跨膜蛋白的活性重建中，bicelles顯示了優(yōu)于其它化合物(Dencher，N.A.(1989)膜蛋白溫和和快速的跨膜重建Gentle and fast transmembranereconstitution of membrane proteins.Methods Enzymol，171，265-274)。此外，bicelles與脂質(zhì)筏共有一些結(jié)構(gòu)特征即它們形成盤狀脂質(zhì)雙分子層。
在此，我們顯示了bicellar溶液特別適于重組PrP向一種可溶的、剮聚的β折疊中間態(tài)(PrPβ)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變的產(chǎn)生過程，該中間態(tài)能夠進(jìn)一步轉(zhuǎn)變成淀粉樣蛋白原纖維(PrPβf)。這些重組的PrP聚集物基本顯示了文獻(xiàn)記載的PrPSc所有理化性質(zhì)。起始于重組PrP的PrPβ的產(chǎn)生也許打開了另一條在體外條件控制下研究和利用PrP向PrPSc轉(zhuǎn)變的不同相的途徑。
此外，本發(fā)明包括下列應(yīng)用1、為開發(fā)抗傳播性海綿狀腦病，如人克-雅氏病(CJD)的潛在治療方法，在體外和體內(nèi)篩選“轉(zhuǎn)變抑制物”，該轉(zhuǎn)變抑制物包括結(jié)合到PrPC上并因而阻止其向PrPβ構(gòu)象轉(zhuǎn)變(參見圖7)的小分子或生物大分子(如蛋白質(zhì)或核酸)以及PrPSc寡聚體(參見圖1A)或PrPSc/PrPC異二聚體(參見圖1B)。轉(zhuǎn)變抑制物進(jìn)一步包括給合到PrPβ和PrPSc寡聚體或PrPSc/PrPC異二聚體上，并因而阻止PrPβf和PrPSc淀粉樣蛋白原纖維形成的小分子或生物大分子(參見圖1和7)，轉(zhuǎn)變抑制物還包括結(jié)合到PrPSc寡聚體、PrPβ和PrPβf上并導(dǎo)致它們分解成PrPC寡聚體或PrPC單體的良性同工型的小分子或生物大分子。體外篩選方法包括在“發(fā)明目的和概述”中所概述的方法，使用CD光譜分析、電子顯微鏡照相、光學(xué)顯微鏡照相和蛋白酶K抗性分析，以及其它光譜技術(shù)如核磁共振波譜法、動(dòng)態(tài)光散射和熒光相關(guān)光譜學(xué)以及生物化學(xué)技術(shù)如BIAcore。體內(nèi)篩選方法包括用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行的研究和細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。
體外篩選PrPSc特異性配體用于開發(fā)新的用于診斷的傳播性海綿狀腦病檢測(cè)方法，其中PrPβ代表一種理想的篩選模板(參見圖7)。PrPSc特異性配體包括結(jié)合到PrPβ和/或PrPβf(參見圖7)和PrPSc寡聚體(參見圖1A)、PrPSc/PrPC異二聚體(參見圖1B)或PrPSc淀粉樣蛋白原纖維(參見圖1)上的小分子或生物大分子，其中在與PrPC的結(jié)合相比時(shí)該結(jié)合親和性是相對(duì)地高。體外篩選方法包括在“發(fā)明目的和概述”中所概述的方法，使用電子顯微鏡照相、光學(xué)顯微鏡照相和蛋白酶K抗性分析，還包括其它光譜技術(shù)如動(dòng)態(tài)光散射和熒光相關(guān)光譜學(xué)以及生物化學(xué)技術(shù)。
開發(fā)特異性結(jié)合PrPSc的抗體，其中PrPβ和/或PrPβf代表理想的抗原(參見圖7)。特異性結(jié)合PrPSc的抗體可以通過體外工程方法或在人和動(dòng)物以PrPβ或PrPβf主動(dòng)免疫之后而產(chǎn)生。該抗體可用于人和/或動(dòng)物的被動(dòng)免疫。
工業(yè)化生產(chǎn)“重組PrPSc”作為用于傳播性海綿狀腦病檢測(cè)方法的“PrPSc標(biāo)準(zhǔn)”，其中PrPβ和/或PrPβf代表重組PrPSc(參見圖7)?！癙rPSc標(biāo)準(zhǔn)”包括一種用于測(cè)定蛋白酶K抗性和聚集行為的重組PrP標(biāo)準(zhǔn)，其使用光譜技術(shù)如動(dòng)態(tài)光散射和熒光相關(guān)光譜。傳播性海綿狀腦病檢測(cè)方法可以應(yīng)用于人和各種動(dòng)物如牛、羊、駝鹿、鹿、貓、豬和馬。
生產(chǎn)“重組PrPSc”用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的接種研究或細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，其中PrPβ和/或PrPβf代表重組的PrPSc(參見圖7)。
使用核磁共振波譜法、X射線結(jié)晶學(xué)或電子顯微鏡照相所測(cè)定的PrPSc的三維結(jié)構(gòu)用作為配體和先導(dǎo)化合物設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)。PrPβ代表液體核磁共振和X射線結(jié)晶學(xué)的理想底物，而PrPβf代表固體核磁共振和電子顯微鏡檢查的理想底物(參見圖7)。
本發(fā)明及其應(yīng)用可以用于涉及神經(jīng)變性疾病(例如阿爾茨海默癥、帕金森病和多發(fā)性硬化癥)的其它蛋白質(zhì)或通常應(yīng)用于在構(gòu)象轉(zhuǎn)變以后引發(fā)疾病的蛋白質(zhì)(構(gòu)象疾病如原發(fā)性系統(tǒng)淀粉樣變性、II型糖尿病、動(dòng)脈淀粉樣變性)。
本發(fā)明進(jìn)一步包括根據(jù)1-7點(diǎn)的野生型蛋白及其變體的產(chǎn)生和/或應(yīng)用。這些變體包括蛋白片段、突變蛋白、融合蛋白、源自合成的蛋白和肽，以及蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果重組鼠PrP向PrPβ的轉(zhuǎn)變?cè)诤?5mM二已酰-磷酸膽堿(DHPC)、23.75mM二肉豆蔻酰-磷酸甘油(DMPC)和1.25mM二肉豆蔻酰磷酸絲氨酸(DMPS)的轉(zhuǎn)變緩沖液中，mPrP(23-231)發(fā)生了從占優(yōu)勢(shì)的α螺旋向可溶的富含β折疊的同工型，稱為PrPβ的轉(zhuǎn)變。
圖2顯示了在bicellar溶液中mPrP(23-231)向PrPβ的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。在含有25mM長(zhǎng)鏈(DMPX；含DMPC，DMPG和/或DMPS)以及25mM短鏈DHPC磷脂的轉(zhuǎn)變緩沖液中記錄遠(yuǎn)紫外圓二色(CD)譜。首先，光譜在37℃累積(圓形)，隨后加熱樣品到65℃ 15分鐘。于37℃平衡后，記錄第二次CD譜(三角形)。圖2A顯示在5％DMPS和95％DMPC存在時(shí)，鼠PrP重折疊為富含β折疊的PrPβ型，其在CD譜中215nm處具有特征性的最小值。圖2B顯示了當(dāng)使用5％的二肉豆蔻酰-磷酸甘油(DMPG)代替DMPS時(shí)所觀察到的類似的構(gòu)象改變。圖2C顯示在中性bicelles中加熱蛋白質(zhì)，即在不存在DMPS或DMPG時(shí)沒有誘導(dǎo)二級(jí)結(jié)構(gòu)改變。圖2D顯示在無脂質(zhì)的緩沖液中加熱蛋白質(zhì)沒有再次誘導(dǎo)二級(jí)結(jié)構(gòu)改變。
如在脂質(zhì)不存在時(shí)對(duì)于mPrP(23-231)所觀察到的(Hornemann，S.，Korth，C.，Oesch，B.，Riek，R.，Wider，G.，Wuthrich，K.和Glockshuber，R.(1997)重組全長(zhǎng)鼠朊病毒蛋白mPrP(23-231)純化和光譜特性Recombinant full-length murine prion protein，mPrP(23-231)purification and spectroscopic characterization.Febs Letters，413，277-281)，圖2A進(jìn)一步顯示了mPrP(23-231)在37℃下，對(duì)于α螺旋具有特征性的208nm處的最小值和217nm處的肩部。加熱蛋白質(zhì)到65℃ 15分鐘導(dǎo)致PrPβ的形成，它顯示了在CD譜中215nm處的單一最小值，提示β折疊二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)增加。將樣品冷卻回37℃后，只觀察到極小的光譜的變化。沒有可以看到的聚集并且在20,000g下離心30分鐘后并不引起沉淀。而且，在室溫溫育多至100天并沒有顯著地改變CD譜。圖2B進(jìn)一步顯示在bicelles中DMPS取代帶負(fù)電荷的DMPG導(dǎo)致了與圖2A相比類似的結(jié)果。圖2C、D進(jìn)一步顯示在中性bicelles或無脂質(zhì)緩沖液中mPrP(23-231)的加熱沒有導(dǎo)致PrPβ的形成。
將DMPS的相對(duì)數(shù)量增加到10％或更多似乎增加了未轉(zhuǎn)變PrP中的α螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量(數(shù)據(jù)未顯示)，暗示該形式也直接與帶負(fù)電荷的bicelles相互作用。然而，加熱后的快速沉淀使CD譜的定量分析成為不可能。因而PrPβ的形成好像是不可逆的脂質(zhì)相關(guān)的過程，它依賴于在脂質(zhì)雙分子層上負(fù)電荷的分布。
2.N端截短的人PrP片段的轉(zhuǎn)變圖3顯示人PrP向PrPβ的轉(zhuǎn)變對(duì)于N端“尾部”長(zhǎng)度的依賴性。如對(duì)圖2所描述地記錄了CD譜圓形，加熱前；三角形，加熱后。指出了重組的PrP構(gòu)建體。
在試圖縮小形成PrPβ所需要的肽片段的努力中，我們分析了完整的人PrP及其各種N端截短的片段的光譜特性。在轉(zhuǎn)變緩沖液中加熱后，hPrP(23-230)、hPrP(90-230)和hPrP(105-230)顯示了一種從占優(yōu)勢(shì)的α螺旋向富含β折疊的蛋白的類似轉(zhuǎn)變(圖3A-C)。對(duì)于這些蛋白在加熱后沒有觀察到聚集作用。但是，在轉(zhuǎn)變緩沖液中加熱的片段hPrP(121-230)立即導(dǎo)致了沉淀，從而沒能記錄到有意義的CD譜。因而，在哺乳動(dòng)物PrP中肽片段105-120的存在似乎對(duì)于重組PrP向PrPβ的轉(zhuǎn)變是必需的。值得注意的是，在所有目前已知的朊病毒蛋白中(Wopfner等，1999)這種最保守的序列元件都含有AGAAAAGA基序，它已被顯示了對(duì)于體內(nèi)PrPc向PrPSc的轉(zhuǎn)變是必不可少的(Holscher，C.，Delius，H.和Burkle，A.(1998)非轉(zhuǎn)化型PrPCδ114-121在羊瘙癢病感染的小鼠成神經(jīng)細(xì)胞溜細(xì)胞中的過表達(dá)導(dǎo)致了野生型PrP(Sc)聚集的轉(zhuǎn)顯性抑制Overexpression ofnonconvertible PrPC delta114-121 in scrapie-infected mouseneuroblastoma cells leads to trans-dominant inhibition of wild-typePrP(Sc)accumulation.J Virol，72，1153-1159)。
3.轉(zhuǎn)變的動(dòng)力學(xué)機(jī)制為從機(jī)理上深入了解PrPβ的形成，在蛋白質(zhì)溶液快速加熱后在恒定的波長(zhǎng)226nm處我們測(cè)量了轉(zhuǎn)變動(dòng)力學(xué)(參見材料和方法)。所有的動(dòng)力學(xué)測(cè)量在100mM氟化鈉存在下進(jìn)行以模仿生理環(huán)境。
圖4A顯示在轉(zhuǎn)變緩沖液中測(cè)量的鼠PrP的轉(zhuǎn)變動(dòng)力學(xué)作為摩爾橢圓率在226nm處的改變值。不同的蛋白質(zhì)濃度在相應(yīng)的曲線旁指出。圖4B顯示了在不同溫度下相對(duì)于PrP濃度(45 to 180 uM)所測(cè)定的起始轉(zhuǎn)變速率的雙對(duì)數(shù)曲線。
圖4A進(jìn)一步顯示了在不同鼠PrP濃度時(shí)所獲得的有代表性的數(shù)據(jù)系列。隨著不斷增加的蛋白質(zhì)濃度反應(yīng)變得顯著更快，提示了與PrPβ的形成相關(guān)聯(lián)的構(gòu)象的改變以一種包括PrP分子寡聚化的協(xié)同方式發(fā)生。當(dāng)轉(zhuǎn)變?cè)陬A(yù)形成的PrPβ存在下進(jìn)行時(shí)，觀察到的速率常數(shù)沒有增加。在圖4B中，相對(duì)于蛋白質(zhì)濃度的對(duì)數(shù)繪制了起始反應(yīng)速率的對(duì)數(shù)。不考慮溫度，這些曲線的斜度為n＝2.1±0.2。因而，二聚化似乎是單體PrP向寡聚的PrPβ轉(zhuǎn)變的限速步驟。
圖5顯示PrP向PrPβ轉(zhuǎn)變的溫度依賴性。根據(jù)圖5A在恒定的蛋白質(zhì)濃度100μM和介于57℃和65℃之間的不同溫度下測(cè)量鼠PrP的轉(zhuǎn)變動(dòng)力學(xué)。圖5B顯示小鼠、人、牛和駝鹿PrP的埃林坐標(biāo)圖，其中轉(zhuǎn)變的速率常數(shù)k被繪制于相對(duì)于反向的絕對(duì)溫度的對(duì)數(shù)標(biāo)度上。
檢查了圖5A顯示了反應(yīng)速率隨著溫度提高從而能夠根據(jù)埃林方程測(cè)定與轉(zhuǎn)變限速步驟相關(guān)聯(lián)的活化焓。相對(duì)于反向絕對(duì)溫度的反應(yīng)速率常數(shù)k的對(duì)數(shù)坐標(biāo)圖，以及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合值顯示于圖5B。計(jì)算出的各種片段的活化參數(shù)和PrP的物種總結(jié)于表1。
表1PrP向PrPβ轉(zhuǎn)變實(shí)驗(yàn)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)
1通過特征性的β折疊CD譜以及加熱后不存在沉淀所證明了PrP向PrPβ的轉(zhuǎn)變(參見材料和方法)。
2通過將方程5與在不同溫度下實(shí)驗(yàn)測(cè)定的反應(yīng)速率k擬合后所獲得的值。
3，4在37℃下分別使用方程6和5計(jì)算。
5在2M尿素存在下進(jìn)行的轉(zhuǎn)變。
對(duì)于鼠和狗的PrP，獲得大約300kJ·mol-1的活化焓，它是完整人和牛PrP的相應(yīng)的熱焓的兩倍。這一發(fā)現(xiàn)與人和牛PrP的核磁共振結(jié)構(gòu)近似的觀點(diǎn)相一致，而它們都與鼠PrP的結(jié)構(gòu)顯著不同(Lopez Garcia等，2000)。
4.產(chǎn)生重組PrP原纖維PrPβf去污劑DHPC構(gòu)成了在轉(zhuǎn)變緩沖液中的bicelles的主要成分。在與長(zhǎng)鏈磷脂的混合物中，DHPC的臨界膠束濃度(cmc)大約是5mM(Ottiger，M.和Bax，A.(1998)在大分子中鑒定用于測(cè)量偶級(jí)耦合的磷脂膠束的磁定向Characterization of magnetically oriented phospholipid micelles formeasurement of dipolar couplings in macromolecules.J Biomol NMR，12，361-372)，低于此濃度，在中度酸性或在中性pH下長(zhǎng)鏈磷脂都形成小泡(Ottiger，M.和Bax，A.(1999)在酸性和堿性pH值下基于液晶的Bicelle用于偶級(jí)耦合的NMR測(cè)量Bicelle-based liquid crys-tals for NMR-measurement of dipolar coupling at acidic and basic pH values.J BiomolNMR，13，187-191)。在我們的轉(zhuǎn)變測(cè)定中，稀釋的PrPβ-bicellar溶液明顯地低于DHPC的臨界膠束濃度，立即導(dǎo)致了PrPβ沉淀為PrPβf。以非變性去污劑如辛基葡糖苷處理這些聚集物導(dǎo)致規(guī)則原纖維PrPβf的形成，它可以在電子顯微鏡中觀察到。當(dāng)直接以去污劑處理而沒有脂質(zhì)的前期稀釋時(shí)觀察到了類似的原纖維。
對(duì)去污劑處理的PrP淀粉樣蛋白原纖維進(jìn)行電子顯微鏡照相將25μM的小鼠PrPβf在20,000g下進(jìn)行沉淀并在50mM Tris-HCI、150mM NaCl、320mM蔗糖和0.5％(w/v)辛基葡糖苷中重懸。產(chǎn)生的淀粉樣蛋白原纖維有形成大束的趨向。但是，也分別觀察到由兩個(gè)或四個(gè)螺旋纏繞的直徑為10.5±0.6nm和25.8±0.6nm原絲組成的單個(gè)原纖維(數(shù)據(jù)未顯示)。這些原絲包含一種直徑為4到4.5nm的念珠狀亞結(jié)構(gòu)。
用于羊瘙癢病相關(guān)的原纖維的類似的亞結(jié)構(gòu)已被過描述，并且據(jù)推測(cè)它們可能是原纖維的亞單位(Merz，P.A.，Somerville，R.A.，Wisniewski，H.M.和Iqbal，K.(1981)來自羊瘙癢病感染腦組織的異常原纖維Abnormalfibrils from scrapie-infected brain.Acta Neuropathol(Berl)，54，63-74)。假定為一種球狀，單個(gè)PrPβf念珠包含34-48nm3的體積，是相應(yīng)于hPrP(90-230)體積的1.7-2.5倍。這與PrPβ形成中的限速步驟為二聚體化的觀察結(jié)果是一致的。因而，PrPβf可能是PrP二聚體聚合的聚集物，并且羊瘙癢病相關(guān)的原纖維可能也由類似的構(gòu)件組成。
我們發(fā)現(xiàn)PrPβf結(jié)合剛果紅并顯示交叉偏振光的綠-金黃色雙光折射(數(shù)據(jù)未顯示)，并且它包含一種相應(yīng)于真正的PrPSc的部分蛋白酶K抗性的核心(參見圖6)。
圖6顯示了蛋白酶K消化后重組小鼠PrP(23-230)的十二烷基磺酸鈉電泳結(jié)果。圖6A顯示了PrPβf聚集物。箭頭指示介于16.0和16.4kDa之間的蛋白水解片段，分別對(duì)應(yīng)于PrP殘基105-230和99-230。圖6B顯示了未轉(zhuǎn)變的PrP。箭頭指示介于13.5和14.7kDa之間的主要的蛋白水解片段。
結(jié)果的討論P(yáng)rP轉(zhuǎn)變的機(jī)制在圖7中顯示了在bicellar溶液中形成PrPβ的一種可能的機(jī)制。
圖7顯示了PrP向PrPβ轉(zhuǎn)變的一種機(jī)理模型。重組PrP由一種橢圓體(殘基121-230)和一段不規(guī)則的線條(殘基90-120)所表示。在PrPβ中，柔性尾部變得結(jié)構(gòu)化如幾何線條所顯示。在PrPβ中球狀結(jié)構(gòu)域或者保持不變，或者參與α螺旋向β折疊的構(gòu)象轉(zhuǎn)變(長(zhǎng)方形)。對(duì)由脂質(zhì)分子和蛋白分子所組成的bicelles的相對(duì)尺度進(jìn)行近似的測(cè)量。
對(duì)于有效轉(zhuǎn)變負(fù)電荷必須在bicelles的雙分子層表面存在的觀察結(jié)果證明了在反應(yīng)中的第一步是PrP靜電吸附到雙分子層/水界面。重組朊病毒蛋白分布到帶負(fù)電的雙分子層上的先前觀察結(jié)果支持了這種觀點(diǎn)(Morillas等，1999；Sanghera和Pinheiro，2002)。轉(zhuǎn)變反應(yīng)的PrP濃度依賴性暗示在反應(yīng)途徑中的所有其它的速率都必須明顯地快于PrP的二聚化。而且，二聚化本身并不引起CD譜中可觀察到的變化，而重折疊卻可以。因此，將PrP向PrPβ的轉(zhuǎn)變與蛋白質(zhì)二聚化偶聯(lián)。我們估計(jì)在我們的試驗(yàn)中所用的bicelles具有大約10nm的直徑(Vold和Prosser，1996)，基于PrP分子相對(duì)于bicellar膜的定位它將提供足夠的空間以容納10-20個(gè)PrP的單體。在DHPC稀釋到超過臨界膠束濃度后或在去污劑存在下，顆粒個(gè)體將會(huì)相遇，導(dǎo)致高度聚合的PrP聚集物PrPβf的形成。這種PrP轉(zhuǎn)變的模型與Caughey及其合作者在一種無細(xì)胞的轉(zhuǎn)變反應(yīng)中所得到的觀察結(jié)果相一致(Baron，G.S.，Wehrly，K.，Dorward，D.W.，Chesebro，B.和Caughey，B.(2002)筏相關(guān)的朊病毒蛋白到具有蛋白酶抗性狀態(tài)的轉(zhuǎn)變需要插入PrP-res(PrP(Sc))到與之接觸的膜中Conversion of raft associatedprion protein to the protease-resistant statere-quires insertion ofPrP-res(PrP(Sc))into contiguous membranes.Embo J，21，1031-1040)，提示了在TSE傳染的過程中產(chǎn)生新的PrPSc需要(i)PrPC從靶細(xì)胞中移除；(ii)細(xì)胞間膜交換；或(iii)引入的PrPSc插入受體細(xì)胞的脂筏區(qū)。
PrP與bicelles相互作用的可能方式包括吸附到雙分子層表面和通過DHPC邊緣側(cè)向插入的跨膜片段的形成。轉(zhuǎn)變發(fā)生需要疏水肽片段112-130證明了支持PrP的該部分插入到雙分子層內(nèi)的觀點(diǎn)，盡管PrPβ也可能僅僅吸附到脂質(zhì)表面。如果構(gòu)象的轉(zhuǎn)變是伴隨著β折疊的形成，那么在柔性無序的尾部或球狀結(jié)構(gòu)域或二者中的二級(jí)結(jié)構(gòu)不能夠輕易地通過我們現(xiàn)有的數(shù)據(jù)來確定(參見圖7)。但是，肽片段90-120在轉(zhuǎn)變后變得抗蛋白酶K的事實(shí)顯示了尾部參與了構(gòu)象的轉(zhuǎn)變。在表1中收集的PrPβ形成的過渡態(tài)動(dòng)力學(xué)提供了進(jìn)一步有價(jià)值的信息。所有的過渡態(tài)熵都具有大的正值，顯示了過渡態(tài)包含了與未轉(zhuǎn)變的PrP相比更高程度的無序。肽片段105-120在未轉(zhuǎn)變的PrP中為柔性無序的，使得它不太可能對(duì)ΔS≠有正面貢獻(xiàn)。這些數(shù)據(jù)提示柔性尾部，以及球狀結(jié)構(gòu)域121-230的未折疊部分在轉(zhuǎn)變過程中起著重要作用，這將與在圖2A、B和3A-C中所觀察到的減少的α螺旋和增多的β折疊二級(jí)結(jié)構(gòu)的結(jié)果相一致。這一模型好像似是而非，因?yàn)橐炎C明肽片段110-140以PrP的跨膜形式橫穿脂質(zhì)雙分子層，它可能涉及TSE因子的發(fā)病機(jī)制和傳播(Hegde，R.S.，Mastrianni，J.A.，Scott，M.R.，DeFea，K.A.，Trembla，P.，Torchia，M.，DeArmond，S.J.，Prusiner，S.B.和Lin-gappa，V.R.(1998)在神經(jīng)變性疾病中朊病毒蛋白的跨膜型A transmembrane form of the prion protein in neurodegen-erativedisease.Science，279，827-834；Hegde，R.S.，Trembla，P.，Groth，D.，DeArmond，S.J.，Prusiner，S.B.和Lingappa，V.R.(1999)可傳染的和遺傳的朊病毒疾病與神經(jīng)元退化具有共同的途徑Transmissible andge-netic prion diseases share a common pathway of neurodegeneration.Nature，402，822-826)。由于這種肽片段的三分之二在PrPC構(gòu)架中是結(jié)構(gòu)化的，因此這種膜關(guān)聯(lián)的形式非?？赡馨粋€(gè)結(jié)構(gòu)改變的球狀結(jié)構(gòu)域。
2.TSE傳播的物種屏障的含義在兩組哺乳動(dòng)物朊病毒蛋白，包括人和牛PrP，以及駝鹿、豬、狗和小鼠PrP之間，分別觀察到在PrP向PrPβ轉(zhuǎn)變的活化焓中的巨大差異(表1)。完整的人和牛PrP的相對(duì)低的活化熵說明與其它朊病毒蛋白相比過渡態(tài)為更少的折疊化。而且，從計(jì)算得出的轉(zhuǎn)變的自由能值以及相應(yīng)的于37℃估測(cè)的反應(yīng)速率常數(shù)，得出在人和牛PrP中自發(fā)的轉(zhuǎn)變比在例如小鼠PrP中的快約600倍。值得注意的是，人和牛PrP在氨基酸序列和三維結(jié)構(gòu)方面非常類似(Lopez Garcia等，2000)。由于在轉(zhuǎn)變反應(yīng)中唯一的區(qū)別是PrP的氨基酸序列，在動(dòng)力學(xué)參數(shù)中的變化必須在物種特異性氨基酸序列的基礎(chǔ)上進(jìn)行合理地說明。在上述兩個(gè)PrP組之間相同的序列變化僅在155位發(fā)現(xiàn)，與在其它朊病毒蛋白中的酪氨酸相比此處人和牛的PrP含有一個(gè)組氨酸(圖8)。
圖8顯示通過CLUSTAL W算法(1.8版；(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.和Gibson，T.J.(1994)C通過序列加權(quán)，位點(diǎn)特異性缺口罰分和權(quán)重矩陣選擇lustal-W改善了累進(jìn)的多序列比對(duì)Clustal-W-Improving theSensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment throughSequence Weighting，Position-Specific Gap Penalties and Weight MatrixChoice.Nucleic Acids Research，22，4673-4680)得到的哺乳動(dòng)物PrP序列的序列比對(duì)，從上到下以逐漸升高的轉(zhuǎn)變活化焓進(jìn)行排列(參見表1)。個(gè)別序列的同一性在左面標(biāo)出。在上方，標(biāo)出人PrP的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元(Zahn，R.，Liu，A.，Luhrs，T.，Riek，R.，von Schroetter，C.，Lopez Garcia，F(xiàn).，Billeter，M.，Calzolai，L.，Wider，G.和Wuthrich，K.(2000)人朊病毒蛋白的NMR溶液結(jié)構(gòu)NMR solution structure of the human prionprotein.Proc Natl Acad Sci USA，97，145-150)空心框，常規(guī)二級(jí)結(jié)構(gòu)；黑線，非常規(guī)二級(jí)結(jié)構(gòu)。依據(jù)人PrP，殘基號(hào)在下面標(biāo)出。
溶劑暴露的His155的質(zhì)子化(Zahn，R.，Liu，A.，Luhrs，T.，Riek，R.，von Schroetter，C.，Lopez Garcia，F(xiàn).，Billeter，M.，Calzolai，L.，Wider，G.和Wuthrich，K.(2000)人朊病毒蛋白的NMR溶液結(jié)構(gòu)NMRsolution structure of the human prion protein.Proc Natl Acad Sci USA，97，145-150)似乎實(shí)質(zhì)上增加了能夠轉(zhuǎn)變?yōu)镻rPβ的有能力轉(zhuǎn)變的蛋白質(zhì)構(gòu)象。由于用嵌合小鼠/倉(cāng)鼠PrP的無細(xì)胞轉(zhuǎn)變實(shí)驗(yàn)已經(jīng)顯示了倉(cāng)鼠PrPC的PrPSc抗原表位包括Met139、Asn155和Asn170(Kocisko，D.A.，Priola，S.A.，Raymond，G.J.，Chesebro，B.，Lansbury，P.T.，Jr.和Caughey，B.(1995)在朊病毒蛋白的無細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榈鞍酌缚剐孕椭械奈锓N特異性物種特異性一種關(guān)于羊瘙癢病屏礙的模型Species specificity in thecell-free conversion of prion protein to protease-resistant formsamodel for the scrapie species barrier.Proc Natl Acad Sci USA，92，3923-3927)，His155對(duì)重組PrP轉(zhuǎn)變的影響是令人感興趣的。因而，在我們的轉(zhuǎn)變分析中觀察到的PrP向PrPβ的構(gòu)象轉(zhuǎn)變以及二聚化似乎反映了天然PrPC向PrPSc的轉(zhuǎn)變。假如這樣的話，就得到結(jié)論即在人和牛之間TSE傳播的物種屏障比其它的研究物種更低些。
3.家族性克-雅氏病的含義在人PrP的球狀結(jié)構(gòu)域中單個(gè)氨基酸的取代已顯示與家族性克-雅氏病無關(guān)(參見綜述(Prusiner，1998))。但是，還不了解關(guān)于這一過程的詳細(xì)機(jī)理。不像在大多數(shù)折疊實(shí)驗(yàn)中那樣，在其中對(duì)在蛋白質(zhì)的未折疊和折疊狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)變進(jìn)行研究，PrP向PrPβ的轉(zhuǎn)變發(fā)生在兩種折疊的構(gòu)象之間。因而，家族性氨基酸的取代可以影響PrP的天然態(tài)、過渡態(tài)或轉(zhuǎn)變態(tài)的三維結(jié)構(gòu)。以前曾以重組鼠PrP研究過家族性克-雅氏病的變體對(duì)于熱動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性的影響(Liemann，S.和Glockshuber，R.(1999)與遺傳性人朊病毒疾病相關(guān)的氨基酸取代對(duì)細(xì)胞朊病毒蛋白熱力學(xué)穩(wěn)定性的影響Influence of amino acid substitutions related to inherited human priondiseases on the thermodynamic stability of the cellular prion protein.Biochemistry，38，3258-3267)。盡管五種氨基酸替換使PrP(121-231)的天然狀態(tài)不穩(wěn)定，但三種其它變體事實(shí)上對(duì)熱動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性并沒有影響。而且，對(duì)于不穩(wěn)定的變體沒有觀察到PrPSc樣聚集物的自發(fā)形成，提示了PrPC構(gòu)象的解折疊自身并不足以產(chǎn)生PrPSc。這些結(jié)果與我們的在2M尿素存在下進(jìn)行的轉(zhuǎn)變實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致(表1)，顯示高濃度變性劑對(duì)于過渡態(tài)參數(shù)的影響比單個(gè)氨基酸殘基的取代，例如155位上的酪氨酸替代為組氨酸，要低得多。
在人PrP的氨基酸序列中額外的八肽的存在已經(jīng)證明了不具有發(fā)展成家族性克-雅氏病的遺傳性風(fēng)險(xiǎn)，并且在人類中已發(fā)現(xiàn)多至9個(gè)額外的八肽重復(fù)(Goldfarb，L.G.，Brown，P.，McCombie，W.R.，Goldgaber，D.，Swergold，G.D.，Wills，P.R.，Cervenakova，L.，Baron，H.，Gibbs，C.J.，Jr.和Gajdusek，D.C.(1991)在PRNP基因中重復(fù)編碼傳染性家族克—雅氏病相關(guān)的5，7，和8個(gè)額外的寡肽Transmissible familialCreutzfeldt-Jakob disease associated with five，seven，and eight extraoctapeptide coding repeats in the PRNP gene.Proc Natl Acad Sci USA，88，10926-10930)。每個(gè)八肽重復(fù)都含有一個(gè)色氨酸，它是優(yōu)選隔開脂/水界面的一種氨基酸。因而，這種序列基序可能通過結(jié)合到膜表面并導(dǎo)致PrP濃度局部升高而促進(jìn)轉(zhuǎn)變。但是，包含成熟PrPN末端的殘基23-88的截短形式并沒有阻止在轉(zhuǎn)基因小鼠(Fischer，M.，Rulicke，T.，Raeber，A.，Sailer，A.，Moser，M.，Oesch，B.，Brandner，S.，Aguzzi，A.和Weissmann，C.(1996)具有鄰近氨基缺失的朊病毒蛋白(PrP)恢復(fù)了PrP敲除小鼠對(duì)羊瘙癢病的易感性Prion protein(PrP)with amino-proximaldeletions restoring susceptibility of PrP knockout mice to scrapie.Embo J，15，1255-1264)以及在ScN2a細(xì)胞中的(Rogers，M.，Yehiely，F(xiàn).，Scott，M.and Prusiner，S.B.(1993)在培養(yǎng)細(xì)胞中截短和延伸的朊病毒蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)檠蝠W病同工型Conversion of trun-cated and elongatedprion proteins into the scrapie isoform in cultured cells.Proc NatlAcad Sci USA，90，3182-3186)PrPSc的合成，提示了八肽區(qū)對(duì)于朊病毒增殖并非是必需的，盡管在轉(zhuǎn)基因小鼠中孵育的時(shí)間比在野生型小鼠中要長(zhǎng)(Flechsig，E.，Shmerling，D.，Hegyi，I.，Raeber，A.J.，F(xiàn)ischer，M.，Cozzio，A.，von Mering，C.，Aguzzi，A.和Weissmann，C.(2000)缺乏八肽重復(fù)區(qū)域的朊病毒恢復(fù)了PrP敲除小鼠中羊瘙癢病的易感性Prionprotein devoid of the octapeptide repeat region restoressusceptibility to scrapie in PrP knockout mice.Neuron，27，399-408)。我們的觀察(表1)反映了這些發(fā)現(xiàn)，即在37℃下完整的人PrP的反應(yīng)速率常數(shù)僅比缺少八肽重復(fù)的N端截短的人朊病毒蛋白稍高一些。
材料和方法1.緩沖液和溶液CB＝轉(zhuǎn)變緩沖液(25mM DHPC，23.75mM DMPC，1.25mM DMPS，50mM醋酸鈉pH5.0，100mM氟化鈉)；NaAc＝醋酸鈉緩沖液(50mM醋酸鈉pH5.0)；TNO＝Tris-HCI/辛基葡糖苷緩沖液(25mM Tris-HCI pH7.5，150mM NaAc，1％(w/v)辛基葡糖苷)；TNSucO＝含有0.32M蔗糖的TNO。
2.朊病毒蛋白的純化如前所述，表達(dá)并純化重組朊病毒蛋白(Zahn，R.，Liu，A.，Luhrs，T.，Riek，R.，von Schroetter，C.，Lopez Garcia，F(xiàn).，Billeter，M.，Calzolai，L.，Wider，G.和Wuthrich，K.(2000)人朊病毒蛋白NMR溶液結(jié)構(gòu)NMR solution structure of the human prion protein.Proc NatlAcad Sci USA，97，145-150.；Zahn，R.，von Schroetter，C.和Wuthrich，K.(1997)在大腸桿菌中表達(dá)人朊病毒蛋白并通過高效親和層析柱重折疊純化Human prion proteins expressed in Escherichia coli and purifiedby high-affinity column refolding.FEBS Lett，417，400-404)，通過DNA測(cè)序、N端氨基酸測(cè)序以及MALDI-TOF質(zhì)譜分析確證它們的同一性。
3.CD譜分析在配備了PFD-350S溫度控制單元的Jasco J-815分光光度計(jì)上使用一種0.2mm的石英比色皿進(jìn)行測(cè)量。在不含氟化鈉的轉(zhuǎn)變緩沖液中用50μMPrP來測(cè)量CD譜。一般以10nm/min的速度0.5nm的間隔進(jìn)行10次掃描且累積的反應(yīng)時(shí)間為1秒鐘。通過在轉(zhuǎn)變緩沖液中快速加熱45-180μM的PrP，并且自動(dòng)記錄226nm波長(zhǎng)上橢圓率的變化而進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè)量。數(shù)據(jù)間隔和反應(yīng)時(shí)間均為1秒鐘，并使用4nm的帶寬。未轉(zhuǎn)變PrP作為基線，在37℃下獲得動(dòng)力學(xué)。在轉(zhuǎn)變緩沖液中使用100μM的PrP在55-65℃的溫度范圍中對(duì)轉(zhuǎn)變的溫度依賴性進(jìn)行測(cè)定。
4.數(shù)據(jù)分析假設(shè)n.PrP類型→PrPn的寡聚化作用，對(duì)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，其中n表示每個(gè)合作單元中PrP單體的數(shù)量。形式上，這一反應(yīng)通過方程dc/dt＝-k·cn[1]來描述，其中c、t和k分別表示PrP濃度、時(shí)間和反應(yīng)速率常數(shù)。方程1的一般解法為c(t)＝{c0(1-n)-(n-1)·k·t}1/(1-n)[2]在t＝0時(shí)，蛋白質(zhì)的濃度等于起始濃度C0，而起始反應(yīng)速率V0可以寫成V0＝k·C0n[3]
或log(V0)＝n·log(C0)+log(k)[4]通過將動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)以n＝2擬合于方程2并使用k作為擬合常數(shù)而獲得速率常數(shù)。通過埃林方程描述與限速步驟相關(guān)聯(lián)的活化勢(shì)壘k(T)＝kb T/h·exp(ΔS≠/R)·exp(-ΔH≠/RT)[5]，其中kb、h、ΔS≠和ΔH≠分別表示玻耳茲曼(Boltzmann)常數(shù)、普朗克(Planck)常數(shù)、活化熵和活化焓。隨后通過將方程5擬合k(T)的實(shí)驗(yàn)值而獲得ΔS≠和ΔH≠。從這些值活化作用的自由能被計(jì)算為ΔG≠＝ΔH≠-ΔT·ΔS≠[6]。
PrP淀粉樣蛋白原纖維的制備將在轉(zhuǎn)變緩沖液中的重組鼠PrP(50-250μM)加熱15分鐘至65℃并使其冷卻至室溫(RT)15分鐘，產(chǎn)生PrPβ。隨后，通過加入9倍體積的NaAc誘導(dǎo)聚集作用，產(chǎn)生PrPβf。60分鐘后通過于20,000g下離心15分鐘收集聚集的物質(zhì)。
5.蛋白酶K消化在緩沖溶液中于37℃存在50μg/ml蛋白酶K下于100μM的蛋白質(zhì)濃度中測(cè)定重組PrP(23-230)的蛋白酶抗性，緩沖溶液含有50mM pH7.0的磷酸鈉和150mM氯化鈉。60分鐘后收集蛋白質(zhì)作十二烷基磺酸鈉凝膠電泳。
電子顯微鏡照相在剛用碳涂覆的EM載網(wǎng)(400 MESH)上滴一滴懸浮于TNO或TNSucO中的PrPβf。在室溫溫育1分鐘以后，用一張濾紙將多余的液體小心地從載網(wǎng)上移除，然后以三滴蒸餾水洗滌。以一滴2％(w/v)的醋酸雙氧鈾對(duì)含EM載網(wǎng)的淀粉樣蛋白纖維原進(jìn)行染色，并在Philips H600電子顯微鏡上在100kV下放大10,000倍到30,000倍進(jìn)行分析。
權(quán)利要求
1.一種在重組蛋白質(zhì)和/或其變體中誘導(dǎo)構(gòu)象轉(zhuǎn)變的體外方法，其中所述的構(gòu)象轉(zhuǎn)變導(dǎo)致β折疊二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的增加，該方法包括步驟a)提供一種轉(zhuǎn)變緩沖液；b)向轉(zhuǎn)變緩沖液中加入含有帶負(fù)電荷脂質(zhì)的層狀脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的溶液；c)向轉(zhuǎn)變緩沖液中加入重組的蛋白質(zhì)分子和/或其變體；d)由轉(zhuǎn)變緩沖液、添加的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)分子形成一種樣品混合物；e)在樣品混合物中確定轉(zhuǎn)變溫度；和將步驟d)的樣品混合物置于根據(jù)步驟e)的轉(zhuǎn)變溫度下足夠的時(shí)間以形成構(gòu)象轉(zhuǎn)變的蛋白質(zhì)；其中形成層狀脂質(zhì)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象轉(zhuǎn)變的蛋白質(zhì)的水溶性復(fù)合物，構(gòu)象轉(zhuǎn)變的蛋白質(zhì)為寡聚的β折疊中間態(tài)結(jié)構(gòu)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過有效地破壞層狀脂質(zhì)結(jié)構(gòu)由層狀脂質(zhì)結(jié)構(gòu)和寡聚的β折疊中間態(tài)結(jié)構(gòu)的水溶性復(fù)合物產(chǎn)生淀粉樣聚集物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中為產(chǎn)生所述的淀粉樣聚集物，水溶性復(fù)合物的層狀脂質(zhì)結(jié)構(gòu)通過下述方式被破壞a)稀釋層狀脂質(zhì)結(jié)構(gòu)和寡聚的中間態(tài)結(jié)構(gòu)水溶性復(fù)合物的溶液至明顯低于所用脂質(zhì)的臨界膠束濃度；或b)稀釋層狀脂質(zhì)結(jié)構(gòu)和寡聚的中間態(tài)結(jié)構(gòu)的水溶性復(fù)合物溶液至明顯低于所用脂質(zhì)的臨界膠束濃度，并以非變性去污劑如辛基葡糖苷處理如此產(chǎn)生的淀粉樣聚集物；或c)直接以去污劑處理層狀脂質(zhì)結(jié)構(gòu)和寡聚的中間態(tài)結(jié)構(gòu)的水溶性復(fù)合物，而無須前述的脂質(zhì)的稀釋。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在步驟b)中的層狀脂質(zhì)結(jié)構(gòu)溶液為bicellar脂質(zhì)溶液；在步驟e)中將樣品混合物加熱到高于形成樣品混合物溫度的轉(zhuǎn)變溫度，并且水溶性的寡聚β折疊中間態(tài)結(jié)構(gòu)是一種聚集成淀粉樣蛋白原纖維(PrPβf)的寡聚β折疊中間態(tài)(PrPβ)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中在步驟e)中將樣品混合物加熱到從37℃到65℃的范圍的轉(zhuǎn)變溫度。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中這些蛋白質(zhì)涉及a)包括傳播性海綿狀腦病(TSE)、阿爾茨海默癥、多發(fā)性硬化癥和帕金森病的神經(jīng)變性疾??；和/或其它b)包括原發(fā)性系統(tǒng)淀粉樣變性、II型糖尿病、動(dòng)脈淀粉樣變性的構(gòu)象性疾病。
7.權(quán)利要求1的方法，其中轉(zhuǎn)變緩沖液含有25mM長(zhǎng)鏈(DMPX)和25mM短鏈(DHPC)磷脂以形成bicellar溶液。
8.權(quán)利要求7的方法，其中在轉(zhuǎn)變緩沖液中的長(zhǎng)鏈磷脂為23.75mM(DMPC)和1.25mM(DMPS或DMPG)，且其中短鏈磷脂為25mM(DHPC)。
9.權(quán)利要求1的方法，其中轉(zhuǎn)變緩沖液的pH低于重組蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。
10.通過一種用于誘導(dǎo)在重組的蛋白質(zhì)和/或其變體中的構(gòu)象轉(zhuǎn)變的體外方法生產(chǎn)的寡聚β折疊中間態(tài)結(jié)構(gòu)，其中所述的構(gòu)象轉(zhuǎn)變導(dǎo)致β折疊二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量升高，該方法包括步驟a)提供一種轉(zhuǎn)變緩沖液；b)向轉(zhuǎn)變緩沖液中加入含有帶負(fù)電荷脂質(zhì)的層狀脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的溶液；c)向轉(zhuǎn)變緩沖液中加入重組的蛋白質(zhì)分子和/或其變體；d)由轉(zhuǎn)變緩沖液、添加的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)分子形成一種樣品混合物；e)在樣品混合物中確定轉(zhuǎn)變溫度；和f)將步驟d)的樣品混合物置于根據(jù)步驟e)的轉(zhuǎn)變溫度下足夠的時(shí)間以形成構(gòu)象轉(zhuǎn)變的蛋白質(zhì)；其中寡聚的β折疊中間態(tài)結(jié)構(gòu)為構(gòu)象轉(zhuǎn)變的蛋白質(zhì)，它們是含有層狀脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的水溶性復(fù)合物的部分。
11.由權(quán)利要求10的寡聚β折疊中間態(tài)結(jié)構(gòu)生產(chǎn)的淀粉樣聚集物，其中淀粉樣聚集物來自通過有效地破壞層狀脂質(zhì)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象轉(zhuǎn)變的蛋白質(zhì)的水溶性復(fù)合物的層狀脂質(zhì)結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生寡聚的β折疊中間態(tài)結(jié)構(gòu)。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的寡聚的β折疊中間態(tài)結(jié)構(gòu)和層狀脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的水溶性復(fù)合物或根據(jù)權(quán)利要求11的淀粉樣聚集物，用于開發(fā)在受控制條件下轉(zhuǎn)變的不同相。
13.根據(jù)權(quán)利要求6的方法的應(yīng)用，用于篩選“轉(zhuǎn)變抑制物”以開發(fā)抗在人和/或動(dòng)物中的構(gòu)象性疾病的診斷劑和/或預(yù)防劑和/或治療方法。
14.根據(jù)權(quán)利要求10的寡聚的β折疊中間態(tài)結(jié)構(gòu)和層狀脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的水溶性復(fù)合物或根據(jù)權(quán)利要求11的淀粉樣聚集物的應(yīng)用，用于篩選“轉(zhuǎn)變抑制物”以開發(fā)針對(duì)在人和/或動(dòng)物中的構(gòu)象性疾病的診斷劑和/或預(yù)防劑和/或治療方法。
15.根據(jù)權(quán)利要求10的寡聚的β折疊中間態(tài)結(jié)構(gòu)和層狀脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的水溶性復(fù)合物或根據(jù)權(quán)利要求11的淀粉樣聚集物，用于篩選配體以開發(fā)a)針對(duì)人和/或動(dòng)物中的構(gòu)象性疾病的治療方法；或b)針對(duì)人和/或動(dòng)物中的構(gòu)象性疾病的預(yù)防劑；或c)針對(duì)人和/或動(dòng)物中的構(gòu)象性疾病的診斷檢測(cè)方法。
16.根據(jù)權(quán)利要求6的方法用于篩選配體以開發(fā)a)針對(duì)人和/或動(dòng)物中的構(gòu)象性疾病的治療方法；或b)針對(duì)人和/或動(dòng)物中的構(gòu)象性疾病的預(yù)防方法；或c)針對(duì)人和/或動(dòng)物中的構(gòu)象性疾病的診斷檢測(cè)方法。
17.根據(jù)權(quán)利要求10的寡聚的β折疊中間態(tài)結(jié)構(gòu)和層狀脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的水溶性復(fù)合物，或根據(jù)權(quán)利要求11的淀粉樣聚集物在開發(fā)特異性結(jié)合到構(gòu)象轉(zhuǎn)變的蛋白質(zhì)上的抗體中的用途。
18.根據(jù)權(quán)利要求6的方法在開發(fā)特異性結(jié)合到構(gòu)象轉(zhuǎn)變的蛋白質(zhì)上的抗體中的用途。
19.根據(jù)權(quán)利要求1的方法用于工業(yè)生產(chǎn)重組的構(gòu)象轉(zhuǎn)變的蛋白質(zhì)。
20.根據(jù)權(quán)利要求10的寡聚的β折疊中間態(tài)結(jié)構(gòu)和層狀脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的水溶性復(fù)合物或根據(jù)權(quán)利要求11的淀粉樣聚集物的用途，即用于利用核磁共振分光鏡檢查、X射線或電子顯微鏡檢查確定構(gòu)象轉(zhuǎn)變的蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)作為配體設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)。
21.根據(jù)權(quán)利要求1的方法用于利用核磁共振波譜法、X射線或電子顯微鏡照相確定構(gòu)象轉(zhuǎn)變的蛋白質(zhì)和/或淀粉樣聚集物的寡聚β折疊中間態(tài)結(jié)構(gòu)的三維結(jié)構(gòu)以作為配體設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)。
22.根據(jù)權(quán)利要求15、16、20或21得到的配體用于進(jìn)行人和/或動(dòng)物中的構(gòu)象性疾病的診斷和/或預(yù)防和/或治療性處理。
23.根據(jù)權(quán)利要求13或14得到的“轉(zhuǎn)變抑制物”用于進(jìn)行人和/或動(dòng)物中的構(gòu)象性疾病的診斷和/或預(yù)防和/或治療性處理。
24.根據(jù)權(quán)利要求17或18得到的抗體用于進(jìn)行人和/或動(dòng)物中的構(gòu)象性疾病的診斷和/或預(yù)防和/或治療性處理。
25.根據(jù)權(quán)利要求10的寡聚的β折疊中間態(tài)結(jié)構(gòu)和層狀脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的水溶性復(fù)合物或根據(jù)權(quán)利要求11的淀粉樣聚集物用于進(jìn)行抗神經(jīng)變性疾病和/或其它構(gòu)象性疾病的人或動(dòng)物的主動(dòng)免疫，所述神經(jīng)變性疾病包括傳播性海綿狀腦病(TSE)、阿爾茨海默癥、多發(fā)性硬化癥和帕金森??；所述其它構(gòu)象性疾病包括原發(fā)性系統(tǒng)淀粉樣變性、II型糖尿病和動(dòng)脈淀粉樣變性。
26.根據(jù)權(quán)利要求17或18得到的抗體用于制造對(duì)抗神經(jīng)變性疾病和/或其它構(gòu)象性疾病的人或動(dòng)物的被動(dòng)免疫的藥物，所述神經(jīng)變性疾病包括傳播性海綿狀腦病(TSE)、阿爾茨海默癥、多發(fā)性硬化癥和帕金森?。凰銎渌鼧?gòu)象性疾病包括原發(fā)性系統(tǒng)淀粉樣變性、II型糖尿病和動(dòng)脈淀粉樣變性。
27.用于人和/或動(dòng)物中的構(gòu)象性疾病的診斷或治療性或預(yù)防性處理的組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求13或14的方法所獲得的“轉(zhuǎn)變抑制物”。
28.用于人和/或動(dòng)物中的構(gòu)象性疾病的診斷或治療性或預(yù)防性處理的組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求15、16、20或21的方法所獲得的配體。
29.用于人和/或動(dòng)物中的構(gòu)象性疾病的診斷或治療性或預(yù)防性處理的組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求17或18的方法所獲得的特異性結(jié)合到構(gòu)象轉(zhuǎn)變的蛋白質(zhì)上的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在蛋白質(zhì)中誘導(dǎo)構(gòu)象轉(zhuǎn)變的體外方法，而所述構(gòu)象轉(zhuǎn)變導(dǎo)致β折疊二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量升高，該方法包括步驟a)提供一種轉(zhuǎn)變緩沖液；b)向轉(zhuǎn)變緩沖液中加入含有帶負(fù)電荷脂質(zhì)的層狀脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的溶液；c)向轉(zhuǎn)變緩沖液中加入蛋白質(zhì)分子；d)由轉(zhuǎn)變緩沖液、添加的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)分子形成一種樣品混合物；e)在樣品混合物中確定轉(zhuǎn)變溫度；和f)將步驟d)的樣品混合物置于根據(jù)步驟e)的轉(zhuǎn)變溫度下足夠的時(shí)間以形成構(gòu)象轉(zhuǎn)變的蛋白質(zhì)。通過這一方法，形成了層狀脂質(zhì)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象轉(zhuǎn)變蛋白質(zhì)的水溶性復(fù)合物，所述構(gòu)象轉(zhuǎn)變的蛋白質(zhì)為寡聚的β折疊中間型結(jié)構(gòu)?？梢酝ㄟ^有效地破壞層狀脂質(zhì)結(jié)構(gòu)由層狀脂質(zhì)結(jié)構(gòu)和寡聚的β折疊中間型結(jié)構(gòu)的水溶性復(fù)合物產(chǎn)生淀粉樣聚集物。這類蛋白質(zhì)可能涉及神經(jīng)變性疾病像傳播性海綿狀腦病(TSE)、阿爾茨海默癥、多發(fā)性硬化癥和帕金森病。說明書包括通過該方法生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的應(yīng)用，例如，開發(fā)PrPC向PrP
文檔編號(hào)C07K14/47GK1665838SQ03816241
公開日2005年9月7日 申請(qǐng)日期2003年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月11日
發(fā)明者R·扎恩, T·呂爾斯 申請(qǐng)人:瑞士聯(lián)邦蘇黎世技術(shù)大學(xué)