專利名稱：用于分析物電化學檢測的介體修飾的氧化還原生物分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請總體涉及一種生物傳感器。
背景技術(shù)：
氧化還原生物分子經(jīng)歷可逆還原和氧化并且將電子有效地轉(zhuǎn)移到自然電子受體中。它們通常包含介導并參與氧化和還原過程的活性位點輔基或輔因子。通常，輔基是基于二核苷酸，例如黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)。氧化還原生物分子使底物氧化并從底物得到電子，然后通過輔基的可逆氧化還原反應(yīng)將電子轉(zhuǎn)移到電子受體。
生物傳感器能夠提供對樣品中分析物測定的靈敏、快速并且低成本的檢驗。生物傳感器主要包含識別靶分析物的氧化還原生物分子和將識別事件轉(zhuǎn)換成可測量信號的傳感器。在一種方式中，生物傳感器通過“中斷”電子流向自然生物受體而運行。通過含有與生物分子接近的電極的電路，電子流作為電流或電壓被檢測。因此電子在氧化還原生物分子的活性位點輔基和電極表面之間的轉(zhuǎn)移是生物傳感器有效運行的一個重要因素。
通常可以觀察到電子從氧化還原生物分子向生物傳感器的電極表面轉(zhuǎn)移的效率低于自然電子受體的高效率的還原。一些科研團體已經(jīng)研究了通過氧化還原介體的共價結(jié)合來修飾氧化還原生物分子，但是發(fā)現(xiàn)電子轉(zhuǎn)移速率常數(shù)比酶及它們的自然電子受體之間的電子轉(zhuǎn)移速率常數(shù)低的多。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明，申請人已經(jīng)成功設(shè)計出生物傳感器檢測樣品中分析物的新方法。該新方法是基于合成新的氧化還原介體的基礎(chǔ)上，所述介體在各種試驗條件下可以失去或獲得電子。已經(jīng)確信這種氧化還原介體起到電子中轉(zhuǎn)基團的作用，該中轉(zhuǎn)基團能夠使得非擴散介導(non-diffusion-mediated)的電子從其它氧化還原分子例如氧化還原酶轉(zhuǎn)移。
在一些實施方案中，本發(fā)明提供了具有對應(yīng)于式(I)結(jié)構(gòu)的過渡金屬化合物
其中M是能夠與氮形成配位鍵的金屬元素。R和R′可以是在它們的氮原子上與M配位的含氮有機部分，L可以是一種包含有機胺的連接配體，該有機胺具有約3至約20個非氫原子、脂族氨基和為M提供金屬-氮配位鍵的含氮部分。Z可以是鹵素原子，而m可以是+1、+2、+3、+4、+5或+6。X是與m平衡的陰離子或陰離子的組合。
在其它一些實施方案中，本發(fā)明還提供了制備具有上述對應(yīng)于式I結(jié)構(gòu)的過渡金屬化合物的方法。所述方法將式II的前體化合物與連接配體接觸，經(jīng)過配體交換反應(yīng)形成式I的過渡金屬化合物。
其中Z、M、R、R′、X和m與上述一樣。
在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了一種電化學標簽，包含與式I的過渡金屬化合物結(jié)合的氧化還原生物分子，其中Z、M、R、R′、X和m與上述一樣。在優(yōu)選實施方案中，M是鋨并且L是3-氨丙基咪唑。優(yōu)選過渡金屬化合物共價結(jié)合到氧化還原生物分子上，該生物分子優(yōu)選包含葡萄糖氧化酶。
在另外一些實施方案中，本發(fā)明還提供制備上述電化學標簽的方法。所述方法包括將氧化還原生物分子結(jié)合到式I的過渡金屬化合物，其中Z、M、R、R′、X和m與上述一樣。在優(yōu)選實施方案中，Z是氯，L是3-氨丙基咪唑，通過葡萄糖氧化酶羧酸酯與L中存在的脂族伯氨基之間形成酰胺鍵，過渡金屬化合物與葡萄糖氧化酶共價結(jié)合。
本發(fā)明進一步提供應(yīng)用上述電化學標簽來電化學檢測樣品中分析物的方法。在一些實施方案中，包含分析物和電化學標簽的電化學活性氧化還原配合物在電極的表面形成，其中電化學標簽包括鍵合到式I的過渡金屬化合物上的氧化還原生物分子，其中Z，M，R，R′，X和m與上述一樣。對本發(fā)明的使用、功能或組成沒有限定的情況下，電子在經(jīng)過氧化還原循環(huán)的電化學標簽到電極之間的傳送往返能夠被檢測到，并且指示樣品中分析物是否存在。被檢測的分析物可以是例如核酸或蛋白質(zhì)。在優(yōu)選實施方案中，分析物是對應(yīng)于p53基因的序列，所述p53基因是一種與各種癌癥相關(guān)的基因。在其它實施方案中，被檢測的分析物也可以是氧化還原生物分子的氧化底物。
在進一步的實施方案中，本發(fā)明還涉及包含上述電化學標簽的藥盒，以及使用所述電化學標簽進行分析物的電化學檢測的生物傳感器。


本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，以下敘述的附圖僅僅作為示例性目的。附圖并不是以任何方式限定本公開的范圍的目的。
圖1圖示了被PBS緩沖劑中的絲網(wǎng)印刷碳電極上吸附的Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl改性的葡萄糖氧化酶(GOx)的循環(huán)伏安法的數(shù)據(jù)。(a)為存在EDC/NHS偶合試劑的數(shù)據(jù)，(b)表示不存在EDC/NHS偶合試劑的數(shù)據(jù)。掃描速率100mV/s。
圖2圖示了(a)GOx(b)Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl和(c)由Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl改性的GOx的UV-Vis光譜。
圖3圖示了絲網(wǎng)印刷碳電極上吸附的Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl改性的GOx的測量電流響應(yīng)。(a)表示存在EDC/NHS偶合試劑，(b)表示不存在EDC/NHS偶合試劑。平衡電壓030V，葡萄糖濃度40mM。
圖4圖示了用Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl改性的酶作為電化學標簽的DNA分析(mRNA中的p53基因，20pg/μl)的電流響應(yīng)。(a)具有與p53基因互補的捕獲探針，(b)具有與p53基因非互補的捕獲探針，條件與圖3中所述的相同。
具體實施例方式
根據(jù)本發(fā)明，申請人已經(jīng)設(shè)計了用于檢測樣品中分析物的新型生物傳感器及方法。本發(fā)明基于新的氧化還原介體的合成，所述介體可以在各種試驗條件下失去或得到電子。在不遵循具體理論的情況下，可以確信該氧化還原介體作為電子中轉(zhuǎn)基團使得非擴散介導的電子能夠從其它氧化還原分子例如氧化還原酶轉(zhuǎn)移。
在一些實施方案中，本發(fā)明提供過渡金屬化合物，該化合物可以作為氧化還原介體，并且具有對應(yīng)于上述式I的結(jié)構(gòu)，其中M是可以與氮形成配位鍵的金屬元素。用作M的合適金屬可以是例如鋨(Os)、釕(Ru、鋅(Zn)、鐵(Fe)、銠(Rh)、錸(Re)、鉑(Pt)、鈧(Sc)、鈦(Ti)、釩(V)、鎘(Cd)、鎂(Mg)、銅(Cu)、鈷(Co)、鈀(pd)、鉻(Cr)、錳(Mn)、鎳(Ni)、鉬(Mo)、鎢(W)、銥(Ir)及其混合物。在優(yōu)選實施方案中，金屬元素M是過渡金屬鋨(Os)。
R和R′可以相同和不同，并且與M在它們的氮原子上配位。R、R′或二者可以是例如2，2′-聯(lián)吡啶；由一個或多個取代基取代的2，2′-聯(lián)吡定，其中所述取代基選自C1-C4烷基、苯基和由一個或多個C1-C4烷基取代的苯基；1，10-菲咯啉基(phenanthrolinyl)和由一個或多個取代基取代的1，10-菲咯啉基，其中所述取代基選自C1-C4烷基、苯基和由一個或多個C1-C4烷基取代的苯基。優(yōu)選R和R′中至少一個是2，2’-聯(lián)吡啶。
L是連接配體。在一些實施方案中，L是具有3-20個非氫原子的有機胺，包括含旨族氨基，并且還包含為提供M提供金屬氮配位鍵的含氮部分。在優(yōu)選實施方案中，含氮部分是含有至少一個氮原子的雜環(huán)。非限制性例子包括咪唑、苯并咪唑、吡咯、吡唑、三唑、苯并三唑、吡啶、噠嗪、吡嗪、嘧啶和三嗪。雜環(huán)上的氮原子之一與金屬M形成配位鍵。優(yōu)選的含氮部分是咪唑。當含氮部分是雜環(huán)時，脂族氨基優(yōu)選固定到環(huán)連接的烷基上。烷基可以是直鏈或支鏈并且通常含有1至約20個碳原子。優(yōu)選2～12個和更優(yōu)選3～6個碳原子。優(yōu)選的連接配體L是3-氨丙基咪唑。
Z是鹵素原子。在優(yōu)選實施方案中，Z是氯或溴，更優(yōu)選為氯。上標m可以是+1、+2、+3、+4、+5或+6，根據(jù)金屬M的氧化態(tài)而定。在優(yōu)選實施方案中，例如當金屬是+4氧化態(tài)的鋨時，Z是氯和m為+3。X是與陽離子的形式電荷m相平衡的陰離子或陰離子的組合。例如，X可以非限制性的是氯化物、溴化物、碘化物、氟化物、四氟硼酸鹽、高氯酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、碳酸鹽或亞硫酸鹽。
在其它實施方案中，配位基團R和R’中至少一個、優(yōu)選二者是2，2′-聯(lián)吡啶或1，10-菲咯啉基，二者都可以任選被取代。當聯(lián)吡啶或菲咯啉基被取代時，取代基優(yōu)選選自C1-C4烷基、苯基和進一步被C1-C4烷基、尤其是C1-C2烷基取代的苯基。取代的聯(lián)吡啶和菲咯啉基配位基團可以是單取代、雙取代和更多取代。在一些實施方案中，可以使用雙取代的配位基團。非限制性例子包括4，4′-雙取代-2，2′-聯(lián)吡啶、5，5′-雙取代-2，2′-聯(lián)吡啶、1，10-菲咯啉基、4，7-雙取代-1，10-菲咯啉基和5，6-雙取代-1，10-菲咯啉基。
當R和R′中只有一個是聯(lián)吡啶或菲咯啉基或任選上述取代基團之一時，另一個優(yōu)選選自含有兩個能夠與金屬M形成配位鍵的氮原子的脂族配體。非限制性例子包括1，3-丙二胺、1，4-丁二胺和二者的衍生物，其中所述衍生物是基于1，3-丙二胺和1，4-丁二胺骨架，所述骨架任選由烷基、芳基或不干擾氮與金屬M配位健合或配合物的電化學活性的其它基團取代。
在優(yōu)選實施方案中，過渡金屬化合物具有以下特征中的一個或多個合適的氧化還原電勢，以用作本發(fā)明生物傳感器中電子穿梭，所述電勢通常是生物分子的輔基的電勢和生物傳感器電極電勢之間的中間介質(zhì)；與電極快速交換電子的能力，將電子快速轉(zhuǎn)移至酶或從酶中快速接收電子的能力，使得存在酶或其它電化學活性氧化還原配合物催化劑時促進底物的電氧化或電還原動力學。
在優(yōu)選實施方案中，過渡金屬化合物包含具有下列結(jié)構(gòu)的+3形式電荷的陽離子 本發(fā)明還提供制備可以作為氧化還原介體的過渡金屬化合物的方法，所述過渡金屬化合物具有對應(yīng)于上述式I的結(jié)構(gòu)。在方法的優(yōu)選實施方案中，過渡金屬化合物通過上述通式Ⅱ的前體化合物與連接配體進行配體交換而形成。這里所述的過渡金屬化合物包含有助于與金屬形成穩(wěn)定配合物并且在配體交換條件下能夠被連接配體取代的填充(filler)配體Z。優(yōu)選的連接配體包含為金屬提供金屬-氮配位鍵的含氮部分。在優(yōu)選實施方案中，金屬為鋨，Z是氯和連接配體是3-氨丙基咪唑。
在另一實施方案中過渡金屬化合物被用作氧化還原介體，作為電化學標簽的一部分。當過渡金屬化合物通過連接配體附著到氧化還原生物分子上時就獲得了電化學標簽。在一些實施方案中，過渡金屬化合物共價結(jié)合到氧化還原生物分子的氨基酸，形成電化學標簽。優(yōu)選過渡金屬化合物附著到氧化還原生物分子的氨基酸殘基，所述殘基相對鄰近氧化還原生物分子的活性位輔基。在優(yōu)選實施方案中，過渡金屬化合物在天冬氨酸酯和谷氨酸酯殘基處與葡萄糖氧化酶連接。計算機制圖分析顯示至少兩個谷氨酸酯和八個天冬氨酸酯殘基距離160千道爾頓葡萄糖氧化酶同型二聚體內(nèi)的FAD/FADH輔基的黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)N5原子在至少16埃之內(nèi)。
在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了一種含有氧化還原介體和氧化還原生物分子例如氧化遲原酶的電化學標簽，所述介體是通式I的過渡金屬化合物。在特別優(yōu)選的實施方案中，過渡金層化合物的金層是鋨并且連接配體是3-氨丙基咪唑。在優(yōu)選實施方案中，電化學標簽包含氧化還原介體，所述介體是共價結(jié)合葡萄糖氧化酶的式I的過渡金屬化合物。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供將過渡金屬化合物共價結(jié)合到氧化還原生物分子上形成電化學標簽的方法。在優(yōu)選實施方案中，使用例如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的鹽酸1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥磺基琥珀酰亞胺(NHS)，過渡金屬化合物通過碳二亞胺偶合結(jié)合氧化還原生物分子。不被理論所束縛，通過活化羧基或磷酸鹽形成O-脲衍生物，碳二亞胺促進了羧酸或磷酸鹽和胺之間的酰胺鍵的形成。這種衍生物能夠容易地與親核試劑反應(yīng)?？梢杂盟鲈噭┯纱蓟鶊F生成醚鍵和由酸和醇或酚生成酯鍵以及由酸和胺生成肽鍵。碳二亞胺通常用于作為水常性衍生物EDC或作為有機可溶性衍生物N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)的肽的合成。在EDC存在下，NHS通常用于幫助碳二亞胺偶合。反應(yīng)可以包括中間活性酯(羧基和N-羥基琥珀酰亞胺的縮合物)的形成，所述活性酯進一步與胺官能團反應(yīng)生成最終酰胺鍵。
在一些實施方案中，本發(fā)明還提供使用電化學標簽來電化學測定樣品中分析物的方法。沒有限定本發(fā)明的機理、功能或使用情況下，可以確信所述方法利用從電化學標簽到本發(fā)明的生物傳感器的有效電子轉(zhuǎn)移。本發(fā)明的方法可以用來測定寬范圍樣品的多種分析物。
在非限定性實施例中，包含電化學標簽的電化學活性氧化還原配合物在固體載體例如電極的表面上生成，并且檢測電子轉(zhuǎn)移。在一個實施方案中，通過探針吸引或與分析物結(jié)合而在表面上形成配合物，其中探針固定在電極表面或能夠與電極表面結(jié)合。分析物與探針的結(jié)合取決于被檢測的分析物(“靶”)。例如，當分析物是核酸時，合適的探針是包含與分析物的特定序列互補的單鏈區(qū)的核酸。待檢測的分析物可以包含核酸，其可以是單鏈或雙鏈，依照說明，或含有雙鏈和單鏈序列部分。當分析物僅包含雙鏈核酸，應(yīng)當理解在分析物與互補探針雜交之前需要鏈分離。分析物可以是DNA(基因組或cDNA)、RNA或雜種，其中核酸含有脫氧核苷酸和核苷酸的任意組合和堿基包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、次黃苷、黃嘌呤(xathanine)和次黃嘌呤等的任意組合。當待檢測的分析物包含抗原時，合適的探針是特定識別抗原的抗體。作為替代方案，當靶分析物是抗體時，探針可以包含被抗體識別的抗原。在非限定性例子中，分析物與探針的結(jié)合可以是通過雜交、退火、電荷-電荷相互作用、憎水相互作用或共價鍵合。一般，探針可以包含例如寡核苷酸包括DNA、mRNA、rRNA、tRNA、肽核酸(PNAs)、表達序列標簽(ESTs)、抗原、抗體、配體或受體。
利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多種識別對(pair)來完成電化學標簽和分析物之間的相互作用。在非限制性例子中，識別對由生物素和抗生物素蛋包組成。為了使用識別對，所述對的各個部分共價結(jié)合到分析物和電化學標簽上。所述對的兩個部分的特定相互作用產(chǎn)生了待形成的配合物，其包含所述兩種化學物和共價結(jié)合的識別對。
因而，在一個實施方案中，通過電極表面上的固定探針與識別對的第一部分標記的分析物和識別對的第二部分標記的電化學標簽的相互作用，配合物在電極表面形成。標記的成分在溶液中與氧化還原生物分子的氧化底物結(jié)合在一起，并且所述溶液與電極接觸。通過金屬化合物與如上所述氧化還原生物分子共價結(jié)合，電極在適當?shù)碾妱菹逻\行以有效接收來自氧化底物的電子。如上所述，探針和分析物此特定結(jié)合或雜交，由于探針固定在電極表面上，電極上的分析物的雜交導致將電化學標簽與電極接近，在此產(chǎn)生電子轉(zhuǎn)移。
在優(yōu)選實施方案中，所述方法用于遺傳診斷。例如寡核苷酸探針可以用于測定靶分析物序列，例如p53基因，該基因是一種與各種癌癥相關(guān)的基因。其它非限定性例子包括非息肉病結(jié)腸癌基因、BRCAl乳癌基因、使得患者的癥狀前篩選容易的顯示高危害性Alzheimer病的ApoE4基因、囊性纖維化基因突變、或本領(lǐng)域熟知的其它任何基因。
在一個優(yōu)選實施方案中，使用包含共價結(jié)合過渡金屬化合物的抗生物素蛋白共軛的葡萄糖氧化酶的電化學標簽，利用從大鼠肝臟中提取的mRNA來實施靶p53基因的直接電流檢測。利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，通過將mRNA轉(zhuǎn)化為cRNA來任選進一步配制mRNA，然后用生物素標記cRNA。在電極表面上形成電化學活性氧化還原配合物，在此探針結(jié)合電極，分析物通過核酸雜交與探針結(jié)合，電化學標簽通過涉及抗生物素蛋白和生物素的識別對連接來與分析物結(jié)合。與在其它地方解釋的一樣，那些本領(lǐng)域技術(shù)人員將會認識到，并不限于使用生物素/抗生物素蛋白識別對，存在多種根據(jù)本發(fā)明可以使用的識別對。因而在靶分析物雜交后電化學標簽被帶到電極表面上。在底物(在這種情況下為葡萄糖)存在下，包含氧化遲原生物分子(在這種情況下為葡萄糖氧化酶)的電化學標簽促進了底物的氧化并且電子通過與氧化還原生物分子骨架結(jié)合的過渡金屬化合物穿梭到電極表面。分析物的測定或檢測通過檢測在電化學活性氧化還原配合物與電極之間的電子遷移來確定。當穿梭的電子被電極獲得時就會檢測到電流。
在另一實施方案中，待檢測的分析物也是氧化還原生物分子的氧化底物。在非限定性例子中，電化學標簽的氧化還原生物分子組分包含葡萄糖氧化酶并且分析物是葡萄糖。氧化底物的存在被檢測作為電極上的電子轉(zhuǎn)移活性(檢測電流或電壓)，，其中應(yīng)用本領(lǐng)域已知的技術(shù)將電化學標簽固定或形成在電極表面。在非限定性例子中，電極的表面被識別對的第一部分標記，而電化學標簽被笫二部分標記。被標記的組分可以在溶液中與含有待檢測分析物(在這種情況下，例如是葡萄糖)的樣品結(jié)合，其也是氧化還原生物分子的氧化底物。識別對的各部分的彼此結(jié)合導致將電化學標簽鄰近電極，在此發(fā)生電子轉(zhuǎn)移。包含葡萄糖氧化酶的電化學標簽促進樣品中存在的任何葡萄糖的氧化，并且電子通過與葡萄糖氧化酶骨架結(jié)合的過渡金屬化合物穿梭到電極表面。葡萄糖的測定或檢測通過測定電化學標簽和電極之間的電子轉(zhuǎn)移而確定。當穿梭電子被電極獲得時就會檢測到電流。
在優(yōu)選實施方案中，探針結(jié)合到金電極上。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道探針可以通過本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)固定到電極上。例如識別對可以用來將探針連接到電極上。在這方面，探針可以被改性以包含識測對的第一部分，而電極表面涂覆第二部分，上述識別對與用于將分析物結(jié)合到電化學標簽上的識別對不同。在其它實施例中，本發(fā)明的探針可以共價結(jié)合到薄膜氧化表面上。采用文獻程序，可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種技術(shù)將探針固定到相據(jù)本發(fā)明使用的電極表面上。
在其它一些實施方案中，可以使用本發(fā)明的配合物來實現(xiàn)病毒或細菌的檢測。在該實施方案中，探針被設(shè)計用來檢測來自多種細菌或病毒的靶序列。這里公開的方法允許直接篩選臨床樣品以檢測，例如HIV核酸序列。另外，作為評價抗病毒治療的功效的改進方法，其允許直接監(jiān)測患者體內(nèi)的循環(huán)病毒。同樣，與白血病、HTLV-I和HTLV-II相關(guān)的病毒可以用這種方法檢測。細菌感染例如肺結(jié)核也可以被檢測。
在其它實施方案中，核酸被用作例如水或食品樣品篩選中毒性細菌的探針。例如可以處理樣品以細胞溶解細菌釋放其核酸，然后設(shè)定探針來識別細菌菌珠，包括但不限于病原菌珠，例如沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、霍亂孤茵，大腸桿菌腸毒性菌株和軍團病菌。同樣，生物治療策略(bioremediationstrategy)可以使用本發(fā)明的組合物進行評估。
在其它實施方案中，探針可以用在法醫(yī)上，其中DNA指紋識別被用來使犯罪現(xiàn)場分析物例如DNA與取自受害人和嫌疑人的樣品進行匹配分析。
分析物的來源可以包括例如人類、動物、植物或環(huán)境。
在其它實施方案中，本發(fā)明還涉及包含電化學標簽的藥盒。所述藥盒還可以包含能夠識別和與待檢測分析物結(jié)合的探針，例如如上描述的那些。
在其它一些實施方案中，本發(fā)明進一步涉及利用上述電化學標簽的生物傳感器。該生物傳感器可以包含儀器或在系統(tǒng)中使用，該系統(tǒng)包括檢測和測量由一種或多種電化學標簽產(chǎn)生的信號的必須部件。儀器可以包含包括與電源和檢測器結(jié)合的生物傳感器陣列的集成電路。這種集成電路對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。含有生物傳感器陣列的系統(tǒng)可以另外包括用于測量電壓施加到工作電極后的電化學信號的裝置。可以用程序處理器來完成施加電壓和測量電化學信號。待檢測的信號可以通過例如脈沖電流測定法、間歇脈沖電流測定法或微分脈沖電流測定法測量。作為替代方案，生物傳感器可以包含單工作電極和單參考電極。不論是陣列還是單工作電極，生物傳感器都可以任選包括一個或多個反電極。
這里描述的方法和儀器采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的化驗室技術(shù)并且可以在化驗室手冊中找到，例如Sambrook，J.，et al，Molecular CloningA LaboratoryManual，3rd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2001；Specter，D.L.et al.，CellsA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1998；and Harlow，E.，UsingAntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1999。
這里使用的標題(例如“技術(shù)領(lǐng)域”和“發(fā)明內(nèi)容”)僅僅作為本發(fā)明公開內(nèi)論題的概要組織并不是有意限定本發(fā)明的公開內(nèi)容或其任何方面。特別是，“技術(shù)領(lǐng)域”中公開的主題可以包括本發(fā)明范圍內(nèi)的技術(shù)狀況，并且不可以構(gòu)成時現(xiàn)有技術(shù)的敘述。在“發(fā)明內(nèi)容”中公開的主題并不是詳盡的或完全公開本發(fā)明的整個范圍或其任何實施方案。
此處參考的引文并不構(gòu)成承認那些參考的引文是現(xiàn)有技術(shù)或與本文公開的發(fā)明的可專利性有任何相關(guān)。在說明書中所有引用的參考文件在此通過參考全文結(jié)合。
說明書和特定實施例以及本發(fā)明的啟示性實施方案僅用于說明性目的而不是限定本發(fā)明的范圍。而且，具有聲明特征的大量實施方案的敘述并不排斥其它具有附加特征的實施方案或其它結(jié)合了聲明特征的不同組合的實施方案。提供的特定實施例用于示例性說明如何制備、使用和應(yīng)用本發(fā)明組合物和方法的目的，除非另外明確聲明，特定實施例并不代表本發(fā)明給出的實施方案已經(jīng)、或沒有被制備或測試。
用于本文中時，措詞“優(yōu)選的”和“優(yōu)選地”是指在一定情況下提供了特定優(yōu)點的本發(fā)明的實施方案。然而，在相同或其它情況下，其它實施方案也可以被優(yōu)選。此外，一個或多個優(yōu)選實施方案的敘述并不意味著其它實施方案不能使用而且不排斥本發(fā)明范圍內(nèi)的其它實施方案。
用于本文中時，描詞“包括”及其變化是非限定性的，例如對列表中項目的敘述并不意味著排除也可用于本發(fā)明的材料、組合物、裝置和方法中的其它類似項目。
用于本文中時，術(shù)語“測定”或“檢測”將被用于表示分析物的定性和定量測定或檢測。在此，例如以下定義的方法和系統(tǒng)用于測定或檢測液體介質(zhì)中的分析物，這就意味著表示測定在介質(zhì)中分析物的存在以及任選其濃度。
用于本文中時，術(shù)語“分析物”是指液體樣品中被測定的因子(agent)。分析物可以是或不是氧化還原生物分子的底物。
用于本文中時，術(shù)語“氧化還原生物分子”是指天然或其它改性或設(shè)計的生物分子，其具有固有的電子轉(zhuǎn)移能力，例如促進一種底物或一組底物氧化或還原的酶。一些氧化還原生物分子利用輔基，例如黃素或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)。輔基是氧化還原分子的非蛋白質(zhì)成分，其與氧化還原生物分子結(jié)合使其能夠促進氧化或還原。不存在輔基的最簡單氧化還原生物分子是利用在兩個半胱氨酸殘基之間可逆性形成二硫鍵的那些，如在硫氧還蛋白中。很多利用鐵或銅離子能夠以在兩種不同的氧化還原狀態(tài)存在的能力。
用于本文中時，術(shù)語“底物”或“氧化底物”是指與氧化還原生物分子活性位結(jié)合并且經(jīng)歷例如氧化或還原反應(yīng)的分子。
用于本文中時，術(shù)語“氧化還原介體”是指用來在氧化還原生物分子和電極之間傳送電子的分子。
用于本文中時，術(shù)語“電化學標簽”是指與氧化還原介體共價結(jié)合的氧化還原生物分子。
用于本文中時，術(shù)語“電化學活性氧化還原配合物”是指在含有電化學標簽的電極表面上形成的配合物。
用于本文中時，術(shù)語“生物傳感器”是指含有用于檢測或測量由于電子移動產(chǎn)生的信號的必須部件的儀器或系統(tǒng)，其中所述電子移動在氧化還原反應(yīng)(例如電流檢測)中產(chǎn)生。術(shù)語“生物傳感器”包括用于檢測物質(zhì)濃度和甚至不直接利用生物系統(tǒng)的生物學相關(guān)的其它參數(shù)的裝置。
實施例以下實施例是示例性的，并不起到限定本發(fā)明范圍的目的。
實施例1該實施例舉例說明了氧化還原介體Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl的合成。
Os(bpy)2Cl是用例如在Lay，P. A.et al.，1986，Inorg.Synth.，24291-296中描述的方法由K2OsCl6(99％，Stem Chemicals)合成。Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl合成如下向6.0毫升新鮮蒸鎦的乙二醇中的Os(bpy)2Cl2(0.10mmol)的溶液中一次性加入3-氨丙基咪唑(0.12mmol)，得到的混合物回流90-120分鐘。3-氨丙基咪唑購自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。配位體交換反應(yīng)的完成由循環(huán)伏安法監(jiān)測。然后在快速攪拌下將紫色反應(yīng)混合物緩慢主入200ml乙醚。使用細燒結(jié)漏斗通過抽吸過濾來收集沉淀物。粗產(chǎn)品用醚洗滌，溶解在3.0-5.0毫升乙醇中并再次從醚中沉淀。通過從乙醇中結(jié)晶進一步凈化沉淀物，得到的純產(chǎn)物，產(chǎn)率為75％。
在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中，產(chǎn)物在具有0.19V的E1/2的金電極上顯示出一對可逆氧化還原波。為了確保完成配位體交換，需要稍微過量的3-氨丙基咪唑(10-20％)。
使用循環(huán)伏安法監(jiān)測反應(yīng)的過程。純化的產(chǎn)物由質(zhì)譜分析和電化學表征。其與以下結(jié)構(gòu)相一致 實施例2
該實施例示例說明了通過與氧化還原介體偶合對氧化還原生物分子葡萄糖氧化酶(GOx)進行的改性。
葡萄糖氧化酶抗生物素蛋白D共軛物(GOx-A)(131單位/ng固體)購自Vector Laboratories(San Diego，CA)。葡萄糖氧化酶(GOx，EC 1.1.3.4，typeX-S，來自黑曲霉，213單位/mg固體)購自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。鹽酸1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亞胺(EDC)、N-羥磺基琥珀酰亞胺(Sulfo-NHS)和透析藥盒(MWCO 10,000)來自Pierce。
通過GOx羧酸鹽和脂族伯胺基團之間形成酰胺鍵，利用EDC/NHS作為偶合劑GOx被Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl共價改性，其中所述旨族伯胺基團存在于氧化還原介體(例如過渡金屬化合物)上。
向4.5毫升含有1.0mM Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl和1.0μM抗生物素蛋白共軛的葡萄糖氧化酶(GOx-A)的DI水中加入鹽酸1-乙基-3-(3-(二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，產(chǎn)生4.0mMEDC和1.6mM sulfo-NHS的最終濃度。然后通過PBS緩沖劑離析純化溶液24小時。在對照試驗中，在不加入偶合劑的情況下將相同量的GOx-A與Os配合物混合。
實施例3該實施例示例說明了由過渡金屬化合物Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl共價結(jié)合改性的GOx的電化學標簽是電化學活性的。
利用與低電流組件(CH儀器，Austin，TX)結(jié)合的CH儀器型號660A的電化學工作站來進行電化學試驗。三電極系統(tǒng)由2毫米直徑金工作電極、微型Ag/AgCl參比電極(Cypress Systems，Lawrence，KS)和鉑絲對電極組成。電勢參照Ag/AgCl參考電極。電化學標簽的循環(huán)伏安法(CV)表現(xiàn)出一對良好界定的中心位于0.19V的伏安法電流峰植，顯示出電化學活性。為了證明酶確實被共價改性，與Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl的簡單靜電結(jié)合相反，根據(jù)實施例2進行對照試驗，但是不存在EDC和NHS耦合試劑。對照試驗產(chǎn)生生物活性酶但透析后不具有可檢測介體，表明介體并沒有共價結(jié)合到GOx上(圖1中的曲線b)。
實施例4該實施例使用UV-vis吸收光譜說明了由Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl改性的GOx的特性。
圖2中圖示了原料和改性的GOx的UV-vis吸收光譜。Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl的UV-vis光譜與Os(bpy)2化合物相似。其由于配體內(nèi)(IL)σ→σ*(bpy)躍遷而在UV區(qū)顯示出強烈?guī)Ш陀捎谧孕试S9Os(dπ)→bpy(π*)金屬-到-配體電荷-遷移(MLCT)躍遷而在可見光區(qū)域(400-600nm)內(nèi)通過寬帶。而且，改性的GOx的光譜是來自GOx和Os(bpy)2Cl(3-氨丙基咪唑)配合物的吸收光譜的復(fù)合。Os(bpy)2Cl(3-氨丙基咪唑)和GOx的簡單疊加產(chǎn)生了與活性GOx相似的光譜，證實了活性GOx的形成。
實施例5該實施例使用UV-vis吸收光譜說明了由Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl改性的GOx的生物活性。
為了測定酶在共價改性后是否仍具有生物活性，將一滴改性酶溶液滴到絲網(wǎng)卬刷碳電極上。吸附5～10分針后，利用PBS緩沖劑徹底沖洗電極。在PBS中存在40mM葡萄糖溶液下，通過在0.3伏下測量電流來監(jiān)測催化電流。固定的電活性酶的伏安法結(jié)果顯示GOx保留了其對于葡萄糖氧化的催化活性(圖3)。存在最佳可溶介體的情況下，其催化電流在相同濃度下與天然GOx相當或更好。伏安法結(jié)果進一步證明，與GOx共價結(jié)合的Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl可以促進酶的FAD中心直接還原而不需要溶液中的任何附加介體。同樣，用Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl改性的GOx-抗生物素蛋白共軛物顯示出與活性GOx類似的電化學特性。
實施例6該實施例示例說明了由Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl改性的GOx作為電化學標簽在核酸檢測中的應(yīng)用。
電化學活性GOx-A被用作核酸的直接電流法檢測中的電化學標簽。圖4顯示了由大鼠肝臟中提取的mRNA(20pg/μl)中的p53基因檢測的定型電流曲線(mRNA被轉(zhuǎn)化成cDNA，其隨后被維生物素標記)。核酸制備、捕集探針的固定和測量基本上如在Xie，H.et al.，2004，Nucleic Acids Research，32el 5中所描述。當互補探針被固定到電極表面時，在靶基因雜交后酶被引到電極表面，因為GOx-A的抗生物素蛋白部分結(jié)合到靶的生物素部分。在葡萄糖存在下，酶促進了葡萄糖的氧化。電子隨后通過與GOx-A骨架結(jié)合的Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl向電極表面穿梭并被電極獲得。在電極表面具有非互補捕集探針對照試驗中，靶p53基因沒有與捕集探針雜交，因而酶不能夠結(jié)合到表面上。被檢測的微小電流主要是由于酶的非特異性結(jié)合。表1給出了三次重復(fù)試驗的結(jié)果。
表1p53分析的電流測量響應(yīng)(3次重復(fù))

在不背離本發(fā)明范圍的情況下，可以對以上方法和組合物進行各種改變，包含在以上說明的所有內(nèi)容是作為說明目的而不是限定性的。本發(fā)明的說明和實施例并不用于表示本發(fā)明教導所給出的實施方案已經(jīng)或沒有實施。
權(quán)利要求
1.一種具有下式的過渡金屬化合物 其中M是能夠與氮形成配位鍵的金屬元素；R和R′是在氮原子上與M配位的含氮有機部分，其中R和R′獨立地選自2，2′-聯(lián)吡啶；由一個或多個取代基取代的2，2′-聯(lián)吡啶，其中所述取代基選自C1-C4烷基、苯基和由一個或多個C1-C4烷基取代的苯基；1，10-菲咯啉基；和由一個或多個取代基取代的1，10-菲咯啉基，其中所述取代基選自C1-C4烷基、苯基和被一個或多個C1-C4烷基取代苯基；L是包含有機胺的連接配體，所述有機胺具有約3～約20個非氫原子、脂族氨基和為M提供金屬-氮配位鍵的含氮部分；Z是鹵素原子；m是+1、+2、+3、+4、+5或+6；X是與m平衡的陰離子或陰離子的組合。
2.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中M選自鋨、釕、鋅、鐵、銠、錸、鉑、鈧、鈦、釩、鎘、鎂、銅、鈷、鈀、鉻、錳、鎳、鉬、鎢和銥或它們的混合物。
3.如權(quán)利要求2所述的化合物，其中M是鋨。
4.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中連接配體包含3-氨丙基咪唑。
5.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中Z是氯或溴。
6.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中R和R′獨立地選自2，2′-聯(lián)吡啶、4，4′-甲基-2，2′-聯(lián)吡啶、4，4′-乙基-2，2′-聯(lián)吡啶、4，4′-苯基-2，2′-聯(lián)吡啶、5，5′-甲基-2，2′-聯(lián)吡啶、5，5′-乙基-2，2′-聯(lián)吡啶和5，5′-苯基-2，2′-聯(lián)吡啶。
7.如權(quán)利要求6所述的化合物，其中M選自鋨、釕、鋅、鐵、銠、錸、鉑、鈧、鈦、釩、鎘、鎂、銅、鈷、鈀、鉻、錳、鎳、鉬、鎢和銥或它們的混合物。
8.如權(quán)利要求7所述的化合物，其中M是鋨。
9.如權(quán)利要求6所述的化合物，其中連接配體包含3-氨丙基咪唑。
10.如權(quán)利要求6所述的化合物，其中Z是氯或溴。
11.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中R和R′中至少一個為2，2′-聯(lián)吡啶，M是鋨，Z是氯和連接配體包含3-氨丙基咪唑。
12.如權(quán)利要求1所述的化合物，包含下式
13.一種制備過渡金屬化合物的方法，所述方法包括將具有下式的前體化合物與連接配體接觸以形成權(quán)利要求1的過渡金屬化合物， 其中Z、M、R、R′、X和m如權(quán)利要求1中所限定。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中M選自鋨、釕、鋅、鐵、銠、錸、鉑、鈧、鈦、釩、鎘、鎂、銅、鈷、鈀、鉻、錳、鎳、鉬、鎢和銥或它們的混合物。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中M是鋨。
16.如權(quán)利要求13所述的方法，其中連接配體包含3-氨丙基咪唑。
17.如權(quán)利要求13所述的方法，其中Z是氯或溴。
18.如權(quán)利要求13所述的方法，其中R和R′獨立地選自2，2′-聯(lián)吡啶、4，4′-甲基-2，2′-聯(lián)吡啶、4，4′-乙基-2，2′-聯(lián)吡啶、4，4′-苯基-2，2′-聯(lián)吡啶、5，5′-甲基-2，2′-聯(lián)吡啶、5，5′-乙基-2，2′-聯(lián)吡啶和5，5′-苯基-2，2′-聯(lián)吡啶。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中M選自鋨、釕、鋅、鐵、銠、錸、鉑、鈧、鈦、釩、鎘、鎂、銅、鈷、鈀、鉻、錳、鎳、鉬、鎢和銥或它們的混合物。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中M是鋨。
21.如權(quán)利要求18所述的方法，其中連接配體包含3-氨丙基咪唑。
22.如權(quán)利要求18所述的方法，其中Z是氯或溴。
23.如權(quán)利要求13所述的方法，其中R和R′中至少一個為2，2′-聯(lián)吡啶，M是鋨，Z是氯和連接配體包含3-氨丙基咪唑。
24.如權(quán)利要求13所述的方法，其中前體化合物是具有下式的化合物 其中R和R′為2，2′-聯(lián)吡啶并且在它們的氮原子上與Os配位，Z是氯，m是+3，X是與m平衡的陰離子或陰離子的組合，連接配體是3-氨丙基咪唑，過渡金屬化合物是具有下式的化合物
25.一種電化學標簽，包含與具有下式的過渡金屬化合物結(jié)合的氧化還原生物分子 其中M是能夠與氮形成配位鍵的金屬元素；R和R′是在氮原子上與M配位的含氮有機部分，其中R和R′獨立地選自2，2′-聯(lián)吡啶；由一個或多個取代基取代的2，2′-聯(lián)吡啶，其中所述取代基選自C1-C4烷基、苯基和由一個或多個C1-C4烷基取代的苯基；1，10-菲咯啉基；和由一個或多個取代基取代的1，10-菲咯啉基，其中所述取代基選自C1-C4烷基、苯基和被一個或多個C1-C4烷基取代苯基；L是包含有機胺的連接配體，所述有機胺具有約3～約20個非氫原子、脂族氨基和為M提供金屬-氮配位鍵的含氨部分；Z是鹵素原子；m是+1、+2、+3、+4、+5或+6；X是與m平衡的陰離子或陰離子的組合。
26.如權(quán)利要求25所述的電化學標簽，其中M選自鋨、釕、鋅、鐵、銠、錸、鉑、鈧、鈦、釩、鎘、鎂、銅、鈷、鈀、鉻、錳、鎳、鉬、鎢和銥或它們的混合物。
27.如權(quán)利要求26所述的電化學標簽，其中M是鋨。
28.如權(quán)利要求25所述的電化學標簽，其中氧化還原生物分子包含氧化還原酶。
29.如權(quán)利要求28所述的電化學標簽，其中氧化還原酶包含葡萄糖氧化酶。
30.如權(quán)利要求25所述的電化學標簽，其中連接配體包含3-氨丙基咪唑。
31.如權(quán)利要求25所述的電化學標簽，其中Z是氯或溴。
32.如權(quán)利要求25所述的電化學標簽，R和R′獨立地選自2，2′-聯(lián)吡啶、4，4′-甲基-2，2′-聯(lián)吡啶、4，4′-乙基-2，2′-聯(lián)吡啶、4，4′-苯基-2，2′-聯(lián)吡啶、5，5′-甲基-2，2′-聯(lián)吡啶、5，5′-乙基2，2′-聯(lián)吡啶和5，5′-苯基-2，2′-聯(lián)吡啶。
33.如權(quán)利要求32所述的電化學標簽，其中M選自鋨、釕、鋅、鐵、銠、錸、鉑、鈧、鈦、釩、鎘、鎂、銅、鈷、鈀、鉻、錳、鎳、鉬、鎢和銥或它們的混合物。
34.如權(quán)利要求33所述的電化學標簽，其中M是鋨。
35.如權(quán)利要求32所述的電化學標簽，其中氧化還原生物分子包含氧化還原酶
36.如權(quán)利要求35所述的電化學標簽，其中氧化還原酶包含葡萄糖氧化酶。
37.如權(quán)利要求32所述的電化學標簽，其中連接配體包含3-氨丙基咪唑。
38.如權(quán)利要求32所述的電化學標簽，其中Z是氯或溴。
39.如權(quán)利要求25所述的電化學標簽，其中R和R′中至少一個為2，2′-聯(lián)吡啶，M是鋨，Z是氯以及連接配體包含3-氨丙基咪唑。
40.如權(quán)利要求39所述的電化學標簽，其中氧化原生物分子包含氧化還原酶
41.如權(quán)利要求40所述的電化學標簽，其中氧化還原酶包含葡萄糖氧化酶。
42.如權(quán)利要求25所述的電化學標簽，包含與具有下式的過渡金屬化合物結(jié)合的氧化還原生物分子
43.如權(quán)利要求42所述的電化學標簽，其中氧化還原生物分子包含氧化還原酶。
44.如權(quán)利要求43所述的電化學標簽，其中氧化還原酶包含葡萄糖氧化酶。
45.一種制備權(quán)利要求25所述的電化學標簽的方法，所述方法包括將氧化還原生物分子與具有下式的過渡金屬化物結(jié)合 其中M是能夠與氮形成配位鍵的金屬元素；R和R′是在氮原子上與M配位的含氮有機部分，其中R和R′獨立地選自2，2′-聯(lián)吡啶；由一個或多個取代基取代的2，2′-聯(lián)吡啶，其中所述取代基選自C1-C4烷基、苯基和由一個或多個C1-C4烷基取代的苯基；1，10-菲咯啉基；和由一個或多個取代基取代的1，10-菲咯啉基，其中所述取代基選自C1-C4烷基、苯基和被一個或多個C1-C4烷基取代苯基；L是包含有機胺的連接配體，所述有機胺具有約3～約20個非氫原子、脂族氨基和為M提供金屬-氮配位鍵的含氮部分；Z是鹵素原子；m是+1、+2、+3、+4、+5或+6；X是與m平衡的陰離子或陰離子的組合。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其中M選自鋨、釕、鋅、鐵、銠、錸、鉑、鈧、鈦、釩、鎘、鎂、銅、鈷、鈀、鉻、錳、鎳、鉬、鎢和銥或它們的混合物。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，其中M是鋨。
48.如權(quán)利要求45所述的方法，其中氧化還原生物分子包含氧化還原酶。
49.如權(quán)利要求48所述的方法，其中氧化還原酶包含葡萄糖氧化酶。
50.如權(quán)利要求45所述的方法，其中氧化還原生物分子通過酰胺鍵與過渡金屬化合物結(jié)合。
51.如權(quán)利要求45所述的方法，其中連接配體包含3-氨丙基咪唑。
52.如權(quán)利要求45所述的方法，其中Z是氯或溴。
53.如權(quán)利要45所述的方法，其中R和R′獨立地選自2，2′-聯(lián)吡啶、4，4′-甲基-2，2′-聯(lián)吡啶、4，4′-乙基-2，2′-聯(lián)吡啶、4，4′-苯基-2，2′-聯(lián)吡啶、5，5′-甲基-2，2′-聯(lián)吡啶、5，5′-乙基-2，2′-聯(lián)吡啶和5，5′-苯基-2，2′-聯(lián)吡啶。
54.如權(quán)利要求53所述的方法，其中M選自鋨、釕、鋅、鐵、銠、錸、鉑、鈧、鈦、釩、鎘、鎂、銅、鈷、鈀、鉻、錳、鎳、鉬、鎢和銥或它們的混合物。
55.如權(quán)利要求54所述的方法，其中M是鋨。
56.如權(quán)利要求53所述的方法，其中氧化還原生物分子包含氧化還原酶。
57.如權(quán)利要求56所述的方法，其中氧化還原酶包含葡萄糖氧化酶。
58.如權(quán)利要求53所述的方法，其中氧化還原生物分子通過酰胺鍵與過渡金屬化合物結(jié)合。
59.如權(quán)利要求53所述的方法，其中連接配體包含3-氨丙基咪唑。
60.如權(quán)利要求53所述的方法，其中Z是氯或溴。
61.如權(quán)利要求45所述的方法，其中R和R′中至少一個為2，2′-聯(lián)吡啶，M是鋨，Z是氯以及連接配體包含3-氨丙基咪唑。
62.如權(quán)利要求61所述的方法，其中氧化還原生物分子包含氧化還原酶。
63.如權(quán)利要求62所述的方法，其中氧化還原酶包含葡萄糖氧化酶。
64.如權(quán)利要求61所述的方法，其中氧化還原生物分子通過酰胺鍵與過渡金屬化合物結(jié)合。
65.如權(quán)利要求45所述的方法，所述方法包括將氧化還原生物分子與具有下式的過渡金屬化合物結(jié)合
66.如權(quán)利要求65所述的方法，其中氧化還原生物分子包含氧化還原酶。
67.如權(quán)利要求66所述的方法，其中氧化還原酶包含葡萄糖氧化酶。
68.如權(quán)利要求66所述的方法，其中氧化還原生物分子通過酰胺鍵與過渡金屬化合物結(jié)合。
69.一種用于檢測樣品中分析物的方法，所述方法包括在電極表面形成包含分析物和電化學標簽的電化學活性氧化還原配合物；和在電極檢測電子轉(zhuǎn)移，其中所述電化學標簽包含與具有以式的過渡金屬化合物結(jié)合的氧化還原生物分子 其中M是能夠與氨形成配位鍵的金屬元素；R和R′是在氮原子上與M配位的含氮有機部分，其中R和R′獨立地選自2，2′-聯(lián)吡啶；由一個或多個取代基取代的2，2′-聯(lián)吡啶，其中所述取代基選自C1-C4烷基、苯基和由一個或多個C1-C4烷基取代的苯基；1，10-菲咯啉基；和由一個或多個取代基取代的1，10-菲咯啉基，其中所述取代基選自C1-C4烷基、苯基和被一個或多個C1-C4烷基取代苯基；L是包含有機胺的連接配體，所述有機胺具有約3～約20個非氫原子、脂族氨基和為M提供金屬-氮配位鍵的含氮部分；Z是鹵素原子；m是+1、+2、+3、+4、+5或+6；X是與m平衡的陰離子或陰離子的組合。
70.如權(quán)利要求69所述的方法，其中M選自鋨、釕、鋅、鐵、銠、錸、鉑、鈧、鈦、釩、鎘、鎂、銅、鈷、鈀、鉻、錳、鎳、鉬、鎢和銥或它們的混合物。
71.如權(quán)利要求70所述的方法，其中M是鋨。
72.如權(quán)利要求69所述的方法，其中分析物是氧化還原生物分子的氧化底物。
73.如權(quán)利要求69所述的方法，其中氧化還原生物分子包含氧化還原酶。
74.如權(quán)利要求73所述的方法，其中氧化還原酶包含葡萄糖氧化酶。
75.如權(quán)利要求69所述的方法，其中連接配體包含3-氨丙基咪唑。
76.如權(quán)利要求69所述的方法，其中Z是氯或溴。
77.如權(quán)利要求69所述的方法，其中所述方法還包括將探針固定到電極表面上；用識別對的第一部分標記分析物；用識別對的第二部分標記電化學標簽；和將被標記的成分與氧化還原生物分子的氧化底物在與電極接觸的溶液中結(jié)合，其中探針和分析物彼此特異性結(jié)合或雜交。
78.如權(quán)利要求77所述的方法，其中識別對包含生物素和抗生物素蛋白。
79.如權(quán)利要求77所述的方法，其中分析物包含核酸。
80.如權(quán)利要求69所述的方法，其中所述方法還包括用識別對的第一部分標記電極表面；用識別對的第二部分標記電化學標簽；和將被標記的成分與氧化還原生物分子的氧化底物在與電極接觸的溶液中結(jié)合，其中所述電化學標簽結(jié)合所述電極表面。
81.如權(quán)利要求80所述的方法，其中識別對包含生物素和抗生物素蛋白。
82.如權(quán)利要求80所述的方法，其中分析物包含氧化還原生物分子的底物。
83.如權(quán)利要求69所述的方法，其中過渡金屬化合物包含有下式的+3陽離子
84.如權(quán)利要求83所述的方法，其中氧化還原生物分子包含氧化還原酶。
85.如權(quán)利要求83所述的方法，其中氧化還原酶包含葡萄糖氧化酶。
全文摘要
用于電化學檢測分析物的組合物和方法，所述組合物包含式(I)過渡金屬化合物，其中M是一種能夠與氮形成配位鍵的金屬元素；R和R′在它們的氮原子上與M配位；L是一種連接配體；Z是氯或溴，而m可以是1～6；X是平衡電荷m的陰離子或陰離子的組合。還提供了電化學標簽和檢測方法。
文檔編號C07F17/00GK101027314SQ200580029087
公開日2007年8月29日 申請日期2005年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月28日
發(fā)明者謝虹, 高志強 申請人:新加坡科技研究局