專利名稱：重組抗體的再折疊方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及提高蛋白質(zhì)較佳型富集和/或回收的制備方法。更具體地說，本發(fā)明涉及重組抗體蛋白質(zhì)的再折疊方法。
背景技術(shù)：
隨著遺傳工程時(shí)代的來臨，帶來了大量生物學(xué)相關(guān)多肽容易制備的前景，該多肽以功能型在遺傳工程所得到的有機(jī)體內(nèi)表達(dá)。在很多情況下，原核細(xì)胞用于重組蛋白的表達(dá)。然而，這個(gè)前景因?yàn)橐恍┰驔]有完全實(shí)現(xiàn)。例如，很多情況下，如果多肽業(yè)已在宿主細(xì)胞的胞質(zhì)中生成并保留，則包函體會(huì)要求蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性，但經(jīng)常只有部分或者很少成功。很多重要目的蛋白質(zhì)在原核細(xì)胞中以可溶形式充其量無效表達(dá)，至少部分因?yàn)轶w內(nèi)蛋白質(zhì)折疊過程的復(fù)雜性(Houry等人，Nature，402147-154，1999)。從包函體內(nèi)重新得到生物學(xué)上有活性的真核蛋白質(zhì)需要在苛刻條件下的蛋白質(zhì)伸展和再折疊，包括使用離液劑和還原性硫醇。在另一些情況下，表達(dá)的蛋白質(zhì)或肽基本上降解，不僅導(dǎo)致產(chǎn)量低，而且生成難以分離和純化的復(fù)雜混合物。
體內(nèi)蛋白質(zhì)中二硫鍵形成是一個(gè)復(fù)雜的過程，由環(huán)境的氧化還原勢(shì)和特定的硫醇-二硫化物交換酶決定(Creighton，Methods Enzymol.107，305-329，1984；Houee-Levin，Methods Enzymol.353，35-44，2002；Ritz and Beckwith，Roles ofthiol-redox pathways in bacteria，Annu.Rev.Microbiol.55，21-48，2001.)。二硫化物在細(xì)胞內(nèi)新生鏈分泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的過程中或分泌之后很快形成(Creighton，MethodsEnzymol.107，305-329，1984)。因?yàn)槿鄙俣蚧镄纬蛇^程，在不成對(duì)半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或表面暴露中的三個(gè)或三個(gè)以上半胱氨酸殘基非常接近，所以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的重組蛋白質(zhì)形成過程中，可以產(chǎn)生同一蛋白質(zhì)的一些構(gòu)象異構(gòu)體，但具有不同的二硫化物結(jié)構(gòu)。
一般來說，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)(包括抗體、IgG抗體、IgG1抗體和結(jié)合人IL-15的IgG1抗體)的半胱氨酸殘基是折疊蛋白質(zhì)區(qū)的一部分時(shí)，它們或者參與半胱氨酸-半胱氨酸二硫鍵或者空間上阻擋二硫鍵的形成。當(dāng)某一半胱氨酸殘基在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上沒有配對(duì)，且在空間上沒有因折疊而被阻擋，可以與溶液中的一自由半胱氨酸形成二硫鍵(半胱氨?；?。該自由半胱氨酸殘基通常與其它氨基酸作為蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)在發(fā)酵培養(yǎng)基中存在。半胱氨?；撬幬锏鞍踪|(zhì)中不需要的翻譯后修飾，可生成具有不需要的特性的構(gòu)象異構(gòu)體，如，結(jié)合力低、生物活性低和穩(wěn)定性低。本發(fā)明提供一種方法去除半胱氨?；?，提高所需無半胱氨酰化的構(gòu)象異構(gòu)體的相對(duì)豐度。
蛋白質(zhì)中不成對(duì)的半胱氨酸殘基可使之半胱氨?；?，這可導(dǎo)致蛋白質(zhì)特性和功能顯著變化。有報(bào)道在體內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)的半胱氨酰化(Craescu等人，J.Biol.Chem.261，14710-14716，1986；Dormann等人，J.Biol.Chem.1993，268，16286-16292；Davis等人，Biochemistry 1996，35，2482-2488；Lim等人，Anal.Biochem.2001，295，45-56.，Bondarenko等人，Int.J.Mass Spectrom.Ion Processes2002，219，671-680)。半胱氨酸殘基的修飾調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性。例如，谷胱甘肽與血色素共價(jià)結(jié)合增加這個(gè)蛋白質(zhì)的氧結(jié)合力(Craescu等人，J.Biol.Chem.261，14710-14716，1986)。另一例中，肝型脂肪酸結(jié)合蛋白質(zhì)(LABP)在半胱氨酰化和谷胱甘肽化后失去結(jié)合親和力(Dormann等人，J.Biol.Chem.1993，268，16286-16292)。HIV-1蛋白酶活性通過半胱氨?；凸入赘孰幕{(diào)節(jié)(Davis等人，Biochemistry 1996，35，2482-2488)。據(jù)報(bào)道，在血液循環(huán)中有人抗體片段含有不成對(duì)的半胱氨酸。例如，某篇報(bào)道顯示，免疫球蛋白的λ型輕鏈在位置33上有一自由半胱氨酸，所以輕鏈共有6個(gè)半胱氨酸殘基(Buchwald等人，Can.J.Biochem.1971，49，900-902)。這表示這種自由半胱氨酸是λ輕鏈的亞組III的特性。
盡管有報(bào)道在IgG分子中有不成對(duì)的半胱氨酸，還是有不成對(duì)半胱氨酸半胱氨?；瘺]有報(bào)道的情形。半胱氨?；臋z測(cè)在分析上難度很大，早期報(bào)道中半胱氨?；瘷z測(cè)失敗可能因?yàn)樵诜治鲞^程中的步驟之一中使用了還原(還原將消除半胱氨?；?。當(dāng)半胱氨?；霈F(xiàn)在CDR區(qū)域時(shí)，可以影響生物活性，如146B7所示，146B7是直接抗人IL-15的全長人抗體。通過再折疊消除半胱氨酰化有助于使異質(zhì)性最小化，因此提高產(chǎn)物的同種性。通過再折疊消除半胱氨?；部梢蕴岣弋a(chǎn)物效率。半胱氨酰化將出現(xiàn)在含有一個(gè)或多個(gè)不成對(duì)半胱氨酸的其它IgG分子中，消除半胱氨?；瘜?duì)這種產(chǎn)物的藥物活性很重要。
PCT出版的WO02/68455揭示了腫瘤壞死因子受體Fc融合蛋白的再折疊方法。該蛋白質(zhì)通過將IgG1抗體的Fc區(qū)域與兩種腫瘤壞死因子受體(TNFr)融合的生物工程方法而生成，而不是自然生成。該申請(qǐng)并沒有提出蛋白質(zhì)因至少一個(gè)自由或不成對(duì)半胱氨酸的存在，也就是說，沒有參與二硫鍵形成的半胱氨酸而有異種結(jié)構(gòu)。
已知帶有自由半胱氨酸的復(fù)雜蛋白質(zhì)存在，至少一些免疫球蛋白是這種蛋白質(zhì)在市場(chǎng)上銷售的相關(guān)例子。具體地說，值得注意的是，WO02/68455沒有提供自然生成如免疫球蛋白分子的方法的例子，也沒有討論或解決含有自由或不成對(duì)半胱氨酸的大而復(fù)雜的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)折疊問題。
微生物細(xì)胞產(chǎn)生的包函體蛋白質(zhì)的體外再折疊(E.coli)在文獻(xiàn)中詳述，其包括兩個(gè)步驟。首先，包函體蛋白質(zhì)溶于高濃度的離液劑和還原劑中，以打斷所有的二硫鍵(Middelberg，A.P.Preparative protein refolding.Trends Biotechnol.2002，20，437-443)。例如，在Rudolph，R.；Lilie，H.的綜述中包函體溶解溶液包括6M鹽酸胍和100mM DTT(In vitro folding of inclusion body proteins FASEB J.1996，10，49-56)。第二步是在適中濃度的鹽酸胍(0.5-1.0M)和溫和的氧化還原環(huán)境中進(jìn)行蛋白質(zhì)折疊(Middelberg，A.P.Preparative protein refolding.Trends Biotechnol.2002，20，437-443)。本發(fā)明不包括蛋白質(zhì)完全變性的溶解步驟和在高濃度離液劑和還原劑參與下所有二硫鍵的還原。所述的發(fā)明方法不使蛋白質(zhì)變性，或僅僅使它變性，以及僅僅還原/氧化(改組)少數(shù)幾個(gè)二硫化物。本發(fā)明涉及在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生產(chǎn)的蛋白質(zhì)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的蛋白質(zhì)包括體內(nèi)蛋白質(zhì)折疊和二硫化物形成，而微生物細(xì)胞生產(chǎn)的蛋白質(zhì)是高密度、未折疊、不溶蛋白質(zhì)，與混合二硫化物(包函體)一起凝聚成團(tuán)。因?yàn)椴溉閯?dòng)物細(xì)胞正確連接大部分二硫鍵，無需蛋白質(zhì)完全變性和所有二硫鍵還原。
US4766205認(rèn)識(shí)到蛋白質(zhì)重組生產(chǎn)受不適當(dāng)形成的分子內(nèi)二硫鍵妨礙，導(dǎo)致重組蛋白質(zhì)的“非天然”構(gòu)象被“凍結(jié)”，使得它們不能夠轉(zhuǎn)變成天然構(gòu)象。這種非天然產(chǎn)物至少部分無生物學(xué)活性。為了解決這個(gè)問題，US4766205揭示了包括將蛋白質(zhì)暴露給還原劑，加入加合形成的二硫化物化合物，然后加入氧化劑暫時(shí)去除還原劑的方法。該發(fā)明詳述了蛋白質(zhì)經(jīng)受完全變性和二硫鍵還原而溶解。所涉及的步驟和所要求的化合物數(shù)量給這個(gè)方法帶來麻煩。值得注意的是，US4766205沒有討論所揭示的哺乳動(dòng)物生產(chǎn)的蛋白質(zhì)再折疊方法的應(yīng)用，也沒有討論通過分子間鍵而形成的大而復(fù)雜的蛋白質(zhì)，如免疫球蛋白。
以上討論顯示，基本上需要且有興趣發(fā)展有效經(jīng)濟(jì)的大的活性多肽制備、純化和分析系統(tǒng)，所需多肽通過如，重組方法生成，因而所生成的多肽是活性構(gòu)象或容易加工和復(fù)性成功能態(tài)。另外，不管事實(shí)上有廣泛使用的技術(shù)分析低分子量蛋白質(zhì)如胰島素，或大蛋白質(zhì)的低分子量水解產(chǎn)物，還是需要發(fā)展其它方法和技術(shù)以制備有序列和詳細(xì)構(gòu)象信息的大蛋白質(zhì)，具體地說，有通過分子間鍵形成的多于一個(gè)亞單位的蛋白質(zhì)。本發(fā)明直接提出這些需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明直接提供活性多肽的有效經(jīng)濟(jì)的制備、純化和分析，所述多肽證實(shí)因?yàn)榇嬖诓灰?guī)則的二硫鍵和自由或不成對(duì)的半胱氨酸殘基，導(dǎo)致現(xiàn)有重組制備方法難以控制。更具體地說，本發(fā)明描述了一種蛋白質(zhì)再折疊方法，以制備藥學(xué)和結(jié)晶特性改進(jìn)的蛋白質(zhì)。如下文詳述，還原/氧化(氧化還原)耦合劑的加入使重組蛋白質(zhì)中的似天然二硫鍵的形成變得容易，因此制備結(jié)構(gòu)上同種并且更有活性的分子型。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種重組IgG抗體(如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體)的制備方法，所述的方法包括將哺乳動(dòng)物細(xì)胞重組生產(chǎn)的多肽在pH值大約為5至11下與還原/氧化耦合劑接觸。該方法可選擇地包括將所述制劑在與所述還原/氧化耦合劑接觸之前、之后或同時(shí)與離液劑接觸。在一些實(shí)施例，所述的多肽是重組IgG1。所述的IgG1較佳至少有一個(gè)自由半胱氨酸殘基。這樣的抗體例子是在US2003/0138421，2003/02358和2004/0071702中被指為146B7的抗體。所有這些完整內(nèi)容全部納入本文作為參考。在另一些較佳實(shí)施例，所述的IgG是IgG2分子。該方法較佳減少了IgG2分子的異質(zhì)性。其它的實(shí)施例包括IgG4分子的再折疊方法，以減少IgG4半分子的出現(xiàn)(這里指“半分子”(half-mer))。
因此，本發(fā)明的方法具體涉及IgG抗體重組型的再折疊。制備這種IgG抗體的例子是通過在CHO細(xì)胞內(nèi)的重組表達(dá)這種抗體的重組抗體制備。IgG1抗體的例子在前述的US文獻(xiàn)中所述，146B7是全長人抗體，即，IgG1，直接抗人IL-15。
如上所述，本發(fā)明的一些實(shí)施例提供有自由或不成對(duì)半胱氨酸殘基的重組IgG1抗體。有不成對(duì)半胱氨酸的抗體被認(rèn)為有至少一個(gè)或以上自由半胱氨酸殘基，其中自由半胱氨酸殘基定義為在抗體多肽重鏈或輕鏈中的氨基酸，通常不包括二硫鍵的形成，但接近二硫半胱氨酸對(duì)，且如果該對(duì)半胱氨酸鍵斷裂，自由半胱氨酸與之前配對(duì)的半胱氨酸之一能夠形成不同的二硫鍵。也可以理解為，有自由半胱氨酸的抗體根據(jù)半胱氨酸配對(duì)，可以表現(xiàn)為多個(gè)構(gòu)象。還可以理解為，有自由半胱氨酸的抗體根據(jù)這個(gè)半胱氨酸殘基半胱氨?；蚬入赘孰幕?，可以表現(xiàn)為多個(gè)構(gòu)象。
與前述一致，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及重組IgG抗體的制備方法，包括將哺乳動(dòng)物細(xì)胞重組生產(chǎn)的多肽在pH值大約為5至11下與還原/氧化耦合劑接觸；以及可選擇地還將所述IgG分子在與所述還原/氧化耦合劑接觸之前、之后或同時(shí)與離液劑接觸。
因此包括這種重組IgG分子制劑的制備方法，包括將哺乳動(dòng)物重組生產(chǎn)的所述IgG分子制劑(也就是說，重組IgG)在pH值大約為5至11下與還原/氧化耦合劑接觸；還可選擇地在與所述的還原/氧化耦合劑接觸之前、之后或同時(shí)將所述制劑與離液劑接觸；以及，選擇地分離重組IgG分子的處理制劑中的片段，其中IgG分子再折疊成所需構(gòu)象。具體的是還原/氧化耦合劑的pH值大約為7至10；更具體的是，還原/氧化耦合劑的pH值大約為7.6至9.6。在一些具體而非限定性的實(shí)施例，還原/氧化耦合劑的pH值大約為8.0；在另一些實(shí)施例pH值大約為8.6。所述的方法在溫度為20℃至37℃下進(jìn)行，更具體的是，在-10℃到+8℃下進(jìn)行。在一些具體實(shí)施例，該方法在4℃下進(jìn)行。
氧化還原耦合劑可以是任何氧化還原耦合劑。在一些實(shí)施例，氧化還原耦合劑包括還原的谷胱甘肽和氧化的谷胱甘肽。更具體的是，在一些實(shí)施例，還原的谷胱甘肽與氧化的谷胱甘肽在氧化還原耦合劑中的比例大約為1∶1到100∶1。在另一些具體實(shí)施例，還原/氧化耦合劑包括半胱氨酸/胱氨酸。還原/氧化耦合劑特別包括大約0.1mM至10mM半胱氨酸和大約0.1mM至10mM胱氨酸。在又一些實(shí)施例，所述的半胱氨酸和胱氨酸以半胱氨酸胱氨酸比例大約為1∶1至10∶1存在。在一些特別而非限定性的實(shí)施例，還原/氧化耦合劑包括6mM半胱氨酸和1mM或6mM胱氨酸。在重組IgG分子(如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)制備方法的一些實(shí)施例，半胱氨酸/胱氨酸包括大約6mM半胱氨酸和大約6mM胱胺。
與氧化還原劑的接觸可在足以發(fā)生伸展和再折疊的任何便利時(shí)間內(nèi)進(jìn)行。在一些實(shí)施例，所述與氧化還原劑的接觸步驟(含有或不含離液劑)，進(jìn)行大約30分鐘或以上。在一些實(shí)施例，所述與氧化還原劑的接觸步驟(含有或不含離液劑)，進(jìn)行大約4到48小時(shí)。
在本發(fā)明的其它方面，所述與還原/氧化耦合劑的接觸包括給生產(chǎn)重組IgG的細(xì)胞培養(yǎng)的生長培養(yǎng)基(即，細(xì)胞培養(yǎng)基)提供還原/氧化耦合劑。
在重組IgG抗體制備方法的一些實(shí)施例，所述的接觸步驟包括將至少一部分純化的(或部分分離的)的重組IgG制劑與還原/氧化耦合劑接觸。無論是否部分純化，重組IgG的濃度范圍預(yù)期為1mg/ml至大約50mg/ml。
本發(fā)明的方法還包括一額外步驟，將根據(jù)以上所述方法再折疊的分離重組蛋白質(zhì)與包括還原/氧化耦合劑的另一組合物接觸。而在一些實(shí)施例使用還原劑和氧化劑，還原劑也可以單獨(dú)使用。
在本發(fā)明的另一方面，重組多肽的制備方法包括將多肽與還原/氧化耦合劑接觸之前、之后或同時(shí)將多肽與離液劑接觸。離液劑是任何離液序列高的化合物或本領(lǐng)域的已知物理?xiàng)l件。典型的離液劑選自由脲、精氨酸、SDS和鹽酸胍組成的組。在一些特別實(shí)施例，離液劑是鹽酸胍。離液劑也包括溫度較低的情況，其中所述的溫度足以低至引起如，IgG的結(jié)構(gòu)變動(dòng)；具體地說，溫度范圍預(yù)計(jì)為0到-30攝氏度。任何如鹽酸胍的離液劑化合物濃度，可根據(jù)具體情況變化，然而，在一些實(shí)施例中，反應(yīng)混合物中的所述的試劑如鹽酸胍的濃度大約為0.1M至1M，而在另一些實(shí)施例中，反應(yīng)混合物中試劑濃度約為0.1M至1.5M。在一些具體實(shí)施例，反應(yīng)混合物中的試劑濃度大約為0.5M。在另一些典型的實(shí)施例，該試劑如鹽酸胍在反應(yīng)混合物中的濃度大約為0.9M。已知高壓力(1000-3000巴)、高溫(高于55℃)、酒精(達(dá)30％)、低pH(低于3.5)可使IgG抗體部分伸展，并且可起離液劑的作用?？捎脙煞N或以上的這些伸展因素聯(lián)合。
本發(fā)明的另一方面提供了如上所述的重組多肽的制備方法，還包括分離所接觸的多肽或分離有所需再折疊構(gòu)象的接觸的多肽片段。本文使用的分離步驟可以是分離蛋白質(zhì)常規(guī)使用的任何分離步驟。所述的分離步驟包括選自由如下組成的組的一個(gè)或多個(gè)技術(shù)反相層析(如，HPLC)、尺寸排阻層析、離子交換層析、疏水作用層析、親和層析和電泳如毛細(xì)管電泳。在使用HPLC的實(shí)施例中，分離包括將重組蛋白質(zhì)的重組IgG制劑樣品加入反相層析柱；通過反相HPLC洗脫重組IgG分子將IgG分子從制劑中其它組分中分離出來，其中將HPLC柱加熱至溫度大約為50℃至90℃；反相HPLC的流動(dòng)相包括與水混合的有機(jī)溶劑，其有至少為6.0的C18洗脫強(qiáng)度系數(shù)，所述的方法與在沒有還原/氧化耦合劑或HPLC分離特性的類似方法相比，生產(chǎn)IgG組分的同種族群。重組IgG可用陽離子交換層析相似地分離?？贵w“同種”群意指抗體群主要包括單一形式的抗體，例如，在溶液中或組合物中至少90％的抗體為適當(dāng)再折疊型。類似的，有自由或不成對(duì)半胱氨酸的多肽“同種”群意指所述多肽群主要包括適當(dāng)單一的再折疊型。本發(fā)明的方法中重組IgG的濃度可為易于再折疊的IgG的任何濃度。同樣地，IgG的濃度可以是IgG的工業(yè)定量(即克重量)(如，一特定的IgG的工業(yè)量)或者可以毫克定量。在一些特定實(shí)施例中，重組IgG分子在反應(yīng)混合物中的濃度大約為1mg/ml至50mg/ml，更具體的是，10mg/ml或15g/ml。重組IgG分子的這些濃度可具體估算。在一些實(shí)施例中，重組IgG分子與pH值大約為8.0的還原/氧化耦合劑接觸。
在本發(fā)明的另一些方面，本發(fā)明的方法特征在于與還原/氧化耦合劑接觸生成的重組IgG抗體(如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體)，與還沒有再折疊的相同IgG抗體相比，其生物學(xué)活性至少增高2倍，這是因?yàn)榻?jīng)還原/氧化耦合劑處理后，通過所述方法制備的制劑中IgG活性型濃度增加。在另一些實(shí)施例中，與離液劑接觸生產(chǎn)的IgG制劑與還沒有再折疊的相同抗體相比，其生物活性有至少兩倍增高，這是因?yàn)榻?jīng)離液劑處理后，通過所述方法制備的制劑中IgG活性型濃度增加。在又一些實(shí)施例中，重組多肽與還原/氧化耦合劑以及離液劑接觸生成的多肽，與沒有接觸的相同多肽相比，其生物活性至少增高3倍。
在另一些實(shí)施例中，接觸離液劑和還原/氧化耦合劑的聯(lián)合效應(yīng)與沒有再折疊的相同抗體相比，其IgG制劑的生物活性至少增高3倍，這是因?yàn)榕c還原/氧化耦合劑和離液劑聯(lián)合處理后，通過所述方法制備的制劑中所述IgG活性型的濃度增加。通過用本文所述的方法再折疊，蛋白質(zhì)所需構(gòu)象型的濃度增加(豐度富集或增加)。在再折疊后的分離步驟中，分離出更多的所需構(gòu)象型。在沒有再折疊的IgG的分離步驟中，分離出的所需構(gòu)象型較少。通過將活性型濃度從40％增加至至少80％或從30％至至少90％，本文所教導(dǎo)的方法得出的活性至少增加2倍或3倍。再折疊步驟將無(或少)活性的IgG分子轉(zhuǎn)變成有(或多)活性IgG。
在本發(fā)明的一特定實(shí)施例，反應(yīng)混合物中的離液劑是鹽酸胍，其最終濃度大約為0.1M至1.5M。
本發(fā)明的方法的特征還在于，它們生成較致密的IgG結(jié)構(gòu)，其中在還原/氧化劑和離液劑的參與下再折疊的重組IgG，生成一種變型，其IgG蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)致密。與未處理的材料相比，用氧化還原劑和離液劑處理重組IgG時(shí)，IgG變得松散(通過SEC和LC/MS分析可見)，經(jīng)氧化還原劑單獨(dú)處理過的IgG也變得更致密。
本發(fā)明IgG群的制備方法，還可通過配制IgG組分族群而進(jìn)行，通過所述的方法生成消毒原料型。在其它實(shí)施例，消毒的單位劑量型通過配制所述方法生成的IgG組分群而得到。
本發(fā)明還提供了需要重組IgG分子的個(gè)體的處理方法，其包括給予個(gè)體根據(jù)本發(fā)明的方法制備的同種IgG分子。在一些實(shí)施例中，所述的方法包括靜脈內(nèi)或皮下給予IgG分子。
本發(fā)明也預(yù)期有自由或不成對(duì)半胱氨酸的IgG蛋白質(zhì)半胱氨?；娜コ椒ǎ约盁o半胱氨?；乃铇?gòu)象異構(gòu)體相對(duì)豐度的增加方法，包括這些蛋白質(zhì)與還原/氧化耦合劑接觸，這些蛋白質(zhì)包括，如，IgG1。
本發(fā)明還預(yù)期有自由或不成對(duì)半胱氨酸的蛋白質(zhì)的貯存穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性、同種性或結(jié)晶特性的提高方法，包括將所述的蛋白質(zhì)與還原/氧化耦合劑接觸。在一些實(shí)施例中，所述的重組蛋白質(zhì)/抗體是高分子量蛋白質(zhì)，分子量大約為90KDa。
在本發(fā)明的一相關(guān)方面，重組多肽的制備方法包括一接觸步驟，其中接觸生產(chǎn)的多肽比不接觸的相同多肽在貯存上更穩(wěn)定。典型的實(shí)施例還包括一些方法，其中接觸生成的重組多肽比不接觸的相同多肽熱穩(wěn)定性好。在另一些實(shí)施例中，重組多肽的生成方法包括一接觸步驟，其中接觸生產(chǎn)的多肽與沒有接觸的相同多肽相比，其晶體特性有改進(jìn)。
本發(fā)明還包括根據(jù)本文所述的方法制備的重組IgG抗體組分群。例如，本發(fā)明包括根據(jù)本文所述生產(chǎn)重組多肽的方法制備的有至少一個(gè)自由半胱氨酸殘基的多肽制劑；其中制劑有如下多肽的同種族群，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4多肽。
在一相關(guān)方面，所述的制劑包括重組IgG抗體，還包括藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑(即，所述制劑包括藥物組合物)。本發(fā)明這方面的典型的實(shí)施例是包括至少一個(gè)自由半胱氨酸的重組多肽制劑。在一些實(shí)施例中，所述的藥物組合物包括IgG分子的族群，如，同種族群，以及藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。本發(fā)明預(yù)期任何已知的給藥途徑，用于包括多肽和藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑的制劑，如肌肉內(nèi)、非腸道、靜脈內(nèi)或皮下注射或埋植、尿道、直腸或眼窩后遞送等。
本發(fā)明的其它特殊方面包括IgG抗體制劑的制備方法，包括將哺乳動(dòng)物細(xì)胞重組生成的IgG抗體純化制劑在pH值大約為5至11下與還原/氧化耦合劑接觸；以及在與還原/氧化耦合劑接觸之前、之后或同時(shí)可選擇地還將制劑與離液劑接觸。
在這些方法中，IgG抗體可選自由如下組成的組IgG1、IgG2、IgG3和IgG4抗體或其呈現(xiàn)異質(zhì)性的片段。這種異質(zhì)性可通過IgG單體、IgG多聚體、IgG半分子或IgG分子的其它片段參與而引入。
在一些實(shí)施例，IgG抗體是IgG2抗體，作為幾種分離型在RP-HPLC洗脫，所述的方法減少RP-HPLC上洗脫的形式的數(shù)量，或改變?cè)赗P-HPLC洗脫的幾種單獨(dú)型的相對(duì)分布。在一些特定實(shí)施例中，所述的方法優(yōu)先富集用RP-HPLC測(cè)定的制劑中幾種單獨(dú)型的至少一種。更具體地，與沒有經(jīng)所述方法處理的制劑相比，優(yōu)先富集型有藥學(xué)上所需的特性。
術(shù)語“優(yōu)先富集”意指所需型的相對(duì)豐度增加或所需型的相對(duì)比率增加。本文所用的藥學(xué)上所需的特性包括但不限于循環(huán)中穩(wěn)定性增加、粘度降低、半衰期延長。例如，用本發(fā)明的方法生成的制劑在冷凍和解凍之后在溫度為2-8℃時(shí)可穩(wěn)定貯存至少一年；在25℃時(shí)可穩(wěn)定貯存至少一月。另外，那些穩(wěn)定制劑比沒有接觸的相同IgG抗體較少形成二聚體、聚合體、回形體、顆粒。如本發(fā)明的方法制備的所需制劑是IgG抗體(或IgG抗體片段)制劑，和沒有與本文所述的還原/氧化耦合劑和可選擇的離液劑接觸的相同IgG抗體(或IgG抗體片段)制劑相比，其粘度較低。另一根據(jù)本發(fā)明的方法制備的所需IgG抗體(或IgG抗體片段)制劑，和沒有與本文所述的還原/氧化耦合劑和選擇的離液劑接觸的同類IgG抗體(或IgG抗體片段)相比，其在循環(huán)中壽命較長。在一些實(shí)施例中，這種所需制劑在循環(huán)中的半衰期比沒有和本文所述的還原/氧化耦合劑和選擇的離液劑接觸的同類IgG抗體(或IgG抗體片段)長20％。本文所用的術(shù)語“半衰期”是藥物(例如，IgG抗體或其片段)的血漿濃度達(dá)到時(shí)間為0時(shí)的起始濃度一半所需的時(shí)間。
在另一些實(shí)施例中，IgG抗體是有至少一個(gè)自由半胱氨酸殘基的重組IgG1抗體或有至少一個(gè)自由半胱氨酸殘基的重組IgG1抗體片段。
在又一些實(shí)施例中，IgG抗體是IgG4抗體以及所述的方法減少IgG4半分子的形成。
在具體實(shí)施例中，所述的方法不包括將制劑與離液劑接觸。
還原/氧化耦合劑的pH值大約為5至10；例如，在7.6至9.6之間，或更具體地，大約8.0至8.6。
還原/氧化耦合劑包括還原的谷胱苷肽和氧化的谷胱苷肽。例如，還原的谷胱苷肽與氧化的谷胱苷肽比例為大約1∶1至100∶1。在另一些實(shí)施例中，還原/氧化耦合劑包括半胱氨酸/胱氨酸。例如，半胱氨酸/胱氨酸包括大約0.1mM至10mM半胱氨酸。在又一些實(shí)施例中，氧化還原耦合劑包括大約0.1mM至10mM胱氨酸且無外生的半胱氨酸加入。在再一些實(shí)施例中，半胱氨酸/胱氨酸以半胱氨酸胱氨酸比例大約為1∶1至10∶1存在。在還一些實(shí)施例中，半胱氨酸/胱氨酸包括大約6mM半胱氨酸和1mM胱氨酸。在另一些其它實(shí)施例中，半胱氨酸/胱氨酸包括大約6mM半胱氨酸和6mM胱氨酸。
所述的方法可包括至少進(jìn)行30分鐘的接觸步驟。在另一些實(shí)施例中，接觸步驟至少進(jìn)行4至48小時(shí)。
在一些具體實(shí)施例中，重組IgG抗體從培養(yǎng)基中純化，接觸之前該抗體就已經(jīng)分泌在培養(yǎng)基中。在另一些實(shí)施例中，接觸發(fā)生在重組IgG抗體處于培養(yǎng)基中時(shí)，抗體已經(jīng)分泌在培養(yǎng)基中。在又一些實(shí)施例中，重組IgG抗體從培養(yǎng)基中部分純化，抗體已分泌在培養(yǎng)基中，例如，在接觸之前細(xì)胞和其它顆粒物質(zhì)已經(jīng)從培養(yǎng)基中去除。
在一些具體實(shí)施例中，本發(fā)明的方法包括將重組IgG抗體與還原/氧化耦合劑接觸的多個(gè)步驟。
在一些具體實(shí)施例中，本發(fā)明的方法包括使IgG抗體從一種方法中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基中分離，所述的方法包括培養(yǎng)在培養(yǎng)基中表達(dá)和分泌IgG抗體或IgG抗體片段的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；在pH值大約為5至11下，加入還原/氧化耦合劑，以及在細(xì)胞中分泌抗體時(shí)可選擇地包括離液劑。這種分離可包括一步或多步層析步驟。
本發(fā)明的方法在培養(yǎng)基或其它含有濃度大約為1mg/ml至50mg/ml的重組IgG抗體制劑中進(jìn)行。
本發(fā)明的方法是這樣的，接觸生成的IgG抗體比沒有接觸的相同IgG抗體貯存更穩(wěn)定。本發(fā)明的方法還是，接觸生成的IgG抗體比沒有接觸的相同IgG抗體熱穩(wěn)定性更好。在另一些實(shí)施例中，接觸生成的IgG抗體比沒有接觸的相同IgG抗體結(jié)晶特性改進(jìn)。本文所用的術(shù)語結(jié)晶特性指晶體生長、形態(tài)學(xué)、大小、均勻、晶體產(chǎn)量、晶體懸浮能力或IgG晶體易于制備成藥物組合物的其它特性。晶體較佳用于溶液中，可單獨(dú)使用或與藥學(xué)上可接受的輔佐劑、稀釋劑或賦形劑聯(lián)合使用。
與還原/氧化耦合劑(以及選擇地離液劑)的接觸生成IgG抗體族群比沒有接觸的相同IgG抗體同種性更高。在另一些方面，接觸生成的IgG抗體與沒有接觸的相同IgG抗體相比，其生物活性增加2倍。在一些具體實(shí)施例中，所述的方法預(yù)期將IgG抗體在與接觸還原/氧化耦合劑之前、之后或同時(shí)與離液劑接觸。離液劑可選自由如下組成的組脲、精氨酸、SDS和鹽酸胍。在一較佳實(shí)施例中，離液劑包括鹽酸胍。
在一些實(shí)施例中，鹽酸胍的濃度大約為0.1M至1.5M。在另一些實(shí)施例中，鹽酸胍的濃度大約為0.1M至1M。在一具體實(shí)施例中，鹽酸胍的濃度大約為0.5M。在另一些具體實(shí)施例中，鹽酸胍的濃度大約為0.9M。
在一些具體實(shí)施例中，與還原/氧化耦合劑接觸以及進(jìn)一步與離液劑接觸生成的IgG抗體與沒有接觸的相同IgG抗體相比，生物活性至少增高3倍。
本發(fā)明的方法也包括將所述方法生成的IgG抗體調(diào)配成消毒原料型。在另一些實(shí)施例中，本發(fā)明的方法還包括將所述方法生成的IgG抗體調(diào)配成消毒單位劑量型。在又一些實(shí)施例中，所述方法包括將有所需再折疊構(gòu)象的接觸IgG抗體片段分離出來。這個(gè)分離步驟選自由如下組成的組反相層析HPLC、尺寸排阻層析、離子交換層析、疏水作用層析、親和層析和電泳。在一些具體實(shí)施例中，該分離步驟是離子交換層析。
本文也包括根據(jù)本文所述的方法制備的IgG抗體制劑，所述的制劑有IgG抗體的同種族群。所述的制劑還包括藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
包括IgG抗體的同種族群和藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑的組合物也包括在內(nèi)。所述組合物可包含IgG1抗體、IgG2抗體、IgG4抗體或IgG1、IgG2或IgG4的IgG單體，IgG1、IgG2或IgG4的IgG多聚體，IgG1、IgG2或IgG4的IgG半分子或這些IgG分子的其它片段。用這種同種族群處理個(gè)體的方法也包括在內(nèi)。在所述的方法中，給藥方法可以是如，皮下或靜脈內(nèi)給藥。
在包括如下步驟的制造、調(diào)配和/或貯存過程中重組IgG抗體的質(zhì)量檢測(cè)或監(jiān)控方法也包括在內(nèi)a)使由哺乳動(dòng)物細(xì)胞重組制備的IgG制劑在pH值大約為5至11下與還原/氧化耦合劑接觸，以及在與還原/氧化耦合劑接觸之前、之后或同時(shí)可選擇地進(jìn)一步將制劑與離液劑接觸；
b)將經(jīng)步驟a)處理過的IgG分子切成片段；和c)使完整的IgG和/或從步驟b)得到的片段進(jìn)行層析分析，并進(jìn)行IgG分子質(zhì)量的檢測(cè)或監(jiān)控。
在這些方法中，IgG抗體是IgG1抗體并且質(zhì)量監(jiān)控包括監(jiān)控IgG1抗體中的自由或不成對(duì)半胱氨酸狀態(tài)。
在另一些這樣的方法中，IgG抗體是IgG2抗體并且質(zhì)量監(jiān)控包括監(jiān)控IgG2型的數(shù)量以測(cè)定制劑的異質(zhì)性。
在又一些這樣的方法中，IgG分子是IgG4分子并且質(zhì)量監(jiān)控包括監(jiān)控IgG4半分子的出現(xiàn)。
在一些方面，層析包括LC/MS分析。
在一些具體方面，檢測(cè)或監(jiān)控在IgG分子的純化步驟中進(jìn)行，所述的純化包括柱層析。
本發(fā)明也提供了重組IgG抗體或IgG抗體片段的制備方法，其包括使由哺乳動(dòng)物細(xì)胞重組生成的IgG抗體或IgG抗體片段在pH值大約為5至11下與還原/氧化耦合劑接觸；以及在與還原/氧化耦合劑接觸之前、之后或同時(shí)，可選擇地進(jìn)一步使IgG抗體或IgG抗體片段與離液劑接觸；在一些實(shí)施例中，在這些方法之前，以一種方法使IgG抗體或IgG抗體片段從哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基中分離，所述的方法包括培養(yǎng)在培養(yǎng)基中表達(dá)和分泌IgG抗體或IgG抗體片段的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；在pH值大約為5至11下加入還原/氧化耦合劑以及在細(xì)胞中分泌抗體時(shí)可選擇地包含離液劑。
可以理解為，重組IgG抗體可以是IgG1、IgG2或IgG4。
本發(fā)明的方法通過本文所述的再折疊方法和重組結(jié)晶型IgG抗體制備提供完整重組結(jié)晶型IgG抗體制劑。在一些實(shí)施例中，制備這些晶體之前，所述的方法包括分離根據(jù)本文所述方法制備的重組IgG抗體。
在一些具體實(shí)施例中，重組IgG抗體加入層析柱的固定相，而氧化還原劑和離液劑是流動(dòng)相的一部分。在另一些實(shí)施例中，還原/氧化耦合劑是酶。在又一些實(shí)施例中，還原/氧化耦合劑包括二價(jià)金屬離子和氧。
本文還描述了IgG抗體制劑的制備方法，該方法包括將哺乳動(dòng)物細(xì)胞重組生成的分離IgG制劑在pH值大約為5至11下與還原/氧化耦合劑接觸；以及在與還原/氧化耦合劑接觸之前、之后或同時(shí)將該制劑可選擇地進(jìn)一步使之經(jīng)受高壓變性。
本發(fā)明包括IgG抗體或其片段的制備方法，該方法包括培養(yǎng)在培養(yǎng)基中表達(dá)和分泌IgG抗體或IgG抗體片段的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；在pH值大約為5至11下加入還原/氧化耦合劑，以及在細(xì)胞中分泌抗體時(shí)可選擇地包含離液劑；并且因此生成的IgG抗體或其片段與沒有接觸還原/氧化耦合劑或選擇地接觸離液劑的相同IgG抗體或其片段相比，其藥學(xué)和結(jié)晶特性均有提高。
本文所述的是在以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為基礎(chǔ)制備重組IgG抗體或重組IgG抗體片段的方法中的提高，所述的提高包括在IgG抗體或IgG抗體片段制備用的培養(yǎng)基中加入pH值為5至11的還原/氧化耦合劑；以及在IgG抗體或IgG抗體片段分泌至培養(yǎng)基后可選擇地加入離液劑。
通過以下的詳細(xì)敘述，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)明顯看到。然而，應(yīng)當(dāng)認(rèn)為，本文的詳述和具體例子只是本發(fā)明的一些實(shí)施例，僅僅是以舉例方式給出，因?yàn)閺谋疚牡脑敿?xì)敘述來看在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變型和改型對(duì)本領(lǐng)域有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員來說是顯而易見的。
附圖簡述以下附圖是本說明書的一部分，并包括在本發(fā)明的進(jìn)一步說明方面內(nèi)。在參考本文具體實(shí)施例的所附圖例并結(jié)合具體實(shí)施例的詳細(xì)說明，本發(fā)明將得到充分理解。


圖1所示為作為IgG1和IgG2形態(tài)有相同CDR的兩種重組人單克隆抗體的RP-層析譜。這兩種分子之間有95％的氨基酸相同，但根據(jù)所述抗體是否是IgG1或IgG2抗體而在抗體制劑的同質(zhì)性上有顯著不同。
圖2所示為(A)總IgG2樣品的陽離子交換CEX和(B)相同總IgG2樣品和收集的CEX片段的反相層析。
圖3A所示為用在UV215nm的吸收值和質(zhì)譜儀的總離子電流(TOC)檢測(cè)的IgG2的反相層析譜。3B所示為從RP柱洗脫的圖3A的峰1、2、3和4的IgG2結(jié)構(gòu)變異體電噴霧電離質(zhì)譜圖。
圖4所示為人IgG抗體的4個(gè)亞類。選自Kuby第4章，免疫球蛋白結(jié)構(gòu)和功能。
圖5所示為推測(cè)的IgG1和IgG4結(jié)構(gòu)。注意到IgG4的結(jié)構(gòu)比IgG1的結(jié)構(gòu)更致密。
圖6所示為嵌合的IgG1、2、3和4抗體的沉降數(shù)據(jù)(選自Phillips等人，Mol.Immunol.，v.31，p.1201-1210，1994)。Phillips等人的圖注注意到這個(gè)圖所示為在含有或不含二-丹酰1，5-戊二胺的情況下包括不同人免疫球蛋白亞類區(qū)域的嵌合免疫球蛋白沉降。(A)在沒有二價(jià)半抗原的情況下免疫球蛋白整體掃描。離心條件IgG1 20℃，52000rpm連續(xù)整體掃描(280nm)，間隔12min；IgG2 21.7℃，52000rpm連續(xù)整體掃描，間隔8min；IgG3 21.6℃，52000rpm連續(xù)整體掃描，間隔8min；IgG4 20.7℃，52000rpm連續(xù)整體掃描，間隔8min。(B)在含有克分子數(shù)相等的二-丹酰1，5-戊二胺的情況下免疫球蛋白整體掃描。離心條件IgG121.7℃，42000rpm，間隔12min；IgG2 21.4℃，44000rpm，間隔8min；IgG3 21.7℃，44000rpm，間隔12min；IgG4 21.7℃，44000rpm，間隔12min。(C)在不含(-)或含有(+)克分子數(shù)相等的二-丹酰1，5-戊二胺的情況下不同亞類的沉降系數(shù)分布(擴(kuò)散不正確)。
圖7所示為與推測(cè)的IgG2抗體結(jié)構(gòu)相比的IgG1抗體結(jié)構(gòu)。
圖8所示為兩種再折疊的IgG2抗體的RP-層析譜。注意到在0.89M變性鹽酸胍的存在下再折疊的天然型和再折疊型與目前生成的IgG2原料剖面圖排列。當(dāng)四種不同的IgG2抗體再折疊時(shí)，可見到半胱氨酸/胱氨酸在室溫下作用48小時(shí)生成的單一峰的相似模式，在半胱氨酸/胱氨酸參與下，室溫下用鹽酸胍作用48小時(shí)也生成單一峰，在用半胱氨酸/胱氨酸單獨(dú)作用所生成的峰之后洗脫出來，而沒有半胱氨酸/胱氨酸處理所產(chǎn)生的異種混合物與IgG2制劑聯(lián)合有多個(gè)峰。
圖9所示為實(shí)施例9的完整IgG1的RP-層析譜。
圖10所示為實(shí)施例4的完整IgG1解卷電噴霧電離質(zhì)譜圖。
圖11所示為實(shí)施例1的IgG1在Lys-C限制性蛋白水解后的RP-層析譜。
圖12所示為圖11的峰1、2和3的解卷ESI質(zhì)譜圖。
圖13所示為圖11中RP-層析譜的峰5和7的解卷ESI質(zhì)譜圖。
圖14所示為實(shí)施例4的IgG1樣品在限制性蛋白水解后的RP-層析譜。
圖15所示為在圖14中標(biāo)記和未標(biāo)記的實(shí)施例4的IgG1的Fab峰的解卷質(zhì)譜圖。
圖16所示為實(shí)施例4的應(yīng)激和對(duì)照完整IgG1的層析譜。
圖17所示為45℃下在A5S緩沖液中培育一個(gè)月的IgG1樣品中發(fā)現(xiàn)的回形體示意圖。
圖18所示為與Lys-C蛋白酶限制性蛋白水解后通過反相層析進(jìn)行的各種IgG1分子對(duì)比。
圖19所示為完整IgG1對(duì)照和天然再折疊樣品在24小時(shí)再折疊后的CEX層析譜。
圖20所示為完整IgG1CHO對(duì)照、天然再折疊和GuHCL再折疊樣品在24小時(shí)培育后的RP層析譜。
圖21所示為IgG1原料在RP層析分離后的峰1(A)和峰2(B)的ESI質(zhì)譜圖。峰1(C)和峰2(D)的解卷ESI質(zhì)譜圖。
圖22所示為IgG1CHO原料(A)、GuHCL再折疊(B)和天然再折疊(僅加入氧化/還原耦合劑)(C)的解卷ESI質(zhì)譜圖。
圖23所示為用Lys-C蛋白酶限制性蛋白水解生成Fc片段，MW＝53488Da和兩個(gè)Fab片段，每個(gè)片段MW＝47282的示意圖。
圖24所示為IgG1CHO經(jīng)Lys-C蛋白酶限制性蛋白水解的RP層析譜對(duì)照(原料)樣品、GuHCL再折疊樣品和天然再折疊樣品。
圖25所示為25IgG1CHO經(jīng)Lys-C蛋白酶限制性蛋白水解后Fab片段的解卷ESI質(zhì)譜圖(A)對(duì)照(原料)樣品；(B)GuHCL再折疊樣品和(C)天然再折疊樣品。
圖26所示為IgG1CHO的Glu-C肽圖(A)原料和(B)天然再折疊。
圖27所示為27IgG1的尺寸排阻層析譜CHO原料、雜種瘤原料和CHO再折疊。
圖28所示為IgG1的CD和熒光測(cè)量CHO原料、雜種瘤原料和CHO再折疊。
圖29所示為IgG1雜種瘤和CHO在限制性蛋白水解后的反相層析譜。分離和定量半胱氨?；?Fab-Cys)和未半胱氨?；?Fab)片段。
圖30所示為IgG1雜種瘤和CHO在限制性蛋白水解之前和之后的反相層析譜。分離和定量半胱氨?；?Fab-Cys)和未半胱氨?；?Fab)片段。
圖3 1所示為用在pH值為5的NEM標(biāo)記自由半胱氨酸后的胰島素處理的IgG1的未還原肽圖。經(jīng)鑒定半胱氨?；稽c(diǎn)在重鏈的C104。
圖32所示為在HC CDR2區(qū)域蛋氨酸48氧化鑒定。根據(jù)未還原肽圖，只有小部分在HC CDR2的M48氧化。
圖33所示為IgG1未還原肽圖的重組離子層析譜(上)和斷片質(zhì)譜圖(底部)，用MS/MS分析顯示在HC CDR2區(qū)域蛋氨酸48氧化鑒定。大約10％的蛋氨酸48被氧化。氧化的肽在98分鐘時(shí)洗脫，未氧化的肽在110分鐘時(shí)洗脫。
圖34所示為IgG1在氧化還原處理或再折疊之前和之后的差示掃描量熱法(DSC)測(cè)量。
圖35所示為有或沒有氧化還原處理的細(xì)胞培養(yǎng)基中純化IgG1的A蛋白親和柱SEC-HPLC層析譜。
圖36所示為在360nm處的熒光發(fā)射監(jiān)測(cè)的原料和氧化還原處理的CHO146B7IgG1抗體的GdnHCL平衡變性。如在0.7MGdnHCL的Cm值移動(dòng)所示，氧化還原處理的146B7IgG1抗體對(duì)化學(xué)變性劑更穩(wěn)定。劃線是為了指導(dǎo)觀察而不代表數(shù)據(jù)。
圖37所示為用于原料和氧化還原處理的146B7IgG1抗體對(duì)照研究的尺寸排阻層析(SEC)數(shù)據(jù)。圖A是貯存溫度為-80、4、29、37和45℃時(shí)主峰單體種類百分比下降的三個(gè)月數(shù)據(jù)。圖B是貯存溫度為-80、4、29、37和45℃時(shí)前單體聚集種類百分比下降的三個(gè)月數(shù)據(jù)。
圖38所示為IgG1、IgG2和IgG4形態(tài)的有相同CDR的三種抗體反相(RP)層析譜。因之前報(bào)道的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性，IgG2抗體顯示多個(gè)峰。IgG4也有結(jié)構(gòu)異質(zhì)性。在變性PR條件下，半分子(1/2IgG4)從共價(jià)結(jié)合的IgG4分子(IgG4)中分離。
圖39所示為IgG4半分子(A)和共價(jià)結(jié)合IgG4(B)的電噴霧電離(ESI)質(zhì)譜。IgG4半分子(C)和共價(jià)結(jié)合IgG4(D)的解卷ESI質(zhì)譜。精確質(zhì)量測(cè)量顯示1/2 IgG4(73398Da)質(zhì)量恰好是IgG4(146796Da)的一半，表明二硫鍵移動(dòng)導(dǎo)致半分子形成。在此測(cè)定中經(jīng)實(shí)驗(yàn)觀察到，從分子間到分子中的二硫鍵移動(dòng)理論上生成恰好質(zhì)量為一半的半分子。
圖40所示為在以下條件下形成的IgG2晶體照片50mg/mL IgG2，50mM氯化鉀pH值為2.0，20％的PEG3350。
圖41所示為在以下條件下形成的IgG2晶體照片50mg/mL IgG2，50mM氯化鉀pH值為2.0，24％的PEG3350。
圖42所示為在以下條件下形成的IgG2晶體照片50mg/mL IgG2，50mMMES pH值為6.0，20％的PEG3350。
圖43所示為IgG1和IgG2抗體示意圖。IgG2抗體有單獨(dú)的輕鏈附著和在鉸鏈區(qū)有兩個(gè)額外的鏈間二硫鍵。顏色代碼綠色＝重鏈(HC)；藍(lán)色＝輕鏈(LC)；黃色點(diǎn)狀線＝內(nèi)部二硫鍵；紅色＝鏈間二硫鍵；帶箭頭的紅色菱形＝易于不規(guī)則的半胱氨酸殘基。
圖44所示為完整IgG抗體的RP-HPLC剖面圖。根據(jù)這個(gè)方法IgG的兩個(gè)亞類顯示顯著不同的剖面圖。購自Sigma的人純化IgG2與所有Amgen的IgG2顯示出相同的異種剖面圖。
圖45所示為A)抗IL-1RIgG2抗體的反相層析譜。B)作為峰1、2、3和4從反相柱洗脫的多個(gè)異構(gòu)體的解卷電噴霧電離質(zhì)譜。4個(gè)峰的MW值是147256、147253、147254、147261Da。
圖46所示為IgG2抗體在還原和烷化之前A)和之后B)的反相層析譜。二硫鍵還原后輕鏈(LC)和重鏈(HC)作為單獨(dú)的峰洗脫出來。
圖47所示為抗IL-1R IgG2抗體、天然氧化還原(型1)和GuHCl氧化還原(型3)材料的生物測(cè)定曲線?？煽吹窖趸脑僬郫B材料生物活性有顯著不同。這些測(cè)定在三天內(nèi)重復(fù)，因此有可靠的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
圖48所示為與IgG2抗體相同的氧化再折疊條件處理的其它IgG2抗體的反相層析譜。通過RP-HPLC顯示出所有IgG2抗體顯著不同，與之前的IgG2抗體再折疊實(shí)驗(yàn)一致。
圖49所示為用進(jìn)入1HZH的PDB坐標(biāo)繪制的人單克隆IgG1抗體鉸鏈區(qū)的晶體結(jié)構(gòu)。顏色代碼藍(lán)色是鉸鏈區(qū)的重鏈(HC)；紅色是包括殘基S131的重鏈環(huán)；綠色是輕鏈(LC)。加入點(diǎn)狀線估計(jì)兩個(gè)變形區(qū)的位置，其坐標(biāo)因其可變性，不能由晶體學(xué)測(cè)定在S127和T137之間的HC環(huán)含有殘基S131(紅色點(diǎn)狀線)和該HC在C217和C226之間的鉸鏈區(qū)的部分(藍(lán)色點(diǎn)狀線)。
圖50所示為顯示在不同水平的GuHCl參與下對(duì)IgG2(抗IL-1R)進(jìn)行氧化還原處理的影響的反相層析譜。
圖51所示為顯示在不同水平的精氨酸HCl參與下對(duì)IgG2(抗IL-1R)進(jìn)行氧化還原處理的影響的反相層析譜。
圖52所示為顯示對(duì)IgG2(抗IL-1R)進(jìn)行氧化還原處理過程中培育溫度的影響的反相層析譜。
具體實(shí)施例方式
包函體狀態(tài)的蛋白質(zhì)氧化再折疊是重組蛋白質(zhì)原核制備的一般方法，但是，通常不在重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)的真核細(xì)胞制備方法中使用。這是因?yàn)檎婧思?xì)胞被認(rèn)為含有足以使重組生成的蛋白質(zhì)可以正確再折疊的細(xì)胞器。然而，如Dillon等人2004年2月27日申請(qǐng)的US60/548302和Bondarenko等人2004年1月23日申請(qǐng)的60/538982的專利申請(qǐng)(本文將每個(gè)申請(qǐng)的全文都合并納入?yún)⒖?所述，最近RP-HPLC分離檢測(cè)技術(shù)的提高顯示之前認(rèn)為是同種的重組生成的高分子量蛋白質(zhì)存在顯著構(gòu)象異質(zhì)性。如前述申請(qǐng)中所討論，異質(zhì)性特性至少部分是因?yàn)槎蜴I的不規(guī)則性。
對(duì)IgG分子的結(jié)構(gòu)和功能的興趣最近在蛋白質(zhì)藥學(xué)工業(yè)領(lǐng)域開始復(fù)蘇。因?yàn)樵谘h(huán)中IgG1和IgG2亞類是最多、維持時(shí)間長并且穩(wěn)定的免疫球蛋白，所以引起特別關(guān)注。本發(fā)明直接提出了需要更多結(jié)構(gòu)上同種的重組蛋白質(zhì)制備方法，更具體地說，重組蛋白質(zhì)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的重組IgG抗體，IgG抗體具體是指活性提高的IgG1、IgG2和IgG4治療性抗體。
幾個(gè)之前的報(bào)道提出，與γ球蛋白其它亞類相比，IgG2分子含有自由硫醇基團(tuán)且結(jié)構(gòu)上異種。在某篇報(bào)道中，所有四種人類IgG抗體的自由硫醇基團(tuán)含量通過與5，5’-二硫代(2，2’-二硝基)苯甲酸酯(DTNB)反應(yīng)測(cè)定(Schauenstein等人1986Int.Arch.Allergy Immunol.，v.80，p.174-179)。暴露的自由硫醇類(每摩爾人IgG大約0.24)被指定為IgG2亞類。也有其它報(bào)道稱，所有四種人類IgG亞類用有硫氧還蛋白還原酶下的硫氧還蛋白和NADPH進(jìn)行鏈間二硫鍵還原。IgG2被發(fā)現(xiàn)在這兩個(gè)效應(yīng)上與其它亞類不同1)免疫還原作用和2)消耗的NADPH試劑。后者表明該試劑通過不穩(wěn)定的鏈間或表面暴露的混合二硫化物還原而消耗。在又一個(gè)研究中，在匯總的人γ球蛋白和幾個(gè)正常血清中檢測(cè)到IgG2的共價(jià)二聚體(Yoo等人，2003，J.Immunol.，v.170，p.3134-3138)。所述二聚體的溴化氰切割分析表明，二聚體的裝配涉及鉸鏈區(qū)的一個(gè)或以上半胱氨酸殘基，還表明，在IgG2鉸鏈區(qū)的自由或不穩(wěn)定半胱氨酸也參與其中。Phillips等人(Mol.Immun.，v.31，p.1201-1210，1994)的研究表明，用沉降和電子顯微鏡分析，鑒定出IgG2分子的多種形態(tài)及其與二價(jià)半抗原復(fù)合物和人γ球蛋白的其它三種亞類的單一形式。
據(jù)近期報(bào)道，確定出超過200個(gè)抗體片段結(jié)構(gòu)，主要是Fab和Fab’(Saphire等人，2002，J.Mol.Biol.，v.319，p.9-18)。完整IgG抗體的晶體僅報(bào)道過十次，并且這些晶體中只有僅僅七個(gè)提供部分或完全的結(jié)構(gòu)。所有這些結(jié)構(gòu)是鼠科IgG或人IgG1抗體，而不是人IgG2抗體(Saphire等人，2002，J.Mol.Biol.，v.319，p.9-18)。全長鉸鏈區(qū)IgG的完整結(jié)構(gòu)僅僅報(bào)道過三次mAb 231，一種鼠科IgG2a(Harris等人，1992，Nature，v.360，p.369-372；Larson等人，1991，J.Mol.Biol.，v.222，p.17-19)；mAb 61.1.3，一種鼠科IgG1(Harris等人，1998，J.Mol.Biol.，v.275，p.861-872)；和直接抗HIV-1 gp120的人IgG1 b12(Saphire等人，2001，Science，v.293，p.1155-1159；Saphire等人，2002，J.Mol.Biol.，v.319，p.9-18)。人們可以獲得靠近鉸鏈區(qū)源自第1HZH號(hào)蛋白數(shù)據(jù)庫(PDB)的人IgG1抗體晶體圖片段(Saphire等人，2001，Science，v.293，p.1155-1159)。實(shí)際上，還沒有得到人IgG2的晶體結(jié)構(gòu)，留下二硫化物連接的問題沒有解決，也表明這個(gè)IgG亞類可能是異種的，使結(jié)晶變得困難。也需要結(jié)構(gòu)分析的新方法。發(fā)明人使用他們新發(fā)展的完整抗體分析方法，通過聯(lián)機(jī)反相層析與質(zhì)譜法使人IgG2抗體的異質(zhì)性發(fā)現(xiàn)和特征表現(xiàn)變得容易(Dillon等人，2004，J.Chromatogr.A，v.1053，p.299-305)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的重組IgG2抗體有顯著構(gòu)象異質(zhì)性，發(fā)明人發(fā)展了一種再折疊方法使該蛋白質(zhì)的兩種形式增多，如本文的實(shí)施例1-3所述。添加物的影響如GndHCl、谷胱甘肽、L-精氨酸對(duì)單鏈免疫球蛋白-折疊的蛋白質(zhì)再折疊，在(Umetsu等人，2003，J.Biol.Chem.，v.278，p.8979-8987)中有討論。1MGndHCl緩沖液中自發(fā)再折疊導(dǎo)致結(jié)構(gòu)中形成正確的二硫鍵；然而，添加L-精氨酸導(dǎo)致沒有二硫鍵的部分折疊中間物形成(Umetsu等人，2003，J.Biol.Chem.，v.278，p.8979-8987)。
在另一具體實(shí)施例中，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)如公布的US2003/0138421所述的抗IL-15的抗體之一，即146B7含有不成對(duì)的半胱氨酸殘基。具體地說，146B7在CDR3重鏈的104位置有一自由半胱氨酸。這個(gè)自由半胱氨酸可以是共價(jià)二聚的來源，并在調(diào)配或貯存時(shí)會(huì)出現(xiàn)穩(wěn)定性問題。這種殘基分不清的出現(xiàn)試圖得出所述重組IgG1的單一活性樣品。氧化還原劑的加入使同種結(jié)構(gòu)并且活性增加的這種IgG1分子生產(chǎn)變得容易。氧化還原劑結(jié)合離液劑的加入使再折疊型IgG1分子的生產(chǎn)變得容易，并且與沒有經(jīng)過氧化還原劑和離液劑處理的相同分子相比更加均一。
如實(shí)施例9所討論，本發(fā)明的方法也用于制備均一完整的IgG4分子。因?yàn)镮gG4不激活補(bǔ)體，有IgG4分子的抗原-抗體-補(bǔ)體復(fù)合物導(dǎo)致免疫原性反應(yīng)和炎癥機(jī)會(huì)非常小。這使得IgG4成為一種非常有吸引力的治療用候選藥物，因?yàn)樗鼘⑹且环N安全的治療形態(tài)IgG4應(yīng)該僅僅與抗原結(jié)合并且在人體內(nèi)不激起任何其它反應(yīng)。
基于IgG4的反應(yīng)因?qū)σ韵路磻?yīng)而生成，如，塵埃、菁草花粉或蜂螫的抗原。這些抗原通?？上?yàn)闆]有明顯免疫反應(yīng)和炎癥。另外，因?yàn)镮gG4鉸鏈區(qū)的單一結(jié)構(gòu)，這類IgG作為完整分子和半分子的混合物出現(xiàn)?？勺⒁獾剑跊]有任何作用的具體理論或機(jī)制支持下，IgG4半分子的出現(xiàn)對(duì)IgG4組分作為治療組合物發(fā)展有害。所述的半分子有潛在問題，因?yàn)樗鼈兡茉趦蓚€(gè)不同的IgG4分子之間互換。在這種情況下，生成一個(gè)IgG4分子，將兩個(gè)抗原一起結(jié)合在兩個(gè)半分子(臂)上。這樣的IgG4是雙功能抗體并且是單價(jià)的。這種IgG4的雙功能和單價(jià)特性使得雜合IgG4分子作為治療劑有潛在的不安全性。例如，治療性IgG4可有目的地與關(guān)節(jié)炎相關(guān)的受體結(jié)合。如果其它IgG4半分子出現(xiàn)在注射部位或整個(gè)人體，可導(dǎo)致既與受體結(jié)合又與花粉抗原結(jié)合的雙功能IgG4。這可導(dǎo)致免疫反應(yīng)和炎癥。本發(fā)明提供IgG4組分的再折疊方法。這種再折疊用于消除通常與完整IgG4分子一起出現(xiàn)的IgG4半分子。
在本發(fā)明的一些方面，也包括直接向真核細(xì)胞生長的發(fā)酵培養(yǎng)基加入和優(yōu)化氧化還原組分和/或離液劑以便得到適合的氧化還原勢(shì)對(duì)分泌到培養(yǎng)基中的IgG(即，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)產(chǎn)物進(jìn)行再折疊。因此，培養(yǎng)基用如半胱氨酸、胱氨酸、胱胺、谷胱甘肽、銅和/或其它還原/氧化劑等組分補(bǔ)充或優(yōu)化，以取得適合的氧化還原勢(shì)。氧化還原成分優(yōu)化可通過變換發(fā)酵培養(yǎng)基中的組分得到。分泌的IgG產(chǎn)物異質(zhì)性用HPLC/MS法或任何其它可得到關(guān)于分離組合物異質(zhì)性信息的蛋白質(zhì)分離技術(shù)評(píng)估。提供更多均一同種重組產(chǎn)物的氧化還原劑和/或離液劑因此可即時(shí)鑒別。
另外，為了或者與在宿主細(xì)胞產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的發(fā)酵培養(yǎng)基中氧化還原劑的包含物相結(jié)合，可加入一單獨(dú)、不同的處理步驟，其中蛋白質(zhì)達(dá)到氧化再折疊。在進(jìn)一步的加工步驟中，折疊溶液可含有如鹽酸胍或脲的變性劑；如多元醇、多聚體的再折疊劑或去污劑和/或還原劑。
在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的重組抗體制備方法公知。這些方法中，抗體制備包括蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)。通過與啟動(dòng)子操作性連接，編碼IgG抗體或IgG抗體片段的核酸很容易表達(dá)，較佳是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有功能的可控制啟動(dòng)子。這種重組構(gòu)建的設(shè)計(jì)是為了IgG抗體蛋白質(zhì)在適合的宿主細(xì)胞(如，細(xì)菌、鼠科或人類)中表達(dá)。本文中蛋白質(zhì)和多肽表達(dá)中適合的啟動(dòng)子廣泛存在并在本領(lǐng)域眾所周知。較佳是連接調(diào)節(jié)區(qū)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子(如，增強(qiáng)子、操縱基因和轉(zhuǎn)錄或翻譯因子的結(jié)合區(qū))。本文的“誘導(dǎo)型”啟動(dòng)子定義為可控型啟動(dòng)子，包括通常參考為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的啟動(dòng)子(即，在不活動(dòng)時(shí)經(jīng)受正調(diào)節(jié)直到被激活劑或誘導(dǎo)劑激活或誘導(dǎo))，或去阻抑啟動(dòng)子(即，在活動(dòng)時(shí)接受負(fù)調(diào)節(jié)直到出現(xiàn)阻抑，同時(shí)去除阻抑子或去阻抑，使得啟動(dòng)子活性增加)。本文所述啟動(dòng)子包括但不限于，例如，trp、lpp、tac和lac啟動(dòng)子，如E.coli的lacUV5；桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的P10或多角體蛋白基因啟動(dòng)子(參見，如，U.S.5,243,041，5,242,687，5,266,317，4,745,051和5,169,784)和其它真核表達(dá)系統(tǒng)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如本領(lǐng)域公知。對(duì)于蛋白表達(dá)，這些啟動(dòng)子插入質(zhì)粒中，與如trp操縱子操縱基因區(qū)的控制區(qū)可操作性地連接。
較佳啟動(dòng)區(qū)是那些例如在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可誘導(dǎo)和有功能的啟動(dòng)區(qū)。細(xì)菌表達(dá)的適合的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和啟動(dòng)區(qū)的例子包括但不限于對(duì)異丙基βD硫代半乳糖呋喃糖苷(IPTG；見Nakamura等人，1979 Cell 181109-1117)有效應(yīng)的E.colilac操縱子；對(duì)重金屬(如，鋅)誘導(dǎo)有效應(yīng)的(見，如U.S.4,870,009)金屬硫蛋白啟動(dòng)子金屬-調(diào)控-組件；對(duì)IPTG(見，如U.S.4,952,496；和Studier等人，1990 Meth.Enzymol.18560-89)有效應(yīng)的噬菌體T7lac啟動(dòng)子和TAC啟動(dòng)子。根據(jù)所使用的表達(dá)宿主系統(tǒng)，載體(如質(zhì)粒、噬菌粒、粘粒、人工染色體、病毒)可選擇地包括選擇性標(biāo)記基因或在宿主細(xì)胞中有功能的基因。因此，例如，選擇性標(biāo)記基因包括在宿主細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建基因型使得轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在一定條件下，如在抗生素的環(huán)境里存活的任何基因。另外需要考慮的是載體中包含物的可篩選標(biāo)記物，即在已轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞中具有可區(qū)別表型的可篩選標(biāo)記物。用于宿主的選擇性標(biāo)記基因包括，例如，抗氨芐青霉素基因(Ampr)、抗四環(huán)素基因(Tcr)和抗卡那霉素基因(Kanr)。
在各種表達(dá)系統(tǒng)中，載體(如，質(zhì)粒)也可包括編碼操作性連接蛋白分泌的信號(hào)的DNA。適合使用的分泌信號(hào)廣泛存在并且在本領(lǐng)域公知。較佳是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有功能的真核分泌信號(hào)。對(duì)本領(lǐng)域有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員來說，各種真核分泌信號(hào)公知，且全部包括在本發(fā)明范圍內(nèi)(見，如，von Heijne，J.Mol.Biol.18499-105，1985)。在一些具體的實(shí)施例中，還包括當(dāng)重組IgG抗體或其片段的表達(dá)已經(jīng)在這些細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)時(shí)，在表達(dá)和分泌重組抗體的細(xì)胞培養(yǎng)基中加入氧化還原劑。氧化還原劑可以單劑量丸藥形式加入或以多劑量形式加入。例如在半胱氨酸/胱氨酸作為還原/氧化耦合劑的情況下，可加入每日多劑量的半胱氨酸/胱氨酸以維持半胱氨酸/胱氨酸在再折疊培養(yǎng)基中適當(dāng)?shù)牧俊?br> 在又一方面，氧化還原劑直接加入蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液以便折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)可以在溶液中再折疊并附著在生長的蛋白晶體上，使得蛋白結(jié)晶產(chǎn)量增高。結(jié)晶步驟可與通過使用已經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)基中的氧化還原劑條件再折疊處理的蛋白質(zhì)材料，和/或通過進(jìn)一步的加工步驟取得的任何改進(jìn)結(jié)合。通過分離加工步驟中或結(jié)晶溶液中蛋白質(zhì)在發(fā)酵過程中的再折疊，本發(fā)明提供藥學(xué)和晶體特性有改進(jìn)的產(chǎn)物，包括同種性、活性/效價(jià)、穩(wěn)定性、晶體生長和晶體產(chǎn)量等特性。較佳用CEX層析重組蛋白質(zhì)的這種藥學(xué)和晶體特性改進(jìn)，因?yàn)楹笠环N技術(shù)需要從總的重組蛋白質(zhì)混合物中僅收集活性成分，這使得成本增高，并且材料顯著喪失。
在本發(fā)明的另一些方面，提供人或人源化IgG抗體的制備方法，如，抗IL-15的全長人IgG1，或抗IL-1R的IgG2，該方法還包括通過重組中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞進(jìn)行IgG生產(chǎn)的再折疊步驟和獲得IgG分子的同種結(jié)構(gòu)、活性型的步驟。在IgG是IgG2的情況下，通過本文所述的HPLC剖面圖鑒定的抗體形式1、2、3和4之一的結(jié)構(gòu)同種型，以致于僅有3型生產(chǎn)或僅有1型生產(chǎn)等。在IgG是IgG1抗體的情況下，包括任何不成對(duì)自由半胱氨酸經(jīng)處理使其對(duì)二聚作用不構(gòu)成損害。如果IgG是IgG4抗體，本發(fā)明的方法提供優(yōu)于作為半分子存在的完整IgG4制劑。為了在一些實(shí)施例中取得這些有益的結(jié)果，可用半胱氨酸-胱氨酸、半胱氨酸/胱胺、谷胱苷肽、銅、分子氧和分子伴侶與不同的緩沖液、溫度和時(shí)間組合下進(jìn)行再折疊。通常再折疊條件包括例如，重組IgG分子以3-15mg/Ml的濃度在兩種緩沖液中的培育1)200mM Tris緩沖液pH 8.0(天然再折疊)；2)含有0.9MGuHCl的200mM Tris緩沖液pH 8.0(GuHCl再折疊)。以適合的摩爾比6mM∶1mM分別加入半胱氨酸∶胱氨酸組合物。樣品在2-8℃下放置48小時(shí)。在24小時(shí)和48小時(shí)取樣分析。在氧化還原劑和離液劑的參與下，用這種典型的再折疊條件進(jìn)行的重組IgG分子再折疊，可生成每克蛋白質(zhì)活性增加三倍的單一結(jié)構(gòu)型。在一些實(shí)施例中，再折疊步驟因此使IgG分子的產(chǎn)量增至三倍，并且在調(diào)配溶液中得到相同活性的所需蛋白質(zhì)濃度減少三倍。
可以理解為，本發(fā)明的方法可用于病人的蛋白質(zhì)配方制備，如IgG1，如抗IL-15的IgG1，或抗IL-R的IgG2，這種制備包括蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)純化，用本文所述的再折疊方法將純化的蛋白質(zhì)再折疊，組合物中緩沖液的交換而生成配方緩沖液和生成用于病人的單劑量配方?；蛘咴谝虼松傻慕M合物緩沖液與配方緩沖液交換而生成可用于病人的單劑量配方之后，配方制備包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞蛋白質(zhì)的生成、蛋白質(zhì)純化和本文所述的蛋白質(zhì)再折疊，以及蛋白質(zhì)所需型的分離。
本發(fā)明提供活性重組蛋白質(zhì)的回收增加方法。另外本發(fā)明還采用離液劑處理(如，例如，如SDS、鹽酸胍和脲的變性劑)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步加工。適當(dāng)再折疊的蛋白質(zhì)制備方法與下文中詳述的蛋白分離的有利LC方法結(jié)合。當(dāng)重組蛋白質(zhì)作為藥物或生物制劑在體內(nèi)使用時(shí)，本發(fā)明這些結(jié)合再折疊生產(chǎn)和蛋白質(zhì)純化方法特別有利。
LC方法的應(yīng)用使得有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員評(píng)估任何給予蛋白質(zhì)生成所需蛋白質(zhì)構(gòu)象的那些具體再折疊條件。也可使用其它純化和分離方法。
重組蛋白質(zhì)的所需構(gòu)象可有或沒有不同的二硫鍵排列，盡管該構(gòu)象較佳含有天然二硫鍵。
業(yè)已發(fā)現(xiàn)，本文所述的方法對(duì)采用多種構(gòu)象的重組IgG抗體或其片段的制備步驟形成溫和而有效的改進(jìn)方法。在一方面，本發(fā)明的方法可用于重組IgG抗體或其片段的制備，其中重組IgG抗體或其片段制劑是含有重組IgG抗體或其片段的穩(wěn)定和不穩(wěn)定構(gòu)象的異種混合物。術(shù)語“穩(wěn)定”和“不穩(wěn)定”是相對(duì)術(shù)語。當(dāng)在相同溶液中測(cè)量時(shí)，穩(wěn)定構(gòu)象，例如，比不穩(wěn)定構(gòu)象的熔點(diǎn)(Tm)高。當(dāng)在相同溶液中測(cè)量時(shí)，如果Tm的不同至少大約2℃則一構(gòu)象比另一構(gòu)象穩(wěn)定，較佳大約4℃，更佳大約7℃，更佳大約10℃，甚至更佳大約15℃，更佳大約20℃，更佳大約25℃，最佳大約30℃。
因此，在一方面，本發(fā)明包括將由重組蛋白質(zhì)的至少兩種構(gòu)象異構(gòu)體的異種混合物組成的重組蛋白質(zhì)制劑與還原/氧化耦合劑接觸足以增加所需構(gòu)象的異構(gòu)體相對(duì)比例的時(shí)間，并且測(cè)定混合物中所需構(gòu)象的異構(gòu)體的相對(duì)比例。在另一方面，本發(fā)明包括將由哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的重組蛋白質(zhì)制劑與pH值大約為7至11的還原/氧化耦合劑接觸，并且分離有所需構(gòu)象的重組蛋白質(zhì)制劑的片段。一些重組蛋白質(zhì)是糖基化重組蛋白質(zhì)如，例如，那些真核細(xì)胞生產(chǎn)的重組蛋白質(zhì)。在一些方面，本發(fā)明的方法用于減少被二硫化物擾亂所誘導(dǎo)的構(gòu)象異質(zhì)性。在更多具體方面，這種構(gòu)象異質(zhì)性存在于抗體，更具體地說，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體。應(yīng)當(dāng)注意，本文中術(shù)語“構(gòu)型”與術(shù)語“構(gòu)象”互換使用，意指二級(jí)、三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)與另一有相同初級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)(相同氨基酸序列)不同的的蛋白質(zhì)。與相同方法生成的相同蛋白質(zhì)但在氧化還原劑和/或離液劑參與的樣品相比，單獨(dú)使用氧化還原劑或與如鹽酸胍的離液劑結(jié)合使用進(jìn)一步處理，可能產(chǎn)生同種性更高、更有治療活性的IgG蛋白質(zhì)。
一般地，本發(fā)明的方法對(duì)改進(jìn)重組IgG(即IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)分子或蛋白質(zhì)的制備過程有用。重組分子或重組蛋白質(zhì)是經(jīng)遺傳工程處理的蛋白質(zhì)。術(shù)語“遺傳工程”指用于在升高或降低的水平創(chuàng)建表達(dá)基因和/或基因突變型的宿主細(xì)胞的任何重組DNA或RNA方法。換句話說，用重組核苷酸分子轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，因此引起細(xì)胞中所需蛋白質(zhì)表達(dá)的變化。基因工程細(xì)胞和/或細(xì)胞系表達(dá)感興趣的蛋白質(zhì)的方法和載體為本領(lǐng)域有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員公知；例如，在Ausubel等人的Current Protocols in Molecular Biology(Wiley&Sons，New York，1988，第四次更新)中所述的各種技術(shù)和Sambrook等人的Molecular CloningALaboratory Manual(Cold Spring Laboratory Press，1989)。遺傳工程技術(shù)包括但不限于表達(dá)載體、目的同種重組和基因激活(見，例如，U.S.5,272,071 to Chappel)和通過工程轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行的反激活(見，例如，Segal等人，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96(6)2758-63)。
在疾病、失調(diào)或病癥的治療方法中，以及除預(yù)防方法或這種疾病、失調(diào)或病癥的防止方法之外，“有效量”的重組多肽是生成所需生物或生理效應(yīng)的多肽的量，如本領(lǐng)域公知。具體關(guān)于治療方法，以及與疾病、失調(diào)或病癥相關(guān)癥狀的改善方法，“有效量”與“治療上有效量”同義。在這些方法中，“需要的研究對(duì)象”是任何動(dòng)物，如，人，其顯示有疾病、失調(diào)或病癥癥狀，有疾病、失調(diào)或病癥發(fā)展風(fēng)險(xiǎn)，或診斷為有疾病、失調(diào)或病癥。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生成并且需要適合再折疊的任何重組蛋白質(zhì)的制備改進(jìn)中的具體應(yīng)用。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明特別直接得到146B7，一種抗-IL-15的IgG1分子的制備和再折疊改進(jìn)。這種蛋白質(zhì)的異質(zhì)性是因?yàn)樵?04位置上(Cys104)不成對(duì)半胱氨酸殘基明顯還原，這是本文所述的氧化還原劑的應(yīng)用結(jié)果。這些有益結(jié)果可通過使用本領(lǐng)域眾所周知的LC和LC/MS方法來監(jiān)測(cè)這種異質(zhì)性評(píng)估。特別是由真菌細(xì)胞系統(tǒng)(如，酵母、絲狀菌)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)分泌的蛋白質(zhì)將糖基化。這些有哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)較佳調(diào)節(jié)至細(xì)胞培養(yǎng)基中生長。工業(yè)上通常使用的這些細(xì)胞的實(shí)施例是CHO，VERO，BHK，HeLa，CV1(包括Cos)，MDCK，293，3T3，骨髓瘤細(xì)胞系(特別是鼠科)，PC12和WI38細(xì)胞。宿主細(xì)胞具體較佳是中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，其廣泛應(yīng)用于幾個(gè)復(fù)合重組蛋白質(zhì)的制備，如細(xì)胞因子、凝血因子和抗體(Brasel等人，1996，Blood 882004-2012；Kaufman等人，1988，J.Biol Chem 2636352-6362；McKinnon等人，1991，J.Mol.Endocrinol 6231-239；Wood等人，1990，J.Immunol1453011-3016)。二氫葉酸還原酶(DHFR)缺乏的突變株細(xì)胞系(Urlaub等人，1980，Proc Natl Acad Sci USA 774216-4220)、DXB11和DG-44都是CHO宿主細(xì)胞系的選擇，因?yàn)橛行HFR可選擇和可擴(kuò)增的基因表達(dá)系統(tǒng)使得在這些細(xì)胞中重組蛋白表達(dá)水平較高(Kaufman R.J.，1990，Meth Enzymol 185527-566)。另外，這些細(xì)胞在貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)中容易操作，并且基因穩(wěn)定性很好。已經(jīng)廣泛鑒定在其中表達(dá)的CHO細(xì)胞和重組蛋白質(zhì)，并且被某些管理機(jī)構(gòu)認(rèn)可臨床應(yīng)用。
業(yè)已發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的方法對(duì)可采用多種構(gòu)象和/或包含多個(gè)結(jié)構(gòu)域的重組IgG(如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)分子制備方法的改進(jìn)溫和有效。“結(jié)構(gòu)域”是多肽鏈的鄰近區(qū)域，其采用特殊三級(jí)結(jié)構(gòu)和/或具有可限制在多肽鏈那個(gè)區(qū)域的特殊活性。例如，某蛋白質(zhì)的一結(jié)構(gòu)域?qū)δ撑潴w有結(jié)合親和力，這個(gè)蛋白的一結(jié)構(gòu)域?qū)α硪慌潴w也有結(jié)合親和力。在耐熱的意義上，結(jié)構(gòu)域可指蛋白質(zhì)協(xié)同未折疊單位。這些含有超過一個(gè)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)可作為蛋白質(zhì)天然形成，也可作為融合蛋白基因工程形成。另外，多肽鏈的結(jié)構(gòu)域可有亞域。
本發(fā)明的組合物和方法也用于其它類型重組IgG蛋白質(zhì)的制備，包括免疫球蛋白分子或其組分，以及嵌合抗體(如，有人恒定區(qū)耦合鼠抗原結(jié)合區(qū)的抗體)或其片段。已知很多DNA編碼蛋白分子技術(shù)可以操作以產(chǎn)生能夠編碼重組蛋白質(zhì)的DNA，這些重組蛋白質(zhì)如單鏈抗體、具有增強(qiáng)親和力的抗體或其它基于抗體的多肽(見，例如，Larrick等人，1989，Biotechnology 7934-938；Reichmann等人，1988，Nature 332323-327；Roberts等人，1987，Nature 328731-734；Verhoeyen等人，1988，Science 2391534-1536；Chaudhary等人，1989，Nature 339394-397)。全長人抗體制劑(如，用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和選擇地進(jìn)一步在體外改型進(jìn)行制備)和人源化抗體制劑也適用于本發(fā)明。術(shù)語人源化抗體也包括單鏈抗體。參見，如，Cabilly等人，U.S.4,816,567；Cabilly等人，歐洲專利0,125,023 B1；Boss等人，U.S.4,816,397；Boss等人，歐洲專利0,120,694 B1；Neuberger，M.S.等人，WO 86/01533；Neuberger，M.S.等人，歐洲專利0,194,276 B1；Winter，U.S.5,225,539；Winter，歐洲專利0,239,400 B1；Queen等人，歐洲專利0 451 216 B1；和Padlan，E.A.等人，EP 0 519 596 A1。本發(fā)明的方法也可在制備包括抗體和細(xì)胞毒性物質(zhì)或發(fā)光物質(zhì)的偶聯(lián)物中應(yīng)用。這些物質(zhì)包括美登素衍生物(如DM1)；腸毒素(如葡萄球菌腸毒素)；碘同位素(如碘-125)；锝同位素(如Tc-99m)；花菁熒光染料(如Cy5.5.18)；和核糖體-失活蛋白質(zhì)(如保加寧(bouganin)，多花白樹抑制劑(gelonin)或皂草素-S6)。
各種融合蛋白制劑也可用本發(fā)明的方法制備。這些融合蛋白的例子包括與重組IgG(即，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)分子一部分融合表達(dá)的蛋白，作為具有拉鏈?zhǔn)浇M分的融合蛋白表達(dá)的蛋白質(zhì)和新型多功能蛋白質(zhì)如細(xì)胞因子和生長因子的融合蛋白(即GM-CSF和IL-3、MGF和IL-3)。WO 93/08207和WO 96/40918敘述了稱為CD40L的分子的各種可溶寡聚形式，分別包括免疫球蛋白融合蛋白和拉鏈結(jié)構(gòu)融合蛋白；其中所討論的技術(shù)可在其它蛋白質(zhì)上應(yīng)用。以上任何分子可表達(dá)為融合蛋白，其包括但不限于細(xì)胞受體分子的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、酶、激素、細(xì)胞因子、免疫球蛋白分子的一部分、拉鏈結(jié)構(gòu)域和抗原決定部位。
重組蛋白質(zhì)制劑較佳通過用本文所述的氧化還原劑在細(xì)胞培養(yǎng)基中得到。重組蛋白質(zhì)通過細(xì)胞在其中培養(yǎng)和之后的純化而生成。重組蛋白質(zhì)制劑可以是細(xì)胞培養(yǎng)上清液、細(xì)胞萃取，但較佳是從其中部分純化的分餾物。“部分純化”意指一些已經(jīng)進(jìn)行的分餾步驟，但存在比所需蛋白質(zhì)活蛋白質(zhì)構(gòu)象更多的多肽種類(至少10％)。本發(fā)明的方法的優(yōu)點(diǎn)之一是重組蛋白質(zhì)制劑濃度可以很高。一些濃度范圍為0.1至20mg/ml，較佳為0.5至15mg/ml，更佳為1至10mg/ml。
重組蛋白質(zhì)制劑可在適合表達(dá)多肽的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞，在本文所述的氧化還原劑的參與下開始制備。多肽也可表達(dá)為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的產(chǎn)物，如，轉(zhuǎn)基因牛、山羊、豬或綿羊的乳成分，這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物具有含有編碼該多肽的核苷酸序列的體細(xì)胞或生殖細(xì)胞。所得到的表達(dá)蛋白質(zhì)可用任何已知方法從這些培養(yǎng)或成分中純化或部分純化(如從培養(yǎng)基或萃取液或體液中)。包括但不限于本文所用的一步或多步過濾、沉淀、相分離、親和層析、凝膠過濾、離子交換層析、疏水作用層析(HIC；用如苯基酯、丁基酯或丙基酯的樹脂)、HPLC或一些以上方法聯(lián)合的分餾。本發(fā)明的有利方法可包括如2004年2月27日Dillon等人申請(qǐng)的U.S.60/548,302，和2004年1月23日Bondarenko等人申請(qǐng)的U.S.60/538,982專利申請(qǐng)所述的高分子量治療蛋白質(zhì)的LC分餾和純化(每個(gè)申請(qǐng)的完整內(nèi)容全部納入本文作參考)。
本文所述的LC和LC/MS方法也可以結(jié)合其它純化方法，如，例如，用含有與多肽結(jié)合的試劑的親和柱進(jìn)行多肽純化；在如伴刀豆球蛋白A瓊脂糖、肝素-toyopearl或汽巴龍藍(lán)3GA瓊脂糖親和樹脂上的一個(gè)或多個(gè)柱步驟；包括洗脫的一個(gè)或多個(gè)步驟；和/或免疫親和層析。多肽可以易于純化的方式表達(dá)。例如，可表達(dá)為融合多肽，如那些麥芽糖結(jié)合多肽(MBP)、谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)或硫氧還蛋白(TRX)。這種融合蛋白的表達(dá)和純化試劑盒在市場(chǎng)上分別由NewEngland BioLab(Beverly，Mass.)、Pharmacia(Piscataway，N.J.)和InVitrogen售賣。多肽可以在尾端加上抗原決定部位，然后用直接抗此抗原決定部位的特殊抗體純化。這樣的抗原決定部位(FLAG)在Kodak(New Haven，Conn.)售賣。也可以用含有多肽結(jié)合多肽的親和柱，如抗重組蛋白質(zhì)的單克隆抗體、抗親和純化表達(dá)的蛋白質(zhì)的單克隆抗體。親和純化步驟的其它類型可以是A蛋白或G蛋白柱，其親和劑結(jié)合含有Fc結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。多肽可以用常規(guī)技術(shù)從親和柱上去除，如，根據(jù)所使用的親和基質(zhì)，溶于高濃度鹽洗脫緩沖液中，然后用或通過交換pH或其它成分，在低濃度鹽緩沖液中透析，或者用親和組分的天然底物競爭性去除。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，重組蛋白質(zhì)制劑可在A蛋白親和柱上部分純化。
前述的一些或所有純化步驟，以各種聯(lián)合方式，也可用于制備重組IgG(即，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的適合制劑并用于本發(fā)明的方法，和/或在重組蛋白質(zhì)制劑與還原/氧化耦合劑接觸后進(jìn)一步純化這種重組多肽。其它哺乳動(dòng)物多肽的基本上自由多肽定義為“分離多肽”。這里所述的可與基于氧化還原劑的方法相結(jié)合的特殊LC方法在以下US專利申請(qǐng)中詳述2004年2月27日Dillon等人申請(qǐng)的U.S.60/548,302，和2004年1月23日Bondarenko等人申請(qǐng)的U.S.60/538,982(每個(gè)申請(qǐng)的完整內(nèi)容納入本文作參考)。
多肽也可用已知常規(guī)化學(xué)合成方法制備。本領(lǐng)域有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員對(duì)通過合成方法的多肽構(gòu)建方法公知。這些合成構(gòu)建多肽序列可在體外糖基化。
所需最后純度根據(jù)多肽的計(jì)劃用途而定。例如，當(dāng)多肽用于體內(nèi)時(shí)要求的純度相對(duì)較高。在這種情況下，純化多肽以致于沒有相應(yīng)于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析可測(cè)到的其它多肽多肽條帶。在相關(guān)領(lǐng)域有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，因其不同糖基化、不同轉(zhuǎn)錄后加工等，相應(yīng)于多肽的多個(gè)條帶可通過SDS-PAGE看到。本發(fā)明的多肽更佳純化成基本上同種，如通過SDS-PAGE分析指示為單個(gè)多肽條帶。多肽條帶可以通過銀染色、卡馬氏藍(lán)染色和/或放射自顯影術(shù)(如果多肽有放射性標(biāo)記)看到。
“接觸”意指在溶液中作用和/或暴露。蛋白質(zhì)或多肽可以與氧化還原劑接觸，也可以與固體支持物結(jié)合(如，親和柱或?qū)游龌|(zhì))。溶液較佳是緩沖液。為了使所需構(gòu)象的蛋白質(zhì)產(chǎn)量最大化，選擇溶液pH值保護(hù)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性并且最適二硫化物交換。在本發(fā)明的實(shí)際應(yīng)用中，溶液的pH值較佳不是強(qiáng)酸性。因此，一些pH值范圍大于pH5，較佳大約為pH6至pH11，更佳大約為pH7至pH10，還要佳大約為pH7.6至pH9.6。在本發(fā)明的一非限定性實(shí)施例中，發(fā)現(xiàn)最適pH大約為pH8.6。然而，本領(lǐng)域有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員可以通過實(shí)驗(yàn)很容易測(cè)定本發(fā)明的具體實(shí)施例的最適pH。
還原/氧化耦合劑是還原劑的來源。一些還原劑是自由硫醇。還原/氧化耦合劑較佳含有選自由以下化合物組成的組還原和氧化的谷胱苷肽、二硫蘇糖醇(DTT)、2-巰基乙醇、二硫硝基苯甲酸酯、半胱氨酸和胱氨酸/胱胺。為了易于使用和經(jīng)濟(jì)，可用還原的谷胱苷肽和/或還原的半胱氨酸。必須注意，在中性pH，半胱氨酸與其自身形成二硫化物生成胱氨酸。這種氧化反應(yīng)的比率在氧的存在下增加，而氧經(jīng)常在包括用于再折疊的氧化還原溶液的溶液中存在。具體地，起始僅含有半胱氨酸(還原劑)的中性pH溶液，很快生成胱氨酸(氧化劑)。因此，在溶液中加入氧化還原耦合劑，可通過僅加入半胱氨酸形成。
氧化還原劑可加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，其中有生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的細(xì)胞生長。在另一些實(shí)施例中，該試劑也可以在LC分離步驟中加到LC流動(dòng)相，分離重組蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施例中，蛋白質(zhì)固定在LC柱的靜止相，而氧化還原劑和離液劑是流動(dòng)相的一部分。在一些特殊實(shí)施例中，未處理的IgG抗體作為異種混合物洗出，如一些峰所示。還原/氧化耦合劑和/或離液劑的使用生成更簡單更均一的峰圖。也包括這種感興趣的更單一的峰可作為同種性更高的IgG制劑分離。
還原/氧化耦合劑以足以增加所需構(gòu)象相對(duì)比例的濃度存在。最適絕對(duì)濃度和還原/氧化耦合劑的比率依據(jù)總IgG的濃度以及某些情況下特殊IgG亞類而定。當(dāng)制備IgG1分子用時(shí)，也依據(jù)不成對(duì)半胱氨酸在蛋白質(zhì)中的數(shù)目和可達(dá)性而定。
一般地，還原/氧化耦合劑中的自由硫醇濃度可為0.05mM至50mM，較佳大約為0.1mM至25mM，更佳大約為0.2mM至20mM。
另外，還原/氧化耦合劑可含有大約高、相同或低濃度的氧化硫醇作為還原的硫醇組分。例如，還原/氧化耦合劑可與還原谷胱苷肽和氧化谷胱苷肽結(jié)合。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，還原谷胱苷肽與氧化谷胱苷肽的比率大約為1∶1至100∶1(還原硫醇∶氧化硫醇)，可行使相等的功能?；蛘咴诹硪粚?shí)施例中，還原/氧化耦合劑可為半胱氨酸或半胱氨酸和胱氨酸/胱胺的組合。因此，當(dāng)起始還原/氧化耦合劑包括氧化硫醇時(shí)，還原硫醇與氧化硫醇的比率在某些實(shí)施例中可為1∶10至1000∶1，較佳大約為1∶1至500∶1，更佳大約為5∶1至100∶1，甚至更佳大約為10∶1。
將重組蛋白質(zhì)制劑與還原/氧化耦合劑接觸一段時(shí)間，使得足以增加所需構(gòu)象的相對(duì)比例。任何比例的相對(duì)增加都是需要的，包括例如，非所需構(gòu)象的蛋白質(zhì)的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％和80％轉(zhuǎn)變?yōu)樗铇?gòu)象的蛋白質(zhì)。用本發(fā)明的方法通常產(chǎn)量范圍為40％至80％。這種接觸可以是給生成蛋白質(zhì)的發(fā)酵培養(yǎng)基提供氧化還原劑?；蛘?，這種接觸發(fā)生在生成蛋白質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)中的蛋白質(zhì)部分純化。在另一些實(shí)施例中，接觸在蛋白質(zhì)從HPLC柱上洗出之后，但在任何進(jìn)一步的處理之前進(jìn)行。本質(zhì)上，接觸在抗體的制備、純化、貯存或調(diào)配的任何階段進(jìn)行。
接觸也可與附著在層析柱的靜止相的IgG抗體進(jìn)行，而氧化還原劑和離液劑是流動(dòng)相的一部分。在這種情況下，接觸可作為層析純化步驟的一部分進(jìn)行。層析再折疊方法的有代表的實(shí)施例包括尺寸排阻(SEC)；在A蛋白柱上的可逆吸附中的溶劑交換；疏水作用層析(HIC)；固定金屬親和層析(IMAC)；反相層析(RPC)；使用固定折疊催化劑，如GroEl，GroES或有折疊特性的其它蛋白質(zhì)。柱上再折疊因其利用市售的操作性層析系統(tǒng)易于自動(dòng)化而有吸引力。在微生物細(xì)胞生成的重組蛋白質(zhì)的柱上再折疊最近在(Li等人，2004)中綜述。
如果接觸步驟在部分或高度純化的重組蛋白質(zhì)制劑中進(jìn)行，接觸步驟可短至1小時(shí)至4小時(shí)，也可長至6小時(shí)至4天。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，大約4小時(shí)至16小時(shí)或18小時(shí)的接觸步驟效果很好。接觸步驟也可發(fā)生在其它步驟中，例如，在純化的固定相或在過濾中或任何其它步驟中。
本發(fā)明的方法可在很寬的溫度范圍進(jìn)行。例如，本發(fā)明的方法已經(jīng)成功地在4℃至37℃下進(jìn)行，然而，最好的結(jié)果在較低溫度下得到。通常，重組蛋白質(zhì)的部分或全部純化制劑的接觸溫度大約為4℃至25℃(周圍)，但也可在更低溫度或更高溫度下進(jìn)行。
另外，預(yù)期所述的方法可在高壓下進(jìn)行。之前，高液靜壓(1000-2000巴)與低于1M的未變性低濃度的鹽酸胍結(jié)合，已經(jīng)用于分解(溶解)和再折疊E-coli生成的幾種變性蛋白質(zhì)，如包括人生長激素、溶解素和b-內(nèi)酰胺酶的包函體(StJohn等人，Proc Natl Acad Sci USA，9613029-13033(1999))。B-內(nèi)酰胺酶在活性蛋白質(zhì)的產(chǎn)量很高時(shí)再折疊，甚至無需加入GdmHCl。在另一篇研究中(Seefeldt等人，Protein Sci，132639-2650(2004))，2000巴高壓調(diào)節(jié)再折疊得到的由哺乳動(dòng)物細(xì)胞生成的蛋白質(zhì)bikunin的再折疊產(chǎn)量，RP HPLC測(cè)定為70％，顯著高于由常規(guī)鹽酸胍“稀釋-再折疊”得到的55％(RP HPLC)。這些發(fā)現(xiàn)指出，高液靜壓使分子間和分子內(nèi)相互作用的斷裂變得容易，導(dǎo)致蛋白質(zhì)伸展和解聚。高壓對(duì)蛋白質(zhì)的作用與離液劑對(duì)蛋白質(zhì)的作用相似。因此，本發(fā)明的方法包括高壓代替離液劑用于蛋白質(zhì)伸展。當(dāng)然，在某些情況下也可使用高壓與離液劑聯(lián)合。
重組蛋白質(zhì)制劑可與各種適合體積的還原/氧化耦合劑接觸。例如，本發(fā)明的方法已經(jīng)在分析實(shí)驗(yàn)室量(1-50mL)、制備量(50mL-10L)和生產(chǎn)量(10L或以上)下成功實(shí)施。因此，本發(fā)明的方法可少量和大量重復(fù)進(jìn)行。
在一些實(shí)施例中，用含有氧化還原劑的培養(yǎng)基生成的蛋白質(zhì)在分離處理步驟中進(jìn)一步用離液變性劑處理，如十二烷基磺酸鈉(SDS)、脲或鹽酸胍(GuHCl)。需要較多離液劑才能觀察到明顯伸展。在一些實(shí)施例中，加工步驟用0.1M與2M之間的離液劑，產(chǎn)生與用0.1M至2M鹽酸胍的等同效果。在一特殊實(shí)施例中，在大約1.0M鹽酸胍存在下獲得氧化再折疊，或在與1.0M鹽酸胍相比，生成再折疊量相同或相似的其它離液劑的量存在下獲得氧化再折疊。在一些實(shí)施例中，這些方法使用大約1.5M和0.5M之間的離液劑。
所用離液劑的量以在所述離液劑的存在下蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性為基礎(chǔ)。需要足夠離液劑打斷蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域相互作用的局部三級(jí)結(jié)構(gòu)和/或四級(jí)結(jié)構(gòu)，但比完全解開分子和/或單個(gè)結(jié)構(gòu)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)所需的離液劑少。為了測(cè)定蛋白質(zhì)通過均衡變性開始伸展的時(shí)間點(diǎn)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以在含有蛋白質(zhì)的溶液中加入離液劑滴定，用如圓二色性和熒光技術(shù)監(jiān)測(cè)結(jié)構(gòu)(圖36)。
還有其它參數(shù)可代替離液劑以解開或輕微干擾蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。溫度和壓力是之前用于使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的兩個(gè)功能性參數(shù)，可以在與氧化還原劑接觸的時(shí)候代替離液劑。發(fā)明人預(yù)期本領(lǐng)域的技術(shù)人員可使用顯示使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變性或擾亂的任何參數(shù)代替離液劑。
二硫化物交換可經(jīng)本領(lǐng)域有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員公知的任何方法抑制。例如，可通過純化步驟將還原/氧化耦合劑或其還原的濃度去除，和/或用化學(xué)方法滅活，如酸化溶液。通常當(dāng)反應(yīng)經(jīng)酸化抑制后，含有還原/氧化耦合劑的溶液pH值會(huì)降至低于7。在一些實(shí)施例中，pH值降至低于6。一般地，pH值大約下降至pH2與pH6之間。
蛋白質(zhì)構(gòu)象和混合物中蛋白質(zhì)構(gòu)象相對(duì)比例測(cè)定可用各種分析和/或定量技術(shù)進(jìn)行。如果蛋白質(zhì)構(gòu)象之間有不同活性，混合物中蛋白質(zhì)構(gòu)象相對(duì)比例測(cè)定可用活性測(cè)定進(jìn)行(如，與配體結(jié)合、酶活性、生物學(xué)活性等)。也可用蛋白質(zhì)生物學(xué)活性?；蛘?，結(jié)合測(cè)定可用于活性用活性單位/mg蛋白質(zhì)表示。
如果在分離技術(shù)中兩種構(gòu)象解離不同，如層析、電泳、過濾或其它純化技術(shù)中，混合物中構(gòu)象的相對(duì)比例可用這些純化技術(shù)測(cè)定。例如，至少重組IgG的兩種不同構(gòu)象可通過疏水作用層析的方法解離。另外，既然遠(yuǎn)UV圓二色性用于評(píng)估蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)組合(Perczel等人，1991，Protein Engrg.4669-679)，這種技術(shù)可測(cè)定蛋白質(zhì)是否有替代構(gòu)象存在。另外一種用于測(cè)定構(gòu)象的技術(shù)是熒光光譜學(xué)，可確定指定為色氨酸和酪氨酸熒光在三級(jí)結(jié)構(gòu)中的補(bǔ)充差異?？蓽y(cè)定構(gòu)象差異和構(gòu)象的相對(duì)比例的其它技術(shù)為測(cè)定聚集狀態(tài)的聯(lián)機(jī)SEC、測(cè)定熔解轉(zhuǎn)換(Tm’s)和組分焓的差示掃描量熱器和離液劑伸展。在本發(fā)明的以下詳述的實(shí)施例中，用LC/MS檢測(cè)法測(cè)定蛋白質(zhì)的異質(zhì)性。
術(shù)語“分離”意指混合物中至少一種組分從混合物中其它組分物理上分開?？捎萌魏斡兄谑惯@些組分分開的純化方法得到蛋白質(zhì)的分離組分或具體構(gòu)象。因此，在以下所述的RP-HPLC之外可以進(jìn)行多個(gè)層析步驟，包括但不限于HIC、羥磷灰石層析、離子交換層析、親和和SEC。其它純化方法是過濾(如，切向流過濾)、電泳技術(shù)(如電泳、電洗脫、等電聚焦)和分相(如PEG-右旋糖相分離)，這里列舉的僅是少數(shù)。另外，含有非所需構(gòu)象的蛋白質(zhì)的重組蛋白質(zhì)制劑分餾物可用本發(fā)明的方法再次處理，進(jìn)一步優(yōu)化所需構(gòu)象的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。
本發(fā)明也可選擇地包括進(jìn)一步調(diào)配蛋白質(zhì)。術(shù)語“調(diào)配”意指蛋白質(zhì)可經(jīng)交換緩沖液、消毒、總包裝和/或包裝給終端用戶。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“消毒總形式”意指調(diào)配劑沒有或基本上沒有微生物污染(在這種程度上可作為食物和/或藥物使用)，并且是限定的組合物和濃度。術(shù)語“消毒單位劑量形式”意指適合用于用戶和/或病人給藥或消費(fèi)的形式。這些組合物可包括有效量的蛋白質(zhì)，并與其它組分聯(lián)合，如生理上可接受的稀釋劑、載體和/或賦形劑。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”意指不干擾活性成分的生物學(xué)活性效力的無毒材料。適合給藥的調(diào)配劑包括水和非水消毒注射溶液，其中含有抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和溶劑，使調(diào)配劑與受者血液等張；以及可包括懸浮劑或加厚劑的水和非水消毒懸浮液。另外，消毒總形式和消毒單位劑量形式可含有濃度低(大約1μM至10μM)的還原/氧化耦合劑(如谷胱苷肽、半胱氨酸等)。多肽可根據(jù)制備藥學(xué)上有用的組合物的已知方法調(diào)配。它們可作為單獨(dú)的活性物質(zhì)或與適合特定指征的其它已知活性物質(zhì)結(jié)合在混合物中聯(lián)合，與藥學(xué)上可接受的稀釋劑(如鹽水、Tris-HCl、醋酸鹽和磷酸緩沖溶液)、防腐劑(如，硫柳汞、苯甲醇、對(duì)羥基苯甲酸酯類、乳化劑、加溶劑、輔助劑和/或載體。藥物組合物適合的配方包括Remington′s PharmaceuticalSciences，16th ed.1980，Mack Publishing Company，Easton，Pa所述的那些。另外，這些組合物可與聚乙二醇(PEG)、金屬離子結(jié)合成復(fù)合物和/或合并入聚合化合物如多聚乙酸、多聚乙醇酸、水凝膠、右旋糖等，或合并入脂質(zhì)體、微乳液、膠束、單層或多層脂質(zhì)體、紅細(xì)胞影或球芽。脂質(zhì)體配方的適合脂類包括但不限于甘油一酸酯、甘油二酸酯、硫酸腦苷脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂角、膽酸等。這種脂質(zhì)體配方的制備在本領(lǐng)域有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員所知的范圍內(nèi)，如以下所揭示，例如U.S.4,235,871；U.S.4,501,728；U.S.4,837,028；和U.S.4,737,323。這些組合物將影響物理狀態(tài)、可溶性、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放率和體外清除率，因此根據(jù)所需應(yīng)用來選擇這些組合物，以致于載體的性質(zhì)依據(jù)所選的給藥途徑而定。適合使用的持續(xù)釋放形式包括但不限于，將多肽裝入緩慢溶解的兼容聚合體形成的膠囊(如U.S.6,036,978所述的藻酸鹽微粒)，與這種聚合體(包括局部應(yīng)用的水凝膠)混合，以及或者裝入兼容的半透移植物中。
本發(fā)明的方法用于重組IgG(如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)蛋白質(zhì)的分析，具體用于高分子量蛋白質(zhì)分析。這些方法也用于高分子量蛋白質(zhì)單體和異種多體蛋白質(zhì)分析，如抗體。這些蛋白質(zhì)可含有轉(zhuǎn)錄后修飾，如，低聚糖組分等。在一些特殊實(shí)施例中，本發(fā)明的方法用于抗體和抗體結(jié)構(gòu)域的分析。在一實(shí)施例中，這些方法用于分子量大于90kDa的蛋白質(zhì)的分析，包括完整抗體、分子量大于90kDa的任何三級(jí)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)?？梢岳斫鉃椋肿恿恳园被嵝蛄袨榛A(chǔ)計(jì)算，包括蛋白質(zhì)的已知轉(zhuǎn)錄后修飾，如碳水化合物修飾。這些方法應(yīng)用于鑒定蛋白質(zhì)的低聚糖組合物、剪切、二聚體或多聚體形成和氧化、有不同二硫化物的結(jié)構(gòu)變異體和/或蛋白質(zhì)內(nèi)的特殊氨基酸。
在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的方法用于分析抗體和抗體片段。待分析的樣品可包括含有一個(gè)Fc結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)Fab結(jié)構(gòu)域的完整抗體?；蛘?，本發(fā)明的方法用來分析抗體的部分結(jié)構(gòu)，例如，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域或Fab結(jié)構(gòu)域中的一或兩個(gè)。本發(fā)明的方法具體預(yù)期用于完整抗體的部分切割產(chǎn)物分析。這種切割可在RP-HPLC分離之前進(jìn)行。通常蛋白水解用酶進(jìn)行，如，木瓜蛋白酶、Lyc-C蛋白酶或胃蛋白酶，在鉸鏈區(qū)進(jìn)行蛋白質(zhì)切割?；蛘?，用還原劑還原連接抗體結(jié)構(gòu)的兩條鏈之間的二硫鍵進(jìn)行切割?？捎萌纾蛱K糖醇、巰基乙醇、三丁基磷化氫和鹽酸三(2-羧基乙基)磷化氫進(jìn)行還原反應(yīng)。綜述蛋白質(zhì)及其片段的制備中所用的分析和制備方法，有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員可參考Josic和LimMethods for Purification ofAntibodies，F(xiàn)ood Technol.Biotechnol.39(3)215-226(2001)。
在一些典型的實(shí)施例中，限制性蛋白水解可用如Lys-C的內(nèi)切蛋白酶在pH值為7.0至8.0反應(yīng)10至60分鐘得到。在37℃下與摩爾比為1∶150的酶蛋白進(jìn)行無變性消化。沒有不適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)剪輯，可生成一些抗體大片段。然后使限制性蛋白水解產(chǎn)物經(jīng)受本文所述的RP-HPLC/MS方法。用這種限制性蛋白水解，生成在IgG1鉸鏈區(qū)的Fab和Fc片段。這些方法檢測(cè)到抗體片段質(zhì)量因?yàn)橐粋€(gè)蛋氨酸殘基氧化而增加+16Da，也檢測(cè)到因不完全二硫鍵形成而增加+2Da。
本發(fā)明的方法可用于分析天然蛋白、融合蛋白、人源化抗體、嵌合抗體、人抗體和單鏈抗體等。在一實(shí)施例中，這些方法也可用于分析如40kDa、50kDa、55kDa、60kDa、65kDa、70kDa、75kDa、80kDa、85kDa或較大的抗體或其片段。在一些實(shí)施例中，加入RP-HPLC柱的抗體是完整Fab區(qū)域。在另一些實(shí)施例中，經(jīng)分析的抗體是(Fab)2區(qū)域，由抗體的Fc區(qū)域切割而形成。類似地，本發(fā)明的方法也用于分析這樣切割生成的Fc區(qū)域。在一些實(shí)施例中，經(jīng)分析的抗體包括完整Fc區(qū)域和僅一個(gè)完整Fab區(qū)域。另外本發(fā)明的方法也用于分析包括抗體Fc區(qū)域及附著其上的添加肽的蛋白質(zhì)，或包括抗體Fab區(qū)域與附著其上的添加肽的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的方法可用于分析重組抗體。重組抗體可含有Fc片段或不含F(xiàn)c片段。具體地，多價(jià)抗體可用本發(fā)明分析。如本文所用的“多價(jià)抗體”指含有多于一個(gè)抗原決定部位的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的重組似抗體分子。例如，這種抗體衍生蛋白質(zhì)包括抗體Fab鏈與結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合的分子如，(Fab-scFv二聯(lián)抗體(bibodies)或三聯(lián)抗體(tribodies))。這些分子是有效的中間重量的不含F(xiàn)c部分的重組雙特異性抗體。缺乏Fc片段的抗體生產(chǎn)有利，因?yàn)樵诳贵w相關(guān)性治療分子中這種結(jié)構(gòu)域的存在通過保護(hù)其在肝臟的新陳代謝增加分子的血清持續(xù)時(shí)間，也可與其它細(xì)胞通過與Fc受體相互作用交聯(lián)，因此在全身激發(fā)免疫效應(yīng)細(xì)胞而引起毒性副作用。這樣，一些抗體相關(guān)治療分子缺乏Fc結(jié)構(gòu)域。那些本領(lǐng)域有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員知道改造這些抗體相關(guān)分子的方法。例如，重組抗體可從抗體衍生組分(如Fc、(Fab’)2、Fab、scFv、雙價(jià)小分子抗體(diabody))與異源二聚基序結(jié)合生成，以有效創(chuàng)建多特異性抗體。
本發(fā)明的方法具體用于測(cè)定抗體完整性，具體為治療性抗體。所述抗體用本文所述的RP-HPLC/MS方法分離和分析，以測(cè)定是否有抗體降解產(chǎn)物存在。本文所述的方法可讓本領(lǐng)域有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員評(píng)估二聚體、抗體切割產(chǎn)物、脫酰胺的存在，N末端焦谷氨酸或的氧化或形成或抗體二硫鍵不規(guī)則的存在。
通過本文以下所述的例子證明本發(fā)明的方法顯示對(duì)藥物抗體及其降解產(chǎn)物的層析分離和精確分子量測(cè)量有改善。這些方法用高分辨力高精確度的質(zhì)譜儀，能測(cè)量因一個(gè)氨基酸殘基(如，甘氨酸57Da)或一個(gè)糖部分(如，半乳糖162Da)不同的兩種抗體變異體之間的不同質(zhì)量。對(duì)于分子量為150kDa的典型IgG抗體來說，質(zhì)譜儀的質(zhì)量分辨力至少應(yīng)該是3000。質(zhì)量分辨力按如下計(jì)算分辨力＝MW/ΔMW＝150kDa/57Da≈3000在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的方法能測(cè)定大于100kDa的抗體或蛋白質(zhì)在氧化之前和之后的質(zhì)量變化，即，16Da的不同。這對(duì)典型IgG產(chǎn)生10000的質(zhì)量分辨力。本發(fā)明的方法進(jìn)一步在以下例子中闡明。
實(shí)施例以下所包括的例子為本發(fā)明的一些實(shí)施例。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解，例子中已揭示的技術(shù)為發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)，在實(shí)踐中施用良好，因此可以認(rèn)為這些技術(shù)為其實(shí)踐構(gòu)建較佳模式。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員，按照本發(fā)明的揭示，應(yīng)當(dāng)知道對(duì)一些公開的具體實(shí)施例可作出許多變化，并在沒有背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，仍然得到相似的結(jié)果。
U.S.臨時(shí)申請(qǐng)60/621,295(納入本文作為參考)提供在還原/氧化劑和選擇地離液劑的存在下一種IgG2分子的再折疊公開。這種再折疊IgG2的生物學(xué)活性比沒有離液劑的再折疊IgG2高6倍，比沒有用氧化還原劑進(jìn)行蛋白質(zhì)再折疊而制備的IgG2總抗體高3至4倍。根據(jù)前述申請(qǐng)，使用再折疊IgG2有可能遞送較大有效劑量的IgG2，而用較少量的蛋白質(zhì)。這種在生產(chǎn)生物學(xué)上有效反應(yīng)的所需蛋白質(zhì)總量減少有利，因?yàn)檫@種必須遞送給動(dòng)物的蛋白質(zhì)量減少，在遞送的時(shí)候如，通過靜脈內(nèi)或皮下注射，將有可能產(chǎn)生較少不利反應(yīng)。
以下例子提供典型的實(shí)施例，以得到有利的重組IgG分子再折疊。
實(shí)施例1蛋白質(zhì)再折疊討論大腸桿菌(E.coli)生產(chǎn)的蛋白質(zhì)再折疊。最近，Rudolph和合作者綜述了大腸桿菌生產(chǎn)再折疊蛋白質(zhì)的進(jìn)步(Lilie等人，1998；Rudolph和Lilie，1996)。
這些作者指出蛋白質(zhì)折疊是蛋白質(zhì)生產(chǎn)機(jī)制中最復(fù)雜的機(jī)制之一和“每個(gè)蛋白質(zhì)必須優(yōu)化關(guān)于緩沖液組合物、蛋白質(zhì)濃度、溫度等特定條件”。不正確的二硫鍵是問題之一。意味著“在E.coli的外周胞質(zhì)中增強(qiáng)不正確二硫鍵的修正是過量表達(dá)內(nèi)生外周胞質(zhì)的DsbC蛋白，這是二硫化物異構(gòu)酶。另一種方法是在硫醇試劑的存在下培養(yǎng)，導(dǎo)致不正確二硫鍵的改組，已經(jīng)證實(shí)增加含有多個(gè)二硫鍵的天然蛋白產(chǎn)量”(Glockshuber等人，Verbessereung der ausbeute bei der sekretion vondisulfidverbruchten proteinen.[專利號(hào).0510658 B1]，1992；Wunderlich等人，J.Biol.Chem.，26824547-24550，1993)。在此引用與蛋白質(zhì)再折疊相關(guān)的其它幾個(gè)專利(Lilie等人，Curr.Opin.Biotech.，9497-501，1998)。也顯示出抗凍肽原使大腸桿菌包函體中的包括人神經(jīng)生長因子的幾種蛋白質(zhì)折疊變得容易(Rattenholl e等人，Eur.J.Biochem.，2683296-3303，2001)。
鼠科單克隆IgG抗體的折疊中間物。鼠科抗體k/IgG1亞類折疊途徑在(Lilie等人，J.Mol. Biol.，248190-201，1995b)中研究，包括結(jié)構(gòu)域折疊，通過二硫鍵和脯氨酰順式/反式異構(gòu)聯(lián)合。該研究鑒定了Fab復(fù)性過程中，F(xiàn)d和輕鏈結(jié)合之后的折疊反應(yīng)由脯氨酰異構(gòu)測(cè)定。根據(jù)輕鏈折疊階段和至少一個(gè)脯氨酰-肽鍵的構(gòu)象判斷，至少有4個(gè)折疊中間物。觀察到的慢折疊相可能是因?yàn)樵贔d片段中的Pro159，并且可能需要四級(jí)而不是三級(jí)結(jié)構(gòu)使異構(gòu)變得容易(Lilie等人，J.Mol. Biol.，248190-201，1995b)。對(duì)于相同的Fab抗體片段，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)域-結(jié)構(gòu)域相互作用是折疊比率限制性步驟，因此在折疊的晚期積累折疊中間物(Lilie等人，Protein Sci.，4917-924，1995a).較早，Lilie等人(Lilie等人，Protein Sci.，21490-1496，1993)顯示了脯氨酰異構(gòu)酶(PPIs)的幾個(gè)成員加速了抗體Fab片段體外再折疊過程，增加了正確折疊分子的產(chǎn)量。它們作為蛋白質(zhì)折疊的催化劑加速Xaa-Pro肽鍵的時(shí)間限制性異構(gòu)(Lilie等人，Protein Sci.，21490-1496，1993)。
鼠科單克隆IgG抗體的另一種折疊狀態(tài)。與天然狀態(tài)不同的另一種折疊狀態(tài)用于敘述具有完整二硫鍵的單克隆IgG抗體(Buchner等人，Biochemistry，306922-6929，1991；Welfle等人，Biochim.Biophys.Acta，1431120-131，1999)。據(jù)報(bào)道，這種構(gòu)象狀態(tài)根據(jù)天然或變性IgG分子在酸性pH(＜3)下培養(yǎng)而形成。這個(gè)A-狀態(tài)的特征為疏水性增加和對(duì)抗變形劑和熱伸展的穩(wěn)定性增加的高度二級(jí)結(jié)構(gòu)，并存在三級(jí)結(jié)構(gòu)(Buchner等人，Biochemistry，306922-6929，1991)。業(yè)已發(fā)現(xiàn)(Buchner等人，J.Biol.Chem.，318829-836，2002)，鼠科單克隆抗體的還原Fab片段及其還原輕鏈在低pH值時(shí)形成特定穩(wěn)定的非天然結(jié)構(gòu)。令人感興趣的是，還原輕鏈另一種折疊狀態(tài)的穩(wěn)定性較氧化輕鏈的高，說明結(jié)構(gòu)域內(nèi)的二硫化物對(duì)天然狀態(tài)的穩(wěn)定性起重要作用，使另一種折疊狀態(tài)不穩(wěn)定(Buchner等人，J.Biol.Chem.，318829-836，2002)。受Fab片段中鏈間二硫化物穩(wěn)定的輕鏈和重鏈之間的相互作用，對(duì)另一種折疊狀態(tài)的形成起關(guān)鍵作用(Lilie等人，F(xiàn)EBS Lett.，36243-46，1995)。Welfe等人發(fā)現(xiàn)將pH值降低至pH 3.4與2.0之間可誘導(dǎo)構(gòu)象轉(zhuǎn)變和新結(jié)構(gòu)的形成，表明從親和柱中解吸應(yīng)在pH 3.5或以上進(jìn)行(Welfle等人，Biochim.Biophys.Acta.，1431120-131，1999)。
用GndHCl和L-精氨酸進(jìn)行的免疫球蛋白折疊的蛋白質(zhì)再折疊。如GnHCl、谷胱苷肽、L-精氨酸的添加物對(duì)免疫球蛋白折疊的蛋白質(zhì)再折疊的影響在(Umetsu等人，J.Biol.Chem.，2788979-8987，2003)中討論。在1m GndHCl的自發(fā)折疊可得到具有正確二硫鍵的結(jié)構(gòu)；然而，加入L-精氨酸形成沒有二硫化物連接的部分折疊中間物(Umetsu等人，J.Biol.Chem.，2788979-8987，2003)。
實(shí)施例2人單克隆IgG2抗體的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性的認(rèn)識(shí)有幾篇報(bào)道發(fā)表了人IgG1抗體的X-線結(jié)晶圖(Saphire等人，Science，2931155-1159，2001；Saphire等人，J.MoI.Biol.，3199-18，2002)。例如，Saphire等人，(2001)顯示人IgG1 b12抗體的X-線結(jié)晶示蹤。然而，直到現(xiàn)在也沒有IgG2抗體的清晰X-線晶體結(jié)構(gòu)。本發(fā)明顯示人IgG2抗體具有抗體異質(zhì)性，以及這種異質(zhì)性使得生成IgG2的X-線晶體數(shù)據(jù)很困難。
反相(RP)HPLC/MS和陽離子交換(CEX)HPLC方法的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，所有人源化IgG2抗體的研究在RP和CEX層析譜中有多個(gè)峰，而IgG1抗體作為單一峰洗出。圖1所示為IgG1和IgG2形態(tài)中顯示有相同CDR的重組人抗體的RP層析譜。在這兩種分子中氨基酸序列有95％相同，但RP層析譜不同，IgG2有多個(gè)峰，而IgG1只有單一峰。與RP層析譜相比，IG2的CEX層析譜顯示相似剖面圖(圖2)。將收集的CEX分餾物再加入RP柱后，可以與整個(gè)IgG2樣品的RP峰共同洗出(圖2)。
高分辨力的Micromass/Waters Q-TOF質(zhì)譜儀用于取得RP HPLC分離峰的質(zhì)譜。圖3A所示為UV在215nm處的吸收值和質(zhì)譜的總離子電流測(cè)得的IgG2抗體的RP層析譜。該圖表明，與其它峰相比，峰1生成較少質(zhì)譜電流。圖3B所示為如果離子53帶正電荷，峰1中洗出的IgG2離子在離子表面含有最多53質(zhì)子。峰1的IgG2分子離子容納大約6個(gè)質(zhì)子，比作為峰2、3和4洗出的其它IgG2分子少，顯示峰1含有IgG2分子與樣品的其它洗出分子相比，折疊更為致密。峰1表面電荷較少的離子也產(chǎn)生較小TIC信號(hào)(圖3A)。另一方面，電噴霧電離質(zhì)譜解卷圖揭示了RP HPLC分離的所有IgG2異構(gòu)體有相同分子量(MW)，質(zhì)量差異精確到±2Da之內(nèi)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)消除了大部分報(bào)道的IgG抗體結(jié)構(gòu)修飾的可能性。還原和烷化之后，IgG1和IgG2抗體的RP層析譜生成沒有異質(zhì)性的輕鏈和重鏈窄峰。還原消除異質(zhì)性的事實(shí)表明其與二硫化物連接相關(guān)。
IgG1和IgG2抗體亞類在鉸鏈區(qū)的結(jié)構(gòu)不同，包括IgG1中的鏈間的兩個(gè)二硫鍵和IgG2中的四個(gè)二硫鍵(圖4和43)。以上研究強(qiáng)烈表明多個(gè)IgG2異構(gòu)體是由分子與不同二硫鍵在鉸鏈區(qū)連接組成。
分析以上所述結(jié)果，發(fā)明人總結(jié)IgG2分子有幾種結(jié)構(gòu)變異體因鉸鏈區(qū)的二硫化物連接而不同。圖4，采用Kuby第4章ImmunoglobulinsStructure andFunction，2002，顯示在傳統(tǒng)課本結(jié)構(gòu)中的IgG抗體的四種亞類。實(shí)際上，Aalberse和Schuurman的一篇研究(Aalberse等人，Immunology，1059-19，2002)鑒定了IgG4的較佳構(gòu)象中，這個(gè)抗體的CH1區(qū)與CH2結(jié)構(gòu)域相互作用(圖5)。圖4顯示IgG4的結(jié)構(gòu)很相似，包括在鉸鏈區(qū)的四個(gè)二硫化物連接。鉸鏈區(qū)的氨基酸序列不同，所以IgG2和IgG4的構(gòu)象不同，但有相似性，并且可能如圖5中的IgG4抗體一樣折疊。
Phillips等人的另一篇研究(Phillips等人，MoI.Immun.，311201-1210，1994)，用電子顯微鏡和沉降分析顯示與其它三種抗體亞類相比的IgG2形狀的分布。這個(gè)研究的作者觀察到“與其它亞類明顯不同的復(fù)合物的分布。觀察到一些是圓形二聚體，一些是線形二聚體，大部分是單體。這表明，根據(jù)能障，這可理解為圍繞由IgG2的Fab臂定向所致的閉合，其可能導(dǎo)致線形二聚體作為用分析性超離心觀察到的起主要作用的復(fù)合物”。沉降數(shù)據(jù)(圖6)顯示部分解離峰，還表明IgG2分子的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性(Phillips等人，MoI.Immun.，311201-1210，1994)。另一篇文章中，Gregory等人(Gregory等人，MoI.Immun.，24821-829，1987)敘述了用沉降和小角度X-線散射分析人IgG.亞類，根據(jù)作者，“IgG1推測(cè)有長度為0-15A的鉸鏈，并且有非共平面的Fab臂；IgG2對(duì)折起來的Fab臂實(shí)際上是無鉸鏈的”。以上引用的兩篇報(bào)道(Gregory等人，MoI.Immun.，24821-829，1987；Phillips等人，MoI.Immun.，311201-1210，1994)，表明IgG2可能有幾種構(gòu)象狀態(tài)，包括具有對(duì)折Fab臂的結(jié)構(gòu)。圖7包括當(dāng)前報(bào)道的作者推測(cè)的IgG2抗體的幾種結(jié)構(gòu)。圖7也包括；唯一報(bào)道的用X線結(jié)晶學(xué)研究的IgG1抗體的結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例3在氧化還原劑存在下的IgG2抗體再折疊減少IgG2結(jié)構(gòu)異質(zhì)性并且增加其活性。
以上所述的研究形成一種思想，即再折疊IgG2抗體是為了證實(shí)其活性。將抗體加入含有緩沖液的半胱氨酸-胱氨酸中，在pH 8，4℃下培育72小時(shí)進(jìn)行再折疊。
本文所使用的較佳氧化還原耦合系統(tǒng)是半胱氨酸/胱氨酸作為還原/氧化耦合劑。起始材料是純化的IgG2抗體制劑。緩沖液是pH 8.5的0.1M檸檬酸鹽或0.2M的Tris。反應(yīng)中IgG2蛋白質(zhì)濃度為0.5mg/mL至10mg/mL。在較佳實(shí)施例中，蛋白質(zhì)濃度在2.5mg/mL至3mg/mL之間變化。
應(yīng)用L-半胱氨酸氧化還原系統(tǒng)(在0至50mM之間變化)，在有或無同量的L-胱氨酸和有或無1mM EDTA參與下評(píng)估步驟。培育溫度為4℃、15℃和220℃，時(shí)間為6、18和48小時(shí)。經(jīng)處理的重組蛋白質(zhì)制劑用RP-HPLC鑒定，如以上例子和Dillon等人的U.S.臨時(shí)申請(qǐng)60/621,295和PCT/US05/001840的圖1至圖15的說明所述。
當(dāng)氧化還原系統(tǒng)含有大約0.1mM至10mM半胱氨酸和大約0.1mM至10mM胱氨酸時(shí)測(cè)到再折疊即時(shí)發(fā)生。半胱氨酸/胱氨酸可為但不需要1∶1的濃度比率。
另外，實(shí)驗(yàn)步驟包括緩沖液中0.9M GndHCl以稍稍解開(松弛)再折疊/氧化過程中的結(jié)構(gòu)。圖8所示為兩個(gè)再折疊實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。該結(jié)果表明，IgG2抗體的兩個(gè)再折疊樣品在結(jié)構(gòu)上同源，在RP層析譜洗脫剖面圖中隨著峰1和峰3共同洗出。
還有另一種可用的氧化還原耦合系統(tǒng)是加入GSH濃度在0.1至5mM之間變化的還原谷胱苷肽和谷胱苷肽(GSH/GSSG比率為10∶1)。在這個(gè)氧化還原耦合劑存在下可評(píng)估培育pH和溫度的影響。pH可在pH 5至pH 9之間變化。培育溫度可為4℃、22℃或31℃。在其它實(shí)施例中，GSH/GSSG氧化還原耦合系統(tǒng)中IgG2的培育溫度是變化的。再折疊在4℃下比在室溫下更有效率(圖52)。
在0.89M鹽酸胍的參與下再折疊的IgG2生物學(xué)活性比沒有鹽酸胍參與的再折疊IgG2高6倍，比沒有用氧化還原劑生產(chǎn)再折疊蛋白質(zhì)所制備的IgG2總抗體高3至4倍(圖47)。
再折疊方法可用使每克材料中活性IgG2形式濃度明顯增加的CHO-生產(chǎn)的克和千克IgG2原料和降低調(diào)配溶液中的蛋白質(zhì)濃度來進(jìn)行。鹽酸胍處理這樣生產(chǎn)的蛋白質(zhì)進(jìn)一步增加生物學(xué)上有活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。本文所述的RP-HPLC/MS研究表明所有IgG2抗體具有多種形式，并且可以根據(jù)提出的再折疊技術(shù)修飾。
用再折疊的IgG2，有可能遞送較大有效劑量的IgG2，而使用較少量的蛋白質(zhì)。這種在產(chǎn)生生物學(xué)上有效效應(yīng)的所需蛋白質(zhì)總量減少將有利，因?yàn)闇p少這種必須遞送給動(dòng)物的蛋白質(zhì)在遞送時(shí)如，經(jīng)靜脈內(nèi)或皮下注射，很可能產(chǎn)生較少不良反應(yīng)。本發(fā)明的方法有利地生產(chǎn)IgG2同源制劑，后者在很多情形下與IgG1相比，是抗體藥物的較佳形態(tài)，因?yàn)榕cIgG2相比，與升高的IgG1補(bǔ)體結(jié)合活性相聯(lián)系的風(fēng)險(xiǎn)更大。
當(dāng)用以上討論的氧化還原劑典型的方法處理重組生成的IgG2純化制劑時(shí)，預(yù)期IgG2可在這種氧化還原耦合系統(tǒng)的參與下生產(chǎn)，其中試劑加到蛋白質(zhì)生成的細(xì)胞培養(yǎng)基中?；蛘?，氧化還原劑可在蛋白質(zhì)純化后加入。另外，當(dāng)本文提供的例子直接用于檢測(cè)IgG2異質(zhì)性時(shí)，預(yù)期可即時(shí)調(diào)整和使用所述方法用于任何翻譯后再折疊和因?yàn)椴灰?guī)則二硫鍵的存在而顯示出異質(zhì)性的重組蛋白質(zhì)。本文所述的方法特別用于其它IgG的生產(chǎn)，如顯示出異質(zhì)性的IgG3和IgG4抗體。
實(shí)施例4對(duì)人單克隆IgG2抗體構(gòu)象異構(gòu)體的發(fā)現(xiàn)和鑒定的進(jìn)一步研究在微生物中生產(chǎn)的人治療蛋白質(zhì)通常錯(cuò)誤折疊，并且以不溶的包函體聚集。隨后蛋白質(zhì)必須在還原/氧化條件下用離液劑再折疊以得到生物學(xué)活性。直到最近，人治療蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)被認(rèn)為可生成有正確折疊和翻譯后修飾的產(chǎn)物。在當(dāng)前的例子中，鑒別出四種抗IL-1R IgG2抗體和幾種其它IgG2抗體的結(jié)構(gòu)變異體。這些新鑒定的結(jié)構(gòu)變異體對(duì)IgG2亞類來說是獨(dú)特的(在重組和天然形成的IgG2中)，還沒有在IgGI或IgG4中發(fā)現(xiàn)?；谶@些發(fā)現(xiàn)，提出人免疫球蛋白IgG2亞類可能進(jìn)一步分成代表構(gòu)象異構(gòu)體的亞-亞類。
材料和方法以下材料和方法是在本例子中使用的典型的方法。類似的其它方法用于其它例子中，如特定指出的那些例子。應(yīng)當(dāng)理解，為了在本發(fā)明的上下文中其它IgG組分分析中應(yīng)用，這些典型的方法可即時(shí)改型。
在研究中使用的抗IL-IR IgG2抗體和其它人單克隆IgG抗體用標(biāo)準(zhǔn)操作步驟進(jìn)行重組表達(dá)和純化。細(xì)胞質(zhì)中的IgG2к人骨髓瘤購自Sigma，#15404。
再折疊步驟在本發(fā)明使用的再折疊步驟的另一特定例子中，人單克隆抗IL-1R IgG2抗體以濃度為3mg/mL或10mg/mL在兩種緩沖液中培育1)200mMTris緩沖液pH 8.0(天然折疊)；2)加入0.9M GuHCl的200mM Tris緩沖液pH8.0(GuHCl再折疊)。分別加入摩爾比為6mM∶1mM(3mg/mL)和10mM∶1mM(10mg/mL)半胱氨酸∶胱氨酸混合物。胱氨酸的精確濃度因其可溶性較差而不能測(cè)定，然而，胱氨酸在以上提到的比率中以重量計(jì)。樣品在2-8℃放置48小時(shí)。實(shí)驗(yàn)的其它再折疊條件包括精氨酸和脲作為離液劑使用、不同比率的半胱氨酸∶胱氨酸、以及用胱胺替代胱氨酸、濃度范圍為0-2M的GuHCl和在氧化還原過程中的多種溫度。
完整抗體的CEX分析蛋白質(zhì)注入Dionex WCX10弱陽離子交換柱，以0.80ml/min流速在25℃下進(jìn)行。通過增加溶劑B的濃度并相應(yīng)地在流動(dòng)相降低A進(jìn)行梯度洗脫。溶劑A是pH 5.0的20mM醋酸鈉，溶劑B包括20mM醋酸鈉，0.5M NaCl pH 5.0。
完整抗體和抗體片段的反相LC/MS分析蛋白質(zhì)注入75℃下操作的Zorbax 300SB C8柱。優(yōu)化方法用包括含有0.1％TFA的異丙醇和乙腈的流動(dòng)相。Agilent 1100毛細(xì)管HPLC系統(tǒng)與設(shè)置有電噴霧電離(ESI)源的Waters Q-TofMicro質(zhì)譜儀聯(lián)機(jī)連接。ESI-Q-TOF質(zhì)譜儀設(shè)置成以正價(jià)離子模式運(yùn)行，其中毛細(xì)管電壓為3400V，樣品圓錐電壓為70-100V，m/z范圍為1000-5000，以及質(zhì)量分辨力為5000。儀器用多價(jià)離子的牛胰蛋白酶原(MW23981.0，Sigma Tl 143)進(jìn)行調(diào)節(jié)和校正。ESI質(zhì)譜圖解卷用Waters的MassLynx軟件中的MaxEntl算法進(jìn)行。
用胃蛋白酶的限制性蛋白水解人IgG2的胃蛋白酶消化在(Turner andBennich，1968，Biochem.J.，v.107，p.171-178)中所述的相似方式進(jìn)行，但pH值較低，時(shí)間較短。用胃蛋白酶的抗IL-1R IgG2抗體和幾種其它IgG2抗體在pH 2.5和室溫下，100mM醋酸銨緩沖液中，僅加入胃蛋白酶進(jìn)行限制性蛋白水解1小時(shí)。在酶蛋白質(zhì)比率(w∶w)為1∶50，且沒有變性的情況下進(jìn)行消化。
還原、氧化和胰蛋白酶消化還原和烷化用IgG在變性條件下進(jìn)行，生成自由重鏈和輕鏈，并進(jìn)一步分析鑒定。用7.5M鹽酸胍(Mallinckrodt，#7716)，0.1MTris-HCl(Fluka)，1mM乙二胺四乙酸(EDTA，Sigma#6281-92-6)pH 7.5加到體積為0.5mL將抗體稀釋至2mg/mL。從0.5M二硫蘇糖醇(DTT，Sigma D5545)母液中取5-μL加入使DTT濃度達(dá)到5mM，反應(yīng)混合物在37℃放置30分鐘。蛋白質(zhì)溶液冷卻到室溫，從0.5M碘乙酰胺(IAM，Sigma#11149)母液中取13-μL使IAM濃度達(dá)到13mM。烷化在室溫下避光進(jìn)行40分鐘。0.5mL體積的還原和烷化材料與1mL的10mM醋酸鈉(JT BAKER，Phillipsburg，NJ，#9526-03)pH5.0交換至蛋白質(zhì)終濃度為1mg/mL。緩沖液交換用Sephadex G-26基質(zhì)(Pharmacia Biotech)裝填的NAP-5凝膠過濾柱進(jìn)行。序列級(jí)的胰蛋白酶消化用前述的還原和烷化IgG進(jìn)行。凍干胰蛋白酶(Worthington#3744)以0.50mg/mL的終濃度在水中懸浮。還原緩沖液通過消化緩沖液交換，消化緩沖液包括0.1MTRIS，1M脲，20mM羥胺(Sigma#H9876)，pH 7.5。加入1M的脲和20mM羥胺以增加輕鏈和重鏈的溶解性，相應(yīng)防止蛋白質(zhì)氨基甲?；?Cohen，1968，Ann.Review Biochem.，v.37，p.695-726)。胰蛋白酶消化以1∶50的酶蛋白質(zhì)比率在37℃下過夜。加入少量20％的蟻酸至其終濃度為0.2％停止消化。消化放置在維持在4℃的自動(dòng)加樣器以用于RP LC/MS分析，或冷凍以用于將來分析。用相同的步驟還原、烷化和消化較少量的抗體，將摩爾比相同的組分加入體積較少的溶劑，用相似的步驟還原、烷化和消化較少量抗體。
胰蛋白酶肽的HPLC胰蛋白酶肽通過反相HPLC分析，使用裝配有UV探測(cè)器、自動(dòng)加樣器、微量流量電池和溫度控制柱小室的Agilent 1100 HPLC單位。一Polaris Ether柱，250×2mm，裝入3μm大小的顆粒和300?？讖紺18樹脂(Varian，Torrance，CA，USA)用于肽譜分離。溶劑為A＝0.1％TFA三氟醋酸水溶液，B＝90∶9.015∶0.085的ACN∶水∶TFA。步驟如下。胰蛋白酶肽注入RP HPLC柱， 然后與100％A平衡。在0至50％B的線性梯度下運(yùn)行205分鐘。用200μL/min的流速洗脫。溫度維持在50℃。將消化的20μg總蛋白注入柱中進(jìn)行質(zhì)譜分析。從柱中流出物通過UV探測(cè)器分析，然后直接進(jìn)行聯(lián)機(jī)離子阱質(zhì)譜分析。
離子阱質(zhì)譜法Thermo Finnigan離子阱質(zhì)譜儀LCQ DECA與HPLC系統(tǒng)聯(lián)機(jī)使用，以鑒別消化產(chǎn)物。用三種方法得到肽及其片段的質(zhì)量，包括完全掃描，然后聚焦并進(jìn)行MS/MS掃描。軸ESI源標(biāo)準(zhǔn)用作大氣-真空界面。儀器用合成肽(m/z 842)的雙電荷離子調(diào)整。Thermo Finnigan Bio Works 3.1軟件的Sequest算法和Mass Analyzer軟件進(jìn)行肽識(shí)別。
結(jié)合測(cè)定用抗生物素蛋白-IL-1R融合蛋白覆蓋結(jié)合生物素?zé)晒馕⑶蝮w(小珠(Upstate Biotechnology Inc.))。
洗滌小珠除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)， 并等分樣品至96孔過濾平板(Millipore Corp)。將待測(cè)抗體滴定量(從1nM稀釋至61fM)加入小珠。用藻紅蛋白結(jié)合羊抗人(Fab’)2(Southern Biotechnology)檢測(cè)抗體結(jié)合小珠捕獲的抗生物素蛋白-IL-1RI融合蛋白。結(jié)合反應(yīng)用Luminex100儀器(Luminex Corp.)分析。結(jié)合在小珠結(jié)合蛋白上的抗體量與儀器測(cè)定的平均熒光強(qiáng)度(MFI)成比例。用PRISMTM軟件得到結(jié)合曲線和聯(lián)合EC50值(生成最大反應(yīng)一半時(shí)的抗體濃度)。
生物學(xué)活性(軟骨細(xì)胞測(cè)定)抗IL-1R IgG2抗體，再折疊1-型1和再折疊2-型3在測(cè)定基中從40nM連續(xù)稀釋至0.0256pM。50μl稀釋的待測(cè)抗體加入96孔平板，平板中接種有在100ul體積中以10000細(xì)胞/孔的密度的人軟骨細(xì)胞。最終抗體濃度范圍為10nM至0.0064pM。30min培育后，50μl的重組人IL-1β加至終濃度為10pM。培育過夜后，抗體活性用IL-6和MMP-13 ELISA分析。IL-6或MMP-13抑制以IL-1β最大活性百分比計(jì)算。用GraphPad PRISMa軟件建立每種待測(cè)抗體的抑制反應(yīng)曲線并且得到相應(yīng)IC50值(信號(hào)減少50％的抗體濃度)。
生物學(xué)活性(抗體介導(dǎo)的溶解)對(duì)于抗體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解測(cè)定，將抗體加入全血中(1mg/mL)，培育48小時(shí)(37℃，5％CO2)，進(jìn)行熒光激活細(xì)胞分類術(shù)(FACS)分析(標(biāo)記T/B細(xì)胞和溶解紅細(xì)胞)。B/T細(xì)胞的缺失用流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)。
結(jié)果即使兩種技術(shù)在不同的條件下評(píng)估抗體結(jié)構(gòu)，抗IL-1R的IgG2抗體陽離子交換(CEX)和反相(RP)層析都顯示出IgG2的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性(圖1和2A)。CEX流動(dòng)相中，抗體是天然構(gòu)象狀態(tài)(特征為反平行β折疊)，在pH值、溫度和鹽濃度上與生理狀態(tài)接近。另一方面，當(dāng)與在0.1％TFA(pH 2)水溶液中的高百分比異丙醇在75℃下從反相柱洗出后，抗體為熔解了的小球狀態(tài)(Buchner等人，1991Biochemistry，v.30，p.6922-6929；Ptitsyn等人，1990 FEBS Lett.，v.262，p.20-24；Kuwajima，1989 Proteins，v.6，p.87-103)。遠(yuǎn)-UV圓二色性數(shù)據(jù)表明，在這些RP層析條件下天然球蛋白β折疊轉(zhuǎn)變成螺旋性和無規(guī)卷曲熔解結(jié)構(gòu)。從CEX和RP柱洗出的天然和熔解結(jié)構(gòu)有相似剖面圖的事實(shí)，說明構(gòu)象異構(gòu)體有不同共價(jià)結(jié)構(gòu)，以保持天然狀態(tài)和熔解狀態(tài)不同。為了使兩種不同技術(shù)分離的峰相關(guān)聯(lián)，收集四種CEX分餾物，注入RP柱(稱為CEX分餾物1、2、3和4)。再次注入的CEX分餾物1、2、3和4與證實(shí)在相對(duì)豐度和峰的洗脫順序之間有關(guān)聯(lián)的RP峰1、2、3和4共同洗出(圖2B)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)還提供了進(jìn)一步的證據(jù)，RP層析本身不是一種峰分離的來源，而是測(cè)定共價(jià)變異體的另一種有用的分析工具。
人IgG2抗IL-1R單克隆抗體克隆和表達(dá)為IgG1。IgG1亞型含有大于96％的IgG2同源序列。人IgG1抗IL-1R mAb抗原用前述的相同方法通過CEX和RPHPLC分析。IgG1CEX和RP分析生成的層析譜顯示單一同源峰。IgG1抗體與IgG2抗體型3(RP峰3)大約在相同時(shí)間洗出(圖1)。
在實(shí)驗(yàn)部分所述的ESI直角-TOF質(zhì)譜儀與RP HPLC系統(tǒng)聯(lián)機(jī)連接，以鑒別在儀器±2Da的測(cè)量誤差內(nèi)有相同分子量的IgG2四種異構(gòu)體(圖45)。這消除了糖基化的不同、賴氨酸變異體和與作為異質(zhì)性來源的質(zhì)量變化較大相關(guān)的其它化學(xué)降解修飾。盡管異構(gòu)體的解卷ESI質(zhì)譜顯示其分子量相同，這些異構(gòu)體在其表面帶不同數(shù)目的正電荷(質(zhì)子)。完整抗體的RP層析譜在215nm用UV測(cè)定和總離子電流(TIC)測(cè)定進(jìn)行(圖3A)。ESI質(zhì)譜含有完整抗體的多電荷離子，以得到四種分離的異構(gòu)體。這些數(shù)據(jù)顯示較后洗出的形式帶大量正電荷(圖3B)。這表明，這些變異體有較大表面積，可能利于質(zhì)子進(jìn)入基本氨基酸殘基(Chowdhury和Chait，1991 Anal.Chem.，v.63，p.1660-1664；Dobo和Kaltashov，2001，Anal.Chem.，v.73，p.4763-4773；Fenn，1993，J.Am.Soc.Mass Spectrom.，v.4，p.524-535)。當(dāng)這些變異型從RP柱中洗出，型3具有帶大量電荷的較大表面積，而型1有較小表面積和更“折疊”結(jié)構(gòu)。與型1相比，型3帶有大量電荷的事實(shí)也可以從實(shí)驗(yàn)中得出，與型1相比，型3總離子電流(TIC)也較高，但UV吸光值較低。表明與型1的種類相比，型3的種類帶有大量電荷。在峰洗脫過程中通過峰的溶劑B濃度增加少于0.5％。因此，用于電噴霧的有機(jī)溶劑變化較小，應(yīng)該不會(huì)移動(dòng)m/z峰的信封構(gòu)象。對(duì)照實(shí)驗(yàn)用(結(jié)構(gòu)同源)IgG1抗體進(jìn)一步證實(shí)帶電荷狀態(tài)的不同不是由洗脫流動(dòng)相中有機(jī)溶劑百分比的較小不同而引起。
還原和烷化之后，異質(zhì)性消失，有還原二硫鍵的IgG2抗體RP層析譜特點(diǎn)是，輕鏈和重鏈均為單一窄峰(圖46)。這些發(fā)現(xiàn)再次顯示未覆蓋的IgG2抗體變異體有不同二硫化物連接或打開的二硫鍵。打開的二硫化物是一種可能性，因?yàn)殚_放的二硫鍵增加了2Da的質(zhì)量，這對(duì)完整抗體的MW 150kDa來說，在質(zhì)量測(cè)量的誤差范圍內(nèi)。結(jié)構(gòu)變異體與二硫鍵具有不同共價(jià)結(jié)構(gòu)相關(guān)，可在天然條件下通過CEX和在變性條件下通過RP層析分離。
將用于這個(gè)研究中的幾種IgG2和IgG1抗體的反相層析譜進(jìn)行比較。所有IgG1抗體作為單一峰洗出，而所有IgG2抗體，包括人血清中的骨髓瘤IgG2抗體，在相同層析條件下以多個(gè)變異體分離(圖44)。其結(jié)果表明，異質(zhì)性是免疫球蛋白γ分子的整個(gè)IgG2亞類的特點(diǎn)，包括人血清中的IgG2分子。
在IgG2重鏈中，CH1肽PLAPCSR作為輕重鏈的鏈間鍵殘基127-133(EU)的一部分鑒別，該肽的殘基C131與輕鏈連接。相似肽PLAPS131SL占據(jù)人IgG1重鏈的殘基(EU)中的殘基127至133的位置。
盡管IgG2抗體晶體結(jié)構(gòu)還沒有發(fā)表，在IgG1和IgG2抗體的初級(jí)序列之間的相似表明IgG1重鏈的S131位置可用來估計(jì)關(guān)于輕鏈半胱氨酸殘基214和重鏈226和229(鉸鏈區(qū))的IgG2重鏈的C131位置。從RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的進(jìn)入號(hào)碼1HZN下載(Saphire等人，2002，J.Mol.Biol.，v.319，p.9-18)，其人IgG1抗體近鉸鏈區(qū)的晶體結(jié)構(gòu)片段中，絲氨酸S131位置用來估計(jì)人IgG2的半胱氨酸C131位置(圖49)。晶體結(jié)構(gòu)顯示三個(gè)殘基LC C214、HC S131、HC C226互相之間非常接近(6之內(nèi))。這種接近使得它們與鉸鏈區(qū)的不同二硫鍵結(jié)構(gòu)交聯(lián)生成幾種共價(jià)結(jié)構(gòu)變異體。
發(fā)明人已得出的重要數(shù)據(jù)表明可在有或沒有離液劑(GuHCl)的參與下通過氧化還原劑(半胱氨酸/胱氨酸)處理IgG2溶液可以富集不同結(jié)構(gòu)形式。工作假說是，較少量的離液劑可能輕微干擾結(jié)構(gòu)并且改變半胱氨酸殘基在鉸鏈區(qū)的位置，而采用一種結(jié)構(gòu)形式。為了證實(shí)這個(gè)假說，根據(jù)在實(shí)驗(yàn)部分所述的步驟， 用半胱氨酸和胱氨酸混合物處理幾種IgG2抗體樣品。加入的GuHCl量為0M至1.4M。再折疊產(chǎn)量通過反相層析監(jiān)測(cè)(圖50)，顯示型1和型3在48小時(shí)內(nèi)優(yōu)先形成。用反相層析對(duì)比在哺乳動(dòng)物(CHO)細(xì)胞中生成的起始(未處理的)人源化IgG2抗體、在沒有GuHCl參與下的再折疊抗體和在1.0M GuHCl參與下的再折疊抗體，可看到型1在沒有GuHCl的時(shí)候形成較好。加入離液劑使型3的形成變得容易。型3的增加在1.0M GuHCl中最快。其它IgG2抗體再折疊可得到相似結(jié)果。使用精氨酸HCl作為變性劑的效果也在圖中評(píng)估和顯示(圖51)。與GuHCl相比，精氨酸-HCl是弱離液劑。
盡管受體結(jié)合和橋接測(cè)定表明在未處理材料和再折疊材料之間沒有顯著不同，以細(xì)胞為基礎(chǔ)的生物測(cè)定顯示各種異構(gòu)體呈現(xiàn)不同生物學(xué)活性。幾天之內(nèi)重復(fù)生物測(cè)定監(jiān)測(cè)IL-6和MMP-13水平得到一致結(jié)果(圖47)。與未處理的材料相比，型3活性平均高3.5倍，而型1僅僅是未處理的材料的生物活性的一部分(0.7)。因此，型3的活性比型1高七倍。根據(jù)反相層析譜，盡管沒有GuHCl參與的再折疊明顯增加型1，樣品中還是保留小部分型2和3。
也用DSC、CD和熒光檢測(cè)再折疊材料物理性質(zhì)的不同?？赏ㄟ^DSC發(fā)現(xiàn)型之間的最大不同，就是與對(duì)照和型-1相比，型3在較高溫度處僅有一個(gè)主要Tm。
實(shí)施例5實(shí)驗(yàn)證明，對(duì)IL-15起免疫反應(yīng)的IgG1在部分半胱氨?；闹劓溨泻凶杂砂腚装彼釟埢@個(gè)例子直接鑒定了人單克隆IgG1抗體，特別是146B7與IL-15有免疫反應(yīng)性。146B7 IgG1抗體用反相LC/MS分析完整抗體和用Lys-C蛋白酶進(jìn)行限制性蛋白水解后鑒定。這種IgG2在CDR3重鏈的位置104(C104)有一個(gè)自由半胱氨酸殘基。用可能在C104的Fab片段(+119Da)的最顯著的半胱氨酰化鑒別幾種修飾。大約60％的Fab片段半胱氨酰化。另外，可發(fā)現(xiàn)由末端甘氨酸殘基部分切割所致的C-末端甘氨酸變異。這種類型的變異通常在雜交瘤生成的IgG分子中。大約70％的IgG1樣品在每個(gè)重鏈都中沒有甘氨酸，20％在其中一條重鏈中有甘氨酸，10％在兩條重鏈中都有甘氨酸。可能在CDR區(qū)域的蛋氨酸殘基之一的FAB區(qū)域也檢測(cè)到顯著氧化(大約10％)。甚至在應(yīng)激下的樣品中也沒有檢測(cè)明顯到共價(jià)二聚體量。C104殘基不容易以IAA標(biāo)記，IAA表示自由半胱氨酸不容易進(jìn)入。
所檢測(cè)的IgG1抗體在CDR3重鏈的位置104有自由半胱氨酸。這個(gè)自由半胱氨酸可以是共價(jià)二聚作用的來源，導(dǎo)致在調(diào)制或貯存過程中的穩(wěn)定性問題。本例子的目的是建立氧化還原狀態(tài)和評(píng)估自由半胱氨酸對(duì)如IAA的烷化劑的可達(dá)性，在熱處理的樣品中鑒別可能的共價(jià)二聚體以及鑒定已知翻譯后修飾如甘氨酸變異體、糖型變異體(G0、G1、G2)和其它可能的修飾。
完整IgG1的反相LC-MS分析圖9所示的IgG1的RP層析譜與其它IgG1分子的層析譜相似。主要峰(峰3)由IgG分子組成。在峰3的頂端有峰分裂，可能是因?yàn)檫@個(gè)研究所揭示的異質(zhì)性。也可以另外兩個(gè)次要峰(峰1和2)。用精確質(zhì)量測(cè)量鑒別這些峰分別是輕鏈片段E1-G93/S94以及輕鏈的半胱氨?；问健Ｔ谄渌麵gG分子中觀察到少量自由輕鏈。
IgG2中發(fā)現(xiàn)的自由輕鏈(圖8中的峰2)存在半胱氨?；问?。半胱氨?；l(fā)生在輕鏈的自由C214殘基。這個(gè)殘基涉及輕鏈和重鏈之間的二硫鍵。由此C214半胱氨?；璧K輕鏈和重鏈之間的聯(lián)系。然而，在其它分子中也觀察到少量非半胱氨?；p鏈。在這個(gè)抗體樣品中用所述的RP LC/MS方法可立刻探測(cè)到輕鏈污染水平。在含有自由半胱氨酸的生理性蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)半胱氨?；?。在重組抗體中，在生產(chǎn)過程中引入半胱氨?；赡苁怯捎谔峁┙oCHO細(xì)胞的半胱氨酸和幾個(gè)其它氨基酸的加入。不同重組抗體的自由輕鏈中的半胱氨?；潭茸兓@示影響半胱氨?；囊恍┥a(chǎn)特性。這個(gè)觀察可能在理解IgG1重鏈的C104半胱氨?；兄档米⒁狻?br> 圖10所示為主峰的解卷質(zhì)譜圖。通常在IgG1分子中，觀察到因?yàn)橐换騼蓚€(gè)半乳糖殘基從二天線糖(biantennary sugar)丟失而導(dǎo)致幾個(gè)半乳糖變異體(G0、G1和G2)。這些變異體可通過相當(dāng)于半乳糖分子量162Da的特征性不同質(zhì)量而鑒別?？蓮膱D10看出在現(xiàn)有例子的IgG1中沒有觀察到這種典型模式。而是觀察到幾個(gè)相差140至150Da的峰。這個(gè)數(shù)據(jù)表明IgG1有其它來源的異質(zhì)性，以及解卷質(zhì)譜圖觀察到的質(zhì)量不同是隨著各種糖基化形式的額外修飾的一種總和效應(yīng)。這些額外異質(zhì)性可引起如甘氨酸變異體、半胱氨?；脱趸男揎?。
用Lys-C對(duì)IgG1進(jìn)行限制性蛋白水解后的反相LC-MS分析為了進(jìn)一步鑒定樣品，用Lys-C蛋白酶進(jìn)行限制性蛋白水解。當(dāng)用低濃度Lys-C時(shí)，優(yōu)先切割I(lǐng)gG1型分子鉸鏈區(qū)的重鏈甘氨酸(殘基223)，生成Fab和Fc片段。限制性蛋白水解通過從不同區(qū)域分離修飾以增強(qiáng)LC/MS分析，提高分辨力，因?yàn)榕c完整IgG相比，其片段較小。圖11所示為這個(gè)例子的Lys-C處理的IgG1反相層析譜。在一典型IgG1樣品中，觀察到相當(dāng)于Fab和Fc片段的兩個(gè)主要峰。然而，在當(dāng)前例子的IgG1中觀察到幾個(gè)峰，歸因于在這個(gè)樣品中所觀察到的額外修飾。圖12所示為峰1、2和3的解卷電噴霧電離(ESI)質(zhì)譜圖。這些峰的質(zhì)量與Fc片段質(zhì)量相符。
在層析峰1、2和3洗出的Fc片段的質(zhì)量不同大約為128道爾頓，與甘氨酸質(zhì)量相當(dāng)(128.2道爾頓)。甘氨酸變異體通常與雜交瘤細(xì)胞系生產(chǎn)的IgG相關(guān)，以及與羧肽酶B活性相關(guān)。146B7也在雜交瘤細(xì)胞系中生產(chǎn)，由此峰1、2和3為甘氨酸變異體。從質(zhì)量不同可以證實(shí)峰1在兩條重鏈的C末端有甘氨酸殘基。峰2在一條重鏈上有甘氨酸，峰3則沒有C末端殘基。除甘氨酸殘基之外，也觀察到相差162道爾頓的峰。這些峰與在二天線糖組分末端的一或兩個(gè)半乳糖分子丟失而引起的糖異質(zhì)性相符。這種異質(zhì)性在IgG1和IgG2分子的Fc片段中非常典型。沒有觀察到其它非典型糖修飾如雙角糖組分丟失。
圖13所示為圖11所示的峰5和7的解卷質(zhì)譜圖。峰7分子量為47281Da，與Fab(47282)理論分子量相符。峰5分子量為47401，比峰7大約高120道爾頓。120道爾頓的質(zhì)量與加入的半胱氨酸殘基相符。據(jù)報(bào)道，半胱氨酰化也出現(xiàn)在生理性蛋白質(zhì)的自由半胱氨酸。這個(gè)例子的IgG1在重鏈的CDR 3有自由半胱氨酸。這個(gè)自由半胱氨酸可能在生產(chǎn)過程中半胱氨?；?。從峰區(qū)測(cè)量可觀察到超過60％的分子出現(xiàn)半胱氨?；?。峰4和6的質(zhì)量分別與峰5和7有+16道爾頓的不同。這個(gè)質(zhì)量不同很可能與蛋氨酸殘基氧化相關(guān)。進(jìn)一步用肽圖實(shí)驗(yàn)鑒定氧化位點(diǎn)。
IAA 標(biāo)記研究進(jìn)行IAA標(biāo)記以探測(cè)重鏈殘基C104的可達(dá)性。在IAA標(biāo)記之前和之后，完整或Lys-C消化樣品的反相層析譜沒有檢測(cè)出不同。圖14所示為Lys-C限制性蛋白水解后的標(biāo)記和未標(biāo)記IgG1反相層析譜。
IAA標(biāo)記應(yīng)該增加58道爾頓。發(fā)明人在較早的結(jié)果中顯示，60％的IgG1半胱氨酰化，僅有40％可標(biāo)記。圖15所示為標(biāo)記和未標(biāo)記樣品的峰5解卷質(zhì)譜圖(代表自由半胱氨酸型)。標(biāo)記后沒有觀察到質(zhì)量轉(zhuǎn)變，表明自由半胱氨酸沒有標(biāo)記。
受熱應(yīng)激的IgG1 RP LC/MS分析IgG1應(yīng)激樣品在A5S緩沖液中45℃培育1個(gè)月。在殘基104的自由半胱氨酸涉及通過分子間二硫鍵的形成所致的共價(jià)二聚。這種二聚可在熱誘導(dǎo)的應(yīng)激中增強(qiáng)。分析熱應(yīng)激樣品推測(cè)可能的共價(jià)二聚體形成。圖16所示為146B7的應(yīng)激后與對(duì)照的反相層析譜。圖17為應(yīng)激樣品中鑒別的夾式結(jié)構(gòu)的示意圖。
應(yīng)激樣品的峰1和2是由于輕鏈夾E1-G93/S94(10,125Da)和10,107Da的脫水輕鏈夾。峰3含有重鏈N末端片段(E1-G138/G139)。在146B7 IgG1抗體應(yīng)激樣品的主峰可觀察到稍稍提前(峰4)。峰4包括“單臂抗體”Fab-Fc(圖17)和重鏈的小夾形結(jié)構(gòu)(E1-C221/D222)?！皝G失的臂”(Fab片段，圖17)與主峰一起洗出(峰5)。峰5的ESI質(zhì)譜圖顯示少量Fab夾形結(jié)構(gòu)和典型序列梯是由于在鉸鏈區(qū)的多切割位點(diǎn)而形成(數(shù)據(jù)未顯示)。圖16中的峰6包括抗體的共價(jià)二聚體。
因?yàn)樾盘?hào)強(qiáng)度非常低，不能得到好的解卷圖譜。然而，從ESI質(zhì)譜圖中，可在應(yīng)激和對(duì)照樣品中見到少量二聚體包圍。因?yàn)椴煌耆蛛x和強(qiáng)度低，不能進(jìn)行絕對(duì)定量。二聚體濃度非常低，低于1％，并且在熱應(yīng)激后沒有明顯增加。表格X中總結(jié)的是在146B7 IgG1抗體應(yīng)激樣品中鑒別的夾形結(jié)構(gòu)，圖17所示為抗體夾形結(jié)構(gòu)示意圖。
表X應(yīng)激樣品中發(fā)現(xiàn)的夾形結(jié)構(gòu)總結(jié)

在此IgG1的Fc和Fab片段中發(fā)現(xiàn)的異質(zhì)性是分子的獨(dú)特特性。為了證實(shí)在此IgG1中發(fā)現(xiàn)的異質(zhì)性不是方法誘導(dǎo)的，用其它IgG1分子進(jìn)行相似實(shí)驗(yàn)。圖18所示為四種不同IgG在限制性蛋白水解后的RP層析譜。Fc片段在IgG中高度同源，大約在14分鐘洗出。Fab區(qū)域含有可變區(qū)，在不同時(shí)間洗出。從圖19可觀察到，本例子中的IgG1 Fc和Fab片段中發(fā)現(xiàn)的異質(zhì)性是該分子的獨(dú)特特性。一些數(shù)據(jù)也證實(shí)一些修飾對(duì)這個(gè)分子來說是固有的而不是在分析過程中誘導(dǎo)生成的。
總結(jié)本例子的結(jié)果，顯示出C104半胱氨?；c本例子的IgG1有主要關(guān)系。C104在CDR3區(qū)出現(xiàn)和對(duì)該殘基的修飾影響配體結(jié)合。C104半胱氨?；牧吭诓煌鷮?shí)驗(yàn)有變化?？捎^察到調(diào)配劑中的幾種IgG分子的輕鏈半胱氨酰化存在批與批之間的明顯誤差。本文所述的方法使得這些抗體的再折疊方法，可消除自由半胱氨酸的半胱氨?；?。這些方法使得結(jié)構(gòu)異質(zhì)性減少和/或生物學(xué)活性增加和/或穩(wěn)定性和貯存時(shí)間改進(jìn)。這使得產(chǎn)品更均一。已觀察到是否待具體檢測(cè)和比較的抗原結(jié)合的半胱氨酰化。
實(shí)施例6通過反相LC/MS和其它技術(shù)監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)IgG1 CHO氧化還原再折疊改進(jìn)異質(zhì)性，消除半胱氨酰化，增加基于細(xì)胞的生物學(xué)活性。
如本文全文所討論，真核蛋白質(zhì)的原核重組生產(chǎn)受此事實(shí)阻礙，即在重組生產(chǎn)過程中，蛋白質(zhì)經(jīng)常錯(cuò)折疊和聚集成不溶的包函體。這些蛋白質(zhì)需要在離液劑和還原硫醇的存在下再折疊以得到全部生物學(xué)活性。直到最近，假定在真核宿主中生產(chǎn)的真核蛋白質(zhì)(例如，在CHO細(xì)胞生產(chǎn)的人或人源化抗體)均一正確地折疊。如以上例子所討論，幾種IgG2抗體再折疊以消除這些分子的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性，這種再折疊使得IgG2活性顯著增加。在本例子中，進(jìn)一步證明了IgG1抗體再折疊。這種IgG1在位置104含有不成對(duì)半胱氨酸。對(duì)用Lys-C蛋白酶進(jìn)行限制性蛋白水解后得到的完整抗體及其Fab和Fc片段，通過最近發(fā)展的反相LC/MS方法監(jiān)測(cè)再折疊過程，鑒定再折疊種類。
實(shí)施例4提供在本例中再折疊的IgG1抗體的詳細(xì)特征。經(jīng)鑒定這種抗體大約有60％的分子經(jīng)半胱氨?；揎?。通過限制性蛋白水解測(cè)定，發(fā)現(xiàn)這種修飾在抗體的Fab區(qū)。也顯示完整抗體存在至少兩種Fab同種型。其不同被認(rèn)為是由重鏈的104位置獨(dú)特的半胱氨酸所引起的額外半胱氨酰化和/或錯(cuò)折疊所致。另外，用相同材料進(jìn)行生物活性和橋接測(cè)定，顯示不典型結(jié)果。發(fā)明人認(rèn)為Fab的半胱氨?；赡苁沁@種意外性質(zhì)的原因。本例子從氧化再折疊的實(shí)驗(yàn)中提供更多特征性數(shù)據(jù)進(jìn)一步闡明這種影響，評(píng)估這種方法是否可使得IgG1的藥學(xué)特性得到改善。
再折疊步驟3mg/mL的IgG1在兩種緩沖液中培育1)200mM Tris緩沖液pH 8.0(天然再折疊)；2)含有0.9M GuHCl的200mM Tris緩沖液pH 8.0(GuHCl再折疊)。以大約6mM∶1mM的摩爾比分別加入半胱氨酸∶胱氨酸混合物。樣品在2-8℃放置48小時(shí)。于24小時(shí)和48小時(shí)取樣分析。
分析樣品在再折疊之前和之后通過如下技術(shù)分析1)陽離子交換(CEX)層析；2)完整分子的反相LC/MS分析；3)Lys-C蛋白酶的限制性蛋白水解，然后反相LC/MS分析所生成的Fab和Fc片段；4)對(duì)146B7 IgG1抗體原料和再折疊料作肽圖；5)生物學(xué)活性；6)尺寸排阻層析(SEC)；7)熒光和圓二色性光譜學(xué)。這些技術(shù)一般在以上一些實(shí)施例中討論，一些特殊特性提供如下。完整抗體的CEX分析。
用磷酸鈉和氯化鈉緩沖液在pH 7.2時(shí)進(jìn)行CEX分析。
用裝有3μm粒子的Zorbax 300SB C8 1×50mm反相層析柱分析樣品，以50ml/min的流速在75℃下進(jìn)行完整抗體的反相LC/MS分析。優(yōu)化方法使用包括異丙醇和乙腈混合物的靜止相。一Agilent 1100毛細(xì)管HPLC系統(tǒng)與一裝配有電噴霧電離(ESI)源的Micromass Q-TOF Micro質(zhì)譜儀聯(lián)機(jī)連接。ESI-Q-TOF質(zhì)譜儀設(shè)置成正離子模式，毛細(xì)管電壓為3400V，樣品圓錐電壓為70-100V，m/z范圍為1000-6000，以及質(zhì)量分辨力為5000。儀器用多電荷離子牛胰蛋白酶元，MW23981.0，Sigma T1143進(jìn)行調(diào)整和校準(zhǔn)。ESI質(zhì)譜圖解卷用MassLynx軟件的MaxEnt1算法進(jìn)行。
以上所述的條件也適用于Fab和Fc片段的RP LC/MS分析。
IgG1經(jīng)體內(nèi)蛋白酶Lys-C(Roche，Cat#1 420 429)在37℃下，pH 7.5，100mM TRIS緩沖液中進(jìn)行30分鐘限制性蛋白水解。消化在沒有變性的情況下進(jìn)行，其中酶和蛋白質(zhì)比率為1∶400(w∶w)。用這些條件能夠在沒有進(jìn)一步剪切下得到Fab和Fc片段。
在再折疊之前和之后用Glu-C蛋白酶對(duì)IgG1作肽圖。Glu-C蛋白酶消化在沒有還原和烷化的情況下，在pH 5的醋酸銨中進(jìn)行。在pH 5，Glu-C蛋白酶大部分在每個(gè)谷氨酸(E)的C-末端切割。LC/MS/MS分析在與一裝配有ESI源的ThermoFinnigan LCQ離子俘獲質(zhì)譜儀聯(lián)機(jī)連接的一Agilent HP 1100上進(jìn)行。
對(duì)于生物學(xué)活性測(cè)量，通過監(jiān)測(cè)IgG1與200pg/mL和50pg/mL的IL-15的劑量反應(yīng)以及通過測(cè)量生物效能進(jìn)行基于細(xì)胞的生物學(xué)活性測(cè)定。
用SEC層析對(duì)IgG1 CHO原料、GuHCl再折疊料和雜交瘤料進(jìn)行分離。這些組合物的每種取10ug注入(以分開的通道)一Phenomenex TSK Gel superSW3000柱(4.6mm×30cm顆粒大小4u)。流動(dòng)緩沖液為100mM磷酸鈉，150mMNaCl，pH 6.9，流速為0.25ml/min。
對(duì)于CD和熒光光譜學(xué)，將IgG1 CHO原料、GuHCl再折疊和雜交瘤樣品在A5S緩沖液中稀釋至終濃度為0.5mg/mL。在25℃下，在AVIV型202-01圓二色性分光光度計(jì)的250-200nm處收集CD光譜，所有樣品都使用0.2cm的路徑。在25℃下，AVIV ATF105熒光分光計(jì)在290nm處激發(fā)，收集熒光光譜，監(jiān)測(cè)500至300nm處發(fā)射光。
進(jìn)行以上技術(shù)并通過這些實(shí)驗(yàn)得到典型的以下結(jié)果和數(shù)據(jù)。
完整146B7氧化再折疊料的CEX圖19所示為IgG1 CHO原料和GuHCl再折疊的陽離子交換層析譜。層析譜顯示較早洗出(酸性)的峰在再折疊后消失。
圖20所示為完整IgG1氧化再折疊料的反相LC/MS分析的層析譜，顯示IgG1 CHO在氧化再折疊之前和之后的層析譜。對(duì)照樣品顯示兩個(gè)主峰帶有較小的峰后肩。圖20的再折疊材料大部分作為單一種類洗出，與對(duì)照中觀察到的較小峰后肩排列在一起。有或無GuHCl的再折疊IgG1 CHO樣品顯示出相似RP層析剖面圖。RP層析剖面圖的相似表明，與0M或0.9M GuHCl，有相同結(jié)構(gòu)和再折疊率的再折疊種類基本上相同。作為RP層析峰1從10.0至10.5分鐘洗出的種類的精確質(zhì)量測(cè)量，顯示這些抗體分子MW值與U.S.臨時(shí)申請(qǐng)60/621,295所討論的IgG2計(jì)算的分子量相比(也參見圖21)大約大240 Da。這里和隨后的分析鑒別這種質(zhì)量增加是因?yàn)閮蓚€(gè)不成對(duì)半胱氨酸殘基的半胱氨?；Ｔ?1和13分鐘之間洗出的峰2是兩個(gè)、單個(gè)和多個(gè)無半胱氨酰化的抗體分子的解卷。
圖22所示為IgG1 CHO對(duì)照(A)、GuHCl再折疊(B)和天然再折疊(C)的解卷電噴霧電離(ESI)質(zhì)譜圖。再折疊之后，樣品的MW值與計(jì)算的MW值在Q-TOF質(zhì)譜儀的+/-3Da精確度之內(nèi)相同和相等。(通過另外的外部校正進(jìn)行+14-Da更正。這種更正將圖22B、C所示的再折疊型的測(cè)量的MW值(147743Da)調(diào)節(jié)至147757Da，在計(jì)算的MW值147759Da的+/-3Da誤差范圍之內(nèi)?？笽L-1R抗體用于外部調(diào)節(jié)。)ESI質(zhì)譜圖顯示用半乳糖殘基(162Da)分離的幾個(gè)峰，為附著在抗體Fc片段的兩個(gè)糖組分的末端殘基。圖22中標(biāo)記的峰如G0-G0、G0-G1、G1-G1、G2-G1和G2-G2相當(dāng)于每個(gè)抗體分子具有0、1、2、3和4個(gè)總半乳糖殘基的糖基化結(jié)構(gòu)。圖23所示為包括多聚糖(G2-G2)結(jié)構(gòu)的IgG1結(jié)構(gòu)。半乳糖數(shù)目不同通常是所有抗體異質(zhì)性的一般來源，通過Q-TOF質(zhì)譜儀很容易分解。圖22A所示為在10至13分鐘洗出的完整IgG1 CHO原料的ESI質(zhì)譜圖。圖22A所示的質(zhì)譜圖顯示與半乳糖變異體一起洗出的有較高分子量的幾個(gè)額外組分。當(dāng)使用完整抗體分子時(shí)，會(huì)使較高級(jí)MW種類的鑒別復(fù)雜化。
為了進(jìn)一步鑒定樣品，用Lys-C蛋白酶進(jìn)行限制性蛋白水解。當(dāng)使用低濃度時(shí)優(yōu)先切割I(lǐng)gG1亞類鉸鏈區(qū)的重鏈甘氨酸，生成Fab和Fc片段。IgG1抗體用Lys-C切割生成一個(gè)Fc片段，計(jì)算的MW＝53488Da，以及兩個(gè)Fab片段，每個(gè)片段計(jì)算的MW＝47282(圖23)。限制性蛋白水解通過從不同區(qū)域分離修飾增強(qiáng)LC/MS分析，改善與完整IgG相比較小片段的分辨力。圖24所示為Lys-C處理的IgG1反相層析譜。在一個(gè)典型的IgG1樣品，觀察到的兩個(gè)主峰相當(dāng)于Fab和Fc片段。然而，在IgG1原料中觀察到兩個(gè)Fab峰，歸因于樣品中觀察到的附加修飾。再折疊料中的Fab片段大部分作為單一峰洗出，與總對(duì)照中觀察到的峰后肩排列在一起。圖25包括IgG1的Fab片段在再折疊之前和之后的解卷ESI質(zhì)譜圖。再折疊樣品中Fab片段所測(cè)量的質(zhì)量與計(jì)算的質(zhì)量一致，也與IgG1對(duì)照的Fab峰1的質(zhì)量一致(圖25)。對(duì)照樣品的Fab峰1MW值比計(jì)算值高118Da，證實(shí)Fab片段半胱氨酰化。
據(jù)報(bào)道，半胱氨?；谘h(huán)中有自由半胱氨酸的蛋白質(zhì)中，也在單克隆IgG中所檢測(cè)到的輕鏈的較少雜質(zhì)中觀察到。在制備過程中重組抗體中引入半胱氨酰化可能是因?yàn)榧尤肓伺嘤鼵HO細(xì)胞的半胱氨酸和其它氨基酸。圖24中作為峰1和峰2洗出的兩個(gè)Fab片段表現(xiàn)出較大的層析分離，應(yīng)該是由比半胱氨酰化更大結(jié)構(gòu)不同引起的。例如，半胱氨酰化和非半胱氨?；p鏈雜質(zhì)在RP層析譜中共同洗出。Fab片段洗脫時(shí)間的巨大不同是另一個(gè)線索，表明可能涉及二硫鍵不規(guī)則性。
圖26所示為IgG1對(duì)照(原料)和天然再折疊的非還原性Glu-C肽圖。盡管兩個(gè)肽圖排列幾乎一樣，還是有至少三個(gè)肽的強(qiáng)度不同，在圖25中用紅色箭頭標(biāo)記。這時(shí)可進(jìn)行二硫化物的進(jìn)一步鑒別和排列。
表格Y包括基于細(xì)胞的生物學(xué)測(cè)定結(jié)果，通過監(jiān)測(cè)IgG1與200pg/mL和50pg/mL IL-15的劑量反應(yīng)進(jìn)行。表格Z包括基于細(xì)胞的生物學(xué)效能測(cè)量的結(jié)果。兩種測(cè)定顯示出基于細(xì)胞的生物學(xué)活性在通過天然再折疊或GuHCl再折疊的再折疊后加倍。
表格Y.146B7對(duì)照、GuHCl再折疊和天然再折疊的生物測(cè)定結(jié)果。Nicholas Yeager進(jìn)行的測(cè)定。

表Z.146B7對(duì)照，GuHCl再折疊和天然再折疊的生物測(cè)定結(jié)果。

圖27所示為IgG1 CHO原料、GuHCl再折疊料和雜交瘤料的SEC層析譜。色譜圖表明，再折疊材料的保留時(shí)間延長，說明與大量雜交瘤中蛋白質(zhì)相關(guān)的構(gòu)象有變化。也觀察到再折疊材料的聚集峰減小。
圖28所示為CD和熒光光譜學(xué)分析。條A表明IgG1二級(jí)結(jié)構(gòu)在再折疊之后沒有變化。條B顯示相對(duì)于CHO原料和雜交瘤材料的再折疊后熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。這可能是因?yàn)榘l(fā)熒光的色氨酸殘基再折疊后微環(huán)境結(jié)構(gòu)改變。雜交瘤得到的蛋白質(zhì)熒光強(qiáng)度大于CHO原料蛋白質(zhì)。這與雜交瘤相對(duì)于CHO原料生物活性數(shù)據(jù)較大一致。雜交瘤所得到的蛋白質(zhì)在稀釋之前貯存在PBS pH 7.4，這個(gè)pH比CHO原料蛋白質(zhì)用的A5S貯存條件更有益于二硫化物交換反應(yīng)。在樣品之間的發(fā)射光最大波長沒有明顯變化，表明色氨酸環(huán)境極性保持一致。
總結(jié)以上研究，在收集以上數(shù)據(jù)過程中，得知IgG1 CHO原料結(jié)構(gòu)不均一，包括Fab片段中有半胱氨?；陌腚装彼岬姆肿印４蠹s60％的Fab片段半胱氨?；?。因?yàn)榘腚装滨；头前腚装滨；疐ab片段洗脫有很大不同，也因?yàn)樵诳?IL-15 IgG1中存在單一不成對(duì)半胱氨酸，發(fā)明人提議半胱氨?；c二硫鍵不規(guī)則性相關(guān)。IgG1原料在有或無離液劑(0.9M GuHCl和沒有GuHCl)的情況下再折疊。根據(jù)Q-TOF質(zhì)量分光光度計(jì)的精確質(zhì)量測(cè)量，兩種再折疊生成同源非半胱氨?；?46B7分子。24小時(shí)之后，大部分146B7原料再折疊成之后洗出的同源種類。48小時(shí)之后，再折疊基本完成。測(cè)量基于細(xì)胞的生物學(xué)活性，顯示出與沒有再折疊的IgG1 CHO原料相比，再折疊樣品高兩倍。
通過質(zhì)量分光儀測(cè)量鑒別，本例子中的數(shù)據(jù)顯示半胱氨?；N類從RP柱中洗出較早，且在再折疊后消失。在本研究中使用的RP LC/MS技術(shù)特別有效，因?yàn)殄e(cuò)折疊和半胱氨酰化明顯相關(guān)。
以上所示數(shù)據(jù)表明，再折疊IgG1分子在再折疊后更同源，更有活性。進(jìn)一步優(yōu)化和鑒定可在本文教導(dǎo)的研究和技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)行。
實(shí)施例7與白介素-15結(jié)合的重組抗體再折疊方法本實(shí)施例提供不同批146B7限制性蛋白水解，然后RP LC/MS分析的對(duì)比。在本例子列出的數(shù)據(jù)中，用限制性蛋白水解，然后RP LC/MS分析，將不同批的146B7在重鏈C104上的半胱氨?；竭M(jìn)行對(duì)比。也計(jì)算不同批的氧化、琥珀酰亞胺和半乳糖含量水平。半胱氨?；脱趸稽c(diǎn)用作肽圖鑒別。
不同批的半胱氨酰化、氧化、半乳糖含量和琥珀酰亞胺水平變化很大。在CHO和雜交瘤得到的材料存在顯著變化性。CHO所得的146B7再折疊導(dǎo)致半胱氨酰化丟失。再折疊不引起其它修飾，且肽圖上兩種材料看起來類似。對(duì)于雜交瘤、CHO PD和CHO PD再折疊材料，生物活性增加，半胱氨酰化量減少。

以上表格中，分別計(jì)算這些水平(三種修飾的百分比)，并不加至100％。例如，雜交瘤的13％的半胱氨?；肿右惭趸?，而其它87％的半胱氨酰化分子沒有氧化。
Hex I是每分子IgG的Hexose(半乳糖)分子的平均數(shù)量，IgG1半胱氨?；驮僬郫B的鑒定在以上其它例子中敘述。
這些實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)與例子4和5所示的一致。圖29顯示IgG1雜交瘤和CHO在限制性蛋白水解后的另一RP層析譜。半胱氨?；头前腚装滨；慰闪⒖谭蛛x和定量。圖30所示為IgG1再折疊之前和之后的RP層析譜，顯示出再折疊制劑中缺乏Fab-Cys。在標(biāo)記有NEM的自由半胱氨酸的IgG1非還原肽圖，CHO材料在再折疊之前和之后的肽圖看起來類似。IgG1原料含有豐富C104半胱氨?；囊鹊鞍酌鸽腉99-K122，在17分鐘洗出。再折疊后，半胱氨?；呢S度減少，非半胱氨?；呢S度增加。非半胱氨?；挠肗EM標(biāo)記，防止其在還原、烷化和消化中與其它半胱氨酸殘基混淆。圖30所示為用在pH5標(biāo)記有NEM的半胱氨酸的胰蛋白酶作IgG1非肽圖。半胱氨?；恢媒?jīng)鑒定在重鏈的C104位置。也鑒定出重鏈CDR2的蛋氨酸48氧化(圖32)。根據(jù)非還原肽圖，重鏈CDR2的小部分M48被氧化。氧化肽在98分鐘洗出，非氧化肽在110分鐘洗出。從圖32中可觀察到，重建的離子層析譜和碎片質(zhì)譜圖顯示大約10％的M48被氧化。
實(shí)施例8為了加工規(guī)模擴(kuò)大的A蛋白柱上的重組抗體再折疊貫穿本申請(qǐng)的數(shù)據(jù)顯示，IgG2的一般純化，在本文所述的RP HPLC方法可觀察到三個(gè)峰。另外，用有GuHCl或無GuHCl的還原/氧化劑可使三個(gè)峰轉(zhuǎn)變?yōu)榉?或峰3。抗體群的異質(zhì)性是由于二硫鍵不規(guī)則性。這種異質(zhì)性可通過本文所述的再折疊消除。從一些生物活性數(shù)據(jù)來看，層析譜上峰1洗出的抗體群更穩(wěn)定，而峰3洗出的在還原氧化后有相對(duì)穩(wěn)定性，但最有活性。
在本例子中，提供的數(shù)據(jù)顯示IgG分子在柱上再折疊。更具體地，A蛋白親和柱設(shè)計(jì)成IgG還原氧化或再折疊載體。柱的樹脂可以處理1-2M GuHCl，以及如半胱氨酸/胱氨酸的還原劑。樹脂在pH 7.2或以上運(yùn)行，這種pH很適合分離的IgG還原-氧化步驟。
1.溶液中的還原氧化或再折疊

以上表格提供可用于溶液中再折疊IgG的再折疊反應(yīng)混合物典型的組分。為了使以上技術(shù)適用于柱上處理，以下表格提供A蛋白親和柱上的IgG2的氧化還原處理參數(shù)。
2.A蛋白親和柱上的IgG2氧化還原方法條件


純化的IgG1樣品與不同濃度的氧化還原對(duì)在pH 7和8時(shí)和在不同時(shí)間處理。在一些典型的研究中，處理在2-8℃下持續(xù)24小時(shí)?？赏ㄟ^降低樣品的pH值至大約pH 5停止反應(yīng)。生物活性測(cè)定以未處理IgG1的活性百分比表示(參見以下表格)。也進(jìn)行室溫、實(shí)驗(yàn)時(shí)間較短(如，3小時(shí))等氧化還原條件，這些條件被發(fā)現(xiàn)提高146B7的生物活性。
表氧化還原后基于細(xì)胞的生物測(cè)定活性或效能

在圖34中，可觀察到通過DSC測(cè)量，在氧化還原處理后IgG1熔點(diǎn)升高，顯示較高的熱穩(wěn)定性。為了得到這些數(shù)據(jù)，IgG1與6mM半胱氨酸，0.6mM胱氨酸，pH 8，在2-8℃下過夜處理。
IgG1在不添加氧化劑的情況下，也與還原劑單獨(dú)處理，如以上表格的實(shí)驗(yàn)#10所示。在這個(gè)例子中，純化的IgG1與1.5mM半胱氨酸在2-8℃下培育過夜。其活性升高2倍。一些實(shí)施例包括使用還原劑和氧化劑，并可包括抗體再折疊單獨(dú)使用還原劑進(jìn)行。
如一些實(shí)施例中討論，再折疊可通過在細(xì)胞培養(yǎng)，抗體中單獨(dú)加入再折疊劑或甚至通過使用含有氧化還原劑的柱分離抗體得到。在一些典型的實(shí)施例中，IgG1在生成它的細(xì)胞培養(yǎng)基中再折疊。澄清細(xì)胞培養(yǎng)基與氧化還原對(duì)處理(6mM半胱氨酸，0.6mM胱氨酸，2-8℃過夜)。然后用蛋白質(zhì)親和層析純化IgG1。在這個(gè)具體情況下，可觀察到在SEC-HPLC上再折疊的保留時(shí)間移動(dòng)(圖35)。再折疊的IgG2在SEC-HPLC上一致顯示保留時(shí)間較長，這種SEC-HPLC方法可用于再折疊指示測(cè)定方法。
在規(guī)模較大的IgG1抗體生產(chǎn)中，在一些實(shí)施例中，預(yù)期氧化還原處理步驟可在陽離子交換層析步驟之前立刻進(jìn)行抗體再折疊，以消除自由半胱氨酸的半胱氨?；?。這樣生成的抗體群結(jié)構(gòu)異質(zhì)性減少，和/或生物學(xué)活性增高和/或穩(wěn)定性和貯存時(shí)間改善。
實(shí)施例9抗-IL15 IgG1抗體再折疊的穩(wěn)定性研究變性曲線可用于估算蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定性，以及很適合測(cè)量在化學(xué)或構(gòu)象結(jié)構(gòu)不同的蛋白質(zhì)之間的穩(wěn)定性不同(Pace，C.N.，Methods in enzymology 1986 vol.131，267-280.)。在使平衡曲線可配合具體伸展機(jī)制的情況下，自伸展?fàn)顟B(tài)可得到伸展自由能或天然構(gòu)象比伸展?fàn)顟B(tài)較穩(wěn)定多少。通常所做的是蛋白質(zhì)在不同濃度的化學(xué)變性劑中伸展和平衡，和每個(gè)變性劑濃度下記錄的分光計(jì)信號(hào)。在了解曲線的折疊區(qū)(天然基線)和未折疊區(qū)(伸展基線)信號(hào)的情況下，平衡常數(shù)(以及由此的自由能變化)可在伸展轉(zhuǎn)變區(qū)內(nèi)的每個(gè)變性劑濃度下得到。自由能變化值可推斷出沒有變性劑而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)在水中伸展的自由能變化。
不同分光計(jì)方法將在不同的伸展情況下使用，例如，熒光計(jì)用于探測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)伸展，而圓二色性用于監(jiān)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)的伸展。對(duì)于該方法更完全的描述，請(qǐng)參見以上引用的原文。
對(duì)于抗-IL-15 IgG1在氧化還原處理之前和之后的對(duì)比，1mg/mL蛋白質(zhì)在鹽酸胍中平衡過夜，鹽酸胍濃度如圖中表格所示。然后樣品經(jīng)在295nm激發(fā)和在360nm監(jiān)測(cè)熒光發(fā)射來分析(見圖36)。也通過在218nm監(jiān)測(cè)CD來記錄CD數(shù)據(jù)(數(shù)據(jù)未顯示)。遺憾地，在將FL和CD數(shù)據(jù)到伸展部分規(guī)格化后，從兩個(gè)分光計(jì)探針的信號(hào)沒有重疊，這表明非兩種狀態(tài)伸展轉(zhuǎn)變，該轉(zhuǎn)變?cè)诖藭r(shí)不容易適于得出可以在氧化還原和非氧化還原樣品之間對(duì)比的自由能差。然而，F(xiàn)L圖，顯示氧化還原處理樣品的這種轉(zhuǎn)變中點(diǎn)(Cm)比非氧化還原處理的原料高，表明氧化還原處理的146B7 IgG1抗體穩(wěn)定性比非氧化還原處理的樣品大。試驗(yàn)中觀察到熱變性的Tm移動(dòng)也支持這個(gè)結(jié)果，然而，沒有足夠適合的數(shù)據(jù)并考慮到在m值明顯不同，只能說明在氧化還原和非氧化還原處理的146B7 IgG1蛋白質(zhì)平衡伸展中有明顯不同。
進(jìn)行快速穩(wěn)定性研究比較非氧化還原處理的原料IgG1和氧化還原處理的146B7 IgG1抗體。兩種蛋白質(zhì)在A5S緩沖液(10mM醋酸鈉，pH 5，5％山梨醇)中配制成100mg/mL，在以下溫度貯存-80、4、29、37和45℃。在不同時(shí)間點(diǎn)兩種蛋白質(zhì)樣品取樣分析降解。所用方法是尺寸排阻層析(SEC)監(jiān)測(cè)高分子量聚集和低分子量片段，SDS-PAGE和顆粒大小用以測(cè)量不溶聚集。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)也測(cè)量蛋白質(zhì)濃度和pH。圖37是三個(gè)月時(shí)間點(diǎn)的SEC代表數(shù)據(jù)，顯示非氧化還原處理樣品比氧化還原處理的抗-IL-15 IgG1在所有液體溫度下有以較快速率聚集的傾向。每個(gè)樣品的剪切反應(yīng)保持相同(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例10完整IgG4的富集族群生產(chǎn)本例子通過將IgG4半分子再折疊成共價(jià)結(jié)合的完整IgG4分子，直接生產(chǎn)共價(jià)結(jié)合完整單克隆IgG4抗體富集族群。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生產(chǎn)的重組單克隆IgG4是含有IgG4半分子和共價(jià)結(jié)合的完整分子的IgG4分子的異種族群。這種異種族群是在變性劑的存在下，與還原氧化劑接觸生成完整IgG4分子。在進(jìn)行氧化還原處理后，抗體在穩(wěn)定緩沖液(低pH，液體或凍干)中配制，防止半分子進(jìn)一步形成。共價(jià)結(jié)合的完整單克隆IgG4抗體是那些有兩條重鏈和兩條輕鏈的抗體。IgG4半分子有一條重鏈和一條輕鏈。半分子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)中和循環(huán)中與完整分子一起生成。半分子是IgG4亞類走向商業(yè)藥物的主要障礙之一。
人IgG4抗體是免疫球蛋白γ的單一亞類，因?yàn)樗哂袔追N獨(dú)特性質(zhì)。首先，它不能沉淀純化抗原[Aalberse and Schuurman，Immunology 2002，105，9-19；Schuurman等人，Immunology 1999，97，693-698]。這可能由IgG4抗體不能與兩種抗原交聯(lián)并開始生成復(fù)合物引起。人血清IgG4稱為功能性單價(jià)。據(jù)報(bào)道，在免疫球蛋白γ所有亞類中，IgG4僅有少量(如果有)能激活補(bǔ)體，如，可從[Jefferis andLund，Immunol.Lett.2002，82，57-65；Hulett and Hogarth，Adv.Immunol.1994，57，1-127]調(diào)整的表I中看到。這個(gè)獨(dú)特性質(zhì)使得IgG4成為在治療應(yīng)用中有吸引力的候選抗體，因其僅需要結(jié)合配體，而不是可導(dǎo)致不必要的免疫反應(yīng)的復(fù)合物。
表1人IgG-Fc效應(yīng)物配體識(shí)別特異性

從文獻(xiàn)[4]更新，LGL，大顆粒淋巴細(xì)胞；NK，自然殺傷細(xì)胞以及，根據(jù)FcγRIIa同種異型另外，IgG4分子具有以下第二個(gè)獨(dú)特性質(zhì)IgG4分子進(jìn)行IgG4分子中的半分子體內(nèi)交換(HL)[Aalberse and Schuurman，Immunology 2002，105，9-19]。這種交換是有可能的，因?yàn)镮gG4分子由兩個(gè)非共價(jià)結(jié)合的半分子組成。在這些IgG4分子中，在兩條重鏈鉸鏈區(qū)的鏈問二硫鍵移動(dòng)形成鏈內(nèi)鍵。已有報(bào)道，25-75％的IgG4分子片段僅僅為重鏈間的非共價(jià)作用結(jié)合。這些IgG4分子在通常體外生理?xiàng)l件下非常穩(wěn)定，因?yàn)镃H3結(jié)構(gòu)域之間，或者可能CH1和CH2結(jié)構(gòu)域的非共價(jià)作用很強(qiáng)。Aalberse和Schuurman[Immunology 2002，105，9-19]建議，在內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)體路徑中的IgG4轉(zhuǎn)變過程中，這種交換通過蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶(PDI)和/或FcRn(主要組織兼容性復(fù)合物(MHC)相關(guān)的Fc受體)在體內(nèi)催化。也有人提出IgG4重鏈間的二硫鍵與鏈內(nèi)二硫鍵平衡[Schuurman等人，Mol.Immunol.2001，38，1-8]。
這種非共價(jià)結(jié)合IgG4抗體作不完全交換的能力在以下情況與生物學(xué)相關(guān)，即發(fā)現(xiàn)對(duì)在相同時(shí)間和地點(diǎn)偶然出現(xiàn)在體內(nèi)的兩種不相關(guān)抗原的IgG4過激反應(yīng)[Aalberse和Schuurman，Immunology 2002，105，9-19]。在這種情況下，抗體-抗原復(fù)合物能形成并引起免疫原反應(yīng)。這已被Schuurman等人的實(shí)驗(yàn)證實(shí)[Immunology1999，97，693-698]，在研究中顯示在有屋塵螨和菁草花粉的IgG4抗體的病人血清中IgG4交聯(lián)兩種不同抗原。也發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)IgG4分子大片段有兩個(gè)不同的抗原結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致雙特異性。這個(gè)特性代表給遭受屋塵螨，菁草花粉或蜂螫引起的過敏的病人注射IgG4分子有潛在風(fēng)險(xiǎn)，可能有多克隆或第二單克隆IgG4。發(fā)明人從以下觀察中[Aalberse and Schuurman，Immunology 2002，105，9-19；Schuurman等人，Immunology 1999，97，693-698.]提出建議，IgG4半分子是不合乎藥物應(yīng)用需要的種類，因?yàn)樗鼈兡苄纬呻p特異性抗體，在循環(huán)中壽命較短[Angal等人，Mol.Immunol.1993，30，105-108]。實(shí)際上在選擇臨床發(fā)展的藥物中，已考慮到IgG4組分，但認(rèn)為不合乎需要，因?yàn)殡p特異性可由特異治療性IgG4與循環(huán)中可存在的其它IgG4半分子進(jìn)行半分子交換引起。
Angal及其合作者在IgG4的鼠/人嵌合重鏈中將絲氨酸在鉸鏈區(qū)基序-CPSC-變異成脯氨酸(在IgG1和IgG2的相同位置發(fā)現(xiàn))[Angal等人，Mol.Immunol.1993，30，105-108]。這個(gè)單一殘基變異可生產(chǎn)同種同型二聚體IgG4抗體。與原始嵌合IgG4相比，這個(gè)單一點(diǎn)變異導(dǎo)致血清半衰期顯著延長和組織分布改善。
假定本發(fā)明以上觀察和構(gòu)思是關(guān)于IgG1和IgG2分子再折疊，則提出通過將半分子再折疊成共價(jià)結(jié)合的完整分子的IgG4抗體，可為共價(jià)結(jié)合完整單克隆IgG4抗體富集含有IgG4半分子和完整IgG4的異種族群IgG4分子。哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的單克隆IgG4含有半分子和共價(jià)結(jié)合分子，將在變性劑的存在下與還原氧化劑接觸，主要生成IgG4同型二聚體分子。進(jìn)行氧化還原處理之后，抗體應(yīng)該能夠在穩(wěn)定緩沖液(低pH，液體或凍干)中配制，防止更多半分子形成。以下圖38和圖39所示為IgG4抗體的詳細(xì)反相LC/MS分析，用于分離和鑒別半IgG4分子和完整IgG4分子。
已知這些發(fā)現(xiàn)，建議可調(diào)節(jié)上述IgG1和IgG2分子的再折疊實(shí)驗(yàn)，以與所觀察的IgG1和IgG2再折疊相似方式生產(chǎn)適當(dāng)?shù)腎gG4分子再折疊。
實(shí)施例11結(jié)晶特性改善的再折疊抗體本發(fā)明的方法所應(yīng)用的另一領(lǐng)域是抗體晶體形成的領(lǐng)域?？贵w結(jié)晶發(fā)展受限于這些在構(gòu)象、二硫化物連通性、糖變異體(glycovariant)和電荷變異體(chargevariant)方面的大分子不均勻性。IgG分子結(jié)晶已經(jīng)初步限定為Fab片段、Fc片段、片段與配體或Fc受體的復(fù)合物、完整IgG1和完整鼠IgG2a(非完整人IgG2)。之前的完整抗體結(jié)晶專利敘述了球形納米結(jié)晶組合蛋白質(zhì)顆粒和結(jié)晶配方[AltusWO0272636(A2，A3)和WO0300014(A2)]，已經(jīng)在有限的治療性IgG1抗體例子中成功，這些治療性抗體稱為因福利美(Infliximab(Remicade))、利妥昔單抗(Rituximab(Rituxan))和曲妥珠單抗(Trastuzumab(Herceptin))。
高分子量蛋白質(zhì)的反相HPLC分析的最新分析進(jìn)展顯示IgG2抗體的二硫化物異質(zhì)性[Dillon等人，U.S.臨時(shí)申請(qǐng)60/621,295和PCT/US05/001840]。以上敘述了蛋白質(zhì)再折疊方法，該方法通過加入還原/氧化(氧化還原)劑使天然狀二硫鍵形成變得容易，得到具有藥物特性有改善的分子結(jié)構(gòu)同種活性型。本例子在結(jié)晶特性有提高的再折疊抗體應(yīng)用上提供一些數(shù)據(jù)。
如PCT/US05/001840和U.S.臨時(shí)申請(qǐng)60/621,295所述，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及引入或優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組分，包括如以下營養(yǎng)成分 半胱氨酸、胱氨酸、胱胺、谷胱苷肽、銅和/或其它氧化劑，以及不同的緩沖液組合物，以得到適合氧化還原電勢(shì)，用于分泌至培養(yǎng)基中的產(chǎn)物再折疊。第二方面是引入與常規(guī)包函體微生物再折疊不同的蛋白質(zhì)氧化再折疊的分離方法步驟。本發(fā)明的第三方面是在結(jié)晶溶液中直接加入氧化還原劑，以便錯(cuò)折疊的蛋白質(zhì)可以在溶液中再折疊并附著在生長的晶體上，提高結(jié)晶產(chǎn)量。
本例子提供的數(shù)據(jù)證實(shí)再折疊的完整IgG2成功結(jié)晶。IgG1再折疊消除半胱氨?；沧C實(shí)活性和同源性提高[參見以上例子]，以及正在進(jìn)行的結(jié)晶研究證明再折疊IgG1提高該亞類的結(jié)晶特性。在分離方法步驟的發(fā)酵中或在結(jié)晶溶液中，通過再折疊可能生成藥物和結(jié)晶特性提高的產(chǎn)物，包括同源性、活性/效能、穩(wěn)定性、晶體生長和結(jié)晶產(chǎn)量提高。
在最初篩選中，在以下條件下將50mg/mL的抗IL.1R IgG2抗體再折疊得到晶體?？笽L-1R IgG2抗體在變性劑的參與下再折疊組裝成型3，如上所述。
1.50mM氯化鉀，20％PEG 3350 pH 2.02.50mM氯化鉀，24％PEG 3350 pH 2.03.50mM MES，20％PEG 3350 pH 6.05.50mM MES，24％PEG 3350 pH 6.06.1.13M磷酸Na-K，0.1M二甲基胂酸Na pH 5.5，0.69％MEGA-7*(取自Anatrace基于糖的去污劑)7.2.12M醋酸鈉，0.65％MEGA-7*(取自Anatrace基于糖的去污劑)。
圖41-43所示數(shù)據(jù)，顯示在以上條件下形成的IgG2晶體是球形晶體，證明本發(fā)明的方法提供IgG的同源制劑，可形成完整抗體的均一晶體。
根據(jù)本發(fā)明的揭示，在實(shí)驗(yàn)方法適當(dāng)?shù)那闆r下，所有本文所揭示和要求保護(hù)的組合物和/或方法均可制備和實(shí)施。雖然通過一些實(shí)施例業(yè)已隊(duì)本發(fā)明的組合物和方法作了敘述，但對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說將會(huì)明顯地看到，在不脫離本發(fā)明的概念、經(jīng)審計(jì)范圍的情況下，對(duì)本文所述的組合物和/或方法以及方法步驟或者方法步驟的順序均可作出變型。更具體地說，化學(xué)和生理上相關(guān)的一些試劑可以代替本文所述的試劑，而能達(dá)到相同或相似的結(jié)果。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的所有這樣的相似取代和改型均被認(rèn)為是在如所附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的精神、范圍和概念之內(nèi)。
本文全文所引用的參考文獻(xiàn)，在提供了典型的方法上或本文所提出的一些補(bǔ)充的其它細(xì)節(jié)方面來說，全部納入本文作為參考。
權(quán)利要求
1.一種IgG抗體制劑的制備方法，所述的方法包括以下步驟使由哺乳動(dòng)物細(xì)胞重組制備的純化IgG抗體制劑在pH大約為5至11下與還原/氧化耦合劑接觸；和使所述制劑在與所述還原/氧化耦合劑接觸之前、之后或同時(shí)選擇地進(jìn)一步與離液劑接觸。
2.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述的IgG抗體選自由如下組成的組IgG1、IgG2、IgG3和IgG4抗體或其具有異質(zhì)性的片段。
3.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述的IgG抗體是IgG2抗體，其在RP-HPLC上洗脫成幾種單獨(dú)類型以及所述的方法減少在RP-HPLC上洗脫的多種類型，或改變?cè)谒鯮P-HPLC上幾種單獨(dú)類型的相關(guān)分布。
4.如權(quán)利要求3的方法，其特征在于，通過RP-HPLC測(cè)定，所述的方法優(yōu)先富集所述制劑中的至少一種所述的單獨(dú)類型。
5.如權(quán)利要求4的方法，其特征在于，所述的優(yōu)先富集類型與沒有經(jīng)所述方法處理的制劑相比有藥學(xué)上所需的特性。
6.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述的IgG抗體是重組IgG1抗體，至少有一個(gè)半胱氨酸殘基或至少有一個(gè)半胱氨酸殘基的重組IgG1抗體的片段。
7.如權(quán)利要求6的方法，其特征在于，所述的方法不包括使所述的制劑與離液劑接觸。
8.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述的IgG抗體是IgG4抗體，所述的方法減少IgG4半分子的形成。
9.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述的還原/氧化耦合劑的pH大約為5至10。
10.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述的還原/氧化耦合劑的pH大約為7.6至9.6。
11.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述的還原/氧化耦合劑的pH大約為8.6。
12.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述的還原/氧化耦合劑包括還原谷胱苷肽和氧化谷胱苷肽。
13.如權(quán)利要求12的方法，其特征在于，所述的還原谷胱苷肽與氧化谷胱苷肽比大約為1∶1至100∶1。
14.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述的還原/氧化耦合劑包括半胱氨酸/胱氨酸。
15.如權(quán)利要求14的方法，其特征在于，所述的半胱氨酸/胱氨酸包括大約為0.1mM至10mM的半胱氨酸。
16.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述的氧化還原耦合劑包括大約為0.1mM至10mM胱氨酸和不加入外生的半胱氨酸。
17.如權(quán)利要求14的方法，其特征在于，所述的半胱氨酸/胱氨酸以半胱氨酸∶胱氨酸比大約為1∶1至10∶1存在。
18.如權(quán)利要求14的方法，其特征在于，所述的半胱氨酸/胱氨酸包括大約6mM半胱氨酸和大約1mM胱氨酸。
19.如權(quán)利要求14的方法，其特征在于，所述的半胱氨酸/胱氨酸包括大約6mM半胱氨酸和大約6mM胱胺。
20.如權(quán)利要求14的方法，其特征在于，所述的接觸步驟至少進(jìn)行30分鐘。
21.如權(quán)利要求20的方法，其特征在于，所述的接觸步驟大約進(jìn)行4至48小時(shí)。
22.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述的重組IgG抗體在所述的接觸之前純化。
23.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述的重組IgG抗體在所述的接觸之前部分純化。
24.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述的方法還包括使接觸的重組IgG抗體與包括第二還原/氧化耦合劑的另一組合物接觸。
25.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于，在所述的方法之前，以一種方法使所述的IgG抗體從哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中分離，該方法包括，培養(yǎng)在培養(yǎng)基中表達(dá)和分泌IgG抗體或IgG抗體片段的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；在pH大約為5至11下，加入還原/氧化耦合劑，并在所述細(xì)胞分泌抗體時(shí)可選擇地包括離液劑。
26.如權(quán)利要求1和25的方法，其特征在于，所述的純化包括一步或多步層析步驟。
27.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述的重組IgG抗體濃度大約為1mg/ml和50mg/ml。
28.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述的接觸產(chǎn)生IgG抗體，與沒有接觸的相同IgG抗體相比，其貯存更穩(wěn)定。
29.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述的接觸產(chǎn)生IgG抗體，與沒有接觸的相同IgG抗體相比，其熱穩(wěn)定性更好。
30.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述的接觸產(chǎn)生IgG抗體，與沒有接觸的相同IgG抗體相比，其結(jié)晶特性得到改善。
31.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述的接觸產(chǎn)生IgG抗體族群，與沒有接觸的相同IgG抗體族群相比，其同種性更好。
32.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述的接觸產(chǎn)生IgG抗體，與沒有接觸的相同IgG抗體相比，其生物學(xué)活性至少提高2倍。
33.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于，在與所述的還原/氧化耦合劑接觸之前、之后或同時(shí)，使所述的IgG抗體進(jìn)一步與離液劑接觸。
34.如權(quán)利要求33的方法，其特征在于，所述的離液劑選自由以下組成的組脲、精氨酸、SDS和鹽酸胍。
35.如權(quán)利要求34的方法，其特征在于，所述的離液劑包括鹽酸胍。
36.如權(quán)利要求35的方法，其特征在于，所述的鹽酸胍濃度大約為0.1M至1.5M。
37.如權(quán)利要求35的方法，其特征在于，所述的鹽酸胍濃度大約為0.1M至1M。
38.如權(quán)利要求35的方法，其特征在于，所述的鹽酸胍濃度大約為0.5M。
39.如權(quán)利要求35的方法，其特征在于，所述的鹽酸胍濃度大約為0.9M。
40.如權(quán)利要求33的方法，其特征在于，與還原/氧化耦合劑接觸和進(jìn)一步與所述的離液劑接觸產(chǎn)生IgG抗體，與沒有接觸的相同IgG抗體相比，其生物學(xué)活性至少提高3倍。
41.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求33的方法，其特征在于，所述的方法還包括將如所述的方法生產(chǎn)的IgG抗體配制成消毒原料形式。
42.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求33的方法，其特征在于，所述的方法還包括將如所述的方法生產(chǎn)的IgG抗體配制成消毒單位劑量形式。
43.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求33的方法，其特征在于，所述的方法還包括分離有所需再折疊構(gòu)象的經(jīng)接觸的IgG抗體片段。
44.如權(quán)利要求43的方法，其特征在于，所述的分離方法選自由以下組成的組反相層析(HPLC)、尺寸排阻層析、離子交換層析、疏水作用層析、親和層析和電泳。
45.如權(quán)利要求43的方法，其特征在于，所述的分離方法是離子交換層析。
46.一種根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求33制備的IgG抗體制劑，所述的制劑具有所述的IgG抗體同種族群。
47.如權(quán)利要求46的制劑，其特征在于，所述的制劑還包括藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
48.一種組合物，所述的組合物包括重組IgG抗體的同種族群和藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
49.如權(quán)利要求48的組合物，其特征在于，所述的重組IgG抗體是IgG1抗體。
50.如權(quán)利要求48的組合物，其特征在于，所述的重組IgG抗體是IgG2抗體。
51.如權(quán)利要求48的組合物，其特征在于，所述的重組IgG抗體是IgG4抗體。
52.一種需要IgG的患者的治療方法，所述的方法包括給予所述患者有效量的如權(quán)利要求49-51的任一權(quán)利要求所述的IgG同種族群。
53.如權(quán)利要求52的方法，其特征在于，所述的給藥是皮下或靜脈內(nèi)給藥。
54.一種重組IgG抗體在其生產(chǎn)、配制和/或貯存過程中的質(zhì)量檢測(cè)或監(jiān)控方法，所述的包括以下步驟a)使由哺乳動(dòng)物細(xì)胞重組制備的所述IgG制劑在pH大約為5至11下與還原/氧化耦合劑接觸，以及在與所述還原/氧化耦合劑進(jìn)行所述接觸之前、之后或同時(shí)可選擇地使所述制劑與離液劑進(jìn)一步接觸；b)將已經(jīng)根據(jù)步驟a)處理的IgG分子切成片段；和c)使完整IgG和/或從步驟b)得到的片段進(jìn)行層析分析，由此檢測(cè)或監(jiān)控所述IgG分子的質(zhì)量。
55.如權(quán)利要求54的方法，其特征在于，所述的IgG抗體是IgG1抗體，所述的質(zhì)量監(jiān)控包括監(jiān)控所述IgG1抗體的自由或不成對(duì)半胱氨酸狀態(tài)。
56.如權(quán)利要求54的方法，其特征在于，所述的IgG抗體是IgG2抗體，所述的質(zhì)量監(jiān)控包括監(jiān)控所述的IgG2型的數(shù)量以測(cè)定制劑的異質(zhì)性。
57.如權(quán)利要求54的方法，其特征在于，所述的IgG分子是IgG4分子，所述的質(zhì)量監(jiān)控包括監(jiān)控所述的IgG4半分子的存在。
58.如權(quán)利要求54的方法，其特征在于，所述的層析包括LC/MS分析。
59.如權(quán)利要求54的方法，其特征在于，所述的檢測(cè)或監(jiān)控在IgG分子的純化步驟中進(jìn)行，所述的純化包括柱層析。
60.一種重組IgG抗體或IgG抗體片段的制備方法，所述的方法包括以下步驟使由哺乳動(dòng)物細(xì)胞重組制備的IgG抗體或IgG抗體片段在pH大約為5至11下與還原/氧化耦合劑接觸；以及，在與所述還原/氧化耦合劑進(jìn)行所述接觸之前、之后或同時(shí)，可選擇性地使所述IgG抗體或IgG抗體片段與離液劑進(jìn)一步接觸。
61.如權(quán)利要求60所述的方法，其特征在于，在所述的方法之前，以一種方法使所述的IgG抗體或IgG抗體片段從哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中分離，其方法包括培養(yǎng)在培養(yǎng)基中表達(dá)和分泌IgG抗體或IgG抗體片段的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；在pH大約為5至11下，加入還原/氧化耦合劑并在所述細(xì)胞分泌抗體時(shí)可選擇地包括離液劑。
62.如權(quán)利要求60的方法，其特征在于，所述的重組IgG抗體是IgG1。
63.如權(quán)利要求60的方法，其特征在于，所述的重組IgG抗體是IgG2。
64.如權(quán)利要求60的方法，其特征在于，所述的重組IgG抗體是IgG4。
65.一種完整重組結(jié)晶型IgG抗體的制備方法，其特征在于，所述的方法包括實(shí)施權(quán)利要求1或60的方法；和制備所述的重組結(jié)晶型IgG抗體。
66.如權(quán)利要求65的方法，其特征在于，所述的方法還包括在使所述抗體結(jié)晶之前，分離如權(quán)利要求1或權(quán)利要求60的方法制備的重組IgG抗體。
67.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于，將所述的重組IgG抗體放在層析柱的靜止相上，而氧化還原劑和離液劑是流動(dòng)相的一部分。
68.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述的還原/氧化耦合劑是酶。
69.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述的還原/氧化耦合劑包括二價(jià)金屬離子和氧。
70.一種IgG抗體制劑的制備方法，所述的方法包括以下步驟使由哺乳動(dòng)物細(xì)胞重組制備的IgG抗體分離制劑，在pH大約為5至11下，與還原/氧化耦合劑接觸；和與所述還原/氧化耦合劑進(jìn)行所述接觸之前、之后或同時(shí)，可選擇地進(jìn)一步使所述制劑通過高壓變性。
71.一種IgG抗體或其片段的制備方法，所述的方法包括以下步驟培養(yǎng)在培養(yǎng)基中表達(dá)和分泌IgG抗體或IgG抗體片段的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；在pH大約為5至11下，加入還原/氧化耦合劑，和在自所述細(xì)胞分泌抗體時(shí)可選擇地包括離液劑；以及籍此制備的IgG抗體或其片段，與沒有經(jīng)過所述還原/氧化耦合劑和可選擇的離液劑處理的IgG抗體或其片段相比，其藥學(xué)和結(jié)晶特性提高。
72.在一種以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為基的重組IgG抗體或重組IgG抗體片段的制備方法中，其特征在于，所述的改進(jìn)包括在pH大約為5至11下，將還原/氧化耦合劑加到用于所述的IgG抗體或所述的IgG抗體片段制備的培養(yǎng)基中；以及在所述培養(yǎng)基中分泌所述的IgG抗體或所述的IgG抗體片段時(shí)，可選擇地加入離液劑。
全文摘要
本發(fā)明一般涉及IgG蛋白質(zhì)的較佳型的富集或回收提高的制備方法。更具體地，本發(fā)明涉及使這種重組蛋白質(zhì)制劑經(jīng)受還原/氧化耦合劑和可選擇地經(jīng)受離液劑。
文檔編號(hào)C07K1/00GK101072790SQ200580042095
公開日2007年11月14日 申請(qǐng)日期2005年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月22日
發(fā)明者T·狄龍, D·雷德爾, P·邦達(dá)連科, M·里奇, H·S·加吉爾, D·班克斯, J·周, 呂越峰 申請(qǐng)人:埃姆艮股份有限公司