專利名稱：一種分離純化6－姜酚的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及天然藥物領(lǐng)域，具體涉及有效成分6-姜酚的分離方法，即利用多種色譜手段有序聯(lián)用分離中藥姜中有效成分6-gingerol的方法。
背景技術(shù)：
生姜及干姜分別為姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的新鮮根莖及干燥根莖，均為常用中藥。姜中的主要成分為揮發(fā)油類成分、姜辣素類成分以及二苯基庚烷類成分。其中姜辣素類成分含量大，具有明顯的辣味及生物活性，經(jīng)現(xiàn)代研究證實具有多方面的藥理活性，可作為生姜及干姜藥理活性及質(zhì)量控制的研究依據(jù)。姜辣素類成分種類很多，其中含量最高的為6-gingerol，其中文名有6-姜酚，6-姜醇等多個，命名存在一定混亂，故此本專利以其英文名為準。因此，6-gingerol的分離純化對推進姜類中藥的藥理研究和質(zhì)量控制有明顯的意義。
6-gingerol因其分子中有8-羥基酮結(jié)構(gòu)，理化性質(zhì)不穩(wěn)定，而且與多種結(jié)構(gòu)類似的化學成分并存，分離難度較大。國外某些公司有商品化6-gingerol對照品供應(yīng)，但售價昂貴，每20mg單價在200美元左右。而國內(nèi)已有分離方法往往要采用某些分離能力較高但產(chǎn)量較小的方法如薄層刮板法和分析型HPLC法。
CN1616391A公開了一種從姜中分離6-姜酚的方法，其先從姜的丙酮提取物中得到姜油樹脂，再經(jīng)硅膠柱色譜分離、HPLC分離。原料為丙酮浸泡所得姜油樹脂，得率較低，成份相對復雜，不利于后續(xù)的分離。它在第一步硅膠分離時，洗脫劑采用正己烷和乙醚的混合溶液，價格昂貴，而且極具揮發(fā)性，比例在色譜過程中易發(fā)生變化。在HPLC分離步驟中，采用的是水-甲醇-冰醋酸的混合流動相，這導致后處理步驟繁瑣，降低了得率，增加了成本。
也有文獻報導(結(jié)晶姜酚的制取與鑒定，《食品與工業(yè)發(fā)酵》2005年第31卷第10期p48-50)，其第一、二步同CN1313391A，其用干法柱層析，如文獻所述，700g硅膠僅載樣20g，這種方法不利于較大規(guī)模的應(yīng)用。另外，文獻采用制備薄層及Sephadex LH 20柱層析方法對第一步硅膠柱層析中所得6-gingerol粗品進行精制。制備薄層法載樣量少，分離能力有限，僅適用于實驗室少量制備用。Sephadex LH 20柱層析所用填料昂貴，操作時間長，分離效能低，不適合大規(guī)模應(yīng)用。另外，文獻對最后進行正己烷重結(jié)晶步驟沒有特別說明。經(jīng)實驗證實，在僅加熱的情況下，6-gingerol在正己烷中溶解情況不好。
很明顯，由于成本和產(chǎn)量的制約，以6-gingerol為基礎(chǔ)開展姜類中藥的藥理研究和質(zhì)量控制目前還難以實現(xiàn)。
我國超臨界流體萃取研究始于20世紀80年代初，目前已進入商品應(yīng)用階段，市場上已有成熟商品姜超臨界流體萃取物供應(yīng)。超臨界流體萃取技術(shù)由于溫度低，且系統(tǒng)密閉，可大量保存對熱不穩(wěn)定及易氧化的6-gingerol，為6-gingerol的分離純化創(chuàng)造了良好的先決條件。所以如何以姜超臨界流體萃取物為基礎(chǔ)，恰當應(yīng)用多種色譜手段的組合，研究一種快速、易于操作、成品質(zhì)量好且產(chǎn)量較大的制備6-gingerol的方法，是本技術(shù)領(lǐng)域面臨的主要問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的固有不足，公開了一種快速、易于操作、成品質(zhì)量好且產(chǎn)量較大的制備姜中主要活性成分6-gingerol的方法。
本發(fā)明從姜超臨界流體萃取物中分離純化6-姜酚的方法，依次包括下列步驟a、硅膠柱色譜分離；b、HPLC純化；c、重結(jié)晶，其中a步驟中梯度洗脫的洗脫劑為石油醚和乙酸乙酯的混和溶液。
發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，利用文獻報道的乙醚正己烷混合溶劑作為洗脫劑價格昂貴，而且極具揮發(fā)性，比例在色譜過程中易發(fā)生變化。發(fā)明人也曾嘗試過很多種洗脫劑，最后發(fā)現(xiàn)，用石油醚和乙酸乙酯混合溶液作為洗脫劑不僅價格低廉，而且色譜過程中其組成變化較小。本步驟的收率可以達到4～7％，遠遠高于用乙醚正己烷混合溶劑洗脫的收率。
由于6-gingerol在常溫下為油狀液體，易溶于各種中高極性的有機溶劑，難溶于水及正己烷。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，6-gingerol以超聲為輔助手段的條件下，可以在沸騰的正己烷中溶解，在冰箱中靜置后6-gingerol以白色之黃白色結(jié)晶狀態(tài)析出，產(chǎn)品純度可進一步提高，而且產(chǎn)品外觀良好。因此，本發(fā)明重結(jié)晶所用溶劑是正己烷，采用沸水和超聲并用以助溶。實驗證明，每100ml正己烷可以溶解約1g 6-gingerol，適合批量制備。
在本發(fā)明中，HPLC純化時所用的流動相優(yōu)選甲醇。本發(fā)明使用的是單一甲醇流動相，后處理簡單，且所回收甲醇可以考慮重復利用，具有一定環(huán)保因素。
上述制備方法中，a步驟后還可以進一步包括硅膠柱色譜精制步驟，精制步驟的洗脫劑為石油醚和丙酮的混和溶液。精制步驟可使最終成品的純度達98％以上，而沒有精制過程的成品最后純度為95％以上。
上述制備方法中，石油醚和乙酸乙酯的體積比優(yōu)選為5～9∶1。
上述制備方法中，石油醚和丙酮的體積比優(yōu)選為4～8∶1本發(fā)明更優(yōu)選的制備方法依次包括如下步驟a、硅膠柱色譜分離以姜超臨界流體萃取物為原料，拌樣，以層析用硅膠作為固定相，梯度洗脫，洗脫劑為石油醚和乙酸乙酯混和溶液，收集含有6-姜酚部分，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，即得6-姜酚粗品；b、硅膠柱色譜精制將a步所制得的6-姜酚粗品拌樣，以層析用硅膠作為固定相，洗脫劑為石油醚和丙酮混和溶液，收集其中主要色帶，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，即得6-姜酚精制品；c、HPLC純化將b步所得6-姜酚精制品用甲醇溶解，以制備HPLC純化，流動相為純甲醇，收集主要色譜峰，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，即得6-姜酚純品；d、重結(jié)晶將c步所得6-姜酚純品用正己烷重結(jié)晶，用正己烷溶解6-姜酚時采用沸水和超聲兩種手段并用以助溶。
本發(fā)明的制備方法易于操作、成品質(zhì)量好且產(chǎn)量高。尤其是通過精制步驟的產(chǎn)品所制備的6-gingerol純度達98％以上。本發(fā)明的產(chǎn)品收率遠遠高于現(xiàn)有技術(shù)中的收率。各步驟中的收率如下步驟硅膠粗分硅膠精制制備HPLC重結(jié)晶收率4-7％ 約30％ 30-50％ 50-60％具體實施方式
實施例1(1)硅膠柱色譜初步分離以商品姜超臨界流體萃取物300g為原料，以100～200目柱層析硅膠200g拌樣，以100～200目柱層析用硅膠2kg作為固定相，梯度洗脫，洗脫劑極性依次為石油醚∶乙酸乙酯＝12∶1，石油醚∶乙酸乙酯＝9∶1及石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1，收集石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1部分，TLC檢驗合并，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，即得6-gingerol粗品16.5g，收率5.5％。其純度在65％以上(HPLC檢驗，面積歸一化法)。
(2)硅膠柱色譜精制將上步所制得的6-gingerol粗品拌樣，以200～300目層析用硅膠作為固定相，硅膠用量為所用6-gingerol粗品的20倍，洗脫劑為石油醚∶丙酮＝4∶1，收集其中主要色帶，TLC檢驗合并，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，即得6-gingerol精制品6.5g，收率39％。其純度在80％以上(HPLC檢驗，面積歸一化法)。
(3)制備HPLC純化將上步所得6-gingerol精制品用適量甲醇溶解，0.45μm微孔濾膜濾過，以Angilent1100系列制備HPLC純化，流動相為純甲醇，固定相為C18，流速10mL/min，紫外檢測器，檢測波長為254nm，收集主要色譜峰，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，即得6-gingerol純品2g，收率30％。其純度在96％以上(HPLC檢驗，面積歸一化法)。
(4)重結(jié)晶將上步所得6-gingerol純品用正己烷重結(jié)晶。
重結(jié)晶步驟為將沸水加入超聲清洗器，將6-gingerol純品中加入100mL正己烷，超聲條件下溶解。待完全溶解后，立即置于冰箱冷凍室中(約-10℃)，靜置過夜，則可見微黃白色至白色6-gingerol結(jié)晶析出。約1.2g，收率60％。其純度在98％以上(HPLC檢驗，面積歸一化法)。
實施例2(1)硅膠柱色譜初步分離以商品姜超臨界流體萃取物250g為原料，以100～200目柱層析硅膠200g拌樣，以100～200目柱層析用硅膠1.5kg作為固定相，梯度洗脫，洗脫劑極性依次為石油醚∶乙酸乙酯＝12∶1，石油醚∶乙酸乙酯＝9∶1及石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1，收集石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1部分，TLC檢驗合并，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，即得6-gingerol粗品約12g，收率4.8％。其純度在65％以上(HPLC檢驗，面積歸一化法)。
(2)硅膠柱色譜精制將上步所制得的6-gingerol粗品拌樣，以200～300目層析用硅膠作為固定相，硅膠用量為所用6-gingerol粗品的15倍，洗脫劑為石油醚∶丙酮＝5∶1，收集其中主要色帶，TLC檢驗合并，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，即得6-gingerol精制品約4g，收率33％。其純度在80％以上(HPLC檢驗，面積歸一化法)。
(3)制備HPLC純化將上步所得6-gingerol精制品用適量甲醇溶解，0.45μm微孔濾膜濾過，以Angilent1100系列制備HPLC純化，流動相為純甲醇，固定相為C18，流速10mL/min，紫外檢測器，檢測波長為254nm，收集主要色譜峰，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，即得6-gingerol純品約2g，收率50％。其純度在95％以上(HPLC檢驗，面積歸一化法)。
(4)重結(jié)晶將上步所得6-gingerol純品用正己烷重結(jié)晶。
重結(jié)晶步驟為將沸水加入超聲清洗器，將6-gingerol純品中加入100mL正己烷，超聲條件下溶解。待完全溶解后，立即置于冰箱冷凍室中(約-10℃)，靜置過夜，則可見微黃白色至白色6-gingerol結(jié)晶析出。約1.3g，收率65％。其純度在98％以上(HPLC檢驗，面積歸一化法)。
實施例3(1)硅膠柱色譜初步分離以商品姜超臨界流體萃取物100g為原料，以100～200目柱層析硅膠60g拌樣，以100～200目柱層析用硅膠1.0kg作為固定相，梯度洗脫，洗脫劑極性依次為石油醚∶乙酸乙酯＝12∶1，石油醚∶乙酸乙酯＝9∶1及石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1，收集石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1部分，TLC檢驗合并，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，即得6-gingerol粗品。約為6.5g，得率6.5％，其純度在65％以上(HPLC檢驗，面積歸一化法)。
(2)制備HPLC純化將上步所得6-gingerol粗品用適量甲醇溶解，0.45μm微孔濾膜濾過，以Angilent1100系列制備HPLC純化，流動相為純甲醇，固定相為C18，流速10mL/min，紫外檢測器，檢測波長為254nm，收集主要色譜峰，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，即得6-gingerol純品。約為2g，得率31％，其純度在85％以上(HPLC檢驗，面積歸一化法)。
(4)重結(jié)晶將上步所得6-gingerol純品用正己烷重結(jié)晶。
重結(jié)晶步驟為將沸水加入超聲清洗器，將6-gingerol純品中加入100mL正己烷，超聲條件下溶解。待完全溶解后，立即置于冰箱冷凍室中(約-10℃)，靜置過夜，則可見微黃白色至白色6-gingerol結(jié)晶析出。最后得到成品1.2g，得率60％，其純度在95％以上(HPLC檢驗，面積歸一化法)。
權(quán)利要求
1.一種從姜超臨界流體萃取物中分離純化6-姜酚的方法，依次包括下列步驟a、硅膠柱色譜分離；b、HPLC純化；c、重結(jié)晶；其特征是a步驟中梯度洗脫的洗脫劑為石油醚和乙酸乙酯的混和溶劑。
2.權(quán)利要求1的方法，其中重結(jié)晶所用溶劑是正己烷，并采用沸水和超聲并用以助溶。
3.權(quán)利要求1的方法，在a步驟后還包括硅膠柱色譜精制步驟，精制步驟的洗脫劑為石油醚和丙酮的混和溶劑。
4.權(quán)利要求1的方法，其中HPLC純化時所用的流動相為甲醇。
5.權(quán)利要求1的方法，其中石油醚和乙酸乙酯的體積比為5～9∶1。
6.權(quán)利要求3的方法，其中石油醚和丙酮的體積比為4～8∶1。
7.權(quán)利要求1至6的任一項的方法，依次包括下列步驟a、硅膠柱色譜分離以姜超臨界流體萃取物為原料，拌樣，以層析用硅膠作為固定相，梯度洗脫，洗脫劑為石油醚和乙酸乙酯混和溶劑，收集含有6-姜酚部分，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，即得6-姜酚粗品；b、硅膠柱色譜精制將a步所制得的6-姜酚粗品拌樣，以層析用硅膠作為固定相，洗脫劑為石油醚和丙酮混和溶劑，收集其中主要色帶，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，即得6-姜酚精制品；c、HPLC純化將b步所得6-姜酚精制品用甲醇溶解，以制備HPLC純化，流動相為純甲醇，收集主要色譜峰，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，即得6-姜酚純品；d、重結(jié)晶將c步所得6-姜酚純品用正己烷重結(jié)晶，用正己烷溶解6-姜酚時采用沸水和超聲兩種手段并用以助溶。
全文摘要
本發(fā)明涉及天然藥物領(lǐng)域，具體涉及有效成分6－姜酚的分離方法，本發(fā)明利用多種色譜手段有序聯(lián)用分離中藥姜中有效成分6－gingerol，本發(fā)明的分離方法快速、易于操作、成品質(zhì)量好且產(chǎn)量較大。
文檔編號C07C45/00GK1994997SQ200610161540
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月27日
發(fā)明者李萍, 王偉, 李沁, 楚楚 申請人:中國藥科大學