專利名稱：：作為抗腫瘤劑的喹喔啉衍生物的制作方法作為抗腫瘤劑的喹喔啉衍生物政府資助本文工作，全部或者部分，是在國立癌癥研究院資金1R01CA97061-01的資助下完成的。美國聯(lián)邦政府在本發(fā)明中享有一定權(quán)利。發(fā)明背景許多用于治療疾病的藥物是以疾病細胞和正常細胞間的普遍差異作為靶標(biāo)。例如，用于治療卵巢癌和乳腺癌并抑制微管功能的紫杉醇，被認為基于腫瘤細胞相對正常細胞更高的增殖率而顯示對腫瘤細胞的特異性(Miller和Ojima,Chem.Rec.1:195-211，2002)。然而，盡管這是一致的觀點，紫杉醇的體外活性在不同腫瘤細胞系間差別很大(Weinstein等人，Science275:343-349,1997)，表明遺傳因子可以調(diào)節(jié)腫瘤細胞對紫杉醇的敏感性，并且腫瘤細胞的反應(yīng)性不是簡單的決定于增殖率。分子靶向治療代表了抗癌藥物開發(fā)的一種有前途的新方法(Shawver等人，CancerCell1:117-23,2002)。利用這個方法，設(shè)計小分子用于直接抑制特定腫瘤細胞類型中突變或者過表達的癌蛋白。通過靶向于腫瘤細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的特定分子缺陷，這種方法最終可以產(chǎn)生適于特定治療各種腫瘤遺傳組成的方法。近來成功的兩個分子靶向抗癌治療劑的例子是Gleevec(甲磺酸伊馬替尼imatinibmesylate)，一種在費城染色體陽性慢性髓性白血病中發(fā)現(xiàn)的斷裂點簇集區(qū)-abelsen激酶(BCR-ABL)癌蛋白的抑制劑(Capdeville等人，NatRevDmgDiscov1:493-502,2002),和Herceptin(曲妥單抗trastuzumab),—種耙向在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中發(fā)現(xiàn)的HER2/NEU癌蛋白的單克隆抗體(Mokbel和Hassanally,CurrMedResOpin17:51-9，2001)。一種互補的策略涉及尋找基因型選擇性的抗腫瘤試劑，所述試劑只有在特定癌蛋白存在或者特定腫瘤抑制物缺失的條件下對腫瘤細胞才是致死性的。這種基因型選擇性化合物可以直接靶向癌蛋白，或者他們可以耙向其他參與癌蛋白相聯(lián)信號網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵蛋白。已報道的顯示合成致死性的化合物包括(i)雷帕霉素類似物CCI-779在缺少PTEN的骨髓瘤細胞中(Shi等人，CancerRes62:5027-34，2002)，(ii)Gleevec在BCR-ABL-轉(zhuǎn)化細胞中(Druker等人，NatMed2:561-6,1996)，和(iii)大量未充分表征的化合物(Stockwell等人,ChemBiol6:71-83，1999;Torrance等人，NatBiotechnol19:940-5,2001)。盡管有上述研究，仍然非常需要開發(fā)和/或鑒定能夠選擇性靶向腫瘤細胞的化合物。發(fā)明簡述利用一種合成致死篩選法，尤其是合成致死高通量篩選法，這種方法可有效鑒定用于治療或者預(yù)防病癥或者疾病的試劑或者藥物，所述病癥或者疾病例如腫瘤或者其他以細胞增生為特征的病癥(例如白血病)的存在或者發(fā)展，申請人已經(jīng)鑒定出大量化合物/試劑/藥物用于在個體中治療或者預(yù)防癌癥(例如腫瘤或者白血病)，所述個體例如需要治療或者預(yù)防的人。本發(fā)明還提供與一些鑒定出的有治療價值的化合物/試劑直接或者間接結(jié)合的細胞蛋白。這種細胞蛋白提供治療以細胞增生(例如白血病)為特征的疾病或者病癥的其他方法。此處使用的術(shù)語"試劑"和"藥物"可以互換使用；它們可以是化合物或者分子。在一個實施方案中，本發(fā)明指向此處公開的化合物，包括它的鹽。在另一個實施方案中，本發(fā)明指向藥物組合物，包括藥學(xué)上可接受的載體和此處公開的化合物。仍在另一個實施方案中，本發(fā)明是一種促進細胞死亡的方法，包括對細胞給藥有效量的此處公開的化合物。一方面，本發(fā)明是一種鑒定候選抗腫瘤試劑的方法，包括以下步驟a)在合適條件下用足量待測試劑接觸細胞；b)檢測待測試劑是否增強或者抑制erastin結(jié)合蛋白的水平或者編碼erastin結(jié)合蛋白的核酸的水平。該方法還可以包括以下步驟a)用腫瘤細胞接觸待測試劑(體內(nèi)或者體外)；b)檢測待測試劑是否抑制腫瘤細胞的生長。另一方面，本發(fā)明是一種鑒定候選抗腫瘤試劑的方法，包括a)用待測試劑接觸erastin結(jié)合蛋白或者表達erastin結(jié)合蛋白的細胞，其中erastin結(jié)合蛋白或者待測試劑可選用可檢測標(biāo)記物標(biāo)記；b)檢測待測試劑是否結(jié)合erastin結(jié)合蛋白。該方法還可以包括a)用腫瘤細胞接觸待測試劑(體內(nèi)或者體外)；b)檢測待測試劑是否抑制腫瘤細胞的生長。使用不同的待測試劑文庫，可重復(fù)上述兩種方法。另一方面，本發(fā)明涉及鑒定化合物的篩選方法，所述化合物殺傷或者抑制致瘤細胞的生長，例如工程化致瘤細胞，但不是它們對應(yīng)的同源正常細胞。該方法已經(jīng)用于鑒定已知的和新的具有基因型-選擇活性的化合物，包括已知的化合物阿霉素、柔紅霉素、米托蒽醌、喜樹堿、桑吉瓦霉素、棘霉素、波凡霉素、NSC146109和新的化合物即此處的erastin。這些化合物在一種或者多種下列物質(zhì)存在的情況下具有增加的活性hTERT癌蛋白，SV40大T癌蛋白(LT)，小T癌蛋白(ST)，人乳頭狀瘤病毒類型16(HPV)E6癌蛋白，HPVE7癌蛋白,和致癌的HRAS，NRAS禾PKRAS。申請人檢測到hTERT和E7或者LT的過表達增加拓撲異構(gòu)酶2a的表達，以及在表達hTERT的細胞中過表達的RASV^和ST增加拓撲異構(gòu)酶1的表達并且使細胞致敏到erastin起始的非凋亡細胞死亡步驟。本發(fā)明涉及一種鑒定試劑(例如藥物)的方法，所述試劑對致瘤細胞有選擇毒性(例如殺傷或者抑制生長)，例如工程化致瘤細胞，包括人致瘤細胞(例如工程化致瘤細胞和/或腫瘤細胞)。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及鑒定選擇性殺傷或者抑制工程化人致瘤細胞生長(有毒的)的試劑(例如藥物)，包括用候選試劑接觸作為待測細胞的工程化人致瘤細胞；檢測與候選試劑接觸的待測細胞的活性；將待測細胞的活性與合適對照的活性進行比較。在所有實施方案中，通過檢測試劑(例如藥物)殺傷細胞或者抑制細胞生長/增殖以及兩者兼有的能力來評定活力。如果待測細胞的活力低于對照細胞，則鑒定出對工程化人致瘤細胞具有選擇毒性(殺傷或者抑制生長)的試劑(例如藥物)。適當(dāng)?shù)膶φ帐桥c待測細胞相同類型的細胞，除了對照細胞未被工程化為致瘤的。例如，對照細胞可能是衍生出待測細胞的親本原代細胞。對照細胞在與待測細胞相同的條件下接觸候選試劑。適當(dāng)?shù)膶φ湛梢酝瑫r進行，或者預(yù)先確立(例如，預(yù)先確立的標(biāo)準(zhǔn)或者參考)。'在一個實施方案中,鑒定對致瘤細胞有選擇毒性的試劑的方法還包括評定試劑的毒性，所述試劑經(jīng)鑒定是在適當(dāng)?shù)膭游锬Ｐ偷墓こ袒酥铝黾毎蛘咂渌幕诩毎蛘呋诜羌毎捏w系或者試驗中篩選的結(jié)果。例如，如此鑒定的試劑或者藥物可以評定其對諸如從個體獲得的腫瘤細胞或者白血病細胞的毒性或者對(一種或者多種)癌(腫瘤)細胞系的毒性。例如，本方法還可以包含在合適的小鼠模型或者非人靈長類動物中評定試劑(或者藥物)對致瘤細胞的選擇毒性。本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)通過本發(fā)明方法鑒定的試劑(例如藥物)的方法，例如對工程化人致瘤細胞具有選擇毒性的試劑(例如藥物)。利用已知方法合成對致瘤細胞顯示選擇毒性的試劑(例如藥物)。本發(fā)明另外還涉及鑒定對工程化致瘤細胞有毒性的試劑(例如藥物)的方法，例如工程化人致瘤細胞。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及鑒定殺傷或抑制工程化人致瘤細胞的生長(對其有毒性)的試劑的方法，包括將待測細胞與候選試劑接觸，所述待測細胞是工程化的人致瘤細胞；檢測與候選試劑接觸的待測細胞的活性；將待測細胞的活性與合適對照的活性進行比較。如果待測細胞的活力低于對照細胞，則鑒定出對工程化人致瘤細胞具有毒性(殺傷或者抑制生長)的試劑(例如藥物)。這里，適當(dāng)?shù)膶φ帐桥c待測細胞相同類型的細胞(例如工程化人致瘤細胞)，除了對照細胞未與候選試劑接觸。適當(dāng)?shù)膶φ湛梢酝瑫r進行，或者預(yù)先確立(例如，預(yù)先確立的標(biāo)準(zhǔn)或者參考)。例如，如此鑒定的試劑或者藥物可以評定其對諸如從個體獲得的腫瘤細胞或者白血病細胞的毒性或者對(一種或者多種)癌(腫瘤)細胞系的毒性。在一個實施方案中,鑒定對工程化致瘤細胞有毒性的試劑的方法還包括評定試劑的毒性，所述試劑是在適當(dāng)?shù)膭游锬Ｐ突蛘咂渌幕诩毎蛘呋诜羌毎捏w系或者試驗中的工程化人致瘤細胞中篩選的結(jié)果所鑒定的。例如，本方法還包括在適當(dāng)?shù)男∈竽Ｐ突蛘叻侨遂`長類動物中評定試劑(例如藥物)對致瘤細胞的毒性。本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)本發(fā)明方法鑒定的試劑(例如藥物)的方法，例如對工程化人致瘤細胞具有毒性的試劑(例如藥物)。利用已知方法合成對致瘤細胞顯示毒性的試劑(例如藥物)。在另一個實施方案中，本發(fā)明是一種降低腫瘤生長率的方法，包括給藥足夠降低腫瘤生長率的量的治療試劑，其中治療試劑是(a)增強或者抑制VDAC蛋白水平的試劑；(b)增強或者抑制VDAC蛋白活性的試劑；(c)結(jié)合VDAC蛋白的試劑；(d)結(jié)合和/或調(diào)節(jié)包括至少一個VDAC和任選一個或多個其他蛋白的蛋白復(fù)合物的試劑；(e)包括VDAC多肽或者其功能變異體的試劑；(f)包括編碼VDAC多肽或者其功能變異體的核酸的試劑；合適的試劑在現(xiàn)有形式、或者完全或部分新陳代謝后具有所述活性。一方面，本發(fā)明是一種治療癌癥患者的方法，包括對患者給藥選自以下的治療試劑，(a)增強或者抑制VDAC蛋白水平的試劑；(b)增強或者抑制VDAC蛋白活性的試劑；(c)結(jié)合VDAC蛋白的試劑；(d)結(jié)合和/或調(diào)節(jié)包括至少一種VDAC和任選一或多種其他蛋白的蛋白復(fù)合物的試劑；(e)包括VDAC多肽或者其功能變異體的試劑；(f)包括編碼VDAC多肽或者其功能變異體的核酸的試劑；合適的試劑在現(xiàn)有形式、或者完全或部分新陳代謝后具有所述活性。適合用于降低腫瘤生長率和治療癌癥患者的合適試劑包括但不限于，小的有機分子、肽、蛋白質(zhì)、模擬肽、核酸、抗體及其組合。這種試劑通常與可接受的載體制成制劑，可以靜脈內(nèi)、口服、頰的、胃腸外、通過吸入噴霧、通過局部施用或者經(jīng)皮膚給藥。試劑還可以通過局部給藥方式給藥。試劑還可以與至少一種其他抗癌化療劑聯(lián)用，所述化療劑以累加或者協(xié)同方式抑制癌細胞。在另一方面，本發(fā)明是一種增加腫瘤細胞對化療劑敏感性的方法，其中腫瘤細胞與增加或者減少erastin結(jié)合蛋白豐度的化合物接觸。在相關(guān)方面，本發(fā)明是一種降低正常細胞對化療劑敏感性的方法，其中正常細胞與減少或者增加erastin結(jié)合蛋白豐度的化合物接觸。在本發(fā)明的某些實施方案中，通過篩選包括未知或者己知化合物(例如試劑，藥物)或者兩者的標(biāo)記的(annotated)化合物文庫、組合文庫或者其他文庫鑒定候選試劑。在某些實施方案中，本發(fā)明是一種鑒定抑制不需要的細胞增殖的候選治療劑的方法，包括a)將待測試劑和VDAC蛋白或者包括至少一種VDAC和任選一或多種其他蛋白的蛋白復(fù)合物混合；b)檢測待測試劑是否結(jié)合VDAC蛋白；c)如果待測試劑結(jié)合VDAC蛋白，將待測試劑與細胞接觸(體內(nèi)或者體外)并檢測待測試劑是否改變細胞的增殖。VDAC蛋白與待測試劑的結(jié)合是可以例如，通過物理結(jié)合試驗，諸如免疫結(jié)合試驗、酵母雙雜試驗、熒光偏振試驗、表面細胞質(zhì)基因組(plasmon)共振或者熒光共振能量傳遞(FRET)試驗來檢測。在某些實施方案中，本發(fā)明涉及化合物erastin和一類erastin相關(guān)化合物(例如，本發(fā)明的化合物)。在其他實施方案中，本發(fā)明涉及化合物、erastinB和其相關(guān)化合物。在其他實施方案中，本發(fā)明涉及化合物、erastinA和其相關(guān)化合物。在本發(fā)明的其他實施方案中，本發(fā)明涉及選擇性殺傷或者抑制工程化人致瘤細胞生長的(對其有毒的)emsthi的類似物。任選，本發(fā)明的這些化合物與藥學(xué)可接受的載體一起制備成藥物組合物。本發(fā)明還涉及鑒定參與腫瘤發(fā)生的細胞組分的方法。細胞組分包括，例如，蛋白(例如酶、受體)、核酸(例如脫氧核糖核酸、核糖核酸)，和脂(例如磷脂)。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種鑒定參與腫瘤發(fā)生的(一種或者多種)細胞組分的方法，其中(a)細胞，諸如工程化人致瘤細胞與erastin接觸；和(b)直接或者間接與erastin作用的細胞組分被鑒別。被鑒別的細胞組分是參與腫瘤發(fā)生的細胞組分。在另外的實施方案中，本發(fā)明涉及一種鑒定與erastin作用的(一種或者多種)細胞組分的方法，其中(a)細胞，諸如工程化人致瘤細胞、組織、器官、有機體或者上述之一的裂解產(chǎn)物或者提取物，與erastin接觸；(b)直接或者間接與emstin作用的細胞組分被鑒別。被鑒別的細胞組分是直接或者間接與erastin作用的細胞組分。本發(fā)明還涉及治療或者預(yù)防癌癥的方法。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種治療或者預(yù)防癌癥的方法，其中治療有效量的化合物，諸如，例如erastin或者其類似物，或者下面式I-V的化合物，給藥需要癌癥治療的個體。在某些實施方案中，癌癥的特點在于細胞中的RAS途徑被活化。在某些其他實施方案中，癌癥的特點在于細胞表達SV40小T癌蛋白，或者與表達ST的細胞表型相似，和/或致癌HRAS。在某些優(yōu)選的實施方案中，細胞基本上表達野生型水平的Rb(例如，至少大約50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%或者150%等等)。本發(fā)明還涉及鑒定與一種或多種細胞組分作用的試劑(例如藥物)的方法，所述細胞組分直接或者間接與erastin作用。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種鑒定與細胞組分作用的試劑的方法，所述細胞組分與erastin作用，包括(a)用erastin接觸細胞、組織、器官、有機體或者上述之一的裂解產(chǎn)物或者提取物；(b)鑒別與erastin(直接或者間接)作用的細胞組分；(c)用候選試劑接觸細胞、組織、器官、有機體或者上述之一的裂解產(chǎn)物或者提取物，所述試劑是待被評定與細胞組分作用的能力的試劑或者藥物，所述細胞組分與erastin作用；和(d)檢測試劑是否與(b)中的細胞組分(直接或者間接)作用。如果試劑與(b)中的細胞組分作用，它就是與細胞組分作用的試劑，所述細胞組分與erastin作用。在相關(guān)方面，本發(fā)明還涉及鑒定與一種或者多種細胞組分作用的試劑(例如藥物)的方法，所述細胞組分已知與erastin直接或者間接作用，該方法包括(a)用候選試劑接觸細胞、組織、器官、有機體或者上述之一的裂解產(chǎn)物或者提取物，所述試劑是待被評定與細胞組分作用的能力的試劑或者藥物，所述細胞組分已知與erastin作用；和(b)檢測試劑是否與(a)中的細胞組分(直接或者間接)作用。如果試劑與(a)中的細胞組分作用，它就是與細胞組分作用的試劑，所述細胞組分與erastin作用。在某些實施方案中，細胞是一種工程化人致瘤細胞。在其他實施方案中，本發(fā)明涉及與(一種或多種)細胞組分直接或間接相互作用的化合物，所述細胞組分與erastin相互作用。在某些實施方案中，與erastin相互作用的細胞組分參與腫瘤發(fā)生。使用已知方法合成顯示與細胞組分相互作用的試劑(例如藥物)，所述細胞組分與erastin相互作用。本發(fā)明還涉及一種鑒定試劑(例如藥物)的方法，所述試劑在腫瘤細胞中誘導(dǎo)死亡，例如通過細胞凋亡或者非細胞凋亡機理。在一個實施方案中，一種鑒定在腫瘤細胞中通過非細胞凋亡機理誘導(dǎo)死亡的試劑包括(a)用在腫瘤細胞中誘導(dǎo)死亡的候選試劑接觸待測細胞，所述待測細胞是腫瘤細胞(或者包含腫瘤細胞的器官或者組織)；(b)評定試劑是否在待測細胞中誘導(dǎo)凋亡；和(c)與合適的對照比較(b)中凋亡的誘導(dǎo)。如果凋亡在對照細胞而不是待測細胞中被誘導(dǎo)，則鑒定出在腫瘤細胞中通過非細胞凋亡機理誘導(dǎo)死亡的試劑(例如藥物)。合適的對照是與待測細胞相同類型的細胞，除了對照細胞與已知在細胞中誘導(dǎo)凋亡的試劑接觸。合適的對照可以同時進行，或者可以預(yù)先建立(例如，預(yù)先建立標(biāo)準(zhǔn)或者參考)。在某些實施方案中，待測細胞是工程化人致瘤細胞。此處使用的"一"和"一個"是指一個或多個所指的物。在某些方面，本發(fā)明提供藥物開發(fā)活動的方法。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種進行藥物開發(fā)活動的方法，包括(a)鑒定對工程化人致瘤細胞有選擇毒性的試劑(例如藥物)；(b)評定在(a)中鑒定的試劑或者其類似物在動物中的功效和毒性；和(c)制備包括一種或多種在(b)中評定的試劑的藥物制劑。評定的功效可以是在動物的致瘤細胞中試劑選擇性誘導(dǎo)細胞死亡的能力。在另一個實施方案中，進行藥物開發(fā)活動的方法包括建立用于分配待售藥物制劑的分配系統(tǒng)。任選，建立銷售團隊用于藥物制劑的市場推廣。在其他實施方案中，本發(fā)明涉及一種進行蛋白組學(xué)活動的方法，包括鑒定對工程化人致瘤細胞有選擇毒性的試劑(例如藥物)和將進一步開發(fā)對工程化人致瘤細胞有選擇毒性的試劑的權(quán)利許可給第三方。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種進行藥物開發(fā)活動的方法，包括(a)鑒定對工程化人致瘤細胞有毒性的(一種或多種)試劑(例如藥物)；(b)評定在(a)中鑒定的試劑或者其類似物在動物中的功效和毒性；和(c)制備包括一種或多種在(b)中評定的試劑的藥物制劑。例如，鑒定的試劑是erastin。評定的功效可以是在動物的致瘤細胞中，試劑選擇性誘導(dǎo)細胞生長、毒性或者細胞死亡變化的能力。在另一個實施方案中，進行藥物開發(fā)活動的方法包括建立用于分配待售藥物制劑的分配系統(tǒng)。任選,建立銷售團隊用于藥物制劑的市場推廣。在其他實施方案中，本發(fā)明涉及一種進行蛋白組學(xué)活動的方法，包括鑒定對工程化人致瘤細胞有選擇毒性的試劑(例如藥物)和將進一步開發(fā)對工程化人致瘤細胞有選擇毒性的試劑的權(quán)利許可給第三方。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種進行藥物開發(fā)活動的方法，包括(a)鑒定與細胞組分相互作用的(一種或多種)試劑(例如藥物)，所述細胞組分與erastin相互作用；(b)評定在(a)中鑒定的試劑或者其類似物在動物中的功效和毒性；和(c)制備包括一種或多種在(b)中評定的試劑的藥物制劑。評定的試劑功效可以是其在動物的致瘤細胞中選擇性誘導(dǎo)細胞死亡的能力。在另一個實施方案中，進行藥物開發(fā)活動的方法包括建立用于分配待售藥物制劑的分配系統(tǒng)。任選，建立銷售團隊用于藥物制劑的市場推廣。在其他實施方案中，本發(fā)明涉及一種進行蛋白組學(xué)活動的方法，包括鑒定與細胞組分相互作用的試劑(例如藥物)，所述細胞組分與erastin相互作用，和將進一步開發(fā)與細胞組分相互作用的試劑的權(quán)利許可給第三方，所述細胞組分與erastin相互作用。在另一個實施方案中，本發(fā)明是一種進行制藥活動的方法，包括(a)鑒定一種抑制細胞增殖的候選治療劑，其中候選治療劑是(i)增強或者抑制VDAC蛋白水平的試劑；(ii)增強或者抑制VDAC蛋白活性的試劑；(Hi)與VDAC蛋白結(jié)合的試劑；(iv)結(jié)合和/或調(diào)節(jié)包括至少一種VDAC和任選一種或多種其他的蛋白的蛋白質(zhì)復(fù)合物的試劑；(v)包括VDAC多肽或者其功能性變體的試劑；(vi)包括編碼VDAC多肽或者其功能性變體的核酸的試劑；或者(vii)此處公開的化合物，(b)進行在步驟(a)中鑒定的候選治療劑在動物中的功效和毒性的治療評價；和(c)制備藥物制劑，其包括一種或多種在步驟(b)中鑒定的具有可接受的治療評價的候選治療劑。取代步驟(b)和(C)的一步或者兩步或者除了步驟(b)和(C)的一步或者兩步之外，所述方法可以包括將候選治療劑進一步開發(fā)的權(quán)利許可給第三方。在另一個實施方案中，進行藥物開發(fā)活動的方法包括建立用于分配待售藥物制劑的分配系統(tǒng)。任選，建立銷售團隊用于藥物制劑的市場推廣。在另一個實施方案中，本發(fā)明是一種進行制藥活動的方法，包括(a)鑒定抑制細胞增殖的候選治療劑，其中候選治療劑是(i)增強或者抑制VDAC蛋白的試劑；或者(ii)增強或者抑制VDAC蛋白和第二種蛋白之間相互作用的試劑，禾卩(b)將進一步開發(fā)候選治療劑的權(quán)利許可給第三方。在另一個實施方案中，進行藥物開發(fā)活動的方法包括建立用于分配待售藥物制劑的分配系統(tǒng)。任選，建立銷售團隊用于藥物制劑的市場推廣。本發(fā)明的另一個方面是進行制藥活動的方法，包括下面的一種或者多種市場開發(fā)、生產(chǎn)、將市場開發(fā)權(quán)利許可給第三方和將生產(chǎn)試劑盒的權(quán)利許可給第三方，其中試劑盒包括(a)在生物樣品中檢測erastin結(jié)合蛋白、erastin結(jié)合蛋白的活性或者以上兩者的一種或多種試劑；和(b)解釋試驗結(jié)果的說明書。通常，說明書會指出erastin結(jié)合蛋白的水平和/或活性是否正常，相對其所需水平和/或活性是增加還是降低，這樣的話可檢測水平和/或活性是否應(yīng)該改變，或者預(yù)測(部分地)取決于水平和/或活性(例如癌癥化療)的治療是否會成功。在某些實施方案中，說明書包括關(guān)于emstin結(jié)合蛋白一個或多個正常、降低和升高的水平或者活性的指導(dǎo)。在某些實施方案中，基于erastin結(jié)合蛋白、emstin結(jié)合蛋白的活性或者兩者的水平，說明書包括關(guān)于用下列一個或多個后續(xù)治療的指導(dǎo)(i)增強或者抑制VDAC蛋白水平的試劑；(ii)增強或者抑制VDAC蛋白活性的試劑；(iii)結(jié)合VDAC蛋白的試劑；(iv)結(jié)合、調(diào)節(jié)或者結(jié)合和調(diào)節(jié)包括至少一種VDAC和任選一種或多種其他的蛋白的蛋白質(zhì)復(fù)合物的試劑；(v)包括VDAC多肽或者其功能性變體的試劑；(vi)包括編碼VDAC多肽或者其功能性變體的核酸試劑；和(vii)此處公開的化合物。在某些實施方案中，基于emstin結(jié)合蛋白、erastin結(jié)合蛋白的活性或者兩者的水平，說明書包括關(guān)于下列一個或多個治療是否成功的指導(dǎo)(i)增強或者抑制VDAC蛋白水平的試劑；(ii)增強或者抑制VDAC蛋白活性的試劑；(iii)結(jié)合VDAC蛋白的試劑；(iv)結(jié)合、調(diào)節(jié)或者結(jié)合和調(diào)節(jié)包括至少一種VDAC和任選一種或多種其他的蛋白的蛋白質(zhì)復(fù)合物的試劑；(v)包括VDAC多肽或者其功能性變體的試劑；(vi)包括編碼VDAC多肽或者其功能性變體的核酸的試劑；和(vii)此處公開的化合物。在某些實施方案中，基于erastin結(jié)合蛋白、emstin結(jié)合蛋白的活性或者兩者的水平，說明書包括關(guān)于癌癥治療成功概率的指導(dǎo)。鑒定增加人細胞對特定化合物敏感性的遺傳改變，最終可能允許從機理上剖析致癌信號網(wǎng)絡(luò)并定制針對特定腫瘤類型的化療方法。申請人已經(jīng)開發(fā)了一種發(fā)現(xiàn)小分子的系統(tǒng)學(xué)方法，所述小分子在帶有特定遺傳變化的細胞中具有增加的活性。使用這個系統(tǒng)，他們檢測到幾個臨床使用的抗腫瘤試劑，在特定遺傳元件存在的情況下更具效力和更具活性。此外，他們鑒定出新的選擇性殺傷細胞的化合物，所述細胞表達小的T癌蛋白和致癌RAS。這些遺傳靶向的小分子可以作為開發(fā)具有良好治療指數(shù)的抗癌藥物先導(dǎo)物。本發(fā)明還提供包裝的藥物。在一個實施方案中，包裝的藥物包括-(i)治療有效量的對工程化人致瘤細胞具有選擇毒性的試劑；和(ii)用于治療癌癥患者的試劑給藥的說明書和/或標(biāo)簽。在一個特定實施方案中，試劑是erastin。在另一個實施方案中，包裝的藥物包括(i)治療有效量的對工程化人致瘤細胞具有選擇毒性的試劑；和(ii)用于治療癌癥患者的試劑給藥的說明書和/或標(biāo)簽。在另一個相關(guān)的實施方案中，包裝的藥物包括(i)治療有效量的與細胞組分相互作用的試劑，所述細胞組分與erastin相互作用；和(ii)用于治療癌癥患者的試劑給藥的說明書和/或標(biāo)簽。說明書或者標(biāo)簽可以儲藏在電子介質(zhì)，例如CD、DVD、軟盤、存儲卡等等，這些可以通過電腦讀取。本發(fā)明還提供使用本發(fā)明鑒定的任意試劑制備癌癥治療藥劑，例如，利用erastin或者其類似物制備癌癥治療藥劑。在某些實施方案中，本發(fā)明的方法還包括聯(lián)合給藥一種或多種試劑，例如通常通過細胞凋亡機制殺傷細胞的化療劑。適合用于降低腫瘤生長率和治療癌癥患者的合適試劑包括但不限于，小的有機分子、肽、蛋白質(zhì)、模擬肽、核酸、抗體及其組合。可以預(yù)期的是本發(fā)明的所有實施方案可與一種或多種其他實施方案組合。在另一個方面，本發(fā)明涉及用于鑒定化合物的篩選法，所述化合物在工程化細胞而不是其等基因的正常細胞相似物中抑制蛋白的細胞毒性。這些方法已經(jīng)被用于鑒定已知的和新的具有基因型選擇性活性的化合物。任選，這些化合物在突變蛋白存在情況下活性增加。本發(fā)明涉及一種鑒定試劑(例如，藥物)的方法，所述試劑在工程化細胞中選擇性抑制細胞毒性。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種鑒定試劑(例如，藥物)的方法，所述試劑在工程化細胞中抑制突變蛋白的細胞毒性，包括用候選試劑接觸待測細胞(例如，表達突變蛋白的工程化細胞)；檢測與候選試劑接觸的待測細胞的活力；和將待測細胞的活力與合適對照的活力作比較。如果待測細胞的活力大于對照細胞的活力，則鑒定出選擇性抑制細胞毒性的試劑(例如，藥物)。合適的對照是與待測細胞類型相同的細胞，除了對照細胞沒有進行工程化以表達造成毒性的蛋白。例如，對照細胞可以是衍生出待測細胞的親本原代細胞。對照細胞在與待測細胞相同的條件下接觸候選試劑。合適的對照可以同時進行，或者預(yù)先建立(例如，預(yù)先建立標(biāo)準(zhǔn)或者參考)。在某些方面，本發(fā)明提供在哺乳動物中治療病癥的方法，包括給藥哺乳動物治療有效量的erastin類似物，例如，通式I代表的化合物(I)其中病癥的特點在于細胞具有增強的Ras信號活性和改變(例如，降低或者增加)的SV40小t抗原的細胞靶向蛋白的活性；和任選基本上野生型水平的Rb活性；和其中R'選自H、-Z-Q-Z、-C卜s垸基-N(R2)(R4)、-d-s烷基-OR3、3-到8-元碳環(huán)或者雜環(huán)，芳基，雜芳基，和Cl4芳院基；每次出現(xiàn)的W和R"均是獨立選自H、C,-4垸基、Q-4芳烷基、芳基、雜芳基、酰基、垸基磺酰和芳基磺酰，如果W和R"在相同氮原子和不同時是氫時，它們是不同的，并且當(dāng)112和R"在相同氮并且R2或W是酰基、烷基磺酰或者芳基磺酰，另一個選自H、Q—8垸基、芳基、Cm芳院基，和雜芳基；R選自H、C,-4垸基、Q-4芳烷基、芳基和雜芳基；W選自和Q選自O(shè)禾口NR2;和每次出現(xiàn)的Z獨立地選自Q-6垸基、C2-6烯基和C2-6炔基。當(dāng)Z是烯基或者炔基基團，雙鍵或者三鍵優(yōu)選不在基團的末端(從而排除，例如，烯醇醚、炔醇醚(alkynolether)、烯胺和/或炔胺)。在一些實施方案中，W選自或。在某些這種實施方案中，W選自-Z-Q-Z、-Q-8垸基-N(R2)(R4)、《1-8烷基-0113、芳基、雜芳基，和C卜4芳烷基；在某些實施方案中，W夷R4。在某些這種實施方案中，W選自-Z-Q-Z、-C,.s烷基-N(R2)(R4)、-CLs垸基-OR3、芳基、雜芳基，禾口Ci-4芳烷基。在某些實施方案中，W選自-Z-Q-Z、烷基-N(R2)(R4)、烷基-OR3、芳基、雜芳基，和CV4芳垸基。'在某些實施方案中，W選自CM芳烷基和?；?。在某些這種實施方案中，W是?；Ｔ谀承嵤┓桨钢校琖是?；?，R4是-C(0)-d-3烷基-Y,Y選自H、烷基、垸氧基、芳氧基、芳基、雜芳基、雜芳氧基和環(huán)烷基。在某些實施方案中，Y選自芳氧基、芳基、雜芳基、雜芳氧基和環(huán)垸基。在優(yōu)選的這種實施方案中，Y選自芳氧基和雜芳氧基。在更優(yōu)選的這種實施方案中，Q-3垸基-Y是-CH20-苯基，其中苯基任選用鹵素取代，優(yōu)選氯。在某些Y是-CH20-苯基的優(yōu)選實施方案中，選擇剩余的值以從實施方案中排除erastin。在某些實施方案中，芳基任選用選自Cr6垸基、CF3、羥基、Cr4烷氧基、芳基、芳氧基、鹵素、-NR2R4、硝基、羧酸、羧酸酯和磺酰的基團取代。適當(dāng)?shù)脑噭┛梢栽诂F(xiàn)有形式或者完全或者部分新陳代謝后具有所述活性。在某些實施方案中，病癥的特點在于細胞具有基本上野生型水平的Rb活性。在某些這種實施方案中，細胞特征還在于增強的Ras信號活性和/或SV40小t抗原的細胞靶向蛋白的改變(例如，降低或者增加)的活性。在某些實施方案中，化合物通過非細胞凋亡機理殺傷細胞。在某些實施方案中，化合物通過非細胞凋亡機理外的機理殺傷細胞。在某些實施方案中，細胞具有增強的Ras途徑活性(例如，RasV12)，過表達SV40小t抗原，具有本質(zhì)上降低的磷酸酶PP2A活性，和/或調(diào)節(jié)(例如，增強或者抑制)VDAC水平或者活性，比如VDAC2或者VDAC3。在某些實施方案中，病癥是癌癥。在某些實施方案中，細胞被誘導(dǎo)表達SV40小t抗原，例如，用過表達SV40小t抗原的病毒載體感染所述細胞，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或者腺病毒載體。在某些實施方案中，病毒載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或者腺病毒載體。在某些實施方案中，本發(fā)明的方法還包括聯(lián)合給藥所述哺乳動物一種試劑，例如通常通過細胞凋亡機理殺傷細胞的化療劑。在某些實施方案中，聯(lián)合給藥的試劑選自表皮生長因子受體拮抗劑、五硫化二砷、阿霉素、順鉑、卡鉑、西咪替丁、洋紅霉素、氮芥鹽酸、五甲三聚氰酰胺、塞替派、替尼泊甙、環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、去甲氧基竹紅菌甲素A、左旋苯丙氨酸氮芥、異環(huán)磷酰胺、曲磷胺、曲奧舒凡、足葉草毒素(prodophyllotoxin)或者足葉草毒素衍生物、鬼臼乙叉甙磷酸鹽、替尼泊甙、鬼臼乙叉甙、異長春堿、環(huán)氧長春堿、長春地辛、9-氨基喜樹堿、camptoirinotecan、克立那托、甲地孕酮、甲氨蝶呤、絲裂霉素C、ecteinascidin743、白消安、亞硝脲氮芥(BCNU)、環(huán)己亞硝脲(CCNU)、洛弗斯特丁、1-甲基-4-苯基吡啶鎗離子、司莫司汀、十字孢堿(stau!"QspQrin)、鏈脲霉素、酞菁、達卡巴嗪、氨基蝶呤、氨甲蝶呤、曲美沙特、硫鳥嘌呤、巰基嘌呤、氟達拉濱、pentastatin、2-氯脫氧腺苷(cladribin)、阿糖胞苷(araC)、甲基絲裂霉素、5-氟尿嘧啶、6-巰基嘌呤、阿霉素氫氯化物、甲酰四氫葉酸、霉酚酸、柔紅霉素、去鐵敏、5-氟脫氧尿苷、去氧氟尿苷、雷替曲塞、伊達比星、表柔比星、吡柔比星、佐柔比星、米托蒽醌、爭光霉素硫酸鹽、放線菌素D、番紅精、saframycins、quinocarcins、discodennolides、長春新堿、長春花堿、長春瑞濱酒石酸鹽、vertoporfm、紫杉醇、他莫昔芬、雷洛昔芬、噻唑呋林、硫鳥嘌呤、病毒唑、EICAR、雌氮芥、雌氮芥磷酸鈉、氟他米特、比卡魯胺、布舍瑞林、亮丙瑞林、蝶啶、烯二炔、左旋四咪唑、aflacon、干擾素、白介素、阿地白介素(aldesleukin)、非格司亭、沙莫司亭、利妥昔單抗、卡介苗、維甲酸、倍他米松、吉西他濱氫氯化物、異搏定、VP-16、六甲密胺、毒胡蘿卜內(nèi)酯(thapsigargin)、奧沙利鉑、異丙鉑、四鉑、洛鉑、DCP、PLD-147、JM118、JM216、JM335、沙鉑、紫杉萜、脫氧紫杉醇、TL-139、5'-降-脫氫長春堿(下文中5'-降長春堿)、喜樹堿、依立替康(Camptosar，CPT-ll)、托泊替康(Hycamptin)、BAY38-3441、9-硝基喜樹堿(Orethecin、盧比替康)、依沙替康(DX-8951)、勒托替康(GI-147211C)、gimatecan、homocamptothecinsdiflomotecan(BN-80915)和9-氨基喜樹堿(IDEC-13')、SN-38、ST1481、karanitecin(BNP1350)、氮茚并咔唑(例如NB-506)、原小蘗堿、茚托利辛、idenoisoquinolones、苯并-吩嗪或者NB-506。本發(fā)明另一個方面提供一種殺傷細胞、促進細胞死亡或者抑制細胞增殖的方法，包括給藥細胞(l)有效量的化合物，由通式I代表<formula>formulaseeoriginaldocumentpage48</formula>其中:W選自H、-Z-Q-Z、-CN8烷基-N(R2)(R4)、s烷基-OR3、3-到8-元碳環(huán)或者雜環(huán)，芳基，雜芳基，和CL4芳烷基；每次出現(xiàn)的112和W均是獨立選自H、Cm院基、Cm芳院基、芳基、雜芳基、酰基、垸基磺酰和芳基磺酰，如果W和W在相同氮原子和不同時是氫時，它們是不同的，并且當(dāng)112和114在相同氮上并且f或W是?；?、垸基磺?；蛘叻蓟酋?，另一個選自H、Q.8烷基、芳基、Cl4芳焼基，和雜芳基；RS選自H、C,V烷基、Cr4芳垸基、芳基和雜芳基；Q選自O(shè)和NR2;和每次出現(xiàn)的z獨立地選自Cl6院基、(:2.6烯基和<:2.6炔基。(當(dāng)z是烯基或者炔基基團，雙鍵或者三鍵優(yōu)選不在基團的末端)；和(2)—種在細胞中增加VDAC(例如，VDAC2，VDAC3)豐度的本發(fā)明另一個方面提供一種殺傷細胞的方法，包括給藥細胞(1)有效量的化合物，由通式I代表w選自試劑。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage49</formula>其中:W選自H、-Z-Q-Z、烷基-N(R2)(R4)、-C卜s烷基-OR3、3-到8-元碳環(huán)或者雜環(huán)，芳基，雜芳基，^芳烷基；每次出現(xiàn)的W和R"均是獨立選自H、Cu4垸基、cm芳烷基、芳基、雜芳基、?；?、垸基磺酰和芳基磺酰，如果W和R"在相同氮原子和不同時是氫時，它們是不同的，并且當(dāng)112和114在相同氮上并且R2或W是酰基、烷基磺?；蛘叻蓟酋?，另一個選自H、d.s烷基、芳基、Cm芳焼基，和雜芳基；W選自H、Cm院基、C,-4芳垸基、芳基和雜芳基；W選自R4,R4,或、R,Q選自0和NR2;和每次出現(xiàn)的z獨立地選自(^.6垸基、<:2.6烯基和<:2.6炔基。(當(dāng)z是烯基或者炔基基團，雙鍵或者三鍵優(yōu)選不在基團的末端)；和(2)—種在細胞中降低VDAC(例如，VDAC2，VDAC3)豐度的在另一個實施方案中，本發(fā)明是一種促進細胞死亡的方法，包括對細胞給藥有效量的式(I)的化合物。試劑。在某些實施方案中，化合物如上所述。在某些實施方案中，細胞是癌細胞。在某些實施方案中，試劑包括編碼VDAC比如VDAC3的多核苷酸。在某些實施方案中，試劑是適合運輸進細胞的VDAC蛋白(例如，VDAC3)，例如，與異源內(nèi)化結(jié)構(gòu)域融合的蛋白。在某些實施方案中，試劑是包括VDAC蛋白(例如，VDAC3)的脂質(zhì)體制劑。在某些實施方案中，試劑增強或者抑制內(nèi)源VDAC(例如，VDAC3)表達，刺激或者抑制VDAC(例如，VDAC3)表達或者增強或者抑制VDAC(例如，VDAC33)抑制劑的功能。在某些方面，該方法還涉及給藥一種增加細胞中VDAC(例如，VDAC2，VDAC3)豐度的試劑。在某些方面，該方法還涉及給藥一種降低細胞中VDAC(例如，VDAC2，VDAC3)豐度的試劑。在另一個方面，本發(fā)明是一種增加腫瘤細胞對化療劑敏感性的方法(例如，累加的或者協(xié)同的)，其中腫瘤細胞與此處公開的化合物接觸。在相關(guān)方面，本發(fā)明是一種降低正常細胞對化療劑敏感性的方法，其中正常細胞與此處公開的化合物接觸。在一個實施方案中，本發(fā)明是一種鑒定對利用本發(fā)明的化合物的治療可能有反應(yīng)的患者的方法。使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)表征鑒定方法，確定為具有腫瘤形成的患者顯示一個或多個下列表征將被認為是有反應(yīng)的異常的Ras信號途徑活性，其特征在于一種或多種途徑成員的活化(例如，磷酸化Erkl/2,磷酸化MEK等等)，禾口/或VDAC蛋白(1，2或者3)的表達，和/或在體外或者體內(nèi)暴露于本發(fā)明的化合物的相似或者相同基因型的細胞系的敏感性。本發(fā)明的另一個方面提供一種通式I代表的化合物，或者其藥學(xué)可接受的鹽WCO其中Ri選自H、-Z-Q-Z、-d.8垸基-N(R2)(R4)、-<:1-8垸基-0113、3-到8-元碳環(huán)或者雜環(huán)，芳基，雜芳基，和Cm芳院基；每次出現(xiàn)的W和R"均是獨立選自H、d-4烷基、d-4芳垸基、芳基、雜芳基、酰基、垸基磺酰和芳基磺酰，如果W和R"在相同氮原子和不同時是氫時，它們是不同的(除了在某些實施方案中，其中R2和R"是氫)，并且當(dāng)R"和R"在相同氮上并且W或R"是?；?、垸基磺酰或者芳基磺酰，另一個選自H、d-8烷基、芳基、Cl4芳院基，和雜芳基；W選自H、CM烷基、d-4芳垸基、芳基和雜芳基；，ANR2IW選自Q選自O(shè)和NR2;禾口每次出現(xiàn)的Z獨立地選自d-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基。當(dāng)Zn是烯基或者炔基基團，雙鍵或者三鍵優(yōu)選不在基團的末端。本發(fā)明的另一個方面提供一種通式n代表的化合物-其中Ar是取代的苯基；W選自H、-d.8烷基、-Z-Q-Z、-d.8垸基-N(R2)(R4)、-d.8垸基-OR3、3-到8-元碳環(huán)或者雜環(huán)，芳基，雜芳基，和Cm芳院基；每次出現(xiàn)的W和W均是獨立選自H、Cm院基、CM芳烷基、芳基、雜芳基、?；?、垸基磺酰和芳基磺酰，當(dāng)W和R"在相同氮并且112或114是?；⑼榛酋；蛘叻蓟酋?，另一個選自H、d.s烷基、芳基、C"4芳垸基，芳基和雜芳基；RS選自H、C"4烷基、Cr4芳烷基、芳基和雜芳基；RS代表在其結(jié)合的環(huán)上的0-4取代基。Q選自O(shè)禾nNR2;禾口每次出現(xiàn)的z獨立地選自Qv烷基、c2—6烯基和(:2.6炔基。當(dāng)z是烯基或者炔基基團，雙鍵或者三鍵優(yōu)選不在基團的末端。本發(fā)明的另一個方面提供一種通式iii代表的化合物:其中Ar是取代的或者未取代的苯基；r1選自h、-d.8烷基、-z-q-z、-c卜s院基-N(r2)(R4)、-d—8烷基-or3、3-到8-元碳環(huán)或者雜環(huán)，芳基，雜芳基，和Cm芳院基；每次出現(xiàn)的112和W均是獨立選自H、Cm院基、Cm芳院基、芳基、雜芳基、?；?、垸基磺酰和芳基磺酰，當(dāng)112和r"在相同氮并且RZ或R"是?；?、烷基磺?；蛘叻蓟酋＃硪粋€選自H、d.s垸基、芳基、Cl4芳院基，和雜芳基；RS選自H、CM烷基、Cr4芳烷基、芳基和雜芳基；RS代表在其結(jié)合的環(huán)上的0-4取代基。R4q選自0和nr2;和丑每次出現(xiàn)的Z獨立地選自C^垸基、(32.6烯基和C2-6炔基。當(dāng)Z是烯基或者炔基基團，雙鍵或者三鍵優(yōu)選不在基團的末端。本發(fā)明的另一個方面提供一種通式IV代表的化合物(IV)其中Af是取代的或者未取代的苯基；R1是-C"8院基；每次出現(xiàn)的W和R"均是獨立選自H和Q-8垸基；RS代表在其結(jié)合的環(huán)上的0-4取代基。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage54</formula>Q選自0和NR2。本發(fā)明的另一個方面提供一種通式V代表的化合物:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage55</formula>其中R'選自H和d.8烷基；R2選自H和d-s垸基；W選自鹵素、C,.8垸氧基和d.8垸基；R4選自H、鹵素、Cw烷氧基和d.s烷基;RS選自H、鹵素和硝基；和N是1或者2。預(yù)期上述通式I一V代表的化合物可用于以下方法1)治療哺乳動物的病癥，包括給藥哺乳動物治療有效量的所述化合物，2)殺傷細胞，包括給藥細胞a)有效量的所述化合物，和b)增加細胞中VDAC(例如，VDAC2，VDAC3)豐度的試劑，或者3)殺傷細胞，包括給藥細胞a)有效量的所述化合物，和b)降低細胞中VDAC(例如，VDAC2，VDAC3)豐度的試劑。預(yù)期本發(fā)明的全部的實施方案可以和一個或多個其他實施方案聯(lián)用，即使它們在本發(fā)明的不同方面描述。在本發(fā)明的某些實施方案中，化合物或者試劑不是公開在表2中的化合物。附圖簡述圖1是顯示實驗轉(zhuǎn)化的人細胞間關(guān)系的示意圖。BJ細胞是原代人包皮成纖維細胞。BJ-TERT細胞衍生于BJ細胞，并表達hTERT，端粒末端轉(zhuǎn)移酶的催化亞單位。BJ-TRET/LT/ST細胞通過引入編碼猴病毒40大(LT)和小T(ST)癌蛋白的基因組構(gòu)建體而衍生自BJ-TRET細胞。BJ-TERT/LT/ST/RAS^2腫瘤細胞通過引入HRAS(RAS^2)的致癌等位基因而衍生自BJ-TERT/LT/ST細胞(Hahn等人，1999，NatMed5,1164-70)。BJ-TERT/LT/RASV12細胞起源于BJ細胞，通過引入編碼TERT，LT,RASV12的構(gòu)建物和對照載體的cDNA(Hahn等人，2002,NatRevCancer2,331-41)。BJ-TERT/LT/RASV12/ST細胞通過引入編碼ST的cDNA而起源于BJ-TERT/LT/RASV12細胞(Hahn等人，2002，NatRevCancer2,331-41)。TIP5細胞是原代人包皮成纖維細胞。TIP5-衍生的細胞系通過引入編碼hTERT,LT,ST，RAS或者乳頭狀瘤病毒E6或者E7蛋白的載體來制備，如圖所示。E6和E7可以共同代替LT(Lessnick等人，2002，CancerCell1，393-401)。圖2顯示九個基因型選擇性化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖3顯示棘霉素和喜樹堿對工程化細胞的效果圖示。標(biāo)記的細胞在384孔板用棘霉素(A)或者喜樹堿(B，C)處理48小時。顯示使用鈣黃綠素AM檢測的細胞活力的抑制百分比。誤差線表明一個標(biāo)準(zhǔn)差。(A)棘霉素處理的BJ，BJ-TERT，BJ-TERT/LT/ST禾卩BJ-TERT/LT/ST/RASV12細胞；(B)喜樹堿處理的BJ，BJ-TERT,BJ-TERT/LT/ST和BJ-TERT/LT/ST/RASV12細胞；和(C)喜樹堿處理的BJ-TERT/LT/RASV12，BJ-TERT/LT/RASV12/ST和BJ-TERT/LT/ST/RASV12細胞。圖4顯示erastin對工程化細胞的效果圖示。標(biāo)記的細胞在384孔板用erastin處理48小時。顯示使用鈣黃綠素AM檢測的細胞活力的抑制百分比。誤差線表明一個標(biāo)準(zhǔn)差。(A)erastin處理的BJ，BJ-TERT,BJ-TERT/LT/ST和BJ-TERT/LT/ST/RASVI2細胞；(B)erastin處理的BJ，BJ-TERT,BJ-TERT/LT/RASV'2細胞(缺少ST)，BJ陽TERT/LT/RASV12/ST(致瘤細胞)和TERT/LT/ST/RASV12(致瘤細胞)；和(C)獨立衍生的TIP5/TERT、TIP5/TERT/E6、TIP5/TERT/LT、TIP5/TERT/LT/ST禾口TIP5/TERTLT/ST/RASV12細胞。圖5顯示腫瘤選擇性化合物的蛋白靶標(biāo)在工程化致瘤細胞中被上調(diào)。(A-C)來自BJ,BJ-TERT,BJ-TERT/LT/ST，BJ-TERT/LT/ST/RASV12BJ-TERT/LT/RASV'2禾卩BJ-TERT/LT/RASV12/ST細胞裂解物的Westernblot，使用抗拓撲異構(gòu)酶II(A)或者TOPI(B，C)的抗體。在(C)欄，細胞用針對TOPI,lamicA/C的siRNA或者相同長度的對照雙鏈DNA雙鏈體(TOPIdsDNA)轉(zhuǎn)染。在各種情況下，各點用抗eIF-4E的抗體檢測以確定蛋白上樣量的差異。對每條帶的相對量進行定量測定。(D)TOPIsiRNA防止工程化腫瘤細胞中喜樹堿造成的細胞死亡。用針對TOPI的siRNA轉(zhuǎn)染和指定濃度喜樹堿處理后，檢測細胞數(shù)目。(E)岡田酸，PP2A及其他細胞磷酸酶的抑制劑，使原代人細胞對喜樹堿敏感。BJ原代細胞用指定濃度的喜樹堿和岡田酸同時處理，測定對鈣黃綠素AM活性染色的效果。雖然岡田酸在測試的最高濃度殺傷BJ細胞，在3.4nM它自身是無效的，但它導(dǎo)致細胞對喜樹堿敏感。(F)岡田酸促進TOPI的表達。BJ原代細胞用指定濃度的岡田酸處理，TOPI的表達水平用westernblot檢測。對每條帶的相對量進行定量測定。圖6顯示erastin以ST/RASV12依賴模式誘導(dǎo)快速細胞死亡。(A)erastin對BJ-TERT和BJ-TERT/LT/ST/RASV12細胞時間依賴的效應(yīng)。在含有指定濃度erastin的情況下，細胞種植于384孔板。在使用鈣黃綠素AM24,48和72小時后檢測細胞活力的抑制。(B)在BJ-TERT(紅)和BJ-TERT/LT/ST/RASV12(藍)細胞中erastin對AlamarBlue活性染色的效果。(C)用erastin處理的BJ-TERT/LT/ST/RASV12禾BBJ原代細胞細胞的照片。細胞結(jié)合過夜，然后用9pMerastin處理24小時，然后拍昭。"、、o圖7顯示喜樹堿而不是erastin誘導(dǎo)凋亡的特征。(A)喜樹堿處理，而不是erastin處理的，BJ-TERT/LT/ST/RASV12細胞顯示破碎的核(總核的10-20%、紅色和藍色箭頭)如圖所示。(B)喜樹堿處理，而不是erastin處理的，BJ-TERT/LT/ST/RASV12細胞顯示AnnexinV染色。與未處理、erastin處理(9/xM)和喜樹堿處理(1/xM)相應(yīng)的在指定的Ml區(qū)域的細胞百分比是6%，6%和38%。(C)喜樹堿處理，而不是erastin處理的，BJ-TERT/LT/ST/RASV12細胞帶有活化的caspase3。喜樹堿和erastin處理樣品的裂解產(chǎn)物利用針對有活性/剪切形式的caspase3的抗體通過westernblot分析。斑點用抗elF4E的抗體再次檢測，以控制上樣水平。圖8顯示erastin和erastinB的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖9顯示在erastin處理的腫瘤細胞核保持完整。圖10顯示erastin誘導(dǎo)活性氧的形成。圖11顯示erastinA的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖12指出相對于非致瘤BJEH細胞中的表達，致瘤BJELR細胞中VDAC3的表達顯著地升高。圖13顯示將VDAC—1水平設(shè)為100%，VDAC同工型在靶細胞中的相對表達水平。圖14顯示利用線粒體提取物和固定化的活性(A6)和無活性(B1)Erastin衍生物從pull-down試驗中通過Westernblot和SDS-PAGE鑒定的蛋白。圖15顯示在(a)HCT116細胞，(b)DLD-I細胞，(c)OVCAR-3細胞和(d)BT549細胞的MCL試驗中的化合物12、13和5。圖16顯示在(a)MiaPaca2細胞，(b)DU145細胞，(c)SK—Mel28細胞和(d)Malm3M細胞的MCL試驗中的化合物12、13和5。圖17顯示在(a)BT549細胞，(b)MCF-7細胞，(c)HOP-92細胞和(d)HOP-62細胞的MCL試驗的化合物12，13和5。圖18顯示化合物6在HT-1080異種移植物中誘導(dǎo)腫瘤生長抑制。圖19顯示化合物5在HT-1080異種移植物中誘導(dǎo)明顯的腫瘤消退。圖20顯示在HT-1080異種移植物中使用化合物5的體重趨勢。圖21顯示化合物6在PANC-1異種移植物中誘導(dǎo)腫瘤生長抑制。圖22顯示化合物5在PANC-1異種移植物中誘導(dǎo)腫瘤消退。發(fā)明詳述基因型選擇性化合物作為分子探針的能力基于化學(xué)遺傳學(xué)的前提，即小分子可用于鑒定行使生物學(xué)效果的蛋白和途徑(Schreiber,1998,Bioorg.Med.Chem.6,1127-1152;Stockwell，2000，NatRevGenet1,116-25;Stockwell，2000，TrendsBiotechnol18，449-55)。例如，觀測到天然產(chǎn)物雷帕霉素阻止細胞生長，使發(fā)現(xiàn)哺乳動物的雷帕霉素(mTOR)的耙標(biāo)作為調(diào)節(jié)細胞生長的蛋白成為可能(Brown等人，1994,Nature369，756-758;Sabatini等人，1994,Cell78，35-43)。申請人已經(jīng)結(jié)合這兩種方法，化學(xué)和分子遺傳學(xué)，用于發(fā)現(xiàn)受人類疾病例如癌癥關(guān)聯(lián)突變影響的途徑。申請人已經(jīng)加工了一系列具有確定遺傳元件的腫瘤細胞，用于鑒定那些關(guān)鍵途徑，這些途徑的破壞將導(dǎo)致致瘤表型(Hahn等人，1999,NatMed5,1164-70;Hahn等人，2002,NatRevCancer2,331-41;Lessnick等人，2002,CancerCell1,393-401)。申請人推定這些實驗轉(zhuǎn)化的細胞使從已知的和新的化合物來源中鑒定基因型選擇性試劑成為可能，所述試劑在特定癌癥相關(guān)等位基因存在的情況下顯示合成致死性。具有基因型選擇致死性的化合物可以作為腫瘤細胞中信號網(wǎng)絡(luò)的分子探針，并作為后續(xù)開發(fā)具有良好療效指數(shù)的臨床有效藥物的先導(dǎo)物，和/或作為有效藥物。使用這種方法，申請人已經(jīng)對天然和合成化合物文庫進行高通量篩選研究，并且已經(jīng)鑒定出強殺傷癌癥活性的化合物。erastin和erastin類似物比如erastinB和erastinA就在這些化合物中。盡管如此，很多檢測試劑或者化合物可被用于此處描述的篩選研究(例如，鑒定抗腫瘤候選物的方法)。這種檢測試劑包括但不限于，小的有機分子，肽，模擬肽，蛋白(包括抗體)，核酸，糖類。因此，本發(fā)明提供通式I的化合物，所述化合物殺傷癌細胞，尤其是基因型特異的癌細胞，比如那些具有升高的Ras信號活性，改變的SV40小t抗原耙向活性，和/或基本上完整的Rb活性的癌細胞。申請人還已經(jīng)鑒定了幾個直接或者間接結(jié)合erastin和/或它的類似物的細胞蛋白。這些蛋白包括電壓依賴性陰離子通道(VDAC1，VDAC2，和VDAC3)，Prohibitin，核糖體結(jié)合糖蛋白(ribophorin)，Sec61a禾卩Sec22b。定量RT-PCR還表明對erastin殺傷敏感的細胞的VDAC3表達水平升高(例如，高2-6倍，通常高2-2.5倍)。但不希望被任何特定理論束縛，這些實驗表明高水平的VDAC，尤其是VDAC3禾口VDAC2，表達增強erastin(和其類似物)介導(dǎo)的細胞殺傷，這甚至可能是功效所需要的。因此，本發(fā)明的一個方面提供一種選擇性殺傷癌細胞的方法，尤其是那些具有升高的Ras活性，改變的SV40小t抗原靶向活性，和優(yōu)選的基本上完整的Rb和/或p53活性，所述方法包括對需要治療的哺乳動物患者給藥治療有效量的由通式I代表的化合物其中W選自H、-Z-Q-Z、烷基-N(R2)(R4)、-C卜s烷基-OR3、3墨到8-元碳環(huán)或者雜環(huán)，芳基，雜芳基，和芳烷基；每次出現(xiàn)的112和仗4均是獨立選自H、Cl4院基、Cm芳院基、芳基、雜芳基、?；?、烷基磺酰和芳基磺酰，如果W和W在相同氮原子和不同時是氫時，它們是不同的，并且當(dāng)W和W在相同氮并且R2或W是?；③酋；蛘叻蓟酋?，另一個選自H、d-8烷基、芳基、Cm芳院基，和雜芳基；W選自H、Cm焼基、d-4芳垸基、芳基和雜芳基;NR2w選自Q選自O(shè)禾BNR2;和每次出現(xiàn)的Z獨立地選自d-6垸基、(32.6烯基和C2.6炔基。當(dāng)Z是烯基或者炔基基團，雙鍵或者三鍵優(yōu)選不在基團的末端。在某些實施方案中，通式I的化合物不包括erastin或者erastinA。如本領(lǐng)域公知，Ras的組成性活化是人癌細胞惡性生長的重要因素。在20%到30%的人類腫瘤中發(fā)現(xiàn)，RAS原癌基因(H-RAS，N-RAS,K-RAS)的突變是頻發(fā)的遺傳畸變，盡管在不同腫瘤類型中的發(fā)生率變化很大(Bos，CancerRes.49:4682-4689,1989)。最高的RAS突變率是在胰腺腺癌(90%)，結(jié)腸腺癌(50%)和肺腺癌(30%)中發(fā)現(xiàn)。在甲狀腺的濾泡和未分化癌中，RAS突變的發(fā)生也是相當(dāng)高的(50%)。最常觀察到的RAS突變出現(xiàn)在Ras調(diào)節(jié)的關(guān)鍵位點--即密碼子12、13和61。這些突變的每一種均導(dǎo)致Ras正常GTPase活性的消除。Ras活化還經(jīng)常在血液惡性腫瘤例如骨髓性白血病和多發(fā)性骨髓瘤中觀察到。在大約三分之一的脊髓發(fā)育不良綜合征(MDS)和急性骨髓性白血病(AML)中，RAS基因被突變活化。RAS突變存在于大約40%新確診的多發(fā)性骨髓瘤患者中，并且頻率隨病程進展增加。另一方面，多瘤病毒感染多種脊椎動物(現(xiàn)在已知12個成員)。鼠科多瘤病毒在1953年被LudwigGross在研究小鼠的白血病時分離，這樣命名是因為它在多個位點引起實體瘤。本家族的第二個成員,Sweet和Hilleman于1960年在用于生長SabinOPV的原代猴腎細胞培養(yǎng)物中分離了猿空泡病毒40(SV40)(Hilleman,DevBiolStand94:183-190,1998)。兩種人多瘤病毒，cBK病毒(BKV)和JC病毒(JCV)，在1971年被分離。多瘤病毒編碼三種參與細胞轉(zhuǎn)化的蛋白，稱為大腫瘤抗原(LT)，中T抗原(mT)和小腫瘤抗原(sT)。這三種蛋白是由早期區(qū)域轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的不同剪接造成的，包含同源序列。多瘤的大T抗原與腫瘤抑制蛋白pRb相互作用，能夠在培養(yǎng)中使原代成纖維細胞永生化。位于N末端的DnaJ結(jié)構(gòu)域，尤其是在殘基42和47之間發(fā)現(xiàn)的HPDKYG序列，對Rb家族的功能性失活非常關(guān)鍵，對SV40大T抗原也是這樣。LT的表達不足以產(chǎn)生完全轉(zhuǎn)化的細胞表型--這需要mT,它是多瘤病毒的主要轉(zhuǎn)化蛋白。小鼠多瘤中T由421個氨基酸組成，可以被分為至少三個結(jié)構(gòu)域，其中一些與LT和sT共用。氨基末端結(jié)構(gòu)域包括前面79個氨基酸，所述結(jié)構(gòu)域還存在于LT和sT。在殘基80-192之間鄰近它的是還存在于多瘤sT的結(jié)構(gòu)域，包含兩個半胱氨酸富集區(qū)，Cys-X-Cys-X-X-Cys，這在SV40的小T中也被鑒定出。這些半胱氨酸的突變消除mT轉(zhuǎn)化細胞的能力。剩余的229氨基酸對mT是獨特的，包含小鼠mT的主要酪氨酸磷酸化位點和參與轉(zhuǎn)化活性必需蛋白的膜定位的疏水性區(qū)域(在羧基端的大約20個氨基酸)。SV40的小T抗原包括174個氨基酸。在殘基97-103之間的區(qū)域與蛋白磷酸酶2A(PP2A)相互作用。這些相互作用降低了PP2A滅活ERK1和MEK1蛋白激酶的能力，導(dǎo)致刺激靜止的猴腎細胞的增殖。小T抗原依賴試驗還鑒定出其他具有增強細胞轉(zhuǎn)化的能力的區(qū)域。這些區(qū)域位于N端部分，這是SV40的小和大T抗原共用的，能潛在地起DnaJ結(jié)構(gòu)域的作用。小T抗原還可以結(jié)合微管蛋白，已經(jīng)表明這在其生物機能中起作用。申請人發(fā)現(xiàn)具有活化Ras活性和小T抗原表達的細胞(因此減少小T抗原耙蛋白活性，例如減少的PP2A等等，或者增強ERK1和MEK1)可以通過erastin和其類似物被選擇性的殺傷，可能通過非細胞凋亡機理。在優(yōu)選的實施方案中，細胞表達基本上野生型水平的Rb和/或p53(或者其他E6/E7蛋白靶標(biāo))。因此，在某些實施方案中，某些特定基因型的癌細胞可被本發(fā)明的化合物選擇性的殺傷。這些可以包括帶有組成活化的Ras突變或者Ras信號途徑突變和增強的ERK1、MEK1活性或者減活的PP2A的癌癥。在某些其他實施方案中，靶細胞的基因型可以被選擇性的改變(例如，表達SV40的小T抗原，表達ERK1或者MEK1，或者抑制PP2A，等等)，這樣的話以前對erastin和erastin類似物不敏感的靶細胞現(xiàn)在對這種殺傷敏感。具體地，本發(fā)明提供一種選擇性殺傷癌細胞的方法，所述癌細胞具有升高的Ras活性和小T抗原表達(或者改變的小T抗原靶蛋白活性，例如PP2A活性，增強的ERK1或者MEK1活性，或者一種模仿sT效果的機理，包括但不限于PP2A調(diào)節(jié)亞單位中的突變)，而保護不具有升高的Ras活性的相對正常細胞，即使這些細胞也表達小T抗原。這可能是有用的，因為許多癌癥帶有體細胞Rasvl2或者導(dǎo)致癌細胞中Ras信號活性升高的其他類似突變，而相同患者/個體中的正常細胞通常沒有相同的RasV^或者其他的Ras途徑突變。Erastin和其類似物可以用來選擇性的殺傷這些癌細胞，如果癌細胞同時表達小T抗原(或者具有改變的小T抗原靶蛋白活性)。即使個體/患者中的其他正常細胞還表達小T抗原，本發(fā)明方法仍能有效殺傷癌細胞，因為正常細胞可能沒有升高的Ras信號活性。即使個體不表達小T抗原，小T抗原可以輸送給患者(以蛋白或者載體編碼DNA的形式)使其具有對erastin/erastin類似物殺傷癌癥(而不是正常)細胞的敏感性。既然已理解的是小T抗原自身不足以誘導(dǎo)對患者的副作用，治療的副作用(提供小T抗原給患者)將是微小或者不存在的。事實上多達3000萬美國人被認為已經(jīng)通過1955至1963年之間的脊髓灰質(zhì)炎疫苗接種而暴露于SV40。SV40通過用于生長脊髓灰質(zhì)炎病毒的獼猴腎細胞進入疫苗。那些方法不再被使用，從1963年起脊髓灰質(zhì)炎疫苗已經(jīng)不含病毒。90年代的DNA研究在一些人類腫瘤中發(fā)現(xiàn)SV40。然而，腫瘤組織中的病毒DNA與分裂細胞的相關(guān)不能證明病毒引起腫瘤的形成。在2002年10月，美國醫(yī)學(xué)會的一個科學(xué)小組得出結(jié)論，沒有辦法確定幾十年前廣泛使用的被猴腎病毒SV40污染的脊髓灰質(zhì)炎疫苗是否導(dǎo)致人類癌癥患病率的增加。在一些實施方案中，升高的Ras活性通過在氨基酸位置12、13和/或61的組成性活化Ras(N-，H-，或者K-Ras)突變而顯示。在一些其它實施方案中，Ras活性的升高通過Ras途徑蛋白一種或多種下游組件增強的活性顯示，包括但不限于Raf、MEK、MAPK等等。在其他實施方案中，小T抗原表達可以伴隨有載體對靶細胞的感染，比如表達SV40小T抗原的腺病毒或者逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(見下文)。或者，小T抗原可以直接地提供給靶細胞。例如，小T抗原可利用本領(lǐng)域已知的各種方法導(dǎo)入靶細胞(參見下文細節(jié))。在一個實施方案中，小T抗原可以通過捕獲在帶有正電荷的脂質(zhì)體表面(例如lipofectins)而提供給靶細胞，任選可用抗靶組織細胞表面抗原的抗體標(biāo)記，例如，抗癌細胞表面抗原的抗體。在另一個實施方案中，小T抗原可以通過胞轉(zhuǎn)(transcytosis)作用提供給靶細胞，利用任何能夠調(diào)節(jié)這種功效的"內(nèi)化肽"，包括但不限于HIV蛋白Tat的N端結(jié)構(gòu)域(例如，Tat的殘基l-72或者其能夠促進胞轉(zhuǎn)作用的更小片段)，果蠅antenopediaIII蛋白的全部或者部分，黃峰毒素(mastoparan)的足夠部分等等(見下文)。在其他實施方案中，通過輸送抗體、RNAi(siRNA，短發(fā)夾RNA，等等)、反義序列或者對這種靶蛋白特異的小分子抑制劑可獲得減少的PP2A。這種靶細胞蛋白拮抗劑的輸送是本領(lǐng)域公知的。參見，例如，WO04078940A2，EP1439227A1，WO04048545A2,US20040029275A1,WO03076592A2,WO04076674A1,W09746671A1，在此全部引入作為參考。本發(fā)明的另一個方面提供一種利用erastin/erastin類似物和一種或多種通過細胞凋亡機理殺傷細胞的試劑或者療法(例如放療)的聯(lián)合療法。這種試劑包括如下所述的多種化療藥物。據(jù)信某些蛋白在erastin敏感細胞中表達水平升高。例如，這樣一種蛋白，VDAC3，當(dāng)暴露于erastin時豐度升高2-2.5倍，但申請人不希望被理論束縛，其存在乃至增加的豐度被認為是erastin介導(dǎo)的殺傷必不可少的。因此在本發(fā)明的另一個方面，提供一種殺傷細胞或者降低細胞增殖率的方法，所述細胞中VDAC例如VDAC2或者VDAC3的水平升高，所述方法包括將靶細胞與通式I-IV的erastin和/或erastin類似物接觸。在某些實施方案中，靶細胞被調(diào)控表達更高水平的VDAC例如VDAC2或者VDAC3，這樣通過erastin和其功能類似物增強殺傷或者降低增殖率的敏感性。例如，VDAC蛋白可利用本領(lǐng)域已知的各種方法導(dǎo)入靶細胞(參見下面詳述)。在一個實施方案中，VDAC蛋白可以通過被捕獲到帶有正電荷表面的脂質(zhì)體(例如lipofectins)中而提供給靶細胞，該脂質(zhì)體可選地用抗耙組織的細胞表面抗原的抗體進行標(biāo)記，例如，抗癌細胞表面抗原的抗體。在另一個實施方案中，VDAC蛋白可以通過胞轉(zhuǎn)作用提供給靶細胞，利用任何能夠調(diào)節(jié)這種功效的"內(nèi)化肽"，包括但不限于HIV蛋白Tat的N端結(jié)構(gòu)域(例如，Tat的殘基1-72或者其能夠促進胞轉(zhuǎn)作用的更小片段)，果蠅antennapediaIII蛋白的全部或者部分，黃峰毒素的足夠部分等等。(見下文)。此外，編碼功能性VDAC的核酸可以導(dǎo)入這種靶細胞，利用例如表達VDAC的腺病毒或者逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。此外，內(nèi)源VDAC(例如，VDAC3)活性可以被試劑刺激，所述試劑刺激VDAC表達，或者抑制VDAC抑制劑(轉(zhuǎn)錄或者翻譯抑制劑，或者促進VDAC在細胞中轉(zhuǎn)換的抑制劑)的活性。在某些方面，本發(fā)明的方法還涉及給藥一種增加細胞中VDAC(例如，VDAC2，VDAC3)豐度的試劑。用于增加VDAC豐度的試劑可以，例如，包括編碼VDAC諸如VDAC3的多核苷酸；適合運輸進細胞的VDAC蛋白(例如，VDAC3)，例如，與異源內(nèi)化結(jié)構(gòu)域融合或者制備成脂質(zhì)體制劑。在某些方面，本發(fā)明的方法還涉及給藥一種降低細胞中VDAC(例如，VDAC2，VDAC3)豐度的試劑。用于降低VDAC豐度的試劑能夠，例如，抑制(inhibit)內(nèi)源VDAC(例如VDAC3)表達，抑制(suppress)VDAC(例如，VDAC3)表達或者增強VDAC(例如，VDAC3)抑制劑的功能。下面章節(jié)描述本發(fā)明的某些示范性的實施方案，它們預(yù)期能夠彼此結(jié)合。此外，所述實施方案只用于說明目的，不是用于在任何方面進行限制。工程化細胞系一方面，本發(fā)明涉及工程化致瘤細胞系。之前的報告己經(jīng)表明，通過引入表達hTERT和致癌RAS蛋白以及其他破壞p53、RB和PP2A功能的載體，有可能將原代人細胞轉(zhuǎn)化為致瘤細胞(Hahn等人,2002，MolCellBiol22，2111-23;Hahn等人，1999,Nature400，464-8;Hahn禾口Weinberg,2002，NatRevCancer2,331-41;Lessnick等人，2002，CancerCell1,393-401)。申請人利用了一系列工程化人致瘤細胞和它們的的前體，這些通過在原代人包皮成纖維細胞中引入特定遺傳元件而構(gòu)建(圖l)。先前已經(jīng)報告了這些工程化致瘤細胞的各種特征，包括它們的倍增時間，它們抗i制老化和培養(yǎng)危機的能力，它們的對Y照射的反應(yīng)，它們以非貼壁依賴性模式生長的能力，以及它們在免疫缺陷小鼠中形成腫瘤的能力(Hahn等人，1999，前文；Hahn等人，2002,前文；Lessnick等人，2002,前文)。在一個系列的工程化細胞中，下列遺傳元件順序引入原代BJ成纖維細胞人端粒末端轉(zhuǎn)移酶的催化亞單位(hTERT)，編碼猴病毒40大(LT)和小T(sT)癌蛋白的基因構(gòu)建體，和HRAS的致癌等位基因(RAS^2)。獲得的轉(zhuǎn)化細胞系分別命名為BJ-TERT,BJ-TERT/LT/ST和BJ-TERT/LT/ST/RASV12。在第二個系列中，編碼LT和ST的互補DNA(cDNA)構(gòu)建體用于代替編碼這兩種病毒蛋白的SV40基因構(gòu)建體，從而構(gòu)建出細胞系。在后一個系列中，ST在最后階段被引入，使申請人:能夠在ST存在或者缺失的情況下檢測化合物。后一種工程化人致瘤細胞系命名為BJ-TERT/LT/RASV12/ST。在第三個系列中，使用來源于獨立制備的人TIP5包皮成纖維細胞的細胞系，這是通過引入編碼hTERT、LT、ST和RASV12的cDNA構(gòu)建體得到的(Lessnick等人，2002,CancerCell1，393-401)。獲得的這些細胞系分別命名為TIP5/TERT，TIP5/TERT/LT，TIP5/TERT/LT/ST和TIP5/TERT/LT/ST/RASV12。在第四個系列中，使用來源于TIP5成纖維細胞的細胞系，這是通過引入編碼hTERT，E6，E7，ST禾BRASVI2的cDNA得至U的。這些細胞系分別命名為TIP5/TERT/E6，TIP5/TERT/E6/E7，TIP5/TERT/E6/E7/ST禾卩TIP5/TERT/E6/E7/ST/RASV12。在這些系列中，HPVE6禾卩E7，分別滅活p53和RB,起到與在LT在上述系列中的類似的作用。但是，通過利用HPVE6和E7，申請人能觀察到分別和獨立地滅活p53和RB的效果。在隨后實例中描述大規(guī)模的篩選化合物的結(jié)果，所述化合物顯示選擇性殺傷這些工程化致瘤細胞系。篩選基因型選擇性化合物的方法，在某些實施方案中，本發(fā)明涉及大規(guī)模篩選化合物，所述化合物顯示選擇性殺傷或者抑制工程化致瘤細胞系生長(有選擇性的毒性)。此處使用的術(shù)語試劑和藥物是可互換使用的。此處使用的術(shù)語"對...有毒性"是指試劑或者化合物殺傷或者抑制致瘤細胞的生長/增殖的能力。大規(guī)模篩選包括對成百上千的化合物進行高通量篩選對工程化致瘤細胞的選擇毒性。在本發(fā)明的一個實施方案中，通過比較與候選試劑接觸后待測細胞與對照細胞的活力，來檢測選擇性的毒性，所述待測細胞是工程化致瘤細胞。一種合適的對照是與待測細胞相同類型的細胞，除了對照細胞未被工程化為致瘤的。例如，對照細胞可能是衍生出待測細胞的親本原代細胞。對照細胞在與待測對照細胞相同的條件下接觸候選試劑。合適的對照可以同時進行，或者可以預(yù)先建立(例如，預(yù)先建立標(biāo)準(zhǔn)或者參考)。在某些實施方案中，候選試劑選自化合物文庫，比如組合文庫。細胞活力可以通過本領(lǐng)域已知的的各種方法檢測，包括利用染料例如鈣黃綠素乙酰甲酯(鈣黃綠素AM)和AlamarBlue。在本發(fā)明的某些實施方案中，在用候選試劑處理后，染料比如鈣黃綠素被用于待測和對照細胞。在活細胞中，鈣黃綠素AM被胞內(nèi)酯酶切割，形成陰離子熒光衍生物鈣黃綠素，它無法擴散出活細胞。因此，當(dāng)與鈣黃綠素AM孵育時，活細胞顯示綠色熒光，而死細胞不顯示?；罴毎@示的綠色熒光可以被檢測，從而提供檢測細胞活力的方法。在本發(fā)明的某些實施方案中，進一步在動物模型中鑒定試劑的特性，所述試劑已經(jīng)在工程化致瘤細胞中確定為選擇性誘導(dǎo)細胞死亡。動物模型包括小鼠，大鼠，兔子和猴子，它們可以是非轉(zhuǎn)基因(例如野生型)或者轉(zhuǎn)基因動物。在工程化致瘤細胞中選擇性誘導(dǎo)細胞死亡的試劑的效果可以在動物模型中進行評定任意多種效果，例如其在動物致瘤細胞中選擇性誘導(dǎo)細胞死亡的能力和其對動物的總體毒性。例如，本方法還包括在適當(dāng)?shù)男∈竽Ｐ椭性u定試劑(例如藥物)對致瘤細胞的選擇毒性。在工程化致瘤細胞中誘導(dǎo)細胞死亡的試劑的效果可以在動物模型中進行評定任意多種效果，例如其在動物的致瘤細胞中誘導(dǎo)細胞死亡的能力和其對動物的總體毒性。例如，本方法還包括在適當(dāng)?shù)男∈竽Ｐ椭性u定試劑(例如藥物)對致瘤細胞的毒性。為了說明，通過使用腫瘤生長試驗進一步評價試劑，所述試驗評定待測試劑抑制小鼠中建立的實體瘤生長的能力。所述試驗通過在裸鼠的脂肪墊植入腫瘤細胞來進行。給藥之前允許腫瘤細胞生長到一定大小。在數(shù)周內(nèi)監(jiān)控腫瘤體積，例如，三周。在試驗過程中還監(jiān)控待測動物的總體健康狀況。在本發(fā)明的其他實施方案中，進一步在基于細胞的試驗中評定試劑的作用機理，所述試劑已經(jīng)被鑒定為一種選擇性殺傷或者抑制工程化致瘤細胞生長/增殖的試劑。例如，試劑可以在凋亡試驗中檢測其通過前-細胞凋亡途徑誘導(dǎo)細胞死亡的能力。在本發(fā)明的其他實施方案中，評定試劑通過非細胞凋亡途徑在致瘤細胞中誘導(dǎo)死亡的能力，所述試劑在腫瘤細胞中誘導(dǎo)死亡。例如，試劑可以在凋亡試驗中檢測其通過前-細胞凋亡途徑不能誘導(dǎo)細胞死亡的能力。在其他實施方案中，本發(fā)明涉及一種鑒定試劑(例如，藥物)的方法，所述試劑在工程化細胞中選擇性抑制細胞毒性。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種鑒定抑制細胞毒性的試劑(藥物)的方法，包括用候選試劑接觸待測細胞(例如，表達突變蛋白的工程化細胞)；檢測與候選試劑接觸的待測細胞的活力；和將待測細胞的活力與合適的對照的活力作比較。如果待測細胞的活如果大于對照細胞的活力，則鑒定出選擇性抑制細胞毒性的試劑(藥物)。合適的對照是與待測細胞類型相同的細胞，除了對照細胞沒有進行工程化以表達造成毒性的蛋白。例如，對照細胞可能是衍生出待測細胞的親本原代細胞。對照細胞在與待測對照細胞相同的條件下接觸候選試劑。合適的對照可以同時進行，或者可以預(yù)先建立(例如，預(yù)先建立標(biāo)準(zhǔn)或者參考)。在某些實施方案中，本發(fā)明的基因型選擇性的化合物(抗腫瘤試劑)可以是任何化學(xué)制劑(元素，分子，化合物，藥物)，不論是合成的、用重組技術(shù)制備的或者從天然來源分離的。例如，這些化合物可以是肽，多肽，類肽，糖，激素，或者核酸分子(比如反義或者RNAi核酸分子)。此外，這些化合物可以是小分子或者通過組合化學(xué)制備的更復(fù)雜的分子，例如，并且組合成文庫。這些文庫可以包括，例如，醇，垸基鹵，胺，酰胺，酉旨，醛，乙醚及其他類型的有機化合物。這些化合物還可以是分離自細胞--細菌、動物或者植物細胞--裂解產(chǎn)物或者生長培養(yǎng)基的天然或者遺傳工程產(chǎn)品或者可以是細胞裂解產(chǎn)物或者生長培養(yǎng)基自身?？梢圆捎梅蛛x的化合物或者混合的化合物的形式將這些化合物用于檢測系統(tǒng)，尤其是在初始篩選步驟。本發(fā)明的基因型選擇性化合物申請人的結(jié)果證明在特定遺傳元件存在的情況下，可能鑒定出具有增加的效力和活性的化合物。盡管先前的報告指出對感興趣的一種遺傳元件可能鑒定出這種基因型選擇性的化合物(Simons等人，2001,GenomeRes11，266-73;Stockwell等人，1999，ChemBiol6，71-83;Torrance等人，2001，NatBiotechnol19，940-5)，此處描述的工作提供一種利用超過23,000種化合物和一種或多種癌癥相關(guān)遺傳元件的合成致死性的系統(tǒng)試驗。鑒定的9種選擇性化合物有助于明確在正常人細胞引入TERT和一個或多個LT、ST、E6、E7和致癌RAS的后果。這些遺傳改變的一個效果是提高細胞增殖率，并對抑制DNA合成的小分子敏感。盡管已經(jīng)確定這種試劑優(yōu)選的耙向到快速復(fù)制的腫瘤細胞，這個原則在這個無偏篩選方法出現(xiàn)是另外的確證。此外，該方法可以容易地區(qū)分具有明確的遺傳選擇性基礎(chǔ)和不具有的那些化合物。結(jié)果顯示hTERT和E7或者LT的表達使細胞對拓撲異構(gòu)酶II毒素敏感。因為RB的損失或者失活(Sellers和Kaelin，1997,JClinOncol15，3301-12;Sherr，2001,NatRevMolCellBiol2，731-7)和端粒末端轉(zhuǎn)移酶的活化(Hahn和Weinberg,2002，NatRevCancer2,331-41;Harley,1994，PatholBiol(Paris)42,342-5)在大部分人類癌癥中都有發(fā)現(xiàn)，這些觀察可以部分地解釋在大范圍人類腫瘤類型中這些試劑的活性。申請人發(fā)現(xiàn)喜樹堿選擇性致死帶有ST和致癌RAS的細胞，因為這兩種基因?qū)ν負洚悩?gòu)酶I的表達有組合的效應(yīng)。快速分裂的腫瘤細胞利用拓撲異構(gòu)酶I解開超螺旋DNA以便連續(xù)和快速的細胞分裂。當(dāng)這兩個途徑被同時改變，拓撲異構(gòu)酶I被上調(diào)，可能是間接地，致使這種腫瘤細胞對拓撲異構(gòu)酶I毒素敏感。這些觀察表明ST與RASV12、LT和hTERT轉(zhuǎn)化人細胞能力的一個方面可以是ST和RASV^對拓撲異構(gòu)酶I的效果。HRAS和KRAS中的突變已經(jīng)在許多種人類癌癥中描述過。此外，最近報道在結(jié)腸和肺腫瘤中有PP2A元件—PPP2RlB的失活(Wang等人，1998,Science282284-7)，而在不同PP2A亞基中的突變在黑素瘤、肺、乳腺和結(jié)腸癌中有描述(Calin等人，2000,Oncogene19,1191-5;Kohno等人，1999,CancerRes59,4170-4;Ruediger等人，2001，Oncogene20,1892-9;Ruediger等人，2001，Oncogene20，10-5)。目前，還不清楚這兩個途徑的同時改變在人類腫瘤中是否高發(fā)或者這兩個途徑紊亂的癌癥是否顯示對這些化合物的敏感度增加。此外，申請人鑒定出一種新的化合物，稱為erastin(參見圖8)，它對表達ST和RASV"的細胞是致死的。即使當(dāng)其使用濃度比在表達RASvl2WST的細胞中觀察到效果所需濃度高8倍時，用這個化合物處理細胞沒能殺傷缺乏RASV"和ST的細胞，表明一定的特異性。一旦獲得，erastin的致死效應(yīng)是快速和不可逆的。Erastin可以用于在任何腫瘤細胞中誘導(dǎo)細胞死亡，其中erastin與腫瘤細胞接觸導(dǎo)致細胞死亡。通過erastin活性產(chǎn)生致死性的致瘤細胞中包括的不僅是工程化致瘤細胞，例如表達ST和RASV"的工程化細胞，而且還有包括不依賴于ST和RASV"表達的活化的RAS途徑的致瘤細胞。申請人還檢測了135個erastin類似物在腫瘤細胞相對正常細胞中的活性和選擇性。這些類似物中的134個是沒有活性的。一個是有活性和選擇性的，但效力比erastin低。這個化合物被命名為erastinB(參見圖8)。在本發(fā)明的某些實施方案中，本發(fā)明涉及化合物，erastin。在其他實施方案中，本發(fā)明涉及化合物erastin的類似物，其中類似物顯示對工程化致瘤細胞的選擇毒性，比如工程化人致瘤細胞。在一個實施方案中，顯示對工程化人致瘤細胞選擇毒性的erastin類似物，是erastinB。在某些實施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明化合物的外消旋混合物，所述混合物顯示對工程化致瘤細胞的選擇毒性。對喜樹堿(CPT)和erastin來說，申請人確定了被RASV12，CIST表達改變的途徑間的協(xié)同作用。RASV12的表達導(dǎo)致幾種已經(jīng)清楚表征的信號途徑的活化，包括RAF-MEK-MAPK信號級聯(lián)，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信號途徑和Ral-鳥嘌呤解離因子途徑(Ral-GDS)。這些途徑的每一種都與人類癌癥有關(guān)，最近的研究顯示這些途徑與細胞轉(zhuǎn)化體系相呼應(yīng)而起作用(Hamad等人，2002，GenesDev16,2045-57)。此外，ST結(jié)合并滅活一種廣泛表達的絲氨酸-蘇氨酸磷酸酶PP2A。盡管在ST表達時被擾亂的PP2A的的特定酶靶標(biāo)還不知道，在被PP2A和RAS改變的途徑中存在本質(zhì)上的重疊(Millward等人，1999，TrendsBiochemSci24,186-91)。進一步了解通過何種機理，erastin在帶有改變的這兩個信號途徑細胞中誘導(dǎo)死亡，可以提供這兩個途徑功能重疊的本質(zhì)和程度的線索。本發(fā)明的erastin類似物，除了erastinB和erastinA，用通式I代表W選自H、-Z-Q-Z、-C,.s垸基-N(R2)(R4)、-Q.s烷基-OR3、3-到8-元碳環(huán)或者雜環(huán)，芳基，雜芳基，和Cl4芳院基；每次出現(xiàn)的W和W均是獨立選自H、Cl4院基、Cl4芳院基、芳基、雜芳基、?；?、烷基磺酰和芳基磺酰，如果當(dāng)112和114在相同氮上并且W或W是?；?、烷基磺酰或者芳基磺酰，另一個選自H、d-8烷基、芳基、Cl4芳院基，和雜芳基；RS選自H、Cm院基、C,-4芳烷基、芳基和雜芳基；Q選自O(shè)和NR2;和每次出現(xiàn)的Z獨立地選自Cl6院基、C2-6烯基和C2-6炔基。當(dāng)Z是烯基或者炔基基團，雙鍵或者三鍵優(yōu)選不在基團的末端。其中:w選自在某些優(yōu)選實施方案中，當(dāng)W和R"在相同N原子上時，它們可以都是H，或者是不同的。在某些實施方案中，W是H。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage74</formula>在某些實施方案中，W是R4<formula>formulaseeoriginaldocumentpage74</formula>在某些實施方案中，W選自H或者取代的或者未替取的的低級烷在某些實施方案中，Rt是H,W是r4，W選自H或者取代的或者未取代的的低級垸基。通式I的示例化合物包括:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage75</formula>本發(fā)明的其他erastin類似物，用通式II表示:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage75</formula>其中Ar是取代的苯基；W選自H、-C,.s烷基、-Z-Q-Z、-d.8烷基-N(R2)(R4)、-Q.8烷基-OR3、3-到8-元碳環(huán)或者雜環(huán)，芳基，雜芳基，和Cl4芳院基；每次出現(xiàn)的112和R"均是獨立選自H、dv烷基、Cw芳烷基、芳基、雜芳基、酰基、垸基磺酰和芳基磺酰，如果W和R"在相同氮上并且112或114是?；?、烷基磺酰或者芳基磺酰，另一個選自H、d.s烷基、芳基、Cm芳院基，和雜芳基；W選自H、Cl4院基、C,-4芳烷基、芳基和雜芳基；RS代表在其結(jié)合的環(huán)上的0-4個取代基。Q選自0禾口NR2;禾口每次出現(xiàn)的Z獨立地選自CL6烷基、02.6烯基和C2V塊基。當(dāng)Z是烯基或者炔基基團，雙鍵或者三鍵優(yōu)選不在基團的末端。在一些實施方案中，115代表1-4個取代基比如鹵素或者硝基。在某些實施方案中，R5代表一個取代基，比如鹵素或者硝基，尤其是氯，位于喹唑酮環(huán)的羰基對位上。在其他實施方案中，R5代表環(huán)上無取代基(即，所有取代基是氫原子)。在某些實施方案，Ar是單一取代，其中取代基是鹵素，低級烷氧基，或者低級垸基。在某些實施方案中，Ar在鄰位有一個取代基，其中取代基是鹵素，低級烷氧基，或者低級垸基。在某些實施方案中，Ar是2，6-二取代，這樣的話一個取代基是鹵素，低級烷氧基，或者低級烷基，第二個取代基是鹵素，低級烷氧基，或者低級垸基。在某些實施方案中，通式II的化合物不包括那些其中Ar上的取代基是乙氧基，其位于喹唑酮環(huán)上氮鍵鄰位的位置的化合物。在其他實施方案中，通式II的化合物不包括那些其中Ar沒有位于喹唑酮環(huán)的氮鍵的鄰位的低級烷氧基或者低級烷基取代基。在通式II的化合物的某些實施方案中，Ar至少有一個鹵素取代基。W是R4在某些實施方案中，Ar有在鄰位一個鹵素取代基。在優(yōu)選的實施方案中，通式II的化合物包括那些其中Ar是2，6—二取代的苯環(huán)，其中取代基是鹵素原子。通式II的示例性化合物包括Ar是取代或未取代的苯基；Ri選自H、-CM烷基、-Z-Q-Z、-d—8烷基-N(R2)(R4)、-d-s垸基-OR3、3-到S-元碳環(huán)或者雜環(huán)，芳基，雜芳基，和Cm芳院基；每次出現(xiàn)的112和R"均是獨立選自H、Q-4垸基、Cl4芳院基、芳基、雜芳基、?；?、烷基磺酰和芳基磺酰，如果W和W在相同氮上并且R或W是?；?、烷基磺?；蛘叻蓟酋?，另一個選自H、d.s烷基、芳基、Cm芳院基，和雜芳基；W選自H、dv烷基、C,-4芳烷基、芳基和雜芳基；RS代表在其結(jié)合的環(huán)上的0-4個取代基。本發(fā)明的其他emstin類似物，用通式III代表:、w選自R2^Q選自0和NR2。每次出現(xiàn)的Z獨立地選自d-6烷基、C2—6烯基和(32.6炔基。當(dāng)Z是烯基或者炔基基團，雙鍵或者三鍵優(yōu)選不在基團的末端。在某些實施方案中，R2和R4或者都是氫或者是不同的。在某些實施方案，R5代表其結(jié)合的環(huán)上的l一4個取代基，比如鹵素或者硝基。在某些實施方案中，R5代表一個取代基，比如鹵素或者硝基，尤其是氯，位于喹唑酮環(huán)的羰基對位上。在其他實施方案中，R5代表環(huán)上無取代基(即，所有取代基是氫原子)。在某些實施方案中，通式III的化合物不包括那些其中Ar上的取代基是位于喹唑酮環(huán)上氮鍵鄰位的位置的乙氧基的化合物。在其他實施方案中，通式III的化合物不包括那些其中Ar沒有位于喹唑酮環(huán)的氮鍵的鄰位的低級垸氧基或者低級烷基取代基原的化合物。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，Ar是取代的苯基。在通式III的化合物的某些實施方案中，Ar至少有一個鹵素取代基。在某些實施方案中，Ar有在鄰位鹵素取代基。在優(yōu)選的實施方案中，通式III的化合物包括那些其中Ar是2，6—二取代的苯環(huán)，其中取代基是鹵素原子。通式m的示例性化合物包括:本發(fā)明的其他erastin類似物，用通式IV代表:79<formula>formulaseeoriginaldocumentpage79</formula>其中Ar是取代的或者未取代的苯基；R1是-C"8焼基；每次出現(xiàn)的W和R"均是獨立選自H和Q-8垸基;W代表在其結(jié)合的環(huán)上的0-4取代基。W選自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage80</formula>在某些實施方案，R5代表其結(jié)合的環(huán)上的l一4個取代基，比如齒素或者硝基。在某些實施方案中，R5代表一個取代基，比如鹵素或者硝基，尤其是氯，位于喹唑酮環(huán)的羰基對位上。在其他實施方案中，R5代表環(huán)上無取代基(即，所有取代基是氫原子)。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，Ar是取代苯基。在某些實施方案中，Ar是單一取代，其中取代基是鹵素，低級垸氧基，或者低級垸基。在某些實施方案中，Ar在鄰位有取代基，其中取代基是鹵素，低級烷氧基，或者低級烷基。在某些實施方案中，Ar是2，6-二取代的，這樣的話一個取代基是鹵素，低級垸氧基，或者低級垸基，第二個取代基是鹵素，低級烷氧基，或者低級垸基。在某些實施方案中，通式IV的化合物不包括那些其中Ar上的取代基是位于喹唑酮環(huán)上氮鍵鄰位的位置的乙氧基的化合物。在其他實施方案中，通式IV的化合物不包括那些其中Ar沒有位于喹唑酮環(huán)的氮鍵的鄰位的低級烷氧基或者低級垸基取代基的化合物。在通式IV的化合物的某些實施方案中，Ar至少有一個鹵素取代基。在某些實施方案中，Ar在鄰位有鹵素取代基。在優(yōu)選的實施方案中，通式IV的化合物包括那些其中Ar是2，6—二取代的苯環(huán)，其中取代基是鹵素原子。通式IV的示例性化合物包括:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage81</formula>本發(fā)明的其他erastin類似物，用通式V代表:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage81</formula>(V)其中R'選自H和d.s浣基；R2選自H和C,.8垸基；R選自鹵素、Q.8烷氧基和d.s垸基；R4選自H、鹵素、d.8垸氧基和d.s垸基;W選自H、鹵素和硝基；和n是1或者2。通式V的示例性化合物包括-<formula>formulaseeoriginaldocumentpage82</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage83</formula>通式I-V的化合物可用于此處所述的用于erastin和erastin類似物任意方法。本發(fā)明的化合物包括此處公開化合物的對映體和非對映體。本發(fā)明還包括此處公開化合物的鹽，尤其藥學(xué)可接受的鹽。此外，本發(fā)明包括此處公開化合物的溶劑化物，水合物和多形體結(jié)晶形式。適當(dāng)?shù)脑噭┛梢栽诂F(xiàn)有形式或者完全或者部分新陳代謝后具有前述的活性。.本發(fā)明還提供本發(fā)明化合物的合成或者制備。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage84</formula>在某些實施方案中本發(fā)明提供化合物A的制備，其中RS和W如對結(jié)構(gòu)II-V的描述。在某些實施方案中化合物A的合成步驟是<formula>formulaseeoriginaldocumentpage84</formula>在某些實施方案中，化合物B與化合物C的反應(yīng)是在極性的質(zhì)子惰性溶劑中進行，例如乙腈、DMSO、二乙醚、丁酮、環(huán)己酮、苯乙酮、四氫呋喃、丙酮、二氯甲烷、環(huán)丁砜或者二甲基甲酰胺。在優(yōu)選的實施方案中，溶劑是二氯甲垸或者二甲基甲酰胺。在某些實施方案中，反應(yīng)在氮氣中進行。在某些實施方案中，有機堿，比如吡啶、二異丙胺、2，6-二甲基吡啶、三垸基胺(例如，三乙胺)、吡咯烷、咪唑或者哌啶，被添加到化合物B的溶液中，然后將化合物C添加到得到的溶液中。在優(yōu)選的實施方案中，有機堿是胺堿，比如三烷基胺例如三乙基胺。在優(yōu)選的實施方案中,反應(yīng)是在0-10'C進行。本發(fā)明還提供結(jié)構(gòu)D的化合物制備方法D，其中R5、R'和Ar如對結(jié)構(gòu)II-V的描述。在某些實施方案中，D的合成步驟是化合物A與化合物E，Ar-NH2的反應(yīng)。在某些實施方案中，化合物A與化合物E的反應(yīng)是在極性的質(zhì)子惰性溶劑中進行，例如乙腈、DMSO、二乙醚、丁酮、環(huán)己酮、苯乙酮、四氫呋喃、丙酮、二氯甲烷、環(huán)丁砜或者二甲基甲酰胺。在優(yōu)選的實施方案中，溶劑是乙腈。在某些實施方案中，反應(yīng)在氮氣中進行。在某些實施方案中，反應(yīng)在三氯膦存在的條件下進行。在某些實施方案中，反應(yīng)在40-60'C維持一段時間，例如5-15小時。在其他的實施方案中，磷?；然锉惶砑拥綌嚢璧娜芤篈和E中，得到的混合物加熱回流一段時間，比如1-5小時。本發(fā)明還提供結(jié)構(gòu)F的化合物制備方法F，其中R5、R1、Ar和W如對結(jié)構(gòu)II-V的描述。在某些實施方案中，化合物F的合成步驟是化合物D與HNR2的反應(yīng)，其中HNR2相當(dāng)于HW。在某些實施方案中，反應(yīng)是在碳酸鉀和碘化物來源存在的條件下進行，比如碘化亞銅，碘化鉀，碘化銫，碘化鈉，或者碘化四丁銨，在極性質(zhì)子惰性溶劑中。在某些實施方案中，化合物D和碳酸鉀混合，并且添加HNR2，然后是碘化物來源。在優(yōu)選的實施方案中，溶劑是乙腈。在某些實施方案中，碘化物試劑是碘化四丁銨；在某些實施方案中，碘化物試劑是碘化鈉。在一些實施方案中，混合物在50-7(TC保持一段時間比如5-15小時。在某些實施方案中HNR2(HW)包括第二個氮原子，其上有胺保護基團。在一些實施方案中，保護基團可以是叔丁氧碳基，芐氧羰基，烯丙氧羰基，9-芴甲氧羰基，2-(三甲基甲硅烷)乙氧羰基，或者2，2,2-三氯乙氧基羰基。在某些實施方案中，反應(yīng)在堿存在的條件下進行，比如碳酸鉀，碳酸鈉，吡啶，二異丙胺，2，6-二甲基吡啶，三乙胺，吡咯烷，咪唑，或者哌啶，和碘化物來源，在極性質(zhì)子惰性溶劑中進行。在某些實施方案中，堿是碳酸鉀或者三乙基胺。在某些實施方案中，化合物D和堿混合，并且添加HNR2，然后是碘化物來源。在優(yōu)選的實施方案中，溶劑是乙腈或者丙酮。在某些實施方案中，碘化物試劑是碘化四丁銨；在某些實施方案中，碘化物試劑是碘化鈉。在一些實施方案中，混合物在70-90'C保持一段時間比如1-10小時。在加成反應(yīng)完成后，可以通過合適的脫保護反應(yīng)從獲得的產(chǎn)品去除保護基團。例如，當(dāng)保護基團是叔丁氧碳基時，保護基團可以通過在化合物溶液中添加酸來去除(例如在產(chǎn)品的二噁烷溶液中添加4NHC1的二噁垸溶液)。在某些實施方案中，在中和混合物之前，反應(yīng)液用水和有機溶劑稀釋。在某些實施方案中，混合物通過添加飽和碳酸鈉水溶液調(diào)為堿性。預(yù)期本發(fā)明的全部的實施方案可以和一個或多個其他實施方案聯(lián)用，盡管它們在本發(fā)明的不同方面描述。術(shù)語"?；?是本領(lǐng)域熟知的，是指通式烴基C(O)-代表的基團，優(yōu)選垸基C(0)-。術(shù)語"酰氨基"是本領(lǐng)域熟知的，是指氨基團被?；鶊F取代，可以例如用通式烴基C(O)NH-代表。術(shù)語"酰氧基"是本領(lǐng)域熟知的，是指通式烴基C(O)O-，優(yōu)選烷基C(O)O-代表的基團。術(shù)語"烷氧基"是指具有氧與其結(jié)合的烷基，優(yōu)選低級烷基。典型的烷氧基包括甲氧基，乙氧基，丙氧基，叔-丁氧基及其類似物。術(shù)語"烷氧烷基"是指垸基用烷氧基取代，可以用通式烷基-O-烷基代表。此處使用的術(shù)語"烯基"，是指一種脂肪基，包含至少一個雙鍵，并且包括"未被取代的烯基"和"取代的烯基"，其中后者是指烯基部分具有取代基，所述取代基替換烯基基團一個或多個碳上的氫。這種取代可能發(fā)生在一個或多個碳原子上，所述碳原子包括或不包括在一個或多個雙鏈內(nèi)。此外，這種取代包括所有能夠預(yù)料到的垸基的取代，如下所述，除非穩(wěn)定性是不允許的。例如，用一種或多種烷基、碳環(huán)、芳基，雜環(huán)或者雜芳基基團取代烯基基團是預(yù)料得到的。術(shù)語"烷基"是指飽和脂肪基團，包括直鏈烷基、支鏈垸基、環(huán)烷基(脂環(huán)的)基團、垸基-取代的環(huán)烷基基團和環(huán)垸基-取代的烷基。在優(yōu)選的實施方案中，直鏈或者支鏈烷基在其骨架上具有30個或者更少的碳原子(例如，對于直鏈而言C1-C30，對于支鏈而言C3-C30),并且更優(yōu)選20個或者更少。同樣地，優(yōu)選的環(huán)烷基在它們的環(huán)狀結(jié)構(gòu)具有從3個到10個碳原子，并且更優(yōu)選在環(huán)狀結(jié)構(gòu)具有5、6或者7個碳。此外，在整個說明書、實施方案和權(quán)利要求中使用的術(shù)語"垸基"(或者"低級垸基")包括"未被取代的烷基"和"取代的烷基"，其中后者是指烷基部分具有取代基，所述取代基替換烴的骨架的一個或多個碳上的氫。這種取代基可以包括，例如，鹵素，羥基，羰基(比如羧基，烷氧羰基，甲酰，或者?；?，硫代羰基(比如硫酯，硫代醋酸鹽，或者硫代甲酸鹽)，烷氧基，磷?；?，磷酸鹽，膦酸鹽，次膦酸鹽，氨基，酰氨基，脒，亞胺，氰基，硝基，疊氮基，巰基，烷硫基，硫酸鹽，磺酸鹽，氨磺酰，亞磺酰氨基，磺酰，雜環(huán)，芳垸基，或者芳香族或者雜芳香族部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道烴鏈上被取代的部分它們自身也是可以被取代的，如果合適的話。例如，取代垸基的取代基可以包括取代和未取代形式的氨基，疊氮基，亞氨基，酰氨基，磷?；?包括膦酸鹽和次膦酸鹽)，磺酰(包括硫酸鹽，磺氨基，氨磺酰和磺酸鹽)，和甲硅烷基基團，以及醚，烷硫基，羰基(包括酮，醛，羧酸酯，和酯)，-CF3，-CN和類似物。示范性取代的烷基描述如下。環(huán)烷基還可以用垸基，烯基，垸氧基，烷硫基，氨垸基，羰基取代的烷基，-CF3，-CN和類似物取代。術(shù)語"C,.y"當(dāng)與化學(xué)部分例如?；?，酰氧基，烷基，烯基，炔基，或者烷氧基聯(lián)用時表示包括一些基團，所述基團在鏈上包含從X到Y(jié)個碳。例如，術(shù)語"Cx.y垸基"是指取代的或者未取代的飽和烴基團，包括直鏈垸基和支鏈垸基基團，所述基團在鏈上包含從X到Y(jié)個碳，包括鹵垸基基團例如三氟甲基和2,2，2-三氟乙基等等。Cq院基表示如果位于末端位置為氫，如果在內(nèi)部，則為鍵。術(shù)語"C2.y烯基"和"C2.y炔基"是指取代的或者未取代的非飽和的脂肪基，長度相似并且可能取代上述烷基，但分別包含至少一個雙鍵或者三鍵。此處使用的術(shù)語"垸氨基"是指用至少一個垸基取代的氨基團。此處使用的術(shù)語"烷硫基"是指用垸基取代的硫醇基，可以由通式烷基S-代表。此處使用的術(shù)語"炔基"，是指一種脂肪基，包含至少一個三鍵，并且包括"未被取代的炔基"和"取代的炔基"，其中后者是指炔基部分具有取代基，所述取代基替換炔基基團一個或多個碳上的氫。這種取代基可能出現(xiàn)在一個或多個碳原子上，所述碳原子包括或不包括在一個或多個三鍵內(nèi)。此外，這種取代包括所有能夠預(yù)料到的對烷基的取代，如上所述，除非穩(wěn)定性是不允許的。例如，用一種或多種烷基、碳環(huán)、芳基，雜環(huán)或者雜芳基基團取代炔基基團是預(yù)料得到的。此處使用的術(shù)語"酰胺"，作為使用此處，是指一種基g^Q其中W和R"各自獨立地代表氫或者烴基基團，或者W和R"與它們結(jié)合的氮原子一起形成在環(huán)結(jié)構(gòu)上具有4-8個原子的雜環(huán)。術(shù)語"胺"和"氨基"是本領(lǐng)域熟知的，是指未取代的和取代的胺及其鹽，例如，可被下面結(jié)構(gòu)代表的部分其中R9、R"和R^各自獨立地代表氫或者烴基基團，或者W和R1Q與它們結(jié)合的氮原子一起形成在環(huán)結(jié)構(gòu)上具有4-8個原子的雜環(huán)。此處使用的術(shù)語"氨烷基"是指用氨基基團取代的烷基團。此處使用的術(shù)語"芳垸基"是指用芳基基團取代的烷基團。此處使用的術(shù)語"芳基"包括取代的或者未取代的單環(huán)芳族基，其中環(huán)上的每個原子是碳。優(yōu)選的環(huán)是5-到7-元環(huán)，更優(yōu)選6-元環(huán)。術(shù)語"芳基"還包括具有兩個或更多環(huán)的多環(huán)體系，具有兩個或更多碳是兩個相鄰環(huán)公用的，其中至少一個環(huán)是芳香族，例如，另一個環(huán)可以是環(huán)烷基，環(huán)烯基，環(huán)炔基，芳基，雜芳基，和/或雜環(huán)。芳基基團包括苯，萘，菲，苯酚，苯胺和類似物。術(shù)語"氨基甲酸鹽"是本領(lǐng)域熟知的，是指基團3-t1LR4Z-R<formula>formulaseeoriginaldocumentpage90</formula>其中W和R"獨立地代表氫或者烴基基團。此處使用的術(shù)語"碳環(huán)"，"碳環(huán)基"和"碳環(huán)的"是指非芳香族飽和的或者非飽和的環(huán)，其中環(huán)上的每個原子是碳。優(yōu)選的碳環(huán)包含3-10個原子，更優(yōu)選5-7個原子。此處使用的術(shù)語"碳環(huán)烷基"是指用碳環(huán)基團取代的烷基團。術(shù)語"碳酸酯"是本領(lǐng)域熟知的，是指基團-OC02-R9，其中R9代表烴基基團。此處使用的術(shù)語"羧基"是指由式-C02H代表的基團。此處使用的術(shù)語"酯"是指基團-C(O)OR9，其中W代表烴基基團。此處使用的術(shù)語"醚"是指烴基基團通過氧連接到另一個烴基基團。因此，烴基基團的醚取代基可以是烴基-O-。醚可以是對稱或者不對稱的。醚的實例包括，但不限于，雜環(huán)-O-雜環(huán)和芳基-O-雜環(huán)。乙醚包括"垸氧基烷基"基團，可以由通式烷基-O-烷基代表。此處使用的術(shù)語"鹵"和"鹵素"表示鹵素，包括氯，氟，溴和碘。此處使用的術(shù)語"雜烷基"和"雜芳垸基"是指用雜芳基基團取代的烷基團。術(shù)語"雜芳基"和"雜芳基"包括取代的或者未取代的芳香族單環(huán)結(jié)構(gòu)，優(yōu)選的5-到7-元環(huán)，更優(yōu)選的5-到6-元環(huán)，其環(huán)狀結(jié)構(gòu)包括至少一個雜原子，優(yōu)選一到四個雜原子，更優(yōu)選一到兩個雜原子。術(shù)語"雜芳基"和"雜芳基"還包括具有兩個或更多環(huán)的多環(huán)體系，兩個或更多碳是兩個相鄰環(huán)公用的，其中至少一個環(huán)是雜原子的，例如，另一個環(huán)可以是環(huán)烷基，環(huán)烯基，環(huán)炔基，芳基，雜芳基，和/或雜環(huán)。雜芳基基團包括，例如吡咯，呋喃，噻吩，咪唑，惡唑，噻唑，吡唑，吡啶，吡嗪，噠嗪，和嘧啶，以及類似物。此處使用的術(shù)語"雜原子"表示除碳或者氫以外的任意元素的原子。優(yōu)選的雜原子是氮，氧和硫。術(shù)語"雜環(huán)基"，"雜環(huán)"和"雜環(huán)的"是指取代的或者未取代的非芳環(huán)結(jié)構(gòu)，優(yōu)選的3-到10-元環(huán)，更優(yōu)選的3-到7-元環(huán)，其環(huán)狀結(jié)構(gòu)包括至少一個雜原子，優(yōu)選一到四個雜原子，更優(yōu)選一到兩個雜原子。術(shù)語"雜環(huán)基"和"雜環(huán)的"還包括具有兩個或更多環(huán)的多環(huán)體系，其中兩個或更多碳是兩個相鄰環(huán)公用的，其中至少一個環(huán)是雜環(huán)，例如，另一個環(huán)可以是環(huán)垸基，環(huán)烯基，環(huán)炔基，芳基，雜環(huán)，和/或雜環(huán)基。雜環(huán)基團包括，例如，哌啶，哌嗪，吡咯烷，嗎啉，內(nèi)酯，內(nèi)酰胺，及類似物。此處使用的術(shù)語"雜環(huán)烷基"是指用雜環(huán)基團取代的烷基團。此處使用的術(shù)語"烴基"是指通過碳原子成鍵的基團，所述碳原子沒有=0或者-s取代基，通常具有至少一個碳氫鍵和主要的碳骨架，但任選包括雜原子。因此，像甲基、乙氧基乙基、2-吡啶基和三氟甲基的基團被認為是用于本申請目的的烴基，但取代基比如乙?；?在連接碳上具有-O取代基)和乙氧基(通過氧而不是連接碳)不是。烴基基團包括，但不限于芳基，雜芳基，碳環(huán)，雜環(huán)，烷基，烯基，炔基，及其組合。此處使用的術(shù)語"羥烷基"是指用羥基取代的垸基團。術(shù)語"低級"當(dāng)與化學(xué)部分例如，?；?，酰氧基，垸基，烯基，炔基，或者烷氧基聯(lián)用時表示包括一些基團，所述基團在取代基上具有十個或者更少非氫原子，優(yōu)選六個或者更少。"低級烷基"，例如，是指一種垸基，所述垸基包含十個或者更少碳原子，優(yōu)選六個或者更少。在某些實施方案中，此處定義的?；?，酰氧基，垸基，烯基，炔基，或者烷氧基取代基，分別是低級?；?，低級酰氧基，低級垸基，低級烯基，低級炔基，或者低級烷氧基，不論它們是單獨或者與其他取代基共同存在，比如在羥垸基和芳烷基(在這樣情況下，例如，當(dāng)計算烷基取代基中的碳原子時，不計算芳基基團中的原子)。術(shù)語"多環(huán)基"，"多環(huán)"和"多環(huán)的"是指兩個或更多環(huán)(例如，環(huán)烷基，環(huán)烯基，環(huán)炔基，芳基，雜芳基和/或雜環(huán)基)，其中兩個或更多原子是兩個相鄰環(huán)共用的，例如，環(huán)是"稠環(huán)"。多環(huán)中的每個環(huán)可以是取代或者未取代的。在某些實施方案中，多環(huán)的每個環(huán)在環(huán)中包含3到IO個原子，優(yōu)選的5到7個。術(shù)語"取代的"是指具有替換骨架上一個或多個碳上的氫的取代基的部分。很清楚"取代"或者"用...取代"包括隱含條件，即這種取代與取代的原子和取代基允許的化合價一致，并且取代導(dǎo)致穩(wěn)定的化合物，例如，不會自發(fā)進行轉(zhuǎn)化例如通過重排、環(huán)化、消除等等。此處使用的術(shù)語"取代的"預(yù)期包括有機化合物所有允許的取代。在較寬范圍，允許的取代基包括有機化合物的非環(huán)狀的和環(huán)狀的，支流和無支鏈的，碳環(huán)的和雜環(huán)的，芳香族和非芳香族取代基。對合適的有機化合物，允許的取代可以是一種或多種，可以是相同或者不同的。對本發(fā)明來說，雜原子比如氮可以有氫取代基和/或此處描述的任何允許的有機化合物取代，其滿足雜原子的化合價。取代基可以包括此處描述的任何取代基，例如鹵素，羥基，羰基(比如羧基，垸氧羰基，甲酰，或者?；?，硫代羰基(比如硫酯，硫代醋酸鹽，或者硫代甲酸鹽)，垸氧基，磷酰基，磷酸鹽，膦酸鹽，次膦酸鹽，氨基，酰氨基，脒，亞胺，氰基，硝基，疊氮基，巰基，垸硫基，硫酸鹽，磺酸鹽，氨磺酰，磺酰氨，磺酰，雜環(huán)，芳垸基，或者芳香族或者雜芳族部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道烴鏈上被取代的部分它們自身也是可以被取代的，如果合適的話。除非特別表明為"未取代的"，此處關(guān)于化學(xué)基團的參考理解為包括取代的變體。例如，關(guān)于"芳基"基團或者部分的參考隱含的包括取代的和未取代的變體。術(shù)語"硫酸鹽"是本領(lǐng)域熟知的，是指基團-OS03H，或者藥學(xué)可接受的鹽。術(shù)語"氨磺酰"是本領(lǐng)域熟知的，是指由下列通式代表的基團其中W和R"獨立地代表氫或者烴基。術(shù)語"亞砜"是本領(lǐng)域熟知的，是指基團-S(O)-R9，其中W代表烴基基團。術(shù)語"磺酸鹽"是本領(lǐng)域熟知的，是指基團S03H，或者藥學(xué)可接受的鹽。術(shù)語"砜"是本領(lǐng)域熟知的，是指基團-S(0)2-R9，其中RS代表烴基基團。此處使用的術(shù)語"硫代烷基"是指用硫醇基取代的烷基團。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage93</formula>此處使用的術(shù)語"硫酯"是指基團-C(O)SR9或者-SC(O)R9，其中Rg代表烴基基團。此處使用的術(shù)語"硫醚"相當(dāng)于醚，其中氧用硫替換。術(shù)語"尿素"是本領(lǐng)域熟知的，可以由下列通式代表其中W和R"獨立地代表氫或者烴基基團。術(shù)語"小的有機分子"是指分子量小于2000amu的非聚合物。通常，這種分子的分子量小于1000amu，比如小于500amu。鑒定基因型選擇性化合物靶標(biāo)的方法在某些實施方案中，本發(fā)明涉及利用基因型選擇性化合物，此處也稱為"配體"(例如，erastin)，鑒定參與改變患病細胞表型的耙標(biāo)(此處還被稱為"細胞組分"(例如，蛋白，核酸，或者脂類)。在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種鑒定參與腫瘤發(fā)生的細胞組分的方法，其中致瘤細胞，諸如工程化人致瘤細胞、組織、器官、有機體或者其裂解產(chǎn)物或者提取物，與所述抗腫瘤化合物接觸；在接觸后，與erastin作用(直接或者間接)的細胞組分被鑒別，從而可以鑒定出參與腫瘤發(fā)生的細胞組分。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種鑒定參與腫瘤發(fā)生的細胞組分的方法。在這個方法中，(a)致瘤細胞，諸如工程化人致瘤細胞、組織、器官、有機體或者其裂解產(chǎn)物或者提取物，與erastin抑制劑接觸和與erastin接觸；和(b)與erastin抑制劑作用(直接或者間接)的細胞組分被鑒別，這些細胞組分參與腫瘤發(fā)生。細胞可以先后或者同時接觸erastin和erastin抑制劑?？衫眉褐姆椒ㄨb定與erastin或者本發(fā)明的任何試劑相互作用的細胞組分。如此處描述，這些方法所述化合物(或者配體)可以用任何化學(xué)方法制備。此外，所述化合物可以是體內(nèi)或者體外合成的天然存在的生物分子。配體可選衍生自另一個化合物。這種改變的一個益處是，衍生化合物可以用于促進配體靶復(fù)合物收集或者配體收集，例如，在分離配體和靶標(biāo)后。衍生基團的非限制性實例包括生物素，熒光素，地高辛，綠色熒光蛋白，同位素，多聚組氨酸，磁珠，谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶，光激活交聯(lián)劑或者任意其組合。衍生基團還可以用于結(jié)合靶標(biāo)(例如，erastin結(jié)合蛋白)以有利于它們的檢測。根據(jù)本發(fā)明，靶標(biāo)(細胞組分)可以是體內(nèi)或者體外合成的天然存在的生物分子。靶標(biāo)可以包括氨基酸，核酸，糖，脂類，天然產(chǎn)物或者其任意組合。本發(fā)明的一個益處是不需要耙標(biāo)性質(zhì)或者功能的先驗知識。配體和靶標(biāo)的相互作用可以是共價的或者非共價的。任選，配體_耙標(biāo)配對中的配體對其他靶標(biāo)可以顯示親合力，或者也可以不顯示親合力。配體-耙標(biāo)配對中的耙標(biāo)對其他配體可以顯示親合力，或者也可以不顯示親合力。例如，配體和耙標(biāo)間的結(jié)合可以使用體外生化法在蛋白水平鑒定，包括光-交聯(lián)，放射性同位素標(biāo)記的配體結(jié)合和親和色譜法(JakobyWB等人，1974，MethodsinEnzymology46:1)。此外，小分子可以固定在合適的固體支持物或者親合基質(zhì)例如瓊脂糖基質(zhì)上，用于篩選不同細胞類型和生物體的提取物。同樣地，小分子可以接觸細胞，組織，器官，生物體或者其裂解產(chǎn)物或者提取物，然后加入固相支持體以捕獲小分子和結(jié)合的耙蛋白。表達克隆可用于檢測蛋白的小庫中的靶標(biāo)(KingRW等人，1997，Science277:973)。肽(Kieffer等人,1992,PNAS89:12048)，核苷衍生物(HaushalterKA等人，1999,Curr.Biol.9:174)和藥物-牛血清白蛋白(藥物-BSA)結(jié)合物(Tanaka等人，1999，Mol.Pharmacol.55:356)已經(jīng)被用于表達克隆中。另一個將配體與編碼耙標(biāo)的DNA緊密聯(lián)系的有用技術(shù)是噬菌體展示。噬菌體展示，主要用于單克隆抗體領(lǐng)域，在病毒表面創(chuàng)建了肽或者蛋白文庫，并用于篩選活性(SmithGP,1985，Science228:1315)。淘篩噬菌體以獲得連接到固相上的靶標(biāo)(ParmleySF等人，1988，Gene73:305)。噬菌體展示的一個優(yōu)點是cDNA位于噬菌體中，因此不需要分離克隆步驟。一種非限制性實例包括結(jié)合反應(yīng)條件，其中配體包括標(biāo)記物例如生物素、熒光素、地高辛、綠色熒光蛋白、放射性同位素、組氨酸標(biāo)記物、磁珠、酶或者其組合。在本發(fā)明的一個實施方案中，靶標(biāo)可以在基于機理的試驗中篩選，比如檢測結(jié)合靶標(biāo)的配體的試驗。這可以包括與配體或者蛋白或者被檢測的指示劑的固相或者液相結(jié)合情況。或者，編碼功能還不確定的蛋白的基因可以與報告系統(tǒng)(例如，^-半乳糖苷酶、熒光素酶或者綠色熒光蛋白)一起轉(zhuǎn)染細胞，并篩選文庫，優(yōu)選的通過高通量篩選或者用文庫的單獨成員?？梢允褂没谄渌麢C理的結(jié)合試驗，例如，檢測對酶活性作用的生化試驗，基于細胞的試驗，其中靶標(biāo)和報告系統(tǒng)(例如，熒光素酶或者/3-半乳糖苷酶)已經(jīng)導(dǎo)入細胞，以及檢測自由能變化的結(jié)合試驗。靶標(biāo)被固定到孔、珠或者芯片上，或者通過固定化抗體捕獲，或者毛細管電泳分析，進行結(jié)合試驗。結(jié)合的配體通?？梢允褂帽壬蛘邿晒饣蛘弑砻娴入x子共振來檢測。在某些實施方案中，通過調(diào)節(jié)本發(fā)明鑒定的靶標(biāo)(細胞組分)的功能(例如，活性或者表達)，本發(fā)明還預(yù)期了治療或者預(yù)防疾病(例如癌癥)的方法。為了說明，如果靶標(biāo)被鑒定促進腫瘤生長，治療劑可用于改變或者降低靶標(biāo)的功能(活性或者表達)。或者，如果靶標(biāo)被鑒定抑制腫瘤生長，治療劑可用于增強靶標(biāo)的功能(活性或者表達)。治療劑包括，但不限于，抗體、核酸(例如，反義寡聚核苷酸或者用于RNA干擾的小抑制RNA)、蛋白、小分子(例如，本發(fā)明的化合物)或者模擬肽。Erastin耙標(biāo)在某些實施方案中，本發(fā)明提供emstin和erastin類似物的靶標(biāo)，在此處通稱為erastin靶標(biāo)。Erastin靶標(biāo)可以直接或者間接地結(jié)合erastin或者如上所述的erastin類似物。可選地，erastin靶標(biāo)可以在細胞中調(diào)節(jié)化合物例如erastin或者erastin類似物的抗腫瘤活性。示例性erastin靶標(biāo)包括，但不限于VDAC1，VDAC2,VDAC3，Prohibitin，核糖體結(jié)合糖蛋白，Sec61a和Sec22b。電壓依賴性陰離子通道(VDACs)是被不同基因編碼的孔道形成蛋白家族，在哺乳動物組織中表達出至少三種蛋白產(chǎn)品(VDAC1，VDAC2，和VDAC3)。VDACs已知主要功能是允許外線粒體膜(ODF)的幾乎自由滲透性。參見，例如，Shoshan-Barmatz等人，2003，CellBiochemBiophys39:279-92。在ODF中與在線粒體中，VDAC2和VDAC3可能具有可選擇的結(jié)構(gòu)組織，不同的功能(Hinsch等人，2004，JBiolChem.279:15281-8)。不同種類的代表性VDAC序列已經(jīng)儲存在GenBank。例如，人VDAC1氨基酸和核酸序列可以在GenBank登錄號NP—003365和NM—003374中找到；人VDAC2氨基酸和核酸序列可以在GenBank登錄號NP_003366和NM—003375中找到；人VDAC3氨基酸和核酸序列可以在GenBank登錄號NP—005653和NM—005662中找到。Prohibitin是遍在表達的進化保守的基因。據(jù)認為它是細胞增殖的負調(diào)節(jié)劑，可用作腫瘤抑制物(例如，F(xiàn)usaro等人，2003,J.Biol.Chem.278:47853-47861;Fusaro等人，2002，Oncogene21:4539-4548)。不同種類的代表性prohibitin序列已經(jīng)儲存在GenBank。例如，人prohibitin氨基酸和核酸序列在GenBank登錄號NP_002625和NM—002634中可以找到。核糖體結(jié)合糖蛋白(例如，I和II)是看起來參與核糖體結(jié)合的蛋白。它們是大量的、高度保守的糖蛋白，專一靶向于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜上(例如，F(xiàn)u等人，2000,J.Biol.Chem.275:3984-3990;Crimaudo等人，1987,EMBOJ.6:75-82)。不同種類的代表性核糖體結(jié)合糖蛋白序列已經(jīng)儲存在GenBank。例如，人核糖體結(jié)合糖蛋白I氨基酸和核酸序列在GenBank登錄號NP一002941禾QNM—002950中可以找到；人核糖體結(jié)合糖蛋白II氨基酸和核酸序列在GenBank登錄號NP—002942和NM—002951中可以找到。Sec61-alpha蛋白據(jù)認為在分泌肽和膜多肽插入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中起作用(參見，例如，Higy等人，2004,Biochemistry43:12716-22)。不同種類典型的Sec61alpha序列已經(jīng)儲存在GenBank中。例如，人Sec61-alpha-I氨基酸和核酸序列在GenBank登錄號NP—037468和NM—013336中可以找到；而人Sec61-alpha-I1的氨基酸和核酸序列在GenBank登錄號NP_060614和NM—018144中可以找到。Sec22-beta蛋白表明在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體蛋白的運送以及與SNARE形成復(fù)合物中起作用(例如，Parlati等人，2000，Nature407:194-198;Mao等人，1998,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:8175-8180)。不同種類典型的Sec61-beta序列已經(jīng)儲存在GenBank中。例如，人Sec61-beta的氨基酸和核酸序列在GenBank登錄號NP—004883和NM—004892中可以找到。在某些實施方案中，本發(fā)明涉及通過利用erastin靶標(biāo)鑒定候選抗腫瘤治療劑的方法。在這種方法中，與erastin靶標(biāo)結(jié)合或者增加或者降低emstin靶標(biāo)功能(例如，活性或者表達或者相互作用)的待測試劑可以確定為候選抗腫瘤治療劑。候選抗腫瘤治療劑還可以在體內(nèi)或者體外檢測其抗腫瘤活性。鑒定候選抗腫瘤治療劑的方法類似地可通過如上所述的篩選法來完成。輸送方法本發(fā)明的某些實施方案中使用輸送蛋白(例如，小t抗原，VDAC，PP2A抑制劑等等)或者編碼這種蛋白的DNA到靶細胞的方法，這可以通過任意標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)和分子醫(yī)學(xué)技術(shù)來實現(xiàn)。下面舉例說明的實施方案只是可用于這種目的的技術(shù)中的幾種。在本發(fā)明的一個方面，有關(guān)蛋白或者產(chǎn)生反義分子的表達構(gòu)建體，可用任意生物學(xué)有效的載體給藥，例如在體內(nèi)能夠有效地將重組基因轉(zhuǎn)染細胞的任意制劑或者組合物。所述方法包括將有關(guān)基因插入病毒載體，所述病毒載體包括重組逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒和單純皰疹病毒-1，或者重組細菌或者真核質(zhì)粒。病毒載體可用于直接轉(zhuǎn)染細胞；質(zhì)粒DNA可以借助于例如陽離子脂質(zhì)體(例如，lipofectin)或者衍生的(例如，抗體結(jié)合的)、多聚賴氨酸結(jié)合物、gramacidinS、人工病毒被膜或者其他這類胞內(nèi)載體進行輸送，以及基因構(gòu)建體直接注入或者在體內(nèi)進行CaP04沉淀。應(yīng)該了解合適的靶細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)代表基因治療中關(guān)鍵的第一步，特定基因輸送系統(tǒng)的選擇依賴于一些因素，諸如預(yù)定靶標(biāo)的表型和給藥途徑，例如局部的或者全身的。體內(nèi)向細胞引入編碼有關(guān)蛋白的核酸的優(yōu)選的方法是使用包含核酸的病毒載體，例如，編碼基因產(chǎn)物的cDNA。用病毒載體感染細胞的優(yōu)勢在于大部分靶細胞可以捕獲核酸。此外，病毒載體內(nèi)編碼的分子，例如，通過病毒載體中包含的cDNA，可以在接納病毒載體核酸的細胞中有效表達。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺相關(guān)病毒載體通常被認為是重組基因輸送系統(tǒng)的選擇，用于外源基因傳遞到體內(nèi)，尤其是到人體內(nèi)。這些載體可以有效的將基因輸送入細胞，傳遞的核酸穩(wěn)定地整合到宿主的染色體DNA中。人類免疫缺陷性病毒(HIV)和貓免疫缺陷病毒(FIV)代表了稱為"慢病毒"的逆轉(zhuǎn)錄病毒家族亞群，它們因為在整合后長時間處于潛伏期而得名。來源于這兩種病毒的載體系統(tǒng)已經(jīng)有效用于臨床前模型，在治療應(yīng)用中顯示了廣闊前景。與大部分逆轉(zhuǎn)錄病毒不同，HIV和FIV(和來源于它們的載體)能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細胞(Humeau等人，MolTher.2004，9(6):902-13;Curran等人，MolTlier.2000，1(1》31-8)。根據(jù)靶細胞類型這個性質(zhì)可能是有利的。此外，F(xiàn)IV可以通過其增加的轉(zhuǎn)基因運載能力同其他逆轉(zhuǎn)錄病毒區(qū)分開(Curmn等人，MoITher,2000,1(1):31-8).2000,1(1):31-8)。逆轉(zhuǎn)錄病毒使用的主要先決條件是確保其使用安全，尤其是考慮到野生型病毒在細胞群中傳播的可能性。只產(chǎn)生復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒的?；毎?稱為"包裝細胞")的開發(fā)促進了逆轉(zhuǎn)錄病毒在基因治療中的應(yīng)用，對缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒進行了深入研究以用于基因治療目的的基因轉(zhuǎn)移(綜述參見Miller,A.D.，Blood76:271,1990)。因此，可以構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，其中部分逆轉(zhuǎn)錄病毒編碼序列(gagpol，env)被編碼有關(guān)多肽的核酸取代，導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制缺陷。復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒然后被包裝變成病毒顆粒，所述病毒顆粒采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過輔助病毒感染靶細胞。產(chǎn)生重組逆轉(zhuǎn)錄病毒和體外或者體內(nèi)用這種病毒感染細胞的實驗步驟參見CurrentProtocolsinMolecularBiology，Ausubel，F(xiàn).M.等人，(eds.)，JohnWiley&Sons,Inc.,GreenePublishingAssociates,(2001),9.9-9.14章及其他標(biāo)準(zhǔn)實驗手冊。合適的逆轉(zhuǎn)錄病毒的實例包括pLJ、pZIPpWE和pEM，這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。用于制備嗜親性和兼嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)的合適包裝病毒系的實例包括vCrip、vCre、V2和vAm。逆轉(zhuǎn)錄病毒已經(jīng)用于在體外和/或體內(nèi)將各種基因?qū)朐S多不同的細胞類型中，包括神經(jīng)細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞、淋巴細胞、成肌細胞、肝細胞、骨髓細胞(參見例如Eglitis等人，Science230:1395-1398，1985;Danos和Mulligan,PNASUSA85:6460-6464，1988;Wilson等人，PNASUSA85:3014-3018,1988;Armentano等人，PNASUSA87:6141-6145，19卯；Huber等人，PNASUSA88:8039-8043，1991;Ferry等人，PNASUSA88:8377-8381，1991;Chowdhury等人，Science254:1802-1805，1991;vanBeusechem等人，PNASUSA89:7640-7644,1992;Kay等人，HumanGeneTherapy3:641-647，1992;Dai等人，PNASUSA89:10892-10895，1992;Hwu等人，J.Immunol.150:4104-4115，1993;U.S.PatentNo.4,868,116;U.S,專利4,980,286;PCT申i青WO89/07136;PCT申請WO89/02468;PCT申請WO89/05345;禾卩PCT申請WO92/07573)。此外，已證明通過修飾病毒顆粒表面上的病毒包裝蛋白，能夠限制逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染范圍，從而限制基于逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體(參見PCT公開文本W(wǎng)093/25234,WO94/06920,和W094/11524)。例如，改變逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染范圍的步驟包括將對細胞表面抗原特異的抗體偶聯(lián)到病毒env蛋白(Roux等人，PNASUSA86:9079-卯83，1989;Julan等人，J.GenVirol73:3251-3255，1992;和Goud等人,Virology163:251-254,1983);或者將細胞表面配體偶聯(lián)到病毒env蛋白(Nedaetal，J.Biol,chem.266:14143-14146,1991)。偶聯(lián)可以是與蛋白或者其他種類化學(xué)交聯(lián)的形式(例如，偶聯(lián)到乳糖以將env蛋白轉(zhuǎn)化為脫唾液酸糖蛋白)，以及通過產(chǎn)生融合蛋白(例如，單鏈抗體/env融合蛋白)而偶聯(lián)。這些技術(shù)，不僅有利于限制或與此相反，指導(dǎo)對某些組織類型的感染，還可以用于將嗜親性載體轉(zhuǎn)換成兼性載體。對本發(fā)明有用的另一種病毒基因輸送系統(tǒng)是腺病毒衍生的載體。腺病毒的基因組可以被調(diào)控，這樣的話它編碼感興趣的基因產(chǎn)物，但其不具有在正常病毒裂解性生命周期中復(fù)制的能力(參見例如Berkner等人，BioTechniques6:616,1988;Rosenfeld等人，Science252:431-434,1991;和Rosenfeld等人，Cell68:143-155，1992)。合適的腺病毒載體來源于腺病毒株Ad型5dl324或者本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其他腺病毒株(例如Ad2，Ad3，Ad7等等)。重組腺病毒在某些方面是有優(yōu)勢的，它們不能感染非分裂細胞，可用于感染大量細胞類型，包括氣道上皮(Rosenfeld等人，(1992)引用前文)，內(nèi)皮細胞(Lemarchand等人，PNASUSA89:6482-6486，1992),肝細胞(Herz和Gerard,PNASUSA90:2812-2816,1993)和肌細胞(Quantin等人，PNASUSA89:2581-2584，1992)。此外，病毒顆粒相對穩(wěn)定，易于純化和濃縮，并且如上所述，可以進行修飾以影響感染的范圍。此外，導(dǎo)入的腺病毒DNA(和其包含的外源DNA)不整合到宿主細胞的基因組，仍保持為附加體，從而避免了潛在問題，即作為在導(dǎo)入DNA整合入宿主基因組(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA)的位置發(fā)生的插入致突變作用的結(jié)果。此外，相對其他基因輸送載體，腺病毒基因組運載外源DNA的能力較強(到8kb)(Berkner等人,前文；Haj-Ahmand和GrahamJ.,Virol.57:267,1986)。當(dāng)前使用的大多數(shù)是復(fù)制缺陷型腺病毒載體，因此本發(fā)明也使用這種載體，所述載體被切除全部或者部分病毒El和E3基因，但保持差不多80%的腺病毒遺傳物質(zhì)(參見例如Jones等人，Cell16:683,1979;Berkner等人，前文；和Graham等人，在MethodsinMolecularBiology,EJ.Murray,Ed.(Humana,Clifton,NJ,1991)vol.7.pp.109-127)。插入相關(guān)基因的表達可受例如，E1A啟動子、主要晚期啟動子(MLP)和結(jié)合的前導(dǎo)序列、病毒E3啟動子或者外源添加啟動子序列的控制。另一種用于有關(guān)基因輸送的病毒載體系統(tǒng)是腺相關(guān)病毒(AAV)。腺相關(guān)病毒是一種天然發(fā)生的缺陷病毒，需要另一種病毒，例如腺病毒或者皰疹病毒作為輔助病毒以便有效的復(fù)制和多產(chǎn)的生命周期(綜述參見Muzyczka等人，Curr.TopicsinMicro.Immunol.(1992)158:97-129,1992)。它也是少數(shù)幾種能夠?qū)⑵銬NA整合到非分裂細胞中，顯示出高頻率的穩(wěn)定整合的病毒(參見例如Flotte等人，Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7:349-356,1992;Samulski等人，J.Virol.63:3822-3828，1989;和McLaughlin等人，J.Virol.62:1963-1973，1989)。只包含有AAV的300堿基對的載體可以包裝和整合。用于外源DNA的空間限于大約4.5kb。如Tratschin等人，Mol.Cell.biol.5:3251-3260,1985中所述的AAV載體可用于將DNA導(dǎo)入細胞。使用AAV載體已經(jīng)將多種核酸導(dǎo)入不同的細胞類型(參見例如Hermonat等人，PNASUSA81:6466-6470，1984;Tratschin等人，Mol.Cell.biol.4:2072-2081，1985;Wondisford等人，Mol.Endocrinol.2:32-39，1988;Tratschinetal，J.Virol.51:611-619，1984;和Flotte等人，J.Biol.Chem.268:3781-3790，1993)。其他用于基因治療的病毒載體系統(tǒng)來源于皰疹病毒、牛痘病毒和幾種RNA病毒。尤其是，皰疹病毒載體可以提供一種在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和眼組織的細胞中持續(xù)維持有關(guān)重組基因的獨特策略(Pepose等人,InvestOphthalmolVisSci35:2662-2666,1994)。除比如上面那些舉例說明的病毒遞送法之外，非病毒方法也可以用于引起有關(guān)蛋白在動物組織中的表達?；蜣D(zhuǎn)移的大多數(shù)非病毒方法依靠哺乳動物細胞攝取和胞內(nèi)運輸高分子的常規(guī)機理。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的非病毒基因輸送系統(tǒng)依靠靶細胞的內(nèi)吞途徑攝取有關(guān)基因。這種類型示范性的基因輸送系統(tǒng)包括脂質(zhì)體衍生的系統(tǒng)、多聚賴氨酸結(jié)合物和人工病毒被膜。在一個典型的實施方案中，編碼有關(guān)多肽的基因可以被表面帶有正電荷的脂質(zhì)體(例如lipofectins)捕獲，(任選)所述脂質(zhì)體用抗靶組織細胞表面抗原的抗體標(biāo)記(Mizuno等人，NoShinkeiGeka20:547-551,1992;PCT公布WO91/06309;日本專利申請1047381;和歐洲專利公布EP-A-43075)。例如，可以使用抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤-抗原單克隆抗體標(biāo)記的脂質(zhì)體進行神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(Mizuno等人，Neurol.Med.Chir.32:873-876，1992)。在另一個說明性的實施方案中，基因輸送系統(tǒng)包括抗體或者細胞表面配體，它們與基因結(jié)合劑例如多聚賴氨酸交聯(lián)(參見，例如，PCT公布WO93/04701,W092/22635,WO92/20316,W092/19749,和WO92/06180)。例如，有關(guān)基因構(gòu)建體可用于通過使用包括抗體的可溶多核苷酸載體在體內(nèi)轉(zhuǎn)染特定細胞，所述抗體結(jié)合多聚陽離子，例如多聚賴氨酸(參見美國專利5,166,320)。應(yīng)該了解通過肽介導(dǎo)的胞吞作用有關(guān)核酸構(gòu)建體的有效輸送可以利用試劑進行改進，所述試劑增強基因從內(nèi)體結(jié)構(gòu)逃逸。例如，整個腺病毒或者流感HA基因產(chǎn)物的融合肽可以用作輸送系統(tǒng)的一部分以誘導(dǎo)包含DNA的內(nèi)體的有效破壞(Mulligan等人，Science260-926,1993;Wagner等人，PNASUSA89:7934,1992;和Christiano等人，PNASUSA90:2122，1993)。在臨床條件下，基因輸送系統(tǒng)可以通過本領(lǐng)域熟知的任意大量方法之一導(dǎo)入患者。例如，基因輸送系統(tǒng)的藥物制劑可以全身性的導(dǎo)入，例如，通過靜脈注射，并且耙細胞中構(gòu)建體的特異轉(zhuǎn)導(dǎo)主要源自轉(zhuǎn)染的特異性，這是由基因運載載體、控制基因表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列造成的細胞類型或者組織類型表達，或者其組合引起的。在其他實施方案中，重組基因的初始輸送非常受限，這是因為導(dǎo)入動物時非常受局限。例如，基因運載載體可以通過導(dǎo)管(參見美國專利5,328，470)或者立體靶向注射(例如Chen等人，PNASUSA91:3054-3057，1994)導(dǎo)入。此外，有關(guān)蛋白可以與第二種肽以融合肽的形式提供，所述第二種肽促進"胞轉(zhuǎn)作用"，例如通過靶細胞攝取肽。舉例說明，有關(guān)蛋白可以作為融合多肽的一部分，所述融合多肽還包括HIV蛋白TatN端結(jié)構(gòu)域的全部或者一個片段，例如，Tat的殘基1-72或者能夠促進胞轉(zhuǎn)作用的其更小片段。在其他實施方案中，有關(guān)多肽可以與觸角足m蛋白的全部或者部分形成融合多肽。合成肽已經(jīng)有效地用于轉(zhuǎn)運蛋白、肽和小分子穿過包括血腦屏障的生物膜，因此可以用于本申請(Rothbard等人,NatMed.2000,6(11):1253-7;Rothbard等人,JMedChem,2002，45(17):3612-8)。盡管提供的合成蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)序列實例的特征在于高密度的精氨酸殘基，還可以用其他功能類似但結(jié)構(gòu)不同的分子或者序列取代的。為進一步舉例說明，有關(guān)多肽(或者模擬肽)可以嵌合肽形式提供，其中包括異源肽序列("內(nèi)化肽"或者"內(nèi)化作用結(jié)構(gòu)域")，所述肽序列驅(qū)駛有關(guān)多肽序列胞外形式穿過細胞膜的移位，以促進有關(guān)多肽的胞內(nèi)定位。在這點上，治療性有關(guān)多肽是在胞內(nèi)有活性的。內(nèi)化肽自身能夠通過例如胞轉(zhuǎn)作用以較高比率穿過細胞膜。任選，內(nèi)化肽以可切割方式與有關(guān)多肽融合例如形成融合蛋白。相對于單獨的活化多肽，所獲嵌合肽以較高比率被運輸入細胞，從而提供一種促進其導(dǎo)入它所作用細胞的方法，例如，促進有關(guān)多肽的局部施用。除蛋白和模擬肽之外，一種藥物試劑可以與促進輸送到一種物質(zhì)的化合物偶聯(lián)(例如，受體介導(dǎo)的化合物比如維生素B12)。在一個實施方案中，內(nèi)化肽起源于果蠅觸角足蛋白，或者其類似物。相似-蛋白觸角足的60氨基酸長的同源結(jié)構(gòu)域已經(jīng)證明能夠移位穿過生物膜，可以促進與其偶聯(lián)的異源多肽的移位。參見例如，Derossi等人(1994)JBiolChem269:10444-10450;和Perez等人(1992)JCellSci102:717-722。已經(jīng)證明這個蛋白小至16氨基酸的片段足以驅(qū)動內(nèi)化作用。參見Derossi等人(1996)JBiolChem271:18188-18193。本發(fā)明還提供此處所述的多肽(小t抗原或者VDAC)或者模擬肽序列，以及觸角足蛋白(或者其同系物)的至少一部分，相對有關(guān)多肽或者模擬肽，足以在統(tǒng)計意義上顯著的促進嵌合蛋白的跨膜運輸。這種多肽或者其模擬肽可以用于幫助有效和特異殺傷癌細胞的相關(guān)方法。內(nèi)化肽的另一個實例是HIV反式激活因子(TAT)蛋白。這個蛋白被分成四個結(jié)構(gòu)域(Kuppuswamy等人(1989)Nucl.AcidsRes.17:3551-3561)。純化的TAT蛋白可以被在組織培養(yǎng)中的細胞攝取(Frankel和Pabo,(1989)Cell55:1189-1193)，例如對應(yīng)于TAT殘基37-62的片段的肽在體外被細胞快速攝取(Green和Loewenstein,(1989)Cell55:1179-1188)。高度堿性的區(qū)域調(diào)節(jié)內(nèi)化作用和內(nèi)化部分靶向到核(Ruben等人，(1989)J.Virol.63:1-8)。另一種示范性跨細胞的多肽可以被產(chǎn)生以包括黃峰毒素的足夠部分(T.Higashijima等人，(1990)J.Biol.Chem.265:14176)以促進嵌合蛋白的跨膜運輸。但不希望被任何具體理論束縛，應(yīng)該注意到通過將多肽偶聯(lián)或者結(jié)合到可運輸?shù)碾?，所述可運輸?shù)碾哪軌蛲ㄟ^受體介導(dǎo)的胞轉(zhuǎn)作用穿過膜，親水性多肽也可以生理地運輸穿過隔膜?？梢允褂?，例如，組蛋白，胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白，堿性白蛋白，催乳激素和胰島素樣生長因子I(IGF-I)，胰島素樣生長因子II(IGF-II)或者其他生長因子的全部或者部分，來產(chǎn)生這種類型的合適的內(nèi)化肽。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一種胰島素片段，顯示對毛細管細胞上胰島素受體的親合力，其降低血糖效率比胰島素低，通過受體介導(dǎo)的胞轉(zhuǎn)作用能夠跨膜轉(zhuǎn)運，因此可以作為有關(guān)跨細胞肽和模擬肽的內(nèi)化肽。優(yōu)選的生長因子-衍生的內(nèi)化肽包括EGF(表皮生長因子)-衍生肽例如CMHIESLDSYTC禾BCMYIEALDKYAC;TGF-beta(轉(zhuǎn)化生長因子beta)衍生肽；衍生自PDGF(血小板衍生生長因子)或者PDGF-2的肽；衍生自IGF-I(胰島素樣生長因子)或者IGF-II的肽；和FGF(成纖維細胞生長因子)-衍生肽。另一類移位/內(nèi)化肽顯示pH-依賴的膜結(jié)合。對于在酸性pH假定具有螺旋構(gòu)象的內(nèi)化肽，內(nèi)化肽獲得兩親性的性質(zhì)，例如，它具有疏水性和親水性界面。更具體地，在大約5.0-5.5的pH范圍內(nèi)，內(nèi)化肽形成促進基團插入靶標(biāo)膜的alpha—螺旋、兩親性結(jié)構(gòu)。在例如細胞內(nèi)體內(nèi)的低pH環(huán)境中，可以發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)alpha-螺旋的酸性pH。通過內(nèi)吞機理攝取，這種內(nèi)化肽可用于促進有關(guān)多肽和模擬肽從內(nèi)體隔室轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)。優(yōu)選的pH依賴的膜結(jié)合內(nèi)化肽包括高比例的螺旋形成殘基，比如谷氨酸，甲硫氨酸，丙氨酸和亮氨酸。此外，優(yōu)選的內(nèi)化肽序列包括pKa在pH5-7范圍內(nèi)的離子化殘基，這樣的話在pH5時肽內(nèi)存在充分不帶電荷的膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域以便插入靶細胞膜。在這方面特別優(yōu)選的pH依賴的膜結(jié)合內(nèi)化肽是aal-aa2-aa3-EAALA(EALA)4-EALEALAA-酰胺，這代表Subbarao等人的肽序列的修飾(Biochemistry26:2964，1987)。在這些肽序列中，第一個氨基酸殘基(aal)優(yōu)選的是獨特的殘基，比如半胱氨酸或者賴氨酸，促進內(nèi)化肽與靶蛋白結(jié)合物的化學(xué)結(jié)合?？梢赃x擇氨基酸殘基2-3來調(diào)節(jié)內(nèi)化肽對不同膜的親合力。例如，如果殘基2和3都是賴氨酸或者精氨酸，內(nèi)化肽將具有結(jié)合具有負表面電荷的膜或者脂類的能力。如果殘基2-3是中性氨基酸，內(nèi)化肽將插入中性膜。其他優(yōu)選的內(nèi)化肽包括apo-脂蛋白A-I和B的肽；肽毒素，比如蜂毒素，bombolittin，delta溶血素和豹鰨劑(paradaxin);抗生素肽，比如丙甲菌素；肽類激素，比如降鈣素，促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子，beta內(nèi)啡肽，胰高血糖素，甲狀旁腺激素，胰多肽；和對應(yīng)于很多分泌蛋白信號序列的肽。此外，示范性的內(nèi)化肽可以通過添加取代基進行修飾，所述取代基增強內(nèi)化肽在酸性pH下的alpha-螺旋特性。另一類適合用于本發(fā)明的內(nèi)化肽包括在生理pH下"隱藏"的疏水性結(jié)構(gòu)域，但在耙細胞內(nèi)體的低pH環(huán)境下暴露。當(dāng)pH誘導(dǎo)疏水性結(jié)構(gòu)域打開和暴露時，該部分結(jié)合脂質(zhì)雙分子層并影響共價連接的多肽移位進細胞質(zhì)。這種內(nèi)化肽在例如假單胞菌屬外毒素A，網(wǎng)格蛋白，或者白喉毒素中測序鑒定后可以構(gòu)建模型?？仔纬傻鞍谆蛘唠囊部勺鳛榇颂幍膬?nèi)化肽?？仔纬傻鞍谆蛘唠目梢垣@自或者衍生自，例如，C9補體蛋白，溶胞T細胞分子或者NK細胞分子。這些部分在膜上能夠形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，從而允許結(jié)合的多肽轉(zhuǎn)運過膜進入細胞內(nèi)部。僅內(nèi)化肽的膜插入就足以使有關(guān)多肽或者模擬肽移位穿過細胞膜。但是，移位可以通過將內(nèi)化肽附著在胞內(nèi)酶的底物上來改進(即，"附屬肽")。優(yōu)選的附屬肽附著于內(nèi)化肽的一部分，所述內(nèi)化肽從細胞膜突出到胞質(zhì)表面。附屬肽可以有利地附著于移位/內(nèi)化部分或者錨肽的末端。本發(fā)明的附屬部分可以包含一種或多種氨基酸殘基。在一個實施方案中，附屬部分可以提供細胞磷酸化作用的底物(例如，附屬肽可以包含酪氨酸殘基)。在這方面示范性的附屬部分是N-十四酰轉(zhuǎn)移酶的肽底物，例如GNAAAARR(Eubanks等人，在Peptides.ChemistryandBiology,GarlandMarshall(ed.)，ESCOM，Leiden,1988,pp.566-69)。在這些構(gòu)建體中，內(nèi)化肽將結(jié)合于附屬肽的C端，因為N端甘氨酸對附屬部分的活性非常關(guān)健。這個雜交肽，在C端附著到E2肽或者模擬肽后，被N-十四烷基化的，進一步錨定到靶細胞膜，例如，它用于增加肽在細胞膜上的局部濃度。為進一步舉例說明附屬肽的使用，可磷酸化的附屬肽首先共價附著于內(nèi)化肽的C端，然后與有關(guān)多肽或者模擬肽整合成融合蛋白。融合蛋白的肽組件插入靶細胞質(zhì)膜，于是附屬肽移位穿過膜突進靶細胞的細胞質(zhì)。在質(zhì)膜的胞質(zhì)面，在中性pH中附屬肽被細胞激酶磷酸化。一旦磷酸化，附屬肽不可逆將融合蛋白錨定到膜上。靶向到細胞表面膜可以促進多肽移位進細胞質(zhì)。合適的附屬肽包括作為激酶底物的肽，具有單個正電荷的肽，和包含被膜結(jié)合糖基轉(zhuǎn)移酶糖基化的序列的肽。被膜結(jié)合糖基轉(zhuǎn)移酶糖基化的附屬肽可以包括序列x-NLT-x，其中"x"可以是例如另一個肽，一種氨基酸，偶合劑或者疏水性分子。當(dāng)這種疏水性三肽與微粒體小囊泡孵育時，它穿過胞囊膜，在腔面被糖基化，由于其親水性被捕獲在小囊泡內(nèi)(C.Hirschbergetah,(1987)Ann.RRev.BBiochem.556:63-87)。包含序列x-NLT-x的附屬肽因此將促進靶細胞保留相應(yīng)多肽。在本發(fā)明這方面的另一個實施方案中，附屬肽可用于促進多肽或者模擬肽與靶細胞的相互作用。在這方面示范性附屬肽包括衍生自包含序列"RGD"的細胞粘連蛋白的肽，或者衍生自包含序列CDPGYIGSRC的層粘連蛋白的肽。胞外基質(zhì)糖蛋白，比如纖粘連蛋白和層粘連蛋白，通過受體介導(dǎo)的步驟結(jié)合細胞表面。三肽序列，RGD，已經(jīng)確定是結(jié)合細胞表面受體必需的。這個序列存在于纖粘連蛋白，玻連蛋白，補體C3bi，von—Willebrand因子，EGF受體，轉(zhuǎn)化生長因子beta，膠原類型I，大腸桿菌的lambda受體，纖維蛋白原和Sindbis衣殼蛋白(E.Ruoslahti，Ann.Rev.Biochem.557:375-413，1988)。識別RGD序列的細胞表面受體已經(jīng)集合成稱為"整合素"的相關(guān)蛋白的超家族。"RGD肽"與細胞表面整合素的結(jié)合將促進多肽的細胞表面滯留，最終是多肽的移位。如上所述，通過化學(xué)交聯(lián)或者融合蛋白形式，內(nèi)化肽和附屬肽可以各自單獨的被添加到多肽或者模擬肽。在融合蛋白的例子中，無結(jié)構(gòu)的多肽接頭可以包括在每個肽部分之間。通常，內(nèi)化肽足以用于多肽的直接輸出。但是，當(dāng)提供附屬肽例如RGD序列時，可能需要包括分泌信號序列以便從其宿主細胞直接輸出融合蛋白。在優(yōu)選的實施方案中，分泌信號序列位于N末端遠端，并且(任選)側(cè)翼是分泌信號和融合蛋白其他部分的蛋白水解作用位點。在一個示范性的實施方案中，多肽或者模擬肽被設(shè)計包括整合素結(jié)合RGD肽/SV40核定位信號(參見例如HartSL等人，1994;J.Biol.Chem.269:12468-12474)，例如被Ndel-EcoRl片段中的核苷酸序列編碼:catatggutgactgccgtggcgatatgttcggttgcggtgctcctccaaaaaagaagagaaaggtagctggattc,其編碼RGD/SV40核苷酸序列MGGCRGDMFGCGAPPKKKRKVAGF。在另一個實施方案中，蛋白可1以與HIV-1tat(1-72)多肽工程化，例如，如Ndel-EcoRl片段所提供catatggagccagtagatcctagactagagccctggaagcatccaggaagtcagcctaaaactgcttgtaccaattgctattgtaaaaagtgttgctttcattgccaagtgtttcataacaaaagcccttggcatctcctatggcaggaagaagcgagacagcgacgaagacctcctcaaggcagtcagactcatcaagtttctctaagtaagcaaggattc，其編碼HIV-1tat(1-72)肽序歹ij:MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCQVCFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQ。在另一個實施方案中，融合蛋白包括HSV-IVP22多肽(ElliottG.,O'HareP(1997)Cell,88:223-233)，由Ndel-EcoRl片段提供。在另一個實施方案中，融合蛋白包括來自例如核苷酸序列(Ndel-EcoRl片段)的VP22蛋白的C端結(jié)構(gòu)域。在某些例子中，需要包括核定位信號作為有關(guān)多肽的一部分。在產(chǎn)生包括多肽的融合多肽時，可能需要包括無結(jié)構(gòu)的接頭以便確保不同肽結(jié)構(gòu)域的正確折疊。本領(lǐng)域已知多種合成和天然的接頭可以用于本發(fā)明，包括(Gly3Ser)4接頭。治療方法在某些實施方案中，本發(fā)明提供在個體中治療或者預(yù)防癌癥的方法。術(shù)語"癌癥"，"腫瘤"，和"瘤形成"在此處可以互換使用。此處使用的癌癥(腫瘤或者腫瘤形成)的特點在于一種或者多種下列性質(zhì)在環(huán)境中細胞生長不受正常生化和生理影響調(diào)節(jié)；退行發(fā)育(例如，缺少正常調(diào)節(jié)的細胞分化)；和在有些情況下，轉(zhuǎn)移。癌癥疾病包括，例如，肛門癌，膀胱癌，乳腺癌，宮頸癌，慢性淋巴細胞性白血病，慢性髓性白血病，子宮內(nèi)膜癌，毛細胞性白血病，頭和頸癌，肺(小細胞)癌，多發(fā)性骨髓瘤，非hodgkin's淋巴瘤，濾泡性淋巴瘤，卵巢癌，腦腫瘤，結(jié)腸直腸癌，肝細胞癌，卡波西肉瘤，肺(非小細胞癌)，黑素瘤，胰腺癌，前列腺癌，腎細胞癌，和軟組織肉瘤。其他的癌癥病癥可以參見，例如，Isselbacher等人(1994)Harrison'sPrinciplesofInternalMedicine1814-1877，在此引入作為參考。通常，如上所述的可用此處所述方法治療的癌癥顯示不受控制的VDAC表達。在一個實施方案中，上述癌癥包含Ras信號途徑的突變，導(dǎo)致Ras信號活性升高。例如，突變可以是Ras基因上的組成性活化突變，比如RasV12。在其他實施方案中，癌癥可以包含PP2A上喪失功能的突變，禾口/或MEKl禾口/或ERKl的活化突變。在某些其他實施方案中，癌癥的特點在于細胞表達SV40小t癌蛋白，或者與表達ST和/或致癌HRAS的細胞表型相似。在某些優(yōu)選的實施方案中，細胞表達基本上野生型水平的Rb(例如，至少大約50%，60%，70%，80%，90%，100%,110%，120%,130%，或者150%等等)。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種在個體中治療或者預(yù)防癌癥的方法，包括給藥個體治療有效量的化合物，所述化合物對工程化人致瘤細胞，或者特定基因型(或者特異改變的基因型)的癌細胞顯示選擇毒性。在某些實施方案中，癌癥的特點在于包括活化的RAS途徑的細胞。在某些其他實施方案中，癌癥的特點在于細胞表達SV40小t癌蛋白，或者顯示sT和/或致癌RAS的靶標(biāo)的調(diào)節(jié)。在相關(guān)實施方案中，本發(fā)明預(yù)期本發(fā)明的方法與其他抗腫瘤療法，例如抗實體瘤和控制轉(zhuǎn)移建立的傳統(tǒng)化療方法，聯(lián)合應(yīng)用。本發(fā)明化合物的給藥可以在化療期間或者化療之后進行。這種試劑通常與可接受的載體配制成制劑，可以靜脈內(nèi)、口服、頰的、胃腸外、通過吸入噴霧、通過局部施用或者經(jīng)皮膚給藥。試劑還可以通過局部給藥方式給藥。優(yōu)選的，一種或多種其他試劑與抗癌癥化療劑(例如，本發(fā)明的化合物)聯(lián)合給藥，以累加或者協(xié)同方式抑制癌細胞。大量的傳統(tǒng)化合物已經(jīng)顯示具有抗腫瘤活性。這些化合物已經(jīng)在化療中用作藥物制劑縮小實體瘤，預(yù)防轉(zhuǎn)移和進一步生長，或者降低在白血病或者骨髓惡性腫瘤中惡性細胞的數(shù)目。盡管化療在治療各種類型的惡性腫瘤中有效，許多抗腫瘤化合物誘導(dǎo)不良副作用。多數(shù)情況下，當(dāng)兩種或者多種不同治療方法結(jié)合時，治療可以協(xié)同作用，可以降低每種療法的劑量，從而降低每種化合物在較高劑量時的不良副作用。在其他情況下，對一種治療無反應(yīng)的惡性腫瘤可能對兩種或更多種不同治療的療法組合有反應(yīng)。因此，本發(fā)明的化合物和藥物組合物可以與傳統(tǒng)抗腫瘤化合物聯(lián)合給藥。傳統(tǒng)的抗腫瘤化合物包括，僅僅為舉例說明氨魯米特，安吖啶，阿那曲唑，天冬酰胺酶，卡介苗，比卡魯胺，爭光霉素，布舍瑞林，白消安，喜樹堿，卡培他濱，卡鉑，亞硝脲氮芥，苯丁酸氮芥，順鉑，2-氯脫氧腺苷，氯膦酸鹽，秋水仙堿，環(huán)磷酰胺，環(huán)丙氯地孕酮，阿糖胞苷，達卡巴嗪，放線菌素D,柔紅霉素，雙烯雌酚，己烯雌酚，紫杉萜，阿霉素，表柔比星，雌二醇，雌氮芥，鬼臼乙叉甙，依西美坦，非格司亭，氟達拉濱，氟氫可的松，氟尿嘧啶，氟烴甲基睪丸素，氟他米特，吉西他濱，染料木素，戈舍瑞林，羥基脲，伊達比星，異磷酰胺，伊馬替尼，干擾素，依立替康，ironotecan，來曲唑，甲酰四氫葉酸，亮丙瑞林，左旋四咪唑，環(huán)己亞硝脲，氮芥，甲羥孕酮，甲地孕酮，左旋苯丙氨酸氮芥，巰基嘌呤，美司鈉，氨甲蝶呤，絲裂霉素，米托坦，米托蒽醌，尼魯米特，諾考達唑，奧曲肽，奧沙利鉑，紫杉醇，帕屈膦酸二鈉，噴司他丁，普卡霉素，卟菲爾鈉，甲基芐肼，雷替曲塞，riruximab，鏈脲霉素，蘇拉明，他莫昔芬，替莫唑胺，替尼泊甙，睪丸激素，硫鳥嘌吟，塞替派，二氯環(huán)戊二烯鈦，托泊替康，曲妥單抗，維甲酸，長春花堿，長春新堿，長春地辛，和長春瑞濱。在其他實施方案中，本發(fā)明的化合物和藥物組合物可以與傳統(tǒng)抗腫瘤化合物聯(lián)合給藥，所述傳統(tǒng)抗腫瘤化合物選自表皮生長因子受體拮抗劑，五硫化二砷，阿霉素，順鉑，卡鉑，西咪替丁，洋紅霉素，氮芥氫氯化物，五甲三聚氰酰胺，塞替派，替尼泊甙，環(huán)磷酰胺，苯丁酸氮芥，去甲氧基竹紅菌甲素A，左旋丙氨酸氮芥，異磷酰胺，曲磷胺，曲奧舒凡，足葉草毒素或者足葉草毒素衍生物，鬼臼乙叉甙磷酸鹽，替尼泊甙，鬼臼乙叉甙，異長春堿，環(huán)氧長春堿，長春地辛，9-氨基喜樹堿，camptoirinotecan，克立那托，甲地孕酮，甲氨蝶呤，絲裂霉素C，ecteinascidin743，白消安，亞硝脲氮芥(BCNU)，環(huán)己亞硝脲(CCNU)，洛弗斯特丁，l-甲基-4-苯基吡啶鎗離子，司莫司汀，十字孢堿，鏈脲霉素，酞菁，達卡巴嗪，氨基蝶呤，氨甲蝶呤，曲美沙特，硫鳥嘌呤，巰基嘌呤，氟達拉濱，pentastatin,克拉曲賓，阿糖胞苷(araC)，泊非霉素，5-氟尿嘧啶，6-巰基嘌呤，阿霉素氫氯化物，甲酰四氫葉酸，霉酚酸，柔紅霉素，去鐵敏，5-氟脫氧尿苷，去氧氟尿苷，雷替曲塞，伊達比星，表柔比星，吡柔比星，佐柔比星，米托蒽醌，博來霉素硫酸鹽，放線菌素D，番紅精，saframycins，quinocarcins，discodermolides，長春新堿，長春花堿，長春瑞濱酒石酸鹽，vertoporfm，紫杉醇，他莫昔芬，雷洛昔芬，噻唑呋林，硫鳥嘌呤，病毒唑，EICAR，雌氮芥，雌氮芥磷酸鈉，氟他米特，比卡魯胺，布舍瑞林，亮丙瑞林，蝶啶，烯二炔，左旋四咪唑，aflacon，干擾素，白介素，阿地白介素，非格司亭，沙莫司亭，利妥昔單抗，卡介苗，維甲酸，betamethosone,鹽酸吉西他濱，異搏定，VP-16，六甲密胺，毒胡蘿卜內(nèi)酉旨(thapsigargin)，奧沙利鉑，異丙鉑，四鉑，洛鉑，DCP,PLD-147，JM118，JM216，JM335，沙鉑，紫杉萜，脫氧紫杉醇，TL-139，5'-降-脫水長春堿(以下5'-降-長春花堿)，喜樹堿，依立替康(Camptosar，CPT-ll)，托泊替康(Hycamptin)，BAY38-3441,9-硝基喜樹堿(Orethecin,盧比替康)，依沙替康(DX-8951)，勒托替康(GI-147211C)，gimatecan，homocamptothecinsdiflomotecan(BN-80915)和9-氨基喜樹堿(IDEC-13')，SN-38,ST1481,karanitecin(BNP1350)，口引哚咔唑(indolocarbazole)(例如，NB-506),原小蘗堿，茚托利辛，idenoisoquinolones,苯-吩嗪或者NB-506。在另一個相關(guān)實施方案中，本發(fā)明預(yù)期將本發(fā)明實施的方法與其他抗腫瘤療法例如照射聯(lián)用。此處使用的術(shù)語"照射"是用于包括通過光子、中子、電子或者其他類型的電離輻射治療贅生性細胞或者相關(guān)細胞的任意療法。這種放療包括，但不限于，X射線，伽馬照射，或者重離子顆粒，比如alpha或者beta粒子。此外，照射可以是放射性的。在患者中照射贅生性細胞的方法是本領(lǐng)域公知的，包括例如，外粒子束療法和近距放射療法。檢測癌癥(腫瘤或者腫瘤形成)是否已經(jīng)被治愈的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括，例如，腫瘤細胞數(shù)目減少(例如，細胞增殖下降或者腫瘤大小減小)。應(yīng)該意識到本發(fā)明的治療可以是耐久和完全反應(yīng)，或者可以包括部分或者短暫的臨床反應(yīng)。參見實例，Isselbacher等人(1996)Harrison'sPrinciplesofInternalMedicine13ed.,1814-1882，在此引入作為參考。檢測腫瘤細胞的致敏性或者增加的死亡的試驗是本領(lǐng)域公知的，包括，例如，評定細胞活力的標(biāo)準(zhǔn)劑量反應(yīng)試驗；DNA提取物的瓊脂糖凝膠電泳或者檢測表示細胞死亡特征的DNA斷裂的流式細胞計量術(shù)；檢測參與凋亡的多肽活性的試驗；和檢測細胞死亡形態(tài)特征的試驗。關(guān)于這些試驗的細節(jié)在此處其他地方描述。其他試驗包括，染色質(zhì)試驗(例如，計數(shù)濃縮的核染色質(zhì)的頻率)或者例如在Lowe等人(1993)Cell74:957-697中描述的抗藥性試驗，在此引入作為參考。還可參見美國專利號5,821,072，也在此引入作為參考。藥物組合物預(yù)期的治療劑可以進行評價以便檢測它們包含在藥物組合物中的適應(yīng)性。這種試劑一個通用的檢測方法是療效指數(shù)，這是治療劑量對有毒劑量的比率。治療劑量(功效)和有毒劑量的閾值可以調(diào)整為適當(dāng)?shù)?例如，治療反應(yīng)或者最小化毒性反應(yīng)的必需量)。例如，治療劑量可以是試劑治療有效量的(相對于治療一種或多種病癥)，有毒劑量可以是引起死亡的劑量(例如，LD50)或者在一定比例受治療者中引起不希望有的效果。優(yōu)選的，試劑的療效指數(shù)至少是2，更優(yōu)選的至少是5，甚至更優(yōu)選的至少是10。評價治療劑還可以包括檢測試劑的藥物動力學(xué)，當(dāng)以不同制劑和/或通過不同途徑給藥時檢測其生物利用率和/或吸收。本發(fā)明的化合物，例如erastin或者微管蛋白抑制劑，可以給需要它的個體施用。在某些實施方案中，個體是哺乳動物比如人，或者非人哺乳動物。當(dāng)給藥個體時，本發(fā)明的化合物可以作為藥物組合物給藥，所述藥物組合物包含，例如，本發(fā)明的化合物和藥學(xué)可接受的載體。藥學(xué)可接受的載體是本領(lǐng)域公知的，包括，例如，水溶液比如水或者生理緩沖鹽水或者其他溶劑，或者媒介例如乙二醇，甘油，油劑比如橄欖油或者可注射的有機酯。在優(yōu)選的實施方案中，當(dāng)這種藥物組合物用于人施用時，水溶液是無熱原的，或者基本上無熱原的?？梢赃x擇賦形劑，例如，以延緩試劑的釋放或者選擇性靶向一種或多種細胞，組織或者器官。藥學(xué)可接受的載體可以包含生理可接受的試劑，所述試劑用作，例如，穩(wěn)定或者促進化合物例如erastin或者微管蛋白抑制劑的吸收。這種生理可接受的試劑包括，例如，糖類，比如葡萄糖，蔗糖或者右旋糖酐，抗氧化劑，比如抗壞血酸或者谷胱甘肽，螯合劑，低分子量蛋白或者其他穩(wěn)定劑或者賦形劑。藥學(xué)可接受的載體的選擇，包括生理可接受的試劑，依賴于例如組合物的給藥途徑。藥物組合物(制劑)還可以是脂質(zhì)體或者其他聚合物基質(zhì)，這可以整合入例如本發(fā)明的化合物。脂質(zhì)體，例如，由磷脂或者其他脂類組成，是無毒的的，生理可接受的和可代謝的載體，可以相對容易的制造和給藥。包含本發(fā)明化合物的藥物組合物(制劑)可以通過多種給藥途徑給藥，包括，例如，口服；肌內(nèi)；靜脈內(nèi)；肛門；陰道；胃腸外；鼻；腹膜內(nèi)；皮下；和局部。組合物可以通過注射或者通過溫育給藥。在某些實施方案中，本發(fā)明的化合物(例如，erastin)可以單獨給藥或者與另一種抗腫瘤治療劑聯(lián)合給藥。此處使用的短語"聯(lián)合給藥"是指聯(lián)用兩種或更多不同治療化合物的任意給藥形式，這樣的話在先前給藥的治療化合物在體內(nèi)仍然有效時給藥第二種化合物(例如，兩種化合物同時在患者體內(nèi)起作用，這可以包括兩種化合物的協(xié)同效應(yīng))。例如，不同的治療化合物可以在相同制劑或者在分開的制劑中給藥，或者同時的或者依次的。因此，接受這種治療的個體可以受益于不同治療化合物的協(xié)同效應(yīng)。預(yù)期本發(fā)明的化合物(例如erastin)以治療有效量(劑量)給藥患者(例如哺乳動物，優(yōu)選的是人)。"治療有效量"是指化合物的濃度足以得到所需治療效果(例如，病癥的治愈，贅生性細胞的死亡)。應(yīng)該理解化合物的有效量會根據(jù)患者的重量，'性別，年齡和治療史而變化。其他影響有效量的因素可能包括，但不限于，患者病癥的嚴(yán)重程度,接受治療的疾病，化合物的穩(wěn)定性，和，如果需要，與本發(fā)明的化合物一起給藥的另一種治療劑。通常，對人類患者有效量的范圍從大約0.001mg/kg體重到大約50mg/kg體重。通過多次試劑給藥可以輸送更多的總劑量。檢測功效和劑量的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。參見例如，Isselbacher等人(1996)Harrison'sPrinciplesofInternalMedicine13ed.,1814-1882，在此引入作為參考。實施例現(xiàn)在概述本發(fā)明，參考下列實施例更容易理解本發(fā)明，包括下列實施例僅僅為了舉例說明本發(fā)明的某些方面和實施方式，不是用于限制本發(fā)明。實施例1鑒別在特定的癌癥相關(guān)等位基因存在條件下具有增強效力或者活性的化合物此處描述的工作是用于鑒定在hTERT，LT，ST，E6,E7或者RASV12存在條件下具有增強的效力或者活性的化合物。盡管此處描述的工作利用hTERT，LT，ST，E6，E7和RASV12作為轉(zhuǎn)化基因，將來的研究可以利用多種癌癥結(jié)合等位基因，利用這種方法以便確定參與許多癌基因和腫瘤抑制物的信號網(wǎng)絡(luò)。具有這些遺傳元件的工程化細胞系用于篩選23,550種化合物，包括來自組合文庫的20,000種化合物，來自國家的癌癥學(xué)會多樣性收集物的1,990種化合物，和1，540種有生物學(xué)活性的已知化合物，所述已知化合物是申請人選擇和購買并制成可供篩選的集合。初篩檢測(一式四份)測定用每種化合物治療致瘤BJ-TERT/LT/ST/RASV12工程化致瘤細胞的效果，所述化合物在g/mL濃度作用48小時，對應(yīng)于分子量400的化合物10uM，這大約是文庫的中值分子量。使用染料鈣黃綠素乙酰甲酯(鈣黃綠素AM)檢測細胞活力(Wang等人，1993，Hum.Immunol.337,264-270)，這是一種能夠自由擴散進細胞的非熒光化合物。在活細胞中，,丐黃綠素AM被胞內(nèi)酯酶切割，形成陰離子熒光衍生物鈣黃綠素，它不能擴散出活細胞。因此，當(dāng)與鈣黃綠素AM孵育時，活細胞顯示綠色熒光，而死細胞不顯示。對于在BJ-TERT/LT/ST/RASV"細胞中顯示50%或者更強抑制染料鈣黃綠素AM染色活力的化合物，然后在BJ和BJ-TERT/LT/ST/RASV12細胞中所述化合物進行兩倍系列稀釋以鑒定顯示合成致死性的化合物，這種化合物在致瘤細胞中是致死性的，但在同源原代細胞中不是。計算各化合物在各細胞系中的IC5o值(抑制50%的鈣黃綠素AM信號所需濃度)(表1)。結(jié)果鑒定出九種化合物(圖2)，這些化合物在BJ-TERT/LT/ST/RASV12致瘤細胞中比BJ原代細胞活性至少高4倍(在BJ原代細胞中至少需要4倍高的濃度以便獲得相同的鈣黃綠素AM信號的50%抑制)。以下是這九種化合物的更詳細的分析。這些化合物中的三種(阿霉素，柔紅霉素和米托蒽醌)現(xiàn)在臨床用作抗癌藥物，一種(喜樹堿)是臨床使用抗癌藥(托泊替康和依立替康)的天然產(chǎn)物類似物，一種(棘霉素)最近在進行n期臨床試驗。所有這九種化合物然后在各組工程化細胞中進行多劑量復(fù)孔檢測，以證實觀察到的選擇性也存在于多種獨立衍生的細胞系中(圖1和表1)。申請人開發(fā)了一種檢測化合物在兩種不同細胞系中IC5o(抑制50yo活力信號所需的濃度)改變的選擇性計量法。為計算兩個細胞系間的選擇性值，化合物在一種細胞系中的IC5Q除以相同化合物在第二種細胞系中的IC50。因此，具有選擇性值4的化合物在一種細胞系中使用的濃度比第二種細胞系高4倍。計算各化合物的"腫瘤選擇性值"，通過用化合物在親本原代BJ細胞中的IC5o值除以化合物在工程化BJ-TERT/LT/ST/RASV12細胞中的IC5o值，工程化BJ-TERT/LT/ST/RASV"細胞包含產(chǎn)生致瘤細胞所需的全部四種遺傳元件(表1)。這些工程化致瘤細胞利用起主要作用的病,癌蛋白比如LT，ST，E6和E7。這些病毒蛋白可能在特定形式的癌癥中參與細胞轉(zhuǎn)化，所述特定形式的癌癥即猴病毒40誘導(dǎo)的惡性間皮瘤(Testa和Giordano,2001，SeminCancerBiol77，31-8)和人乳頭狀瘤病毒誘導(dǎo)的宮頸癌(Bosch等人，2002，JClinPathol55，244-65)，并且這些病毒蛋白已經(jīng)用于破壞p53和pRB的功能以在體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)化細胞(Elenbaas等人，2001，GenesDev15,50-65;Jorcyk等人，1998,Prostate34，10-22;Perez-Stable等人，1997,CancerRes57，卯0-6;Rich等人,2001,CancerRes61,3556-60;Sandmoller等人，1995,CellGrowthDiffer6,97-103)。申請人:利用兩種不同的方法滅活細胞蛋白，(它們檢測LT和基于E6/E7滅活pRB和p53的效果)以便控制對特定病毒蛋白觀察到的特應(yīng)性效果。這些化合物的選擇性還在表達p53和pRB主要負抑制劑的細胞系中確認，所述p53和pRB不是衍生自病毒元件。這個細胞系表達(i)破壞內(nèi)源p53四聚體化的p53截短形式(p53DD)，(ii)抗pl6皿"和pl5INK4B(CDK4的主要負調(diào)節(jié)物)抑制的CDK4^e突變體和(iii)細胞周期蛋白Dl。在這些細胞中在多種濃度范圍內(nèi)檢測九種基因型選擇性化合物的效果，所述細胞是指BJ-TERT/p53DD/CDK4R24C/Dl/ST/RAS^2細胞(表1)。結(jié)果顯示在這些細胞中檢測時，所有的化合物都存在活性總體適度減少。但是，這些細胞系中利用非病毒蛋白質(zhì)分析的總體結(jié)果沒有改變(表l)。實施例2測定化合物選擇性的遺傳基礎(chǔ)申請人設(shè)法檢測了每種化合物選擇性的遺傳基礎(chǔ)。簡而言之，對每種化合物，嘗試確定導(dǎo)致細胞對化合物敏感的基因或者基因的組合(表l)。結(jié)果顯示這九種化合物可以分為3組，即(i)顯示無簡單的遺傳選擇性的化合物，(ii)對帶有TERT和非活性RB的細胞顯示選擇性的化合物，和(iii)為顯示致死性需要致癌RAS和ST的存在的化合物。組(i)中的化合物，桑吉瓦霉素，波凡霉素，NSC146109和棘霉素，致瘤細胞選擇性沒有明確的遺傳基礎(chǔ)。，例如，當(dāng)各遺傳元件導(dǎo)入時棘霉素活性有些升高(圖3a)。申請人己經(jīng)注意到當(dāng)這些遺傳元件均導(dǎo)入時，細胞增殖率增加。因此，很可能組(i)中的化合物只對快速分裂的細胞有選擇性。支持這種解釋的事實是，所有這些化合物據(jù)報道通過抑制DNA或者蛋白質(zhì)合成起作用，其在快速分裂的細胞中需求更大。例如，據(jù)報道棘霉素的作用是作為DNA雙插入劑(VanDyke禾卩Dervan，1984,Science225,1122-7;Waring禾口Wakelin，1974，Nature252,653-7)，波凡霉素作為蛋白質(zhì)合成抑制劑(Zalacain等人，1982，F(xiàn)EBSLett148,95-7)，桑吉瓦霉素是核苷酸類似物(Rao，1968,JMedChem11，939-41)，NSC146109在結(jié)構(gòu)上類似于DNA插入劑(圖2)。應(yīng)當(dāng)注意到已經(jīng)報道桑吉瓦霉素作為PKC抑制劑(LoomisandBell,1988,JBiolChem263，1682-92)，盡管這種活性似乎大不可能是與這點相關(guān)的，因為其他PKC抑制劑在這個系統(tǒng)中顯示無選擇性。申請人能鑒定出只是在快速分裂的細胞中活性更高的化合物，例如組(i)中的化合物，因為它們沒有顯示明確的選擇性遺傳基礎(chǔ)。對這些化合物沒有進行進一步的工作。因此，他們可以集中于顯示選擇性的組(ii)和(iii)中化合物的機理研究。組(ii)中的化合物，米托蒽醌，阿霉素和柔紅霉素，是拓撲異構(gòu)酶II毒素，它們結(jié)合拓撲異構(gòu)酶II和DNA并預(yù)防拓撲異構(gòu)酶II引起的雙鏈DNA斷裂的重新連接。這些化合物和蒽環(huán)類抗生素，已經(jīng)有報道在一些細胞類型中誘導(dǎo)活性氧的形成(ROS)(Laurent和Jaffrezou，2001，Blood98，913-24;Muller等人，1998,IntJMolMed14914;Richard等人，2002，LeukRes26,927-31)，盡管申請人在這三種化合物存在的條件下在這些工程化細胞中沒有觀察到ROS的形成。他們發(fā)現(xiàn)當(dāng)hTERT被導(dǎo)入并且當(dāng)RB通過導(dǎo)入LT或者HPVE7被滅活時，這些化合物活力更高(在更低濃度下也有活性)。在細胞中，E7在E6之后導(dǎo)入，所以這些化合物在帶有E7的細胞中增加的效力可能還依賴于E6的存在，即使E6自身不導(dǎo)致這些化合物效力的增加。hTERT的導(dǎo)入和RB的失活引起引起拓撲異構(gòu)酶IIa表達的增加(圖5a)，拓撲異構(gòu)酶lla表達的只是非常有限的增^。致癌RAS的導(dǎo)入引起拓撲異構(gòu)酶IIa表達的進一步增加，盡管申請人沒有觀察到在致癌RAS存在的情況下對于拓撲異構(gòu)酶Ila毒素進一步的致敏化。組(iii)的化合物是喜樹堿(CPT)和來自組合文庫的新化合物，申請人:已經(jīng)將其命名為erastin，因為它是表達RAS和ST的細胞的去除劑(蘭radicatorofRASandgl-expressingcells)(圖2)。有效的CPT誘導(dǎo)和erastin誘導(dǎo)的細胞死亡需要ST和RASV12的存在(圖3、4和表1)。盡管CPT和erastin具有相同的選擇性遺傳基礎(chǔ)，它們的作用機理不同。CPT在缺乏RB功能(通過E7的表達)的細胞中是部分活化的，而erastin不是，并且CPT需要兩天引起B(yǎng)J-TERT/LT/ST/RASV12中死亡，而erastin在18小時內(nèi)是100%有效的(圖3禾n4)。磷酸酶抑制劑岡田酸能夠使在其他情況下是具有抗性的BJ原代細胞對CPT敏化(圖5E)，可能因為岡田酸上調(diào)TOPI(圖5F)。岡田酸不會導(dǎo)致BJ或者BJ-TERT細胞對erastin敏感，與CPT和erastin通過不同的機理作用模型一致。此外，申請人發(fā)現(xiàn)致死的化合物足葉草毒素，一種微管蛋白抑制劑，不使BJ或者BJ-TERT細胞對CPT敏感，證實岡田酸導(dǎo)致的BJ細胞對CPT的致敏性是特異的，不是兩種具有累加但功能上不相干的效果的微弱細胞死亡刺激的結(jié)果。為理解表達RASV^和ST的細胞對CPT敏感性增加的分子基礎(chǔ)，申請人:檢測了工程化細胞中拓撲異構(gòu)酶I的表達水平，拓撲異構(gòu)酶I是公認的CPT耙標(biāo)(Andoh等人,1987,ProcNatlAcadSdUSA84,5565-9;Bjornsti等人，1989，CancerRes49，6318-23;Champoux,2000，AnnNYAcadSd922,56-64;D'Arpa等人，1990,CancerRes50，6919-24;Eng等人，1988，MolPharmacol34，755-60;Hsiang等人，1989，CancerRes49，5077-82;Hsiang和Liu，1988，CancerRes48，1722-6;Liu等人，2000，AnnNYAcadSd922，1-10;Madden禾口Champoux，1992，CancerRes52，525-32;Tsao等人，1993,CancerRes53，5908-14)。他們發(fā)現(xiàn)表達RASV12和ST的細胞上調(diào)TOPI(圖5B)。因為CPT在其他細胞類型中作用的公認作用機理涉及功能的獲得，即以TOPl依賴的方式導(dǎo)入雙鏈DNA斷裂(Liu等人，2000,AnnNYAcadSci922,1-10)，TOPI的上調(diào)可以解釋表達RASvl2fnST細胞對CPT敏感性的增加。為支持這些解釋，他們發(fā)現(xiàn)在BJ-TERT/LT/ST/RASV"細胞中用小干擾RNA(siRNA)導(dǎo)致的TOPI遺傳失活引起對CPT的部分抗性(圖5C，D)。此外申請人檢測了其他erastin類似物在腫瘤細胞相對正常細胞中的活性和選擇性。另一個類似化合物被確定為有活性和選擇性，但活性比erastin低。這個化合物被命名為erastinB(參見圖8)。BJELR細胞是BJ-TERT/LT/ST/RAS^2細胞，BJEH細胞是BJ-TERT細胞。在BJELR和BJEH細胞中進一步的化合物檢測如下實施例3細胞死亡的表征鑒定申請人設(shè)法鑒定了在致瘤BJ-TERT/LT/ST/RAS^2細胞中CPT和erastin誘導(dǎo)的細胞死亡類型。在其他文獻中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CPT誘導(dǎo)凋亡性細胞死亡(Traganos等人，1996,AnnNYAcadSci803,101-10)，其特點在于核形態(tài)學(xué)的改變包括固縮，核破裂和/或染色質(zhì)的著邊(Majno和Joris,1995，AmJPathol146,3-15)。為檢測erastin或者CPT在其系統(tǒng)中是否誘導(dǎo)凋亡，申請人使用熒光顯微術(shù)監(jiān)控接受CPT和erastin處理的致瘤細胞的核形態(tài)學(xué)。盡管在CPT處理的細胞中可顯見核破裂和染色質(zhì)的著邊，在erastin處理的細胞中未見這種形態(tài)學(xué)改變(圖7A)。因為核形態(tài)變異是凋亡細胞所需的，申請人得出結(jié)論erastin誘導(dǎo)的細胞死亡是非細胞凋亡的。進一步支持該結(jié)論的是觀察到CPT，而不是erastin，誘導(dǎo)DNA斷裂(形成DNA條帶)，泛caspase抑制劑(50nMBoc-Asp(Ome)-氟甲基酮，Sigma#B2682(Chan等人，2001，Neuroreport12，541-545))，部分阻斷CPT而不是erastin誘導(dǎo)的細胞死亡，并且CPT而不是erastin引起AnnexinV染色的增加(圖7B)和切割、活化的caspase3的出現(xiàn)(圖7C)。此外，在erastin處理的腫瘤細胞中核保持完整(圖9)。Erastin在表達ST和RASV12細胞中誘導(dǎo)非凋亡細胞死亡的能力是選擇性的。Erastin更長時間的處理和更高的濃度對缺乏RASV"或者ST的細胞活性影響很小，這證實erastin選擇性的定性性質(zhì)(圖6A，C)。因為erastin處理的細胞不經(jīng)歷凋亡，申請人設(shè)法證實erastin確實誘導(dǎo)細胞死亡，而不是細胞脫離。他們使用檢測胞內(nèi)還原電勢的染料AlamarBlue在erastin存在的條件下定量測定細胞活力(Ahmed等人，1994，J.Immunol.Methods170,211-224)。在同質(zhì)AlamarBlue活力試驗中，相對于BJ-TERT細胞Erastin在致瘤BJ-TERT/LT/ST/RASV12細胞中顯示選擇性致死性(圖6B)。用erastin處理18小時的BJ-TERT/LT/ST/RAS^細胞變圓和脫離(圖6C)，不能排除活體染料臺盼藍，在電勢測定染料JC-1檢測中顯示線粒體膜電勢的損失，具有死細胞特征的小細胞尺寸。申請人檢測到，erastin誘導(dǎo)的活力損失一旦完成就是不可逆的，因為用erastin處理24小時的BJ-TERT/LT/ST/RASV^細胞變圓、脫離，當(dāng)重新放到不含erastin的介質(zhì)上不能恢復(fù)。因此，erastin以ST和RASV12依賴方式誘導(dǎo)快速(12-24小時)、不可逆的、非凋亡細胞死亡。此外進行研究以證明erastin誘導(dǎo)活性氧的形成(參見圖IO)。進行篩選尋找emstin活性的遏制劑(抑制劑)。鑒定出四種抑制erastin活性的抗氧化劑，其中之一是抗氧化劑，a-生育酚。下列方法和材料用于此處描述的實施例。構(gòu)建體和逆轉(zhuǎn)錄病毒hTERT，LT，ST，SV40早期區(qū)域和HRASV12的表達構(gòu)建體按先前所述使用(Harm等人，1999，前文；Hahn等人，2002，前文)。hTERT-pWZL-Blaste,E6-pWZL-zeoe和E6E7-pWZL-Zeoe先前已有描述(Lessnick等人，2002，前文)。E6禾卩LTcDNAs克隆入pWZL-Hygroe逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(J.Morgenstern，MilleniumPharmaceuticals惠貝曾)。制備泡狀口腔炎病毒-G糖蛋白假模標(biāo)本逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染按前述方法進行(Lessnick等人，2002,前文)。細胞系TIP5原代成纖維細胞(Lessnick等人，2002，前文)從丟棄的新生包皮制備，用hTERT-pWZL-blaste或者hTERT-pBabe-hygro逆轉(zhuǎn)錄病毒感染使細胞永生化，分別用殺稻瘟菌素或潮霉素篩選。BJ細胞由JimSmith惠贈。hTERT-永生化成纖維細胞用指定逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，選擇合適標(biāo)記物。所有的BJ衍生物在添加15%滅活胎牛血清、青霉素和鏈霉素(pen/strep)的DMEM和M199的1:1混合物中培養(yǎng)。TIP5細胞在包含10%FBS和pen/strep的DMEM中生長。所有細胞培養(yǎng)物在37。C包含5。/。C02的濕潤溫箱中孵育?；衔镂膸彀?,540種化合物的標(biāo)注化合物文庫(ACL)，從國家癌癥學(xué)會獲得的1，990種化合物的NCI多樣性組和包含20，000種化合物的組合文庫(ComgenexInternational,Inc.)用于腫瘤選擇性的合成致死篩選。所有化合物文庫在384孔聚丙烯板中制備為溶解在DMSO中的4mg/ml溶液(歹!j3—22)，.20。C保存。喜樹堿(cat#—C9911，MW348.4)，阿霉素(cat#—D1515MW580.0)，柔紅霉素(cat#—D8809,MW564.0)，米托蒽醌(cat弁—M6545,MW517.4)，岡田酸(cat#—04511，MW805.0)，棘霉素(cat弁—E4392,MW1101)，桑吉瓦霉素(cat弁一S5895，MW309.3)獲自Sigma-AldrichCo。波凡霉素(MW772.84)和NSC146109(MW280.39)獲自國家癌癥學(xué)會發(fā)展治療項目。Erastin(MW545.07)獲自ComgenexInternational,Inc。鈣黃綠素AM活力試驗鈣黃綠素乙酰甲酯(AM)是細胞膜可滲透、非熒光的化合物，它被胞內(nèi)酯酶切割形成陰離子、細胞不可滲透的、熒光化合物鈣黃綠素?；罴毎烩}黃綠素染色，因為胞內(nèi)酯酶的存在并且因為完整的質(zhì)膜阻止熒光鈣黃綠素滲出細胞(Wang等人，1993，前文)。細胞使用ZymarkScicloneALH接種在384孔板，初篩時用各種化合物4ug/mL—式三份處理兩天，在PackardMinitrak的384孔清洗機上用磷酸鹽緩沖液洗滌，與0.7Pg/mL鈣黃綠素(MolecularProbes)孵育四小時。在PackardFusion板計數(shù)器記錄各孔的總熒光強度，通過扣除儀器本底和除以細胞不用任何化合物處理時得到的平均信號，將其轉(zhuǎn)變?yōu)樾盘柕囊种坡?。AlamarBlue活力i式驗AlamarBlue被活細胞中線粒體酶的活性還原，引起比色和熒光變化(Nociari等人，1998，J.IImnmnol.MMethods，13，157-167)。使用注射式大量分注器(Zymark)將細胞以每孔6000個細胞的密度(50yl)接種于384孔黑色、透明底板。使用384固定套管頭從兩倍系列稀釋的erastin板(6X最終濃度)取出10ul，使最高濃度孔中的最終濃度達到20ug/ml。板孵育24小時。AlamarBlue(BiosourceInternational)1:10稀釋后加入各孔，在37。C孵育16小時。使用激發(fā)濾片集中在535nm和發(fā)射濾片集中在590nm的PackardFusion板計數(shù)器來檢測熒光強度。計算各濃度的平均抑制率。誤差條表明一個標(biāo)準(zhǔn)差。AlamarBlue試驗不涉及洗滌細胞。篩選影印子板用ZymarkScicloneALH制備，通過用不含血清和pen/strep的培養(yǎng)基稀釋母板50倍來整合TwisterII，以獲得子板中具有2%DMSO的80ng/ml的化合物濃度。使用注射式大量分注器將細胞接種于黑色、透明底384孔板的1-23列(每孔6000個細胞，57ul)制備檢測板。3-22列用來自文庫子板的化合物處理，通過使用384位置固定的管陣從文庫子板轉(zhuǎn)移3y1。試驗板中最終化合物濃度因此是4ug/ml。試驗板在37°C包含5%C02的濕潤溫箱中孵育48小時。使用來自PackardBioscience(PerkinElmer)的整合Minitrak/Sidetrak機器人系統(tǒng)進行板處理步驟用于分析鈣黃綠素AM活力。試驗板用磷酸鹽緩沖液洗滌，每孔添加20yl鈣黃綠素AM(0.7ixg/ml)。板在室溫孵育4小時。使用集中在535nm的激發(fā)濾片和集中在590nm的發(fā)射濾片的PackardFusion板計數(shù)器來檢測熒光強度?；衔镌谙盗邢♂屩械闹貜?fù)試驗重復(fù)試驗的化合物從廠商處購買。儲備物在384孔聚丙烯板中以1mg/ml濃度溶于DMSO中制備，各化合物在每列中具有16點、兩倍稀釋劑量曲線，一式兩份。列1-2和23-24留為空白作為對照。通過在384孔deep-deep孔板中用DMEM稀釋66.6倍(4.5u1轉(zhuǎn)移到300ti1中)，用儲存的重復(fù)試驗板制備重復(fù)試驗子板。細胞以每孔40P16000個細胞的密度種植，20nl從重復(fù)試驗子板添加。板在37'C5%C02下孵育兩天。數(shù)據(jù)分析未處理細胞的平均RFU(相對熒光單位)通過平均列1、2和23(有細胞但無化合物的孔)的值來計算。鈣黃綠素背景通過平均列24(有鈣黃綠素但無細胞的孔)的值來計算。每孔的抑制率按[l-(RFU-鈣黃綠素對照)/(未處理細胞-鈣黃綠素對照)X100]計算。通過在BJ原代和BJ-TERT/LT/ST/RASV^細胞中一定濃度范圍內(nèi)的檢測，確定在初篩中造成鈣黃綠素染色至少50%抑制的化合物對BJ-TERT/LT/ST/RASV12工程化腫瘤細胞的選擇性。選擇性化合物在所有工程化細胞系中重復(fù)試驗。核形態(tài)學(xué)試驗在六孔板的每孔中的玻璃蓋玻片上接種2mL200,000個致瘤BJ-TERT/LT/ST/RASV'2細胞，分別在生長培養(yǎng)基中用空白(NT)，9nMerastin或者1.1uM喜樹堿(CPT)處理18小時，在37°C5%C02下孵育。核用25ug/mLHoechst33342(MolecularProbes)染色，在熒光顯微鏡上用油鏡IOOX物鏡觀察。細胞大小測量200,000個BJ-TERT/LT/ST/RASV12細胞種于六孔板，只有2mL生長培養(yǎng)基(無處理)，具有9liMerastin或者具有1.1nM喜樹堿(CPT)。24小時后，細胞用胰蛋白酶/EDTA消化釋放，在生長培養(yǎng)基中稀釋到10mL，在庫爾特計數(shù)器上檢測各樣品的細胞大小分布。喜樹堿活性的細胞計數(shù)試驗BJ-TERT/LT/ST/RASV12細胞種于6孔板(200000細胞/孔；每孔2ml)，利用Oligofectamine(LifeTechnologies)在無血清和無抗生素的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染，每孔100nMsiRNA，總體積lml。500y1包含30%FBS的培養(yǎng)基在轉(zhuǎn)染后4小時添加。轉(zhuǎn)染后細胞用指定濃度的喜樹堿處理30小時。500nl所需喜樹堿濃度的5X溶液被添加到各孔。轉(zhuǎn)染75小時后用胰蛋白酶-EDTA消化細胞，血球計數(shù)器計數(shù)。對照實驗表明轉(zhuǎn)染效率大約是10%。WesternBlot分析C3spase-3實驗前在60mm皿中種入5X105BJ-TERT/LT/ST/RASV12細胞。細胞用5ug/mlerasthi(9l4M)處理2、4、6、8或者10小時。一個皿用喜樹堿處理(0.4ug/ml24小時)作為陽性對照。在每個時間點后細胞在裂解緩沖液(50mMHEPESKOHpH7.4，40nMNaCl，2mMEDTA，0.5%TritonX-100，l,5mMNa3V04，50mMNaF，10mM焦磷酸鈉，lOmMbeta-甘油磷酸鈉和蛋白酶抑制片(Roche))中裂解。用Biorad蛋白檢測試劑定量蛋白質(zhì)含量。等量蛋白于16。/。SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離。電泳遷移的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%牛奶封閉，與1:1500稀釋的抗活化caspase-3的多克隆的抗體在4。C孵育過夜。然后膜與1:3000稀釋的抗兔HRP(SantaCruzBiotechnology)孵育1小時，再用增強化學(xué)發(fā)光混合物(NENlifescience,Renaissance)顯色。為檢測每條泳道等量上樣，斑點被切成條，封閉，用1:1000稀釋的抗elF-4E抗體(BDTransductionlaboratories)檢測。拓撲異構(gòu)酶-IIaBJ，BJ-TERT，BJ-TERT/LT/ST，BJ-TERT/LT/ST/RASVI2，BJ-TERT/LT/RASV"禾口BJ-TERT/LT/RASV12/ST細胞種入60mm皿，每皿1X1(^個細胞。在37'C5。/。C02孵育過夜后，細胞按上述方法裂解，蛋白于10%聚丙烯酰胺凝膠上分離。膜與1:1000稀釋的抗人拓撲異構(gòu)酶IIap170抗體(TopoGEN)在4'C孵育過夜，然后和抗小鼠HRP(SantaCruzBiotechnology)孵育。拓撲異構(gòu)酶1(TOPI)一個針對TOPI的21核苷酸雙鏈siRNA(核苷酸2233-2255，從起始密碼子計數(shù)，Genbank登錄號J03250)被合成(Dharmacon，純化和脫鹽/脫保護)，在六孔板中用oligofectamine(LifeTechnologies)轉(zhuǎn)染(100nM)BJ-TERT/LT/ST/RAS^2細胞。75小時后，細胞被裂解，通過Westernblot檢測TOPI的表達水平(Topogen，Cat#_2012-2，1:1000稀釋)。通過切條和用抗eIF的抗體(BDBiosciences,Cat#—610270，1:500稀釋)重新測定相同斑點，對蛋白上樣水平進行檢測。此外，1乂106細胞種于60mm皿，在37°C5%C02條件下生長過夜，然后在150U1裂解緩沖液中裂解。細胞用刮刀刮下，轉(zhuǎn)移到微量離心管，在冰上孵育30分鐘。用Biorad蛋白檢測試劑定量裂解物中的蛋白質(zhì)含量。等量蛋白上樣于10%梯度SDS-聚丙烯酰胺凝膠。電泳遷移蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%奶粉封閉后，膜與小鼠抗人拓撲異構(gòu)酶I抗體(Pharmingen)在4'C孵育過夜，然后與抗小鼠過氧化物酶偶聯(lián)抗體(SantaCruzBiotechnology)醉育。AnnexinV-FITC凋亡試驗每個100mm皿中種入1X1()6個BJ-TERT/LT/ST/RAS^2細胞，生長過夜。細胞用erastin(5或者10ng/ml)處理6、8或者11小時。保持喜樹堿處理(0.4yg/ml)，在接種時處理20小時。處理后，細胞用胰蛋白酶/EDTA收獲，并用包含血清的新鮮培養(yǎng)基洗滌一次，然后用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次。細胞用1X結(jié)合緩沖液(BDPharmingen)重新懸浮，濃度是lXl()S細胞/ml。在室溫避光條件下100"(1X1()S個細胞)與5ulAnnexinV-FITC(BDPharmingen)和碘化丙啶孵育15分鐘。然后加入400yl1X結(jié)合緩沖液，通過流式細胞儀(BectonDickinson)分析細胞。使用Cellquest軟件獲得和分析數(shù)據(jù)。使用FL1通道只分析活細胞的AnnexinV-FITC染色，所述活細胞不被碘化丙啶染色的。ROS分析利用H2DCF-DA的流式細胞分析2'，7'-雙氯雙氫熒光素雙醋酸酯(H2DCF-DA)是非熒光細胞可滲透化合物。細胞內(nèi)的內(nèi)源酯酶切割雙醋酸酯部分，它不再滲出細胞。因此它在細胞內(nèi)積累。然后H2DCF與ROS反應(yīng)形成熒光二氯熒光素(DCF)，這可以用流式細胞儀在FL1通道檢測。1.每個60mm皿中種入3X10S個細胞，生長過夜。2.用待測化合物處理不同時間(1-10小時)。3.每個時間點分別維持一個未處理細胞，化合物處理細胞和陽性對照(過氧化氫處理)的皿。4.在37。C細胞與10yMH2DCF-DA孵育10分鐘。5.對陽性對照細胞，在加入H2DCF-DA5分鐘后，添加500pM過氧化氫，再孵育5分鐘。6.胰酶消化收獲細胞。7.用冷的PBS洗滌兩次。8.在100ulPBS中重懸沉淀，轉(zhuǎn)移到5mlFACS管。9.添力卩5tM碘化丙錠(50ug/ml)，在避光條件下冰浴10分鐘。10.添力口400MPBS，通過流式細胞儀(Becton-Dickinson)分析。11.使用Cellquest軟件程序獲得和分析數(shù)據(jù)。12.只選取碘化丙啶陰性細胞(活細胞)進行DCF染色分析，使用FL1通道，PI在FL3通道，作象限圖。篩選ACL文庫中能夠抑制BJELR細胞中erastin活性的化合物方法包括1，540種化合物的ACL文庫和所有的化合物在384孔聚丙烯板中制備為溶解在DMSO中的4ug/ml溶液，-20^保存。使用ZymarkSciloneALH制備每個文庫的影印子板。子板用DMEM稀釋50倍，子板中的化合物濃度是80iig/ml，具有2%DMSO中。在試驗板中來自子板的化合物用細胞懸液稀釋20倍，因此各化合物的最終濃度是g/ml。BJELR細胞以6000細胞/孔(57p1)(用于共處理篩選)和5000細胞/L(57ul)(用于預(yù)處理篩選)用注射式大量分注器種于384孔黑色、透明底板。對共處理抑制物篩選，細胞用3ul來自ACL文庫的子板的化合物處理(試驗板中最終濃度在4ug/ml)，同時用5ug/mlerastin處理。使用384固定管頭進行化合物轉(zhuǎn)移。板在37°C5%C02溫箱中孵育48小時。對預(yù)處理篩選，細胞用來自ACL文庫子板的化合物預(yù)孵育過夜，然后用5pg/mlerastin再處理48小時。使用PackardBioscience的MiniTrak/SideTrak機器人系統(tǒng)對板進行l(wèi)丐黃綠素試驗。試驗板用PBS洗滌，在室溫下與鈣黃綠素AM(0.7ug/ml)孵育4小時。使用集中在485nm的激發(fā)濾片和集中在535nm的發(fā)射濾片以Fusion板計數(shù)器來檢測熒光強度。BJELR細胞是BJ-TERT/LT/ST/RASVu細胞。表1顯示工程化細胞系中腫瘤選擇性的化合物的效力。九種腫瘤選擇性化合物在全部工程化細胞系種進行16點、兩倍稀釋劑量曲線的重復(fù)試驗。表列出在各細胞系中各化合物達到鈣黃綠素AM染色50%抑制(IQo)的濃度(Ug/mL)。在原代BJ細胞中的ICso除以BJ-TERT/LT/ST/RASV12致瘤細胞中的IC5Q得到各化合物的腫瘤選擇比。通過計算系列中每個隨后細胞系的對的選擇比來檢定化合物對各遺傳元件的選擇性。小T癌蛋白-選擇性化合物被認為是對PP2A(小T癌蛋白的耙標(biāo))有選擇性，而E6-選擇性化合物被認為是對p53缺失有選擇性，E7-選擇性化合物被認為是對RB的缺失有選擇性。<table>tableseeoriginaldocumentpage131</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage131</column></row><table>表2顯示腫瘤選擇性化合物在工程化細胞系中的效力。表列出各細胞系中各化合物對鈣黃綠素染色的抑制(陰性％值)或者增強(陽性％值)(ic50)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage133</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage134</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage135</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage136</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage137</column></row><table><image>imageseeoriginaldocumentpage138</image><formula>formulaseeoriginaldocumentpage139</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage140</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage141</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage142</column></row><table><image>imageseeoriginaldocumentpage143</image><formula>formulaseeoriginaldocumentpage144</formula>-27%-1%-33%-10%-23%-5%-24%-2%-20%-9%200680009733.5<formula>formulaseeoriginaldocumentpage146</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage147</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage148</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage149</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage150</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage151</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage152</column></row><table><image>imageseeoriginaldocumentpage153</image><table>tableseeoriginaldocumentpage154</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage155</formula>實施例4Erastin結(jié)合伴侶的鑒定和表征最初用Pull-down試驗鑒定細胞內(nèi)的erastin結(jié)合伴侶，所述Pull-down試驗使用固定的erastin和細胞裂解產(chǎn)物。最初的pull-down實驗用HEK293、BJEH和BJELR全細胞裂解產(chǎn)物進行。在這些實驗中，erastin的甲氨基衍生物(ERA-A6)被固定到Affigel10,在標(biāo)準(zhǔn)pull-down條件下與裂解產(chǎn)物孵育。洗滌珠子，然后用lOOuMemstin或者0.8。/。十二烷酰肌氨酸(sarkosyl)洗脫。洗脫液用于質(zhì)譜分析。Erastinpull-down試驗結(jié)果的分析發(fā)現(xiàn)在HEK293或者BJEH和BJELR裂解產(chǎn)物第一輪pull-down試驗中鑒定到線fe體或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白的出現(xiàn)頻率較高。這表明膜孔可能是erastin或者其類似物的靶標(biāo)。但是，這些結(jié)果不排除以下可能性，即erastin可能還有在這輪pull-down實驗中未被鑒定的其他和/或不同的靶標(biāo)。在pull-down試驗中用erastin或者erastin類似物反復(fù)觀察幾個蛋白。這些蛋白，包括VDAC1、VDAC2、VDAC3、Prohibitin、核糖體結(jié)合糖蛋白、Sec61a和Sec22b，假設(shè)它們是erastin的靶標(biāo)。因為全細胞裂解產(chǎn)物混合物仍然是相當(dāng)復(fù)雜的，那些蛋白只在pull-down實驗的sarkosyl洗脫液中檢測到。這潛在地增加了質(zhì)譜分析的復(fù)雜性。因此，為簡化混合物，使用不同的分離方法分離或者預(yù)濃縮在全細胞裂解產(chǎn)物pull-down實驗中鑒定的一些蛋白。因為Prohibitin和VDAC同工型都是線粒體蛋白，申請人通過從細胞裂解產(chǎn)物分離線粒體來富集潛在的erastin靶標(biāo)。分離的線粒體提取物然后用于erastinpull-down實驗。在那些利用線粒體提取物的erastinpull-down實驗中，Prohibitin、VDAC和核糖體結(jié)合糖蛋白還通過Westernblot鑒定。圖14顯示pull-down的Westernblot，其中線粒體提取物接觸固定于珠上的活性(A6)和非活性的(Bl)erastin衍生物。Pull-down實驗用線粒體提取物為0.25mg總蛋白進行。珠子在4'C與提取物孵育1.5小時，然后洗滌幾遍。與固定的emstin衍生物結(jié)合的蛋白用50ixL0.8。/。十二烷酰肌氨酸溶液洗脫。Westernblot鑒定蛋白，所述westernblot使用抗-核糖體結(jié)合糖蛋白、-Sec6、-Prohibitin和抗-VDAC抗體的混合。蛋白還通過質(zhì)譜分析鑒定。核糖體結(jié)合糖蛋白和Prohibitin是酸性蛋白，計算的PI值分別是5.57(Prohibitin)和5.96(核糖體結(jié)合糖蛋白I)。申請人利用MonoQ柱在pH6.8條件下通過離子交換色譜法把這兩個蛋白與堿性更強的蛋白(VDAC同工型，Sec22和Sec61a)分離。然后使用抗體檢測這些級分中Prohibitin或者核糖體結(jié)合糖蛋白含i。還檢測這些級分它們與包含固定的ERA-A6和ERA-B1化合物的BIACORE表面的結(jié)合。在BIACORETM實驗中顯示結(jié)合的級份中發(fā)現(xiàn)了Prohibitin和核糖體結(jié)合糖蛋白。有趣地是，觀察到一種未知的45kDa蛋白在銀染SDS-PAGE凝膠中與ERA-A6或者ERA-B1珠子結(jié)合，所述未知蛋白不與任何使用的抗體反應(yīng)。為證實這些發(fā)現(xiàn)，從MonoQ洗脫液級份對ERA-A6和ERA-B1進行pull-down實驗。Prohibitin和核糖體結(jié)合糖蛋白再次被確定為結(jié)合來自幾種級份的Erastin珠。這些實驗清楚地支持以下觀點，即VDAC同工型和Prohibitin及核糖體結(jié)合糖蛋白結(jié)合erastin和erastin類似物。因此這些蛋白在體內(nèi)都是erastin的潛在靶標(biāo)/結(jié)合伴侶。實施例5不同VDAC同工型的表達水平當(dāng)利用BJELR裂解產(chǎn)物進行pull-down時，與來自BJEH細胞的裂解產(chǎn)物比較，erastin的ERA-A6類似物的成功的pull-down始終產(chǎn)生更高的VDAC3基于質(zhì)譜的鑒定值?？紤]可比較的總蛋白量時，VDAC同工型的值越高，與之一致的是這些同工型在BJELR裂解產(chǎn)物相對于BJEH裂解產(chǎn)物中的豐度更高。靶標(biāo)蛋白的不同的水平可能影響Erastin的選擇性。為說明這點，申請人使用定量PCR(Q-PCR)檢測了不同VDAC同工型的相對表達水平。其他可用的方法包括Westernblot和質(zhì)譜分析法。進行定量PCR(Q-PCR)實驗檢測"正常"BJEH細胞系和致瘤BJELR系中不同基因mRNA的相對量(作為基因表達的代替品標(biāo)記物)。對各VDAC同工型(VDACl，2禾卩3)，mRNA的兩個區(qū)域被用于擴增。這些區(qū)域分別稱為1和1-2，2-1和2-2，以及3-1和3-2。各個感興趣基因的mRNA片段擴增的Q-PCR信號與一系列內(nèi)參比較，相對于靶細胞中GAPDHmRNA衍生的信號按比例繪圖。圖11中所示結(jié)果表明，BJELR細胞中VDAC3的表達相對于BJEH細胞中顯著地升高。這個發(fā)現(xiàn)與其他幾個基因觀察的結(jié)果相反，在BJELR細胞中相對于BJEH細胞觀察到所述基因被抑制。使用圖11中相同的Q-PCR數(shù)據(jù)作出圖12，但是圖12重點在于靶細胞中VDAC同工型的相對表達水平。各擴增mRNA片段的Q-PCR信號與一系列內(nèi)參比較，表示為相對于靶細胞中VDAC1mRNA的信號，這被定義為100%。如圖11所示，各VDAC同工型(VDAC1,2和3)mRNA的兩個擴增區(qū)域，分別稱為1，1-2，2-1，2-2，3-i和3-2。結(jié)果表明BJELR細胞中VDAC3的表達比在BJEH細胞中的高2-2.5倍。綜上，這些發(fā)現(xiàn)提示解釋BJELR細胞對erastin處理不同敏感性的一種可能機理。實施例6Erastin對不同VDAC同工型的功能評價功能試驗幫助確認鑒定的蛋白為erastin的功能靶標(biāo)。在某些實施方案中，分離的線粒體可以用于判斷erastin對線粒體功能是否具有作用或者表型效果。例如，表型效果可以通過顯微鏡觀察，當(dāng)檢測線粒體膜電位變化時，或者通過使用某些染料觀察erastin處理后活性氧的釋放，這在本領(lǐng)域已知是用于檢測活性氧(ROS)。在某些其他實施例中，確認實驗可以包括用疊氮基-erastin衍生物，或者erastin類似物或者偶聯(lián)到二齒螯合物親和標(biāo)記交聯(lián)劑(例如SBED)或者可切割的交聯(lián)劑的衍生物來光親和標(biāo)記靶標(biāo)蛋白。仍在其他實施方案中，重組和過表達的蛋白可以用于某些體外試驗，用于評定erastin對其功能具有的任意可能的效果。這種體外試驗可以包括，但不限于直接結(jié)合(體外或者BIACORETm)，或者是可以檢測VDAC同工型通道性質(zhì)的外排試驗。仍在其他實施方案中，可以使用那些靶標(biāo)蛋白的敲除突變株(細胞或者生物體)。與野生型比較，這些突變株可以變成對erastin有抗性的或者超敏的。那些敲除細胞系也可以用于高通量篩選(HTS)以檢測和/或評價erastin或者其類似物的特異性。仍在其他實施方案中，還可以用VDACs、Prohibitin和核糖體結(jié)合糖蛋白的RNAi實驗來評定erastin處理后的任意表型(例如，erastin抗性或者超敏性)。根據(jù)本發(fā)明的這個實施方案，分別以VDAC1、VDAC2禾BVDAC3作為耙標(biāo)的SMARTPOOLsiRNAs購自Dharmacon(Lafayette,CO)。然后優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，例如，在384孔板使用FUGENETM和oligofectamine和熒光標(biāo)記的siRNA雙鏈體。這種程序?qū)е旅?o的轉(zhuǎn)染效率。然后ELR腫瘤細胞可以用抗VDAC1、VDAC2或者VDAC3的siRNAs轉(zhuǎn)染，可以檢測對erastin的劑量-反應(yīng)。實施例7細胞生長的抑制檢測化合物抑制BJELR和BJEH細胞生長的能力?；衔锿ㄟ^Sytox初篩進行分析，這是一種監(jiān)控作為化合物處理結(jié)果的細胞幸存-增殖改變的表型試驗。它設(shè)計為鑒定特異改變細胞生長潛力的化合物的高通量方法，所述細胞帶有在癌癥患者中發(fā)現(xiàn)的致病性的突變，而這種突變不影響正常細胞的生長。該試驗依賴于一種便宜、簡單和可靠的膜不可滲透的熒光染料(Sytox,來自MolecularProbes)的讀數(shù)，所述熒光染料結(jié)合核酸。在健康細胞中，沒有檢測到信號，因為細胞膜是完整的，染料不會進入。但是，如果細胞膜是作為凋亡或者壞死的結(jié)果而受損，將檢測到與受到類似影響細胞的數(shù)目成比例的熒光信號。利用兩步讀數(shù)(在去污劑存在條件下最終讀數(shù)，以標(biāo)記所有細胞)，該試驗可以鑒定產(chǎn)生白細胞郁積、細胞毒性和/或致有絲分裂的化合物。第一次讀數(shù)或者"死細胞"讀數(shù)，通過顯示試驗時培養(yǎng)物中死亡或者瀕死細胞的數(shù)目來評估給定化合物的毒性。第二次讀數(shù)或者"總細胞"讀數(shù)，獲得細胞毒性在減小細胞群大小方面的累積效應(yīng)，以及無毒性時待測化合物對待測細胞群的任意細胞的抑制細胞或者抗增殖效果。為篩選目的，先前描述的BJ-TERT系稱為"正常"參照細胞系，BJ-TERT/LT/ST/RAS^細胞是致瘤細胞系。細胞種于96孔板過夜，在未處理情況下種植密度允許在72小時后孔中95%融合。隨后幾天，細胞接受系列稀釋的待測化合物處理48小時。在這段溫育期后，按廠商推薦濃度添加Sytox試劑到培養(yǎng)物，讀取死細胞熒光讀數(shù)。在完成這些測量后，添加去污劑皂角苷到培養(yǎng)物各孔對膜進行透化處理，以允許Sytox試劑對進入每個細胞，從而便于測量留在培養(yǎng)物中細胞總數(shù)。實施例83-(2-乙氧苯基)-2-(哌嗪-l-基甲基)喹唑啉-4(3H)-酮(化合物5)的合成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage161</formula>步驟1:2"氯甲基)-4H-苯并「dl「l,31噁嗪-4-酮"七合物2)的制備化合物2方法1:在氮氣中，鄰氨基苯甲酸(化合物l，15.3g)溶于300mL二氯甲烷(CH2C12)。然后添加三乙胺(TEA,1.1當(dāng)量)，在冰浴中冷卻混合物。滴加氯乙酰氯(1.1當(dāng)量)的二氯甲烷溶液(150mL)，加溫到室溫攪拌混合物兩小時。(在添加后可以去除冰浴或者混合物可以加溫到室溫超過兩個小時。)通過過濾分離固體，用冷水洗滌(2X)，然后是5%二乙醚(Et20)的己烷溶液洗滌，風(fēng)干，得到化合物2的白色粉末固體(22.5g，定量收率)。最終產(chǎn)品的特征是LC/MSm/zMH+196.13;純度>95°/。；1HNMR。方法2二甲基甲酰胺(DMF)用作反應(yīng)溶劑10克鄰氨基苯甲酸溶于300mLDMF。然后添加TEA(1.5當(dāng)量)，在冰/水浴中冷卻混合物。氯乙酰氯(1.3當(dāng)量)的DMF溶液(100mL)被滴加到冷卻的反應(yīng)混合物中。去除冰/水浴，反應(yīng)混合物攪拌2小時。反應(yīng)混合物注入冰水(200-300mL)中，用乙酸乙酯(EtOAc，3X提取)提取。合并有機層，用水和鹽水洗滌，用硫酸鈉(Na2S04)干燥。濃縮產(chǎn)生固體，該固體與100mL10%Et20/己垸研磨，得到化合物2的白色粉末(12g;85%收率)。最終產(chǎn)品用LC/MS表征。步驟2:2-(氯甲基V3-(2-乙氧苯基)喹唑啉酮-4(3HV酮(化合物3)的制備方法1使用三氯膦(PC13):在氮氣中，化合物2(8.8g)溶于440mL乙腈(CH3CN)，添加2-乙氧基苯胺(1.5當(dāng)量)，攪拌。向這些充分?jǐn)嚢璧姆磻?yīng)混合物中滴加PC13(2當(dāng)量)。得到的漿料加熱到50°C6-12小時。反應(yīng)混合物注入飽和Na2C03/冰混合物中，攪拌30分鐘，用EtOAc(3X300mL)提取。合并的有機層用(最少量的)水和鹽水洗滌，用硫酸鈉(Na2S04)干燥。濃縮溶液，粗的固體/油混合物與3%Et20/己垸(2X100mL)研磨，以除去未反應(yīng)氨基苯乙醚中的絕大部分。獲得的固體過濾分離，然后過硅膠柱(20%EtOAc/己垸)純化。分離的化合物3為白色粉末(11g，75-80%)。最終產(chǎn)品的特征是LC/MSm/zMH+315;純度〉98%。方法2使用磷酰三氯(P0C13):在氮氣中，化合物2(1.2g;6.0mmol;1.0當(dāng)量)和2-乙氧基苯胺(1.2mL;9.0mmo1，1.5當(dāng)量)溶于30mLCH3CN。向該溶液滴加P0C13(l.lmL，12mmol，2.0當(dāng)量)，混合物回流加熱3小時。反應(yīng)物冷卻至室溫，注入冰/飽和NaHC03槳料中，用EtOAc(3X200mL)提取。合并的有機層用水和鹽水洗滌，用Na2S04干燥。用LC/MS對粗反應(yīng)混合物進行分析，證實所需產(chǎn)物化合物3(97%)及少量副產(chǎn)物化合物3c(2-3%)的存在。LC/MS中MH+m/z(333/334/335)與化合物3c的二酰氨結(jié)構(gòu)一致。通常在硅膠上色譜層析分離所需產(chǎn)物(如前步驟2的方法1中所述)，得到的化合物3為白色粉末(1.3g，80-85%收率)。步驟3:3-(2-乙氧苯基)-2-(哌嗪-l-基甲基)喹唑啉-4(3HV酮(化合物5)的制備方法l:在氮氣中，化合物3(5g)溶于CH3CN(0.08-0.2M化合物濃度)，向其中依次加入碳酸鉀(K2C03，1.2當(dāng)量，商品化粉末)，哌嗪(2當(dāng)量)和碘化四丁銨(0.2當(dāng)量)?；旌衔镌?0°C(水浴溫度)加熱8-10小時。反應(yīng)可以按下列兩條路線中的任何一條進行(a)蒸發(fā)掉80%的溶劑，添加水(20mL)，用EtOAc(4X60mL)提取混合物；或者(b)反應(yīng)混合物是用400mLEtOAc稀釋，用水(3X20mL)洗滌。合并的有機層用鹽水洗滌，濃縮成微黃色的油。在硅石(10-25%甲醇/二氯甲烷)上用中壓色譜層析(CombiFlash⑧)純化后獲得的化合物5為白色粉末(80-85%收率)。產(chǎn)物的特征是1HNMR和LC/MSMH+365。步驟4:叔丁基4-(3-2-乙氧苯基)-4-氧代-3,4-二氫喹唑啉-2-基)甲基〗哌嗪-l-羧酸酯(化合物4)的制備化合物3化合物4方法1:在氮氣中，化合物3(4.0g，12.7mmo1，1.0當(dāng)量)溶于60mLCH3CN，向該固體樣品溶液中依次加入K2C03(2.1g，15mmol，1.2當(dāng)量)，叔丁氧羰基一哌嗪(4.73g，25mmol，2.0當(dāng)量)和碘化鈉(Nal，570mg，3mmo1，0.3當(dāng)量)的固體樣品?；旌衔?懸浮液)在8(TC加熱3-6小時。獲得白色懸浮液。利用TLC和LC/MS檢測反應(yīng),顯示化合物3完全轉(zhuǎn)化為化合物4。減壓條件下通過蒸餾去除大約30mLCH3CN，向獲得的槳料中加入60mL水，用EtOAc(4X60mL)提取混合物。合并的有機層用水，氯化銨飽和溶液(去除未反應(yīng)的叔丁氧羰基一哌嗪)，NaHC03飽和溶液和鹽水洗滌，用Na2S04干燥。固體與己垸研磨，經(jīng)過濾濃縮成為白色固體(5.6g，量產(chǎn))。這種材料無需進一步純化就可用于后續(xù)脫保護步驟。最終化合物的特征通過1HNMR，LCMS描述。步驟5:3-(7-乙氧苯基)-2-(哌嗪-基甲基〗喹唑啉-4f3HV酮(化合物5)的制備化合物4化合物5方法1:室溫下化合物4(2.7g，5.8mmol，1.0當(dāng)量)懸浮于15mL無水二噁垸中。室溫下滴加4NHCl/二噁垸溶液(17mL，12當(dāng)量)；反應(yīng)30分鐘后再添加17mL4NHCl/二噁烷，用LC/MS監(jiān)控反應(yīng)進展。(這是一種放熱反應(yīng)，觀察到氣體逸出。反應(yīng)體系必須是開放的，以釋放壓力，同時保持無水條件。)如果殘余任何量的未反應(yīng)化合物4，可再添加8-10mL4NHCl/二噁烷以驅(qū)動反應(yīng)完成。反應(yīng)最后分別添加40mL水和CH2C12到反應(yīng)物中，通過加入足量飽和含水Na2C03溶液調(diào)節(jié)混合物為堿性，達到pH8-9。層被分離，水層用CH2C12(3X60mL)提取。合并有機層，用水(4X10mL，直到水提取物的pH大約為中性)和鹽水洗滌，在Na2S04中干燥。濃縮產(chǎn)生微黃色的油，該油在硅石(10-25%甲醇/二氯甲垸)上用中壓色譜層析(CombiFlash)純化，與包含5-10%二乙醚的己垸研磨后產(chǎn)生的化合物5為白色粉末(85-95%收率)?；衔?的特征通過1HNMR和LC/MS描述。常規(guī)分析方法下列LC條件用于分析化合物5:柱用于質(zhì)譜的XTerra;CI8，3.5/xm尺寸2.1x150mm梯度75%CH3CN(包含0.08%甲酸)/25%水(包含0.1%甲酸)-90%CH3CN(包含0.08%甲酸)/10%水(包含0.1%甲酸)所有化合物用下列柱和移動相條件進行LC/MS分析:柱用于質(zhì)譜的XTerra;C18,3.5/mi尺寸2.1xl50mm<table>tableseeoriginaldocumentpage167</column></row><table>實施例9Sytox初篩Sytox初篩是一種表型試驗，監(jiān)控作為化合物處理結(jié)果的細胞幸存-增殖的改變。它設(shè)計為鑒定特異改變細胞生長潛力的化合物的高通量方法，所述細胞帶有在癌癥患者中發(fā)現(xiàn)的致病性突變，而這種突變不影響正常細胞的生長。該試驗依賴于一種膜不可滲透的熒光染料(Sytox，來自MolecularProbes)的便宜、簡單和可靠的的讀數(shù)，所述熒光染料結(jié)合核酸。在健康細胞中，沒有檢測到信號，因為細胞膜是完整的，染料不會進入。但是，如果細胞膜是作為凋亡或者壞死的結(jié)果而受損，將檢測到與受到類似影響細胞的數(shù)目成比例的熒光信號。利用兩步讀數(shù)(在去污劑存在條件下最終讀數(shù)，以標(biāo)記所有細胞)，該試驗可以鑒定產(chǎn)生白細胞郁積、細胞毒性和/或致有絲分裂的化合物。第一次讀數(shù)或者"死細胞"讀數(shù)，通過顯示試驗時培養(yǎng)物中死亡或者瀕死細胞的數(shù)目來評估給定化合物的毒性。第二次讀數(shù)或者"總細胞"讀數(shù)，獲得細胞毒性減小細胞群大小的累積效應(yīng)，以及無毒性時待測化合物對待測細胞群的任意細胞抑制或者抗增殖效果。為篩選目的，先前描述的BJ-TERT系稱為"正常"參照細胞系，BJ-TERT/LT/ST/RASV12細胞是致瘤細胞系。細胞種于96孔板過夜，在未處理情況下種植密度允許在72小時后孔中95%融合。隨后幾天，細胞接受系列稀釋的待測化合物處理48小時。在這段溫育期后，按廠商推薦濃度添加Sytox試劑到'培養(yǎng)物，讀取死細胞熒光讀數(shù)。在完成這些測量后，添加去污劑皂角苷到培養(yǎng)物各孔對膜進行透化處理，以允許Sytox試劑對進入每個細胞，從而便于測量留在培養(yǎng)物中的細胞總數(shù)。為數(shù)據(jù)評定，我們不區(qū)分顯示細胞毒或者抑制細胞效應(yīng)的化合物。為用于其他檢測，化合物必須滿足兩個嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)i.死細胞或者總細胞讀數(shù)(或者兩者)對腫瘤細胞系產(chǎn)生至少2標(biāo)準(zhǔn)差大小的信號變化ii.對"正常"對照細胞產(chǎn)生小于1標(biāo)準(zhǔn)差大小的信號變化。參見表3和4和圖15-17對應(yīng)于本發(fā)明化合物的體外數(shù)據(jù)。化合物編號IC50inBJELR(口M)<0.1006gl扁7^0.1008kl扁9Sl扁14^0.10015Sl扁10-kl細11^0.10016^0.100n^0.10012<0.10013<0.1001<table>tableseeoriginaldocumentpage170</column></row><table>C:PRLX化合物5@100mg/Kg，QDX5天，IP，n=8D:PRLX化合物5@50mg/Kg，QDX5天，IP，n=8E:媒介對照，QDX5天，IP,n=8F:未治療對照，n二8治療計劃當(dāng)平均腫瘤體積達到200mn^時開始，持續(xù)至第5天，每天給藥每只動物單一IP注射上述治療中的一種，總共5個劑量。、腫瘤移植和分期70只小鼠每只都移植1X107個HT-1080細胞，通過在右后肢側(cè)面SC注射0.1cc接種物。使用25GX5/8針號。使用HT-1080細胞(ATCC分離，第6次傳代凍存物)制備腫瘤細胞接種物，所述HT-1080細胞在DMEM[Gibco，No.l0569-010]+10%FCS[Gibco，No.F-2442]中培養(yǎng)。在細胞收獲時，細胞生長到95-100%的融合度。HT-1080接種物在無菌的DMEM培養(yǎng)基+10。/。FCS中制備，密度1.0Xl()8細胞/inl。在腫瘤移植后+9天，動物分組匹配為治療和對照組，每組由8只小鼠組成?？偣?2個非正常值從實驗中剔除，因為腫瘤太小或者太大。這被認為是實驗第1天，治療從這天開始。注射液的制備下列注射液在化合物給藥的5天期間每天新鮮制備100mg/kg劑量(組A和C)首先，通過在0.35ml溶劑(0.25。/oTween-80，0.1。/。苯甲醇和350mM乙酸)中溶解35mgPRLX化合物6或者PRLX化合物5來制備各化合物的儲液。然后通過將各儲液與3.15ml稀釋劑(lOOmM磷酸鉀緩沖液和32mM蔗糖，pH6.8)混合來1:10稀釋得到的儲液制備最終注射液。溶液然后過濾殺菌(0.45lim膜)。獲得的溶液包含PRLX化合物6或者PRLX化合物5，終濃度10.0mg/ml，pH=6.5。50mg/kg齊U量(組B和D)對兩種化合物，通過添加1.0ml稀釋劑(100mM磷酸鉀緩沖液和32mM蔗糖，pH6.8)，1:2稀釋1.0ml的10mg/ml注射液(如上所述)。獲得的溶液包含PRLX化合物6或者PRLX化合物5的終濃度為5.0mg/mlpH=6.5。媒介對照(組E)然后使用稀釋劑(100mM磷酸鉀緩沖載體對照和32mM蔗糖，pH6.8)1:10稀釋溶劑(0.25%Tween-80，0.1%苯甲醇和350mM乙酸)來制備媒介對照。媒介對照的最終成分包含在100mM磷酸鉀和32mM蔗糖中的0.025%Tween-80,0.01%苯甲醇和35mMHOAc,最終pH=6.8。劑量概述:<table>tableseeoriginaldocumentpage172</column></row><table>腫瘤測量從第1天開始，每隔一天稱重全部動物，測量腫瘤尺寸(長度(L)和寬度(W))。使用下列公式將腫瘤測量結(jié)果轉(zhuǎn)換為腫瘤體積(mm3):腫瘤體積-LXWXW/2。計算各時間點各實驗組獲得的腫瘤體積的平均值，對時間作圖。差異表示為平均值標(biāo)準(zhǔn)差(土SEM)。圖18-20顯示這些實驗的結(jié)果。實施例11PANC-1腫瘤治療研究PRLX化合物6和PRLX化合物5的抗腫瘤活性評定PANC-1異種移植物制備和移植PANC-1研究的實驗計劃基本與上述實施例10中所列的HT-1080研究相同，除了以下區(qū)別大約30-40mgPANC-1傳代腫瘤組織碎塊皮下植入免疫缺陷裸鼠的右側(cè)。每天監(jiān)控腫瘤生長，當(dāng)腫瘤達到大約100mm3時，帶有相似大小腫瘤的動物被分組匹配，開始化合物劑量給藥。按下面所列計量連續(xù)5天每天給藥化合物5—次。在PANC-1異種移植物中，吉西他濱，以模型最大耐受劑量給藥，用作對照。吉西他濱療法是9天內(nèi)每3天進行給藥每天180mg/kg3次。圖21-22顯示這些實驗的結(jié)果。引用參考此處提及的全部出版物和專利在此完整引入作為參考，就像各個獨立出版物或者專利是特異和單獨引入作為參考。在沖突情況下，將以本申請，包括此處的任何定義，為準(zhǔn)。等同物當(dāng)討論本發(fā)明的特定實施方案時，上述說明書是說明性和非限制的。在獲知該說明書和下列權(quán)利要求時本發(fā)明的許多變化對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。本發(fā)明的全部范圍應(yīng)該參考權(quán)利要求和等同物的全部范圍以及說明書和這種變化來決定。權(quán)利要求1.一種在哺乳動物中治療病癥的方法，包括對哺乳動物給藥治療有效量的具有式I結(jié)構(gòu)的化合物或者其藥學(xué)可接受的鹽，其中R1選自H、Z-Q-Z、-C1-8烷基-N(R2)(R4)、-C1-8烷基-OR3、3-到8-元碳環(huán)或者雜環(huán)，芳基，雜芳基和C1-4芳烷基；每次出現(xiàn)的R2和R4均是獨立選自H、C1-4烷基、C1-4芳烷基、芳基、雜芳基、?；?、烷基磺酰和芳基磺酰，如果R2和R4在相同氮原子上和不同時是氫時，它們是不同的，并且當(dāng)R2和R4在相同氮上并且R2和R4之一是?；?、烷基磺?；蛘叻蓟酋r，另一個選自H、C1-8烷基、芳基、C1-4芳烷基，和雜芳基；R3選自H、C1-4烷基、C1-4芳烷基、芳基和雜芳基；W選自和Q選自O(shè)和NR2；和每次出現(xiàn)的Z獨立地選自C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基，其中病癥的特點在于細胞具有增強的Ras信號活性和SV40小t抗原的細胞靶標(biāo)蛋白改變的活性。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其中病癥的特點還在于基本上野生型水平的Rb活性。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中Ri選自Z-Q-Z、8垸基-N(R2)(R4)、-(^.8垸基-0113、芳基，雜芳基和cl4芳烷基。4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其中芳基任選用選自Cl6院基，CF3，羥基，CL4垸氧基，芳基，芳氧基，鹵素，NR2R4，硝基，羧酸，羧酸酯和磺?；幕鶊F取代。5.—種在哺乳動物中治療病癥的方法，包括對哺乳動物給藥治療有效量的具有式I結(jié)構(gòu)的化合物或者其藥學(xué)可接受的鹽，R!選自H、Z-Q-Z、-<:1-8烷基-風(fēng)!12)(114)、-d-s垸基-OR3、3-到8-元碳環(huán)或者雜環(huán)，芳基，雜芳基和cl4芳烷基；每次出現(xiàn)的RZ和R"均是獨立選自H、CM烷基、Cl4芳院基、芳基、雜芳基、酰基、垸基磺酰和芳基磺酰，如果W和W在相同氮原子上和不同時是氫時，它們是不同的，而當(dāng)112和W在相同氮上并且112和^之一是?；?、烷基磺酰或者芳基磺酰，另一個選自H、d.s垸基、芳基、C"4芳垸基，和雜芳基；W選自H、Cm院基、C^芳烷基、芳基和雜芳基；其中:W選自R4;Q選自o禾nNR2;和每次出現(xiàn)的Z獨立地選自d-6烷基、C2、6烯基和CV6炔基，其中病癥的特點在于細胞具有增強的Ras信號活性和SV40小t抗原的細胞靶標(biāo)蛋白改變的活性。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中病癥的特點還在于基本上野生型水平的Rb活性。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中W選自Z-Q-Z、-Cw烷基-N(R2)(R4)、-d.s垸基-OR3、芳基，雜芳基和C^4芳烷基。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中W選自Cr4芳烷基和酰基。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中W是酰基。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中R4是-C(0)-Q-3烷基-Y，Y選自H、烷基、烷氧基、芳氧基、芳基、雜芳基、雜芳氧基和環(huán)烷基。11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中R4是-C(0)-d-3烷基-Y，Y選自芳氧基、芳基、雜芳基、雜芳氧基和環(huán)烷基。12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中W是-C(0)-d-3烷基-Y，Y選自芳氧基和雜芳氧基。13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一所述的方法，其中所述化合物在哺乳動物中通過非細胞凋亡機理殺傷細胞。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述細胞具有增強的Ras信號活性。15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述細胞過表達SV40小t抗原。16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述細胞具有實質(zhì)降低的磷酸酶PP2A活性。17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述細胞過表達VDAC。18.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一所述的方法，其中所述病癥是癌癥。19.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述細胞被誘導(dǎo)表達SV40小t抗原。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中通過用過表達SV40小t抗原的病毒載體感染所述細胞，所述細胞被誘導(dǎo)表達SV40小t抗原。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述病毒載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或者腺病毒載體。22.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一所述的方法，還包括對所述哺乳動物聯(lián)合給藥一種通過細胞凋亡機理殺傷細胞的試劑。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述試劑是化療劑。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述化療劑選自表皮生長因子受體拮抗劑、五硫化二砷、阿霉素、順鉑、卡鉑、西咪替丁、洋紅霉素、氮芥鹽酸、五甲三聚氰酰胺、塞替派、替尼泊甙、環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、去甲氧基竹紅菌甲素A、左旋苯丙氨酸氮芥、異磷酰胺、曲磷胺、曲奧舒凡、足葉草毒素或者足葉草毒素衍生物、鬼臼乙叉甙磷酸鹽、替尼泊甙、鬼臼乙叉甙、異長春堿、環(huán)氧長春堿、長春地辛、9-氨基喜樹堿、camptomnotecan、克立那托、甲地孕酮、甲氨蝶呤、絲裂霉素C、ecteinascidin743、白消安、亞硝脲氮芥(BCNU)、環(huán)己亞硝脲(CCNU)、洛弗斯特丁、l-甲基-4-苯基吡啶鐵離子、司莫司汀、十字孢堿、鏈脲霉素、酞菁、達卡巴嗪、氨基蝶呤、氨甲蝶呤、曲美沙特、硫鳥嘌呤、巰基嘌呤、氟達拉濱、pentastatin、2-氯脫氧腺苷、阿糖胞苷(araC)、甲基絲裂霉素、5-氟尿嘧啶、6-巰基嘌呤、阿霉素氫氯化物、甲酰四氫葉酸、霉酚酸、柔紅霉素、去鐵敏、5-氟脫氧尿苷、去氧氟尿苷、雷替曲塞、伊達比星、表柔比星、吡柔比星、佐柔比星、米托蒽醌、爭光霉素硫酸鹽、放線菌素D、番紅精、saframycins、quinocarcins、discodermolides、長春親j堿、長春花堿、長春瑞濱酒石酸鹽、vertoporfm、紫杉醇、他莫昔芬、雷洛昔芬、噻唑呋林、硫鳥嘌呤、病毒挫、EICAR、雌氮芥、雌氮芥磷酸鈉、氟他米特、比卡魯胺、布舍瑞林、亮丙瑞林、蝶啶、烯二炔、左旋四咪唑、aflacon、干擾素、白介素、阿地白介素、非格司亭、沙莫司亭、利妥昔單抗、卡介苗、維甲酸、倍他米松、吉西他濱氫氯化物、異搏定、VP-16、六甲密胺、t毒胡蘿卜內(nèi)酯、奧沙利鉑、異丙鉑、四鉑、洛鉑、DCP、PLD-147、JM118、JM216、JM335、沙鈷、紫杉萜、脫氧紫杉醇、TL-139、5'-降-脫水長春堿(下文中5'降長春花堿)、喜樹堿、依立替康(Camptosar，CPT-ll)、托泊替康(Hycamptin)、BAY38-3441、9-硝基喜樹堿(Orethedn、盧比替康)、依沙替康(DX-8951)、勒托替康(GI-147211C)、gimatecan、homocamptothecinsdiflomotecan(BN-80915)禾口9-氨基喜樹堿(IDEC-13')、SN-38、ST1481、karanitecin(BNP1350)、氮茚并咔唑(例如NB-506)、原小蘗堿、茚托利辛、idenoisoquinolo跳苯并吩嗪和NB-506。25.—種殺傷細胞，促進細胞死亡或者抑制細胞增殖的方法，包括對細胞給藥(1)有效量的具有式I結(jié)構(gòu)的化合物或者其藥學(xué)可接受的鹽，W選自H、Z-Q-Z、-(^.8烷基->^&2)(114)、-<:1.8烷基-0113、3-到8-元碳環(huán)或者雜環(huán)，芳基，雜芳基和CM芳垸基；每次出現(xiàn)的112和W均是獨立選自H、Cm院基、d—4芳烷基、芳基、雜芳基、酰基、垸基磺酰和芳基磺酰，如果w和w在相同氮原子和不同時是氫時，它們是不同的，而當(dāng)112和W在相同氮上并且R2和W之一是?；?、烷基磺酰或者芳基磺酰時，另一個選自H、d.s烷基、芳基、C"4芳烷基，禾口雜芳基；R3選自H、Cm院基、Cm芳院基、芳基和雜芳基；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>W選自Q選自O(shè)和NR2;和每次出現(xiàn)的z獨立地選自CL6烷基、<:2.6烯基和(32.6炔基，和(2)—種增加細胞中VDAC豐度的試劑。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中W選自Z-Q-Z、-d.s烷基-N(R2)(R4)、-Q.s烷基-OR3、芳基，雜芳基和CL4芳烷基。其中:27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中芳基任選用選自CL6烷基，CF3，羥基，CM烷氧基，芳基，芳氧基，鹵素，NR2R4，硝基，羧酸，羧酸酯和磺?；幕鶊F取代。28.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中VDAC是VDAC1、VDAC2或者VDAC3。29.—種殺傷細胞，促進細胞死亡或者抑制細胞增殖的方法，包括對細胞給藥-(1)有效量的具有式I結(jié)構(gòu)的化合物或者其藥學(xué)可接受的鹽，Ri選自H、Z-Q-Z、-(31-8烷基->^(2)(^4)、-d-s烷基-OR3、3-到8-元碳環(huán)或者雜環(huán)，芳基，雜芳基和CL4芳烷基；每次出現(xiàn)的112和W均是獨立選自H、Cm焼基、Cu4芳垸基、芳基、雜芳基、?；?、烷基磺酰和芳基磺酰，如果f和W在相同氮原子和不同時是氫時，它們是不同的，而當(dāng)W和W在相同氮上并且R2和W之一是?；?、烷基磺酰或者芳基磺酰，另一個選自H、C^烷基、芳基、Cm芳院基，和雜芳基；R選自H、Cw垸基、d-4芳烷基、芳基和雜芳基；其中:W選自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>,R4Q選自0和NR2;禾口每次出現(xiàn)的z獨立地選自cl6垸基、〔2.6烯基和<:2.6炔基，禾口(2)—種增加細胞中VDAC豐度的試劑。30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中R'選自Z-Q-Z、-Cw烷基-n(r2)(r4)、-<:1-8垸基-0113、芳基，雜芳基和cm芳烷基。31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中W選自cm芳烷基和?；?2.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中W是?；?。33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中R4是-C(0)-d.3垸基-Y，Y選自H、垸基、垸氧基、芳氧基、芳基、雜芳基、雜芳氧基和環(huán)垸基。34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中R4是-C(0)-d.3烷基-Y，Y選自芳氧基、芳基、雜芳基、雜芳氧基和環(huán)烷基。35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中R4是-C(0)-d.3烷基-Y，Y選自芳氧基和雜芳氧基。36.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中VDAC是VDAC1、VDAC2或者VDAC3。37.根據(jù)權(quán)利要求25-35中任一所述的方法，其中所述細胞是癌細胞。38.根據(jù)權(quán)利要求25-35中任一所述的方法，其中所述試劑包括編碼VDAC的多核苷酸。39.根據(jù)權(quán)利要求25-35中任一所述的方法，其中所述試劑是適合轉(zhuǎn)運進細胞的VDAC蛋白。40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述試劑是與異源內(nèi)化作用結(jié)構(gòu)域融合的VDAC蛋白。41.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述試劑是包括VDAC蛋白的脂質(zhì)體制劑。42.根據(jù)權(quán)利要求25-35中任一所述的方法，其中所述試劑增強或者抑制內(nèi)源VDAC的表達。43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述試劑刺激VDAC表達。44.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述試劑抑制VDAC抑制劑的功能。45.—種殺傷細胞，促進細胞死亡或者抑制細胞增殖的方法，包括對細胞給藥(1)有效量的具有式I結(jié)構(gòu)的化合物或者其藥學(xué)可接受的鹽，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>其中-Ri選自H、Z-Q-Z、-(:1_8烷基-:^(112)(114)、-d-s烷基-OR3、3-到8-元碳環(huán)或者雜環(huán)，芳基，雜芳基和Cw芳垸基；每次出現(xiàn)的W和R"均是獨立選自H、dv烷基、Cl4芳院基、芳基、雜芳基、?；?、垸基磺酰和芳基磺酰，如果f和W在相同氮原子和不同時是氫時，它們是不同的，而當(dāng)W和W在相同氮上并且R2和W之一是?；?、垸基磺?；蛘叻蓟酋r，另一個選自H、8垸基、芳基、Q-4芳烷基，禾口雜芳基；W選自H、(^.4垸基、Q-4芳烷基、芳基和雜芳基；Q選自0和NR2;禾口每次出現(xiàn)的z獨立地選自CL6烷基、<:2.6烯基和(:2_6炔基，和(2)—種降低細胞中VDAC豐度的試劑。46.具有式I結(jié)構(gòu)的化合物或者其藥學(xué)可接受的鹽，W選自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>(I)其中-Ri選自H、Z國Q-Z、-d.8垸基-N(R2)(R4)、-d.s烷基-OR3、3國到8-元碳環(huán)或者雜環(huán)，芳基，雜芳基和Cw芳烷基；每次出現(xiàn)的R"和R"均是獨立選自H、dv烷基、4芳垸基、芳基、雜芳基、酰基、垸基磺酰和芳基磺酰，如果W和W在相同氮原子和不同時是氫時，它們是不同的，并且當(dāng)W和W在相同氮上并且rS和W之一是酷基、烷基磺?；蛘叻蓟酋r，另一個選自h、Q-8烷基、芳基、C卜4芳烷基，禾口雜芳基；RS選自H、Cl4院基、Q-4芳垸基、芳基和雜芳基；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>w選自和Q選自O(shè)和NR2;和每次出現(xiàn)的z獨立地選自c^烷基、02.6烯基和<:2.6炔基。47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的化合物，其中W選自Z-Q-Z、烷基-N(R2)(R4)、-d.s垸基-OR3、芳基，雜芳基和CM芳烷基。48.根據(jù)權(quán)利要求46所述的化合物，其中芳基任選用選自Cw烷基，CF3，羥基，CM烷氧基、芳基，芳氧基，鹵素，NR2R4，硝基，羧酸，羧酸酯和磺?；幕鶊F取代。49.具有式I結(jié)構(gòu)的化合物或者其藥學(xué)可接受的鹽，Ri選自H、Z-Q-Z、《1.8烷基^(112)(114)、-CLs垸基-OR3、3-到8-元碳環(huán)或者雜環(huán)，芳基，雜芳基和CM芳烷基；每次出現(xiàn)的W和R"均是獨立選自H、d-4垸基、d-4芳垸基、芳基、雜芳基、?；?、烷基磺酰和芳基磺酰，如果W和R"在相同氮原子和不同時是氫時，它們是不同的，而當(dāng)W和R"在相同氮上并且R2和R"之一是?；?、烷基磺?；蛘叻蓟酋r，另一個選自H、d—8烷基、芳基、Ci-4芳烷基，禾口雜芳基；RS選自H、Cm院基、d-4芳烷基、芳基和雜芳基；W選自R4;Q選自O(shè)和NR2;禾口每次出現(xiàn)的Z獨立地選自Q.6烷基、<:2.6烯基和C2-6炔基。50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的化合物，其中W選自Z-Q-Z、-C,.s垸基-N(R2)(R4)、《1.8烷基-0113、芳基，雜芳基和CM芳烷基。51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的化合物，其中W選自Q—4芳垸基和?；?。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>其中:52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的化合物，其中W是?；?。53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的化合物，其中R4是-C(0)-d.3垸基-Y，Y選自H、垸基、烷氧基、芳氧基、芳基、雜芳基、雜芳氧基和環(huán)烷基。54.根據(jù)權(quán)利要求52所述的化合物，其中R4是-C(0)-d.3烷基-Y，Y選自芳氧基、芳基、雜芳基、雜芳氧基和環(huán)烷基。55.根據(jù)權(quán)利要求52所述的化合物，其中R4是-C(0)-d.3垸基-Y，Y選自芳氧基和雜芳氧基。56.—種鑒定候選抗腫瘤試劑的方法，包括a)在合適條件下將細胞與足量待測試劑接觸；和b)檢測待測試劑是否增強或者抑制emstin蛋白結(jié)合復(fù)合物組分的水平或者編碼erastin蛋白結(jié)合復(fù)合物組分的核酸的水平。57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中erastin結(jié)合蛋白是VDAC1，VDAC2，VDAC3，Prohibitin，核糖體結(jié)合糖蛋白，Sec61a或者Sec22b。58.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，還包括a)將待測試劑與腫瘤細胞接觸；和b)檢測待測試劑是否抑制腫瘤細胞的生長。59.—種鑒定候選抗腫瘤試劑的方法，包括a)將待測試劑與erastin結(jié)合蛋白或者表達erastin結(jié)合蛋白的細胞接觸；和b)檢測待測試劑是否結(jié)合erastin結(jié)合蛋白。60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中erastin結(jié)合蛋白是VDAC1,VDAC2，VDAC3,Prohibitin，核糖體結(jié)合糖蛋白，Sec61a或者Sec22b。61.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，還包括a)將待測試劑與腫瘤細胞接觸；和b)檢測待測試劑是否抑制腫瘤細胞的生長。62.根據(jù)權(quán)利要求56或者59所述的方法，其中待測試劑是小的有機分子。63.根據(jù)權(quán)利要求56或者59所述的方法，其中待測試劑是肽、蛋白、糖類或者核酸。64.根據(jù)權(quán)利要求56或者59所述的方法，其中對不同待測試劑的文庫重復(fù)所述方法。65.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中待測試劑或者erastin結(jié)合蛋白用可檢測的標(biāo)記物標(biāo)記。66.根據(jù)權(quán)利要求65所述的方法，其中可檢測的標(biāo)記物是生物素，熒光素，地高辛，綠色熒光蛋白(GFP)，同位素，多聚組氨酸，磁珠，或者谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)。67.—種增加腫瘤細胞對化療劑敏感性的方法，包括將腫瘤細胞與減少或者增加erastin結(jié)合蛋白豐度的化合物接觸。68.根據(jù)權(quán)利要求67所述的方法，其中erastin結(jié)合蛋白是VDAC1，VDAC2，VDAC3，Prohibitin，核糖體結(jié)合糖蛋白，Sec61a或者Sec22b。69.根據(jù)權(quán)利要求67所述的方法，其中化療劑是權(quán)利要求46所述的化合物。70.—種降低正常細胞對化療劑敏感性的方法，包括將正常細胞與減少或者增加erastin結(jié)合蛋白豐度的化合物接觸。71.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中erastin結(jié)合蛋白是VDAC1，VDAC2，VDAC3，Prohibitin，核糖體結(jié)合糖蛋白，Sec61a或者Sec22b。72.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中化療劑是權(quán)利要求46所述的化合物。73.—種鑒定抑制不需要的細胞增殖的候選治療劑的方法，包括(a)將待測試劑與VDAC蛋白或者蛋白復(fù)合物混合，所述蛋白復(fù)合物包括至少一種VDAC蛋白和任選一種或多種其他蛋白；(b)檢測待測試劑是否結(jié)合VDAC蛋白；和(c)如果待測試劑結(jié)合VDAC蛋白，則將待測試劑與細胞接觸，并檢測待測試劑是否改變細胞的增殖。74.根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中待測試劑是小的有機分子、肽、蛋白、模擬肽、核酸或者抗體。75.根據(jù)權(quán)利要求73或者74所述的方法，其中通過物理結(jié)合試驗檢測VDAC蛋白與待測試劑的結(jié)合。76.—種降低腫瘤生長率的方法，包括給藥足以降低腫瘤生長率的一定量的治療劑，其中治療劑是(a)增強或者抑制VDAC蛋白水平的試劑；(b)增強或者抑制VDAC蛋白活性的試劑；(C)與VDAC蛋白結(jié)合的試劑；(d)結(jié)合、調(diào)節(jié)或者結(jié)合并且調(diào)節(jié)包括至少一種VDAC和任選一種或多種其他蛋白的蛋白質(zhì)復(fù)合物的試劑；(e)包括VDAC多肽或者其功能性變體的試劑；或者(f)包括編碼VDAC多肽或者其功能性變體的核酸的試劑。77.—種治療癌癥患者的方法，包括給藥患者一種治療劑，所述治療劑選自(a)增強或者抑制VDAC蛋白水平的試劑；(b)增強或者抑制VDAC蛋白活性的試劑；(c)結(jié)合VDAC蛋白的試劑；(d)結(jié)合、調(diào)節(jié)或者結(jié)合并且調(diào)節(jié)包括至少一種VDAC和任選一種或多種其他蛋白的蛋白質(zhì)復(fù)合物的試劑；(e)包括VDAC多肽和其功能性變體的試劑；和(f)包括編碼VDAC多肽或者其功能性變體的核酸的試劑。78.根據(jù)權(quán)利要求76或者77所述的方法，其中VDAC蛋白是VDAC1、VDAC2或者VDAC3。79.根據(jù)權(quán)利要求76或者77所述的方法，其中待測試劑是小的有機分子、肽、蛋白、模擬肽、核酸或者抗體。80.根據(jù)權(quán)利要求76或者77所述的方法，其中試劑與一種藥學(xué)可接受的載體一起配制成制劑。81.根據(jù)權(quán)利要求76或者77所述的方法，其中所述試劑通過靜脈內(nèi)、口服、頰、胃腸外、通過吸入噴霧、通過局部施用或者經(jīng)皮膚給藥。82.根據(jù)權(quán)利要求76或者77所述的方法，其中試劑通過局部給藥方式給藥。83.根據(jù)權(quán)利要求76或者77所述的方法，還包括給藥至少一種其他的抗癌化療劑，所述化療劑與所述治療劑以累積或者協(xié)同作用的方式抑制癌細胞。84.具有式II結(jié)構(gòu)的化合物或者其藥學(xué)可接受的鹽，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>其中Ar是取代的苯基；R1選自H、d.8烷基、-Z-Q-Z、垸基-N(R2)(R4)、烷基-OR3、3-到8-元碳環(huán)或者雜環(huán)，芳基，雜芳基，和d-4芳烷基；每次出現(xiàn)的R"和R"均是獨立選自H、dv烷基、Cm芳院基、芳基、雜芳基、?；⑼榛酋：头蓟酋?，如果W和R"在相同氮上并且f和R"之一是酰基、烷基磺酰或者芳基磺酰時，另一個選自H、Q—8烷基、芳基、Ci-4芳烷基，芳基禾口雜芳基；RS選自H、dV烷基、d-4芳垸基、芳基和雜芳基；RS代表在其相連的環(huán)上的0-4個取代基。W是或者Q選自0和NR2;禾口每次出現(xiàn)的Z獨立地選自Cw烷基、^.6烯基和C2—6炔基。85.具有式III結(jié)構(gòu)的化合物或者其藥學(xué)可接受的鹽，w阿其中Ar是取代的苯基；R'選自H、-d.8烷基、-Z-Q-Z、-d.8烷基-N(R2)(R4)、-Q.8烷基-OR3、3-到8-元碳環(huán)或者雜環(huán)，芳基，雜芳基，和Cm芳蹤基；每次出現(xiàn)的W和R"均是獨立選自H、Cm院基、Cm芳院基、芳基、雜芳基、?；?、烷基磺酰和芳基磺酰，如果^和R"在相同氮并且^和W之一是?；③酋；蛘叻蓟酋r，另一個選自H、d.8烷基、芳基、C"4芳烷基，禾口雜芳基；RS選自H、Cm院基、d-4芳烷基、芳基和雜芳基；RS代表在其相鄰的環(huán)上的0-4個取代基。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>Q選自O(shè)和NR2;禾口每次出現(xiàn)的Z獨立地選自Cl6院基、C2V烯基和C2-6炔基。86.具有式IV結(jié)構(gòu)的化合物或者其藥學(xué)可接受的鹽，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>其中Ar是取代的苯基；W是-d—8垸基；每次出現(xiàn)的W和W均是獨立選自H和d.s烷基;RM戈表在其相連的環(huán)上的0-4個取代基。W選自，或者Q選自0和NR287.具有式V結(jié)構(gòu)的化合物或者其藥學(xué)可接受的鹽,R4、R2(V)其中W選自H和-d.s垸基；R2選自H和-d.s垸基;113選自鹵素、垸氧基和-Q—8烷基；W選自H、鹵素、垸氧基和-Q.s垸基；rs選自H、卣素和硝基；和n是1或者2。88.—種殺傷細胞，促進細胞死亡或者抑制細胞增殖的方法，包括對細胞給藥有效量的具有式I結(jié)構(gòu)的化合物或者其藥學(xué)可接受的鹽，R/選自H、-Z-Q-Z、-d.8垸基-N(R2)(R4)、-(21_8烷基-0113、3-到8-元碳環(huán)或者雜環(huán)，芳基，雜芳基和cm芳垸基；每次出現(xiàn)的R3和R"均是獨立選自H、Cm院基、Cm芳院基、芳基、雜芳基、?；⑼榛酋：头蓟酋?，如果W和R"在相同氮原子和不同時是氫時，它們是不同的，而當(dāng)W和R"在相同氮上并且R2和R"之一是?；⑼榛酋；蛘叻蓟酋r，另一個選自H、C^垸基、芳基、Cm芳院基，和雜芳基；W選自H、Cm焼基、CM芳烷基、芳基和雜芳基；Q選自0禾tlNR2;禾口每次出現(xiàn)的Z獨立地選自Qv烷基、(:2-6烯基和C2.6炔基。其中:w選自89.—種殺傷細胞，促進細胞死亡或者抑制細胞增殖的方法，包括對細胞給藥有效量的具有式II結(jié)構(gòu)的化合物或者其藥學(xué)可接受的鹽，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>(II)其中Ar是取代的苯基；W選自H、-d.8烷基、-Z-Q-Z、-d.8烷基-N(R2)(R4)、-d.8垸基-OR3、3-到8-元碳環(huán)或者雜環(huán)，芳基，雜芳基，和Cm芳院基；每次出現(xiàn)的W和W均是獨立選自H、d-4烷基、Cm芳院基、芳基、雜芳基、?；③酋：头蓟酋?，如果W和R"在相同氮上并且^和114之一是酰基、烷基磺?；蛘叻蓟酋r，另一個選自H、CV8烷基、芳基、Cm芳院基，芳基和雜芳基；W選自H、Cm院基、Cm芳焼基、芳基和雜芳基；RS代表在其相連的環(huán)上的0-4個取代基。w是<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>或者<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>Q選自0和NR2;和每次出現(xiàn)的Z獨立地選自Cl6院基、(:2.6烯基和Cw炔基。90.—種殺傷細胞，促進細胞死亡或者抑制細胞增殖的方法，包括對細胞給藥有效量的具有式III結(jié)構(gòu)的化合物或者其藥學(xué)可接受的W其中(ni)Ar是取代的苯基；W選自H、-dV烷基、-Z-Q-Z、-C!.8垸基-N(R2)(R4)、-CL8烷基-OR3、3-到8-元碳環(huán)或者雜環(huán)，芳基，雜芳基，和Cm芳院基；每次出現(xiàn)的W和W均是獨立選自H、Cm院基、d-4芳垸基、芳基、雜芳基、?；?、烷基磺酰和芳基磺酰，如果W和R"在相同氮原子以及它們都是氫或者它們是不同的，而當(dāng)W和R"在相同氮并且R2和R"之一是?；?、垸基磺酰或者芳基磺酰時，另一個選自H、d-s垸基、芳基、Cm芳院基，和雜芳基；W選自H、d—4垸基、d-4芳烷基、芳基和雜芳基；RS代表在其相連的環(huán)上的0-4個取代基。W選自Q選自0和NR2;每次出現(xiàn)的z獨立地選自Cl6院基、(:2.6烯基和<:2.6炔基；和其中Ar在喹唑啉酮環(huán)上氮鍵鄰位的位置沒有乙氧基取代基。91.一種殺傷細胞，促進細胞死亡或者抑制細胞增殖的方法，包括對細胞給藥有效量的具有式IV結(jié)構(gòu)的化合物或者其藥學(xué)可接受的鹽，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>其中Ar是取代的苯基；R1是-C"8院基；每次出現(xiàn)的R2和R4均是獨立選自H和Cw烷基;RS代表在其相連的環(huán)上的0-4個取代基。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>W選自Q選自O(shè)和NR2。92.—種殺傷細胞，促進細胞死亡或者抑制細胞增殖的方法，包括對細胞給藥有效量的具有式V結(jié)構(gòu)的化合物或者其藥學(xué)可接受的鹽，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula>其中R1選自H和-C1-8烷基；R2選自H和-C1-8垸基；R3選自鹵素、烷氧基和-C1-8烷基；R4選自H、鹵素、垸氧基和-C1-8烷基；R5選自H、卣素和硝基;和n是l或者2。93.—種增加腫瘤細胞或者正常細胞對化療劑敏感性的方法，包括將所述細胞與權(quán)利要求46，84，85，86或者87所述的化合物接觸。94.一種在哺乳動物中治療癌癥的方法，包括對哺乳動物給藥治療有效量的權(quán)利要求46，S4，85，86或者87所述的化合物或者其藥學(xué)可接受的鹽。95.—種殺傷細胞，促進細胞死亡或者抑制細胞增殖的方法，包括對細胞給藥(1)有效量的權(quán)利要求85，85，86或者87所述的化合物或者其藥學(xué)可接受的鹽，和(2)增加細胞中VDAC豐度的試劑。96.—種殺傷細胞，促進細胞死亡或者抑制細胞增殖的方法，包括對細胞給藥-(1)有效量的權(quán)利要求85，85，86或者87所述的化合物或者其藥學(xué)可接受的鹽，和(2)降低細胞中VDAC豐度的試劑。其中，HNR2相當(dāng)于HW。Ar是取代的苯基；W選自H、-d.8烷基、-Z-Q-Z、-d.8烷基-N(R2)(R4)、-d.8烷基-OR3、3-到8-元碳環(huán)或者雜環(huán)，芳基，雜芳基，和CL4芳烷基；每次出現(xiàn)的f和W均是獨立選自H、Cm院基、Cm芳院基、芳基、雜芳基、?；③酋：头蓟酋?，如果W和R"在相同氮上時，它們或者都是氫或者是不同的，以及當(dāng)112或114在相同氮上時，并且RZ和W之一是酰基、烷基磺酰或者芳基磺酰時，另一個選自H、d.8烷基、芳基、C"4芳烷基，禾口雜芳基；W選自H、Cw烷基、CM芳烷基、芳基和雜芳基；RS代表在其相連的環(huán)上的0-4個取代基。97.—種制備式F代表的化合物的方法<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>每次出現(xiàn)的Z獨立地選自Q—6烷基、(:2.6烯基和C2.6炔基。全文摘要本發(fā)明涉及篩選結(jié)合伴侶的方法，尤其是erastin(例如VDACs，諸如VDAC3)生物活性必需的結(jié)合伴侶。本發(fā)明還提供利用erastin和相關(guān)化合物或者衍生物，例如化合物(I)有效殺傷癌細胞的試劑和方法。文檔編號C07D239/90GK101218211SQ200680009733公開日2008年7月9日申請日期2006年1月25日優(yōu)先權(quán)日2005年1月25日發(fā)明者保羅·B·羅賓斯,基思·西門斯,尤金·陣,布倫特·R·斯托克韋爾,拉杰·葛佩爾·文卡特,約翰·M·佩爾特,羅伯特·R·貝克林,羅伯特·塞利亞,蘇迪爾·R·薩哈斯拉布德,莫里茨·馮雷興貝格,辛迪·盧·徹帕諾斯克,齊龍武申請人:普羅歷克西醫(yī)藥品公司;懷特黑德生物醫(yī)學(xué)研究所;哥倫比亞大學(xué)(紐約)理事會