專利名稱：：抗體的改良方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及通過(guò)人抗體分子的氨基酸置換進(jìn)行分子修飾，以改善表達(dá)量或穩(wěn)定性等性狀的技術(shù)。該技術(shù)對(duì)于在推進(jìn)使用抗體的研究或開(kāi)發(fā)上的大障礙一一生產(chǎn)量低、使用時(shí)發(fā)生凝聚或改性、失活等，有望成為使它們得到改善的方法。
背景技術(shù)：
：抗體藥物是以人所具有的機(jī)體防御機(jī)能為基礎(chǔ)，以特定的功能性分子作為靶的分子靶向治療藥。受到人們很大的關(guān)注，特別是在癌癥領(lǐng)域和類風(fēng)濕領(lǐng)域中顯示很高的有效性，其有力推動(dòng)了近年來(lái)的世界性開(kāi)發(fā)熱潮，世界市場(chǎng)規(guī)模持續(xù)擴(kuò)大。伴隨著這樣的社會(huì)背景，在抗體藥物或抗體工程領(lǐng)域中取得了顯著的技術(shù)進(jìn)步，但是所獲得的抗體分子的克隆常常是由于生產(chǎn)量低或穩(wěn)定性低等，常常是應(yīng)用上非常麻煩，解決上述問(wèn)題并不容易。上述問(wèn)題在推進(jìn)使用抗體進(jìn)行的研究或開(kāi)發(fā)方面遇到的很大的障礙。抗體藥物所遇到的問(wèn)題有成本問(wèn)題。治療時(shí)必須有較大量的抗體，另外在制備設(shè)備等方面也發(fā)生較大投資，不僅患者負(fù)擔(dān)加重，也使國(guó)家醫(yī)療費(fèi)用增加。因此，在抗體藥物的開(kāi)發(fā)中，實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)率的提高、降低成本成為大的課題。生物體內(nèi)的抗體的序列是由于伴隨B細(xì)胞成熟而發(fā)生的隨機(jī)的基因重組或突變而產(chǎn)生，并選擇其中具有最佳的抗體序列的B細(xì)胞進(jìn)行增殖。其最佳化主要與抗原結(jié)合能力有關(guān)，除此之外還是結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性、H鏈和L鏈的相互作用、可變區(qū)和恒定區(qū)的相互作用、蛋白酶的壽丈感性、以及細(xì)胞的分泌效率等多種因素復(fù)雜作用的結(jié)果。因此，天然的抗體序列其穩(wěn)定性未必是最佳。以分離的抗體克隆作為重組蛋白，使其表達(dá)并對(duì)其進(jìn)行分析，也往往是非常不穩(wěn)定的狀態(tài)。結(jié)果必須面對(duì)下述問(wèn)題(l)表達(dá)量非常低、(2)不是可溶性地表達(dá)，而是形成內(nèi)含體，必須進(jìn)行重折疊；(3)純化時(shí)暴露在酸中，容易引起變性；或者(4)在室溫或4。C下通過(guò)靜置就會(huì)發(fā)生沉淀或改性，反應(yīng)性消失。作為解決上述問(wèn)題的對(duì)應(yīng)方法，目的之一是對(duì)每一種抗體克隆分別進(jìn)行操作條件或緩沖液等最佳條件的探討。但是，該探討不僅需要很多的勞力和成本，有時(shí)也可能無(wú)法解決，只好放棄對(duì)有希望的具有反應(yīng)性的抗體克隆進(jìn)行的分析或開(kāi)發(fā)。目的之二是如改良抗體，進(jìn)行氨基酸置換或分子轉(zhuǎn)化等分子修飾。通常，為了提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性而進(jìn)行的修飾的方法有以下從具有同源性的其它序列中移植更保守的氨基酸的方法；實(shí)施計(jì)算機(jī)建模，進(jìn)行合理設(shè)計(jì)，使分子表面的親水性提高，或者使疏水性芯的內(nèi)部的疏水性提高、增加堆積強(qiáng)度等方法(非專利文獻(xiàn)l)。關(guān)于通過(guò)抗體分子的氨基酸置換提高穩(wěn)定性或提高表達(dá)量，目前的報(bào)告例中有很多是對(duì)每種抗體克隆的序列進(jìn)行特征性的氨基酸修飾，可常規(guī)化進(jìn)行的修飾技術(shù)的例子尚未出現(xiàn)?？赡茏鳛槌Ｒ?guī)化的修飾技術(shù)有Worn等人的報(bào)道對(duì)VH進(jìn)行1或2處的氨基酸置換，由此提高單鏈抗體(scFv)的穩(wěn)定性(非專利文獻(xiàn)2);Knappik等人的報(bào)道對(duì)VH進(jìn)行1或多處氨基酸置換，使Fv片段的表達(dá)量提高，抑制凝聚反應(yīng)(非專利文獻(xiàn)3);Steipe等人的報(bào)道對(duì)VL進(jìn)行1或2處的氨基酸置換，提高VL結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性(非專利文獻(xiàn)4);Hugo等人的報(bào)道修飾VL的34位(按照Kabatnumbermg體系)，從而提高scFv的穩(wěn)定性和表達(dá)量(非專利文獻(xiàn)5),其中作為修飾對(duì)象的抗體都是小鼠抗體。關(guān)于抗體藥物，如果使用小鼠抗體，由于其高免疫原性，在給予人時(shí)被識(shí)別為雜質(zhì)并排除。因此，難以將它們作為疾病的治療藥物使用。作為解決該問(wèn)題的方法，可以使用蛋白質(zhì)工程學(xué)的方法，將小鼠單克隆抗體進(jìn)行嵌合化，但是，來(lái)自小鼠的序列占三成或以上，因此如果反復(fù)給予或長(zhǎng)期給予，產(chǎn)生抑制所給予的嵌合抗體活性的抗體，不但其效果顯著減弱，并且可能導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用。因此，目前的主流思路是通過(guò)構(gòu)建將小鼠可變區(qū)的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)移植到人可變區(qū)的人源化抗體、或者具有完全來(lái)自人的序列的人抗體來(lái)解決上述問(wèn)題。Ewert等人報(bào)道以人抗體為對(duì)象，對(duì)VH進(jìn)行1或多處氨基酸置換，可以使scFv的穩(wěn)定性和表達(dá)量提高(非專利文獻(xiàn)6)。但是，其中作為修飾對(duì)象的是VH6家族，屬于該家族的基因的使用頻率不過(guò)1.4-2.4%(非專利文獻(xiàn)7),因此難以說(shuō)這是可廣泛采用的技術(shù)。如上所述，以疾病相關(guān)抗原作為靶的特異性抗體在人的診斷或治療等臨床中非常有效，因此人們普遍希望能夠確立同時(shí)具有高抗原特異性、低免疫原性、以及高生產(chǎn)率的特征的抗體的制備技術(shù)。非專利文獻(xiàn)l:Vnend等人，J.Comput.AidedMol.Des.,7(4),367-396頁(yè)(1993)Worn等人，Biochemistry,37,13120畫(huà)13127頁(yè)(1998)Knappik等人，ProteinEng.,8(1),81-89頁(yè)(1995)Steipe等人,J.Mol.Biol.,240,188-192頁(yè)(1994)Hugo等人，ProteinEng.,16(5),381畫(huà)386頁(yè)(2003)Ewert等人，Biochemistry,42，1517-1528頁(yè)(2003)Brezinschek等人，J.Clin.Invest.,99(10),2488-2501非專利文獻(xiàn)2非專利文獻(xiàn)3非專利文獻(xiàn)4非專利文獻(xiàn)5非專利文獻(xiàn)6非專利文獻(xiàn)7頁(yè)(1997)
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于建立以對(duì)人的免疫原性低的人抗體或人源化抗體作為對(duì)象，用于獲得可保持低免疫原性和特異結(jié)合性、同時(shí)具有高生產(chǎn)率和優(yōu)異的穩(wěn)定'性的抗體的常規(guī)改良方法。針對(duì)上述情況，本發(fā)明人進(jìn)行了深入的研究，結(jié)果成功地發(fā)現(xiàn)通過(guò)將人抗體的可變區(qū)輕鏈(VL鏈)的氨基酸用其它氨基酸序列置換，可以顯著提高抗體的表達(dá)性或穩(wěn)定性，從而完成了本發(fā)明。更具體地說(shuō)，本發(fā)明的特征在于將人抗體的可變區(qū)輕鏈(以下稱為VL鏈)的8位、12位、15位或18位(按照Kabatnumbermg)的至少其中一個(gè)氨基酸置換為除脯氨酸或半胱氨酸之外的其它氨基酸。即，本發(fā)明包含下述1)-18)的發(fā)明。1)改良人抗體或人源化抗體以得到表達(dá)量和/或穩(wěn)定性提高的抗體VL鏈)的8;立、U位、15位或18位(;安照2abatnumbLing)的至少;中二個(gè)氨基酸置換為除脯氨酸或半胱氨酸之外的其它氨基酸。2)上述l)的方法，其特征在于將位于VL鏈的8位、12位、15位或18位的至少一個(gè)脯氨酸、或15位的氨基酸置換為除脯氨酸或半胱氨酸之外的其它氨基酸。3)上述1)或2)的方法，其中，置換后的各位的氨基酸分別選自下述的任意一種氨基酸8位Gly、Thr、Arg或Ser12位:Ser、His、Val、Gly、Leu、Arg、Phe、Met或Glu15位:Arg、Ser、Gly或Phe18位:Arg、Ser、Phe、Ala、Trp、Leu或Gln4)上述l)-3)中任一項(xiàng)的方法，其中，該VL鏈屬于人VKl家族、人Vk2家族或人Vk3家族的其中之一。5)上述l)-4)中任一項(xiàng)的方法，其中，屬于人Vid家族的VL鏈在置換后的各位氨基酸分別選自下述任意一種氨基酸。8位:Gly、Thr、Arg或Ser15位Arg或Ser6)上述5)的方法，其中，該屬于人Vid家族的VL鏈在置換前的FRl具有來(lái)自DPK9(GenBank檢索號(hào)No.X59315)的序列。7)上述5)或6)中任一項(xiàng)的方法，其中，置換后的屬于人Vk1家族的VL鏈的FR1是選自SEQIDNo.2-7中的氨基酸序列的氨基酸序列。8)上述l)-4)中任一項(xiàng)的方法，其中，屬于人VK2家族的VL鏈在置換后的各位氨基酸分別選自下述任意一種氨基酸。12位:Ser、His、Val、Gly、Leu、Arg、Phe、Met或Glu15位Arg18位:Arg、Ser、Phe、Ala、Trp、Leu或Gln9)上述8)的方法，其中，屬于該人VK2家族的VL鏈在置換前的FR1具有來(lái)自DPK18(GenBank檢索號(hào)No.X63403)的序列。10)上述8)或9)中任一項(xiàng)的方法，其中，置換后的屬于人Vk2家族的VL鏈的FR1是選自SEQIDNo.9-25的氨基酸序列的氨基酸序列。11)上述l)-4)中任一項(xiàng)的方法，其中，屬于人VK3家族的VL鏈在置換后的各位氨基酸選自下述任意一種氨基酸。15位Arg、Ser、Gly或Phe12)上述11)的方法，其中，屬于該人VK3家族的VL鏈在置換前的FR1具有來(lái)自DPK22(GenBank檢索號(hào)No.X59315)的序列。13)上述11)或12)中任一項(xiàng)的方法，其中，置換后的屬于人Vk3家族的VL鏈的FR1是選自SEQIDNo.27-30的氨基酸序列的氨基酸序列。14)上述1)-13)中任一項(xiàng)的方法，其中，該抗體是完全抗體、或者Fab、Fab，、F(ab，)2、scAb、scFv、雙抗體[含有由短連4妻肽連接的同種或不同種可變區(qū)域重鏈(VH鏈)和VL鏈的重組二聚體抗體]或scFv-Fc的抗體片段、或者它們與其它蛋白的融合抗體或融合抗體片段、結(jié)合有低分子標(biāo)記物的抗體或抗體片段、被高分子修飾物修飾的抗體或抗體片革殳。15)上述1)-14)中任一項(xiàng)的方法，該方法是通過(guò)基因重組技術(shù)進(jìn)行氨基酸置換。16)人抗體或人源化抗體、或者人抗體片段或人源化抗體片l殳，它們由上述1)-14)中任一項(xiàng)的方法得到，表達(dá)量和/或穩(wěn)定性提高。17)人抗體或人源化抗體、或者人抗體片段或人源化抗體片段的制備方法，該方法是將人抗體或人源化抗體、或者人抗體片段或人源化抗體片段的可變區(qū)輕鏈(以下稱為VL鏈)的8位、12位、15位或18位(按照Kabatnumbering)的至少一個(gè)氨基酸用除脯氨酸或半胱氨酸之外的其它氨基酸置換，得到表達(dá)量和/或穩(wěn)定性提高的抗體的方法，該方法包含以下步驟制備編碼含有置換后的VL鏈的氨基酸序列的該人抗體或人源化抗體、或者人抗體片段或人源化抗體片段的氨基酸序列的基因，將該基因轉(zhuǎn)化真核系統(tǒng)或原核系統(tǒng)生物的宿主，使該人抗體或人源化抗體、或者人抗體片段或人源化抗體片段在該宿主中表達(dá)，接著回收該人抗體或人源化抗體、或者人抗體片段或人源化抗體片段。18)人抗體或人源化抗體、或者人抗體片段或人源化抗體片段，它們是由上述17)的方法制備的，表達(dá)量和/或穩(wěn)定性提高。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)人抗體分子的氨基酸置換進(jìn)行分子修飾，結(jié)果可以顯著改善抗體的表達(dá)量或穩(wěn)定性等性狀。該技術(shù)對(duì)于在推進(jìn)使用抗體的研究或開(kāi)發(fā)上的大障礙一一生產(chǎn)量低、使用時(shí)發(fā)生凝聚或改性、失活等，有望成為使它們得到改善的方法。架區(qū)的氨基酸作為改變對(duì)象，因此可廣泛地應(yīng)用于作為診斷藥或治療藥的抗體藥物的開(kāi)發(fā)。另外，只改變一個(gè)氨基酸，因此可以將給予人時(shí)抗原性誘發(fā)的問(wèn)題抑制在最低限度。已經(jīng)有報(bào)道指出通過(guò)分子修飾提高熱穩(wěn)定性，這可以提高對(duì)體內(nèi)癌組織的打靶(WiUuda等人，CancerRes.，59，5788-5767頁(yè)(1999)),穩(wěn)定性的提高也有望與藥效的提高相聯(lián)系。這樣，本發(fā)明的抗體改良方法有望對(duì)抗體醫(yī)療的發(fā)展帶來(lái)很大貢獻(xiàn)。并且，抗體的應(yīng)用范圍并不限于醫(yī)療領(lǐng)域，也涉及^艮多領(lǐng)域，因此，本發(fā)明還有望在相關(guān)的研究或產(chǎn)業(yè)發(fā)展等廣泛區(qū)域內(nèi)適用。因此，由本發(fā)明的改良方法得到的人抗體或人源化抗體、或者人抗體或人源化抗體片段的表達(dá)量和/或穩(wěn)定性優(yōu)異，具有使純化階段由于活性消失或凝聚物的生成等導(dǎo)致的損失降低的效果，在抗體生產(chǎn)或純化階段也可以提供其有用性。并且，本發(fā)明的改良方法可以提供穩(wěn)定性優(yōu)異的人抗體分子或人源化抗體分子，這自不待言，由此，在制劑設(shè)計(jì)方面可提供較多的選擇肢，在制劑化方面可提供很大的優(yōu)越性。附圖簡(jiǎn)述圖l是表示Fab的表達(dá)中使用的質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖。圖2是對(duì)于SEB3-2-7野生型和L鏈8位突變體的周質(zhì)組分，通過(guò)ELISA對(duì)具有功能的Fab蛋白的表達(dá)量進(jìn)行比較的圖。圖3是對(duì)于Seb3-2-7野生型和L鏈8位突變體，通過(guò)ELISA對(duì)在42。C下處理時(shí)的熱穩(wěn)定性進(jìn)行比較的圖。圖4是對(duì)于Seb3-2-7野生型和L鏈8位突變體，通過(guò)ELISA對(duì)在pH4.5下處理時(shí)的酸耐性進(jìn)行比較的圖。圖5是對(duì)于RNOK203野生型和L鏈12位突變體的培養(yǎng)上清組分，通過(guò)ELISA對(duì)作為具有功能的Fab蛋白質(zhì)的表達(dá)量進(jìn)行比較的圖。圖6是對(duì)于RNOK203野生型和L鏈12位突變體，通過(guò)ELISA對(duì)40。C下處理時(shí)的熱穩(wěn)定性進(jìn)行比較的圖。圖7是對(duì)于RNOK203野生型和L鏈12位突變體，通過(guò)ELISA對(duì)在pH4.0下處理時(shí)的酸耐性進(jìn)行比較的圖。圖8是對(duì)于RNOK203野生型和L鏈12位突變體，通過(guò)ELISA對(duì)凍融耐性進(jìn)行比較的圖。圖9是對(duì)于CTLA4-3-l的野生型和L鏈15位突變體的周質(zhì)組分，通過(guò)ELISA對(duì)具有功能的Fab蛋白質(zhì)的表達(dá)量進(jìn)行比較的圖。圖10是表示在Fd鏈的C末端插入編碼Etag的合成低聚DNA得到的CTLA4-3-lFab野生型和P15R突變體的表達(dá)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖。圖(a)表示野生型，圖(b)表示P"R突變體的表達(dá)質(zhì)粒。圖11是對(duì)構(gòu)成CTLA4-3-lFab-E的野生型和P15R突變體的Fd鏈和L鏈，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析進(jìn)行培養(yǎng)上清組分和周質(zhì)組分的表達(dá)量的比較圖。圖(a)是通過(guò)HRP標(biāo)記抗-EtagAb檢測(cè)Fd鏈時(shí)的情況，圖(b)表示通過(guò)HRP標(biāo)記抗-c-myctagAb沖全測(cè)L鏈時(shí)的情況。泳道l:標(biāo)記、泳道2:CTLA4-3-lFab-E的野生型培養(yǎng)上清組分，泳道3:CTLA4-3-lFab-E的P15R突變體培養(yǎng)上清組分，泳道4:CTLA4-3-lFab-E野生型周質(zhì)組分，泳道5:CTLA4-3-lFab-E的P15R突變體的周質(zhì)組分。圖12是對(duì)CTLA4-3-lFab-E的野生型和P15R的突變體的培養(yǎng)上清組分和周質(zhì)組分，通過(guò)夾層ELISA進(jìn)行Fd鏈和L鏈復(fù)合物表達(dá)量的比較圖。圖(a)表示培養(yǎng)上清組分，圖(b)表示周質(zhì)組分。圖13是對(duì)于CTLA4-3-l的野生型和L鏈15位突變體，通過(guò)ELISA對(duì)在28。C下處理時(shí)的熱穩(wěn)定性進(jìn)行比較的圖。圖14是對(duì)CTLA4-3-l的野生型和L鏈15位突變體，通過(guò)ELISA進(jìn)行酸耐性比較的圖。圖(a)是表示用pH4.0進(jìn)行處理時(shí)的情況，圖(b)表示用pH3.5處理時(shí)的情況。圖15是對(duì)于RNOK203野生型和L鏈15位突變體的培養(yǎng)上清組分，通過(guò)ELISA對(duì)具有功能的Fab蛋白質(zhì)的表達(dá)量進(jìn)行比較的圖。圖16是對(duì)于RNOK203野生型和L鏈15位突變體，通過(guò)ELISA對(duì)用pH5.0處理時(shí)的酸耐性進(jìn)行比較的圖。圖17是對(duì)SEB3-2-7的野生型和L鏈15位突變體，通過(guò)ELISA對(duì)42。C下處理時(shí)的熱穩(wěn)定性進(jìn)行比較的圖。圖18是對(duì)SEB3-2-7的野生型和L鏈15位突變體，通過(guò)ELISA對(duì)酸耐性進(jìn)行比較的圖。圖(a)是表示用pH《5處理時(shí)的情況，圖(b)表示用pH4.0處理時(shí)的情況。圖19是對(duì)RNOK203的野生型和L鏈18位突變體，通過(guò)ELISA對(duì)45°C下處理時(shí)的熱穩(wěn)定性進(jìn)行比較的圖。圖20是對(duì)RNOK203的野生型和L鏈18位突變體，通過(guò)ELISA對(duì)pH4.0處理時(shí)的酸耐性進(jìn)行比較的圖。圖21是對(duì)RNOK203的野生型和L鏈18位的突變體，通過(guò)ELISA對(duì)凍融耐性進(jìn)行比較的圖。實(shí)施發(fā)明的最佳方式要進(jìn)行修飾的人抗體的VL鏈有X鏈或k鏈，小鼠的L鏈中，97。/。是k鏈(免疫學(xué)辭典第二版、2001年、東京化學(xué)同人)，在人源化技術(shù)中幾乎都是使用人vk作為模板序列，并且人的L鏈中，k鏈占670/。，為多數(shù)(Knappik等人、J.Mol.Biol.,296,57-86(2000)),因此優(yōu)選使用k鏈。并且，已知人Vk有Vk1-Vk6的家族，Vk1、Vk2和Vk3的使用頻率合計(jì)為92%，覆蓋了人vk的大部分(Foster等人、J.Clin.Invest,99(7),1614-1627頁(yè)(1997))，因此更優(yōu)選使用Vid-VK3三種的其中之一。作為抗體修飾的策略，是以氨基酸殘基——脯氨酸(Pro;P)作為置換對(duì)象，進(jìn)行氨基酸置換的研究。該脯氨酸位于對(duì)保持人源化抗體VL鏈的立體結(jié)構(gòu)最為重要的構(gòu)架區(qū)(FR)1的區(qū)、是在折疊的定速時(shí)或破壞a螺旋或(3片層結(jié)構(gòu)時(shí)已知的氨基酸殘基。具體來(lái)說(shuō)，是以人抗體或人源化抗體的VL鏈的8位、12位、15位或18位的至少一個(gè)氨基酸作為修飾對(duì)象。本說(shuō)明書(shū)中，抗體VL鏈中氨基酸殘基位置的確定是按照Kabat的numberingscheme進(jìn)行(Kabat,E.A.等、SequencesofProteinsofImmunologicalInterest、第5版、NIHPublicationNo.91-3242、1991)。目前為止的報(bào)告例子中，關(guān)于修飾的方法如上所述，幾乎都是通過(guò)合理設(shè)計(jì)的思路。對(duì)于移植可更高度保守的氨基酸的方法，如上所述，自然界選擇的抗體序列是抗原結(jié)合能力、結(jié)構(gòu)域穩(wěn)定性、H鏈和L鏈的相互作用、可變區(qū)和恒定區(qū)的相互作用、蛋白酶敏感性、細(xì)胞的分泌效率等多種因素復(fù)雜地作用而選擇的，因此未必天然抗體序列就是穩(wěn)定性最佳，該方法是有限度的。另外，關(guān)于利用計(jì)算機(jī)建模的方法，不僅需要很大的勞力，實(shí)際上也不一定使穩(wěn)定性增加，目前很難說(shuō)是有效的思路。本發(fā)明人根據(jù)進(jìn)化工程學(xué)的思路進(jìn)行研究。即，將作為修飾對(duì)象的氨基酸置換成隨機(jī)的氨基酸，從該基團(tuán)中選擇顯示優(yōu)選性狀的突變體。結(jié)果，如以下實(shí)施例所示，可以確認(rèn)，在VL鏈的FR1(l位-23位)上進(jìn)行了下述其中之一的氨基酸置換的抗體顯示表達(dá)量或穩(wěn)定性的改主口。8位:Gly、Thr、Arg或Ser12位Ser、His、Val、Gly、Leu、Arg、Phe、Met或Glu15位Arg、Ser、Gly或Phe18位:Arg、Ser、Phe、Ala、Trp、Leu或Gln這里，要進(jìn)行置換原來(lái)的VL鏈的FR1序列(野生型)的代表性例子有以下氨基酸序列。Vk1(抗SEBfe體SEB3-2-7):DIVMTQSPSSLSASVGDTVTITC(SEQIDNO:1)Vk2(抗FasUt體RNOK203):DWMTQTPLSLPVTLGQPASISC(SEQID冊(cè)8)Vk3(抗CTLA-4^元體CTLA4-3-1):EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC(SEQIDNO:26)更具體地說(shuō)，本發(fā)明中，對(duì)進(jìn)行了下迷所示修飾得到的抗體的表達(dá)量和穩(wěn)定性(耐熱性、耐酸性、凍融耐性等)進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果可確認(rèn)均得到了顯著改善的效果。"-"所示的位置是與野生型(野生型)的氨基酸序列同樣。(1)Vk1野生型DIVMTQSPSSLSASVGDTVTITC(SEQIDNO:1)p8G;------g--------(SEQIDNO:2)P8T:-------T--------(SEQIDNO:3)P8R:-------R-----(SEQIDNO:4)P8S:-------S-------------(SEQIDNO:5)V15R------------R-------(SEQIDNO:6)V15S:-------S--(SEQIDNO:7)(2)vk2野生型dwmtqtplslpvtlgqpasisc(seqidno:8)p12s:---------s----------(SEQIDNO:9)p12h:----------h----------(SEQIDNO:10)p12v:--------v---------(SEQIDNO:11)p12g:---------G--------(SEQIDNO:12)p12l:---------l----------(SEQIDNO:13)p12r:-----------r-----------(SEQIDNO:14)p12f:(SEQIDNO:15)p12m:WHV■■1,,畫(huà)—.....—^^^^■■一^^(SEQIDNO:16)p12e:---------e--------(SEQIDNO:17)u5r:-----------------r-------(SEQIDNO:18)p18r:--------r-----(SEQIDNO:19)p18s:---------------------s——(SEQIDNO:20)p18f:---------F——(SEQIDNO:21)p18a:-----------------a-----(SEQIDNO:22)p18w:------w----(SEQIDNO:23)p18l:---------------l——(SEQIDNO:24)p18q:-----------------q——(SEQIDNO:25)(3)vk3野生型eivltqspgtlslspgeratlsc(SEQIDNO:26)p15r;-------------R-------(SEQIDNO:27)p15s:-------------s-------(SEQIDNO:28)p15g:(SEQIDNO:29)p15f_——fT——(SEQIDNO:30)關(guān)于這些修飾，來(lái)自人的抗體從未言及，即使來(lái)自其它動(dòng)物種類的抗體在目前的報(bào)告例或先有專利中也均未實(shí)施，本申請(qǐng)的報(bào)告是初次的探討例。特別是L鏈15位被置換為Arg(R)的突變體(P15R)中，功能性分子的表達(dá)量增加至約100倍，顯示了極強(qiáng)烈的效果。只是Fab的一個(gè)氨基酸的置換就顯示了這樣大的效果，目前尚未有這樣例子的報(bào)導(dǎo)。另外，通過(guò)將L鏈15位置換為Arg或Ser來(lái)提高表達(dá)量或穩(wěn)定性的修飾技術(shù)至少適用于Vk1家族、Vk2家族和Vk3家族追用，可以確認(rèn)是通用性高的^支術(shù)。本發(fā)明中的氨基酸置換是使用模型抗體，向VL鏈的8位、12位、15位、或18位導(dǎo)入隨機(jī)氨基酸，分別構(gòu)建突變體文庫(kù)。模型抗體是對(duì)VKl、Vk2和Vk3的各家族分別使用人抗SEB抗體(克隆名SEB3-2-7)、人抗CTLA-4抗體(克隆名CTLA4-3-l)以及人源化抗FasL抗體RNOK。使用將各抗體的VL鏈基因?qū)?yīng)的氨基酸的密碼子用隨機(jī)密碼子NNK(N為A或C或G或T,K為G或T)置換得到的低聚DNA引物，以野生型VL為模板，通過(guò)PCR法擴(kuò)增變異導(dǎo)入型VL鏈。將該擴(kuò)增的變異導(dǎo)入型VL鏈與野生型Fab表達(dá)質(zhì)粒的VL區(qū)置換，從而構(gòu)建了變異型Fab表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化JM83,將所得克隆分離，在96孔孩吏量滴定板中誘導(dǎo)表達(dá)。通過(guò)斑點(diǎn)印跡法對(duì)周質(zhì)組分中表達(dá)Fab進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)確認(rèn)了其表達(dá)的克隆進(jìn)行性狀分析，F(xiàn)ab是在大腸桿菌中可以可溶性地表達(dá)的抗體分子，同時(shí)是可以簡(jiǎn)便地研究其可變區(qū)的性狀的分子。對(duì)于從變異型Fab表達(dá)量的比較中選擇的、與野生型相比被認(rèn)為表達(dá)量高的克隆進(jìn)行DNA堿基序列分析，可以確認(rèn)為一個(gè)氨基酸置換的置換體。再對(duì)該克隆進(jìn)行表達(dá)量、熱穩(wěn)定性、對(duì)酸的耐性、凍融的耐性進(jìn)行評(píng)價(jià)。表達(dá)量例如是通過(guò)搖瓶培養(yǎng)進(jìn)行表達(dá)的誘導(dǎo)，使用回收的培養(yǎng)上清或周質(zhì)組分進(jìn)行ELISA,以所得吸光度表示具有功能的Fab蛋白質(zhì)的量，在克隆之間進(jìn)行比較、評(píng)價(jià)。熱穩(wěn)定性例如可如下進(jìn)行評(píng)價(jià)將表達(dá)Fab的培養(yǎng)上清或周質(zhì)組分進(jìn)行稀釋，在規(guī)定溫度的水浴下進(jìn)行2小時(shí)處理，然后回復(fù)至室溫，進(jìn)行ELISA,以所得吸光度的與未處理樣品的吸光度的比例作為殘留活性，在克隆之間進(jìn)行比較。對(duì)酸的耐性例如可如下進(jìn)行評(píng)價(jià)將表達(dá)Fab的培養(yǎng)上清或周質(zhì)組分稀釋，調(diào)節(jié)成規(guī)定的pH,靜置2小時(shí)，然后中和，進(jìn)行ELISA,以所得的吸光度與未處理樣品的吸光度的比例作為殘留活性，在克隆之間進(jìn)行比較。凍融耐性例如可如下進(jìn)行評(píng)價(jià)對(duì)于表達(dá)Fab的培養(yǎng)上清或周質(zhì)組分，重復(fù)規(guī)定次數(shù)進(jìn)行凍融，制成樣品，進(jìn)行ELISA,以進(jìn)行了多次的樣品的吸光度與進(jìn)行了l次的樣品吸光度的比例作為殘留活性，在克隆之間進(jìn)行比較。由這些修飾評(píng)價(jià)的結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過(guò)施加以上詳述的修飾，可以改善抗體的性狀。本發(fā)明中，制備的改變抗體不僅是完全抗體，也可以以Fab、Fab，、F(ab，)2、scAb、scFv、雙抗體或scFv-Fc等抗體片段的形式使用。這些抗體或抗體片段還可以是與其它蛋白質(zhì)或肽融合的融合抗體。這些表達(dá)抗體可以標(biāo)記各種藥物或放射性元素等使用，還可以用聚乙二醇等合成高分子進(jìn)行修飾。通過(guò)本發(fā)明而改善的抗體或抗體片段可以使用基因重組技術(shù)，以編碼該抗體或抗體片段的基因序列信息為基礎(chǔ)，導(dǎo)入到適當(dāng)?shù)乃拗?例如細(xì)菌、枯草桿菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞等)中，使其表達(dá)來(lái)制備。本說(shuō)明書(shū)中，"人源化抗體"是指在人抗體中，只有可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)是來(lái)自小鼠等非人動(dòng)物抗體，CDR以外的可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)(FR)和恒定區(qū)均來(lái)自人抗體。以下，根據(jù)實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受此任何限定。實(shí)施例《實(shí)施例1:大腸桿菌菌抹和DNA》(1)大腸桿菌菌抹使用JM83菌林(Gene,33,103-119頁(yè)(1995))。(2)質(zhì)粒質(zhì)粒pTrc99A-Fab-myc在trc啟動(dòng)子的控制下編碼各Fab克隆。為了使其在大腸桿菌中表達(dá)以及順利地進(jìn)行折疊，將CHl和CK區(qū)C末端的Cys殘基置換為Ser,形成兩鏈之間的二硫鍵缺損的分子型。為了容易地檢測(cè)，在L鏈的C末端附加c-myctag。為了使其分泌到周質(zhì)和培養(yǎng)上清中，將pe舊序列信號(hào)(Lei等人、J.Bacteriol.,169，4379-4383頁(yè)(1987))插入到兩條鏈的編碼區(qū)前方(圖l)。(3)低聚DNA《實(shí)施例2:抗體克隆》(1)抗SEB抗體SEB3-2-7以來(lái)自20名健康人的末梢血的淋巴細(xì)胞作為起始材料，構(gòu)建scFv噬菌體展示文庫(kù)，通過(guò)使用重組SEB蛋白質(zhì)的淘選法，由該文庫(kù)分離SEB,所述抗SEB抗體SEB3-2-7是特異性識(shí)別SEB的人抗體。VH具有來(lái)自屬于VHl家族的DP-75片段的序列，VL具有來(lái)自屬于Vk1家族的DPK9(GenBank檢索號(hào)No.X59315)片段的序列。VL結(jié)構(gòu)域的FR1的氨基酸序列如SEQIDNo.l所示。(2)抗FasL抗體RNOK203是文獻(xiàn)(Nakashima等人、J.Immunol.,167,3266-3275(2001))中報(bào)導(dǎo)的、特異性識(shí)別Fas配體、具有中和能力的人源化抗體。VL具有來(lái)自屬于Vk2家族的DPK18(GenBank檢索號(hào)No.X63403)的片段的序列。VL結(jié)構(gòu)域的FR1的氨基酸的序列如SEQIDNo.8所示。(3)抗CTLA-4抗體CTLA4-3-l以來(lái)自20名健康人的末梢血的淋巴細(xì)胞作為起始材料，構(gòu)建scFv噬菌體展示文庫(kù)，通過(guò)使用重組CTLA-4蛋白質(zhì)的淘選法，由該文庫(kù)分離CTLA-4，所述抗CTLA-4抗體CTLA4-3-1是特異性識(shí)別CTLA-4的人抗體。VH具有來(lái)自屬于VH1家族的DP-25片段的序列，VL具有來(lái)自屬于Vk3家族的DPK22(GenBank檢索號(hào)No.X59315)的片段的序列。VL結(jié)構(gòu)域的FR1氨基酸序列如SEQIDNo.26所示?！秾?shí)施例3:野生型Fab表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建》在上述現(xiàn)有技術(shù)和報(bào)導(dǎo)例中，幾乎都是使用單獨(dú)的VL結(jié)構(gòu)域或scFv,而本發(fā)明是使用Fab進(jìn)行修飾的研究。如果是IgG,則必須是通過(guò)動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)，分析需要時(shí)間和勞力，而如果是片段，則可以通過(guò)細(xì)菌生成，因此研究可以迅速地進(jìn)行。如果是單獨(dú)的結(jié)構(gòu)域或scFv,在將其VH和VL序列重組，變換成IgG分子型時(shí)，常常發(fā)生可能是由于結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致的抗原親和性降低等性狀的變化，如果采用Fab,則已知變換成IgG分子型時(shí)上述變化比較難以發(fā)生。因此，通過(guò)Fab分子型確認(rèn)修飾時(shí)，在變換成IgG分子型時(shí)其效果仍保持的可能性也高?，F(xiàn)有的抗體藥物幾乎都是IgG分子型，因此本發(fā)明的改良技術(shù)與以往的技術(shù)相比，有望對(duì)抗體藥物領(lǐng)域的貢獻(xiàn)度更大。SEB3-2-7和CTLA4-3-l是以scFv表達(dá)質(zhì)粒(載體pCANTAB5E)、RNOK203是以IgG表達(dá)質(zhì)粒(載體；pCAG:Gene108,193-200頁(yè)，1991)作為起始材料，通過(guò)使用PyrobestDNA聚合酶(TAKARA制備)的PCR法擴(kuò)增VH基因和VL基因，將VH基因區(qū)用SfiI、VL基因區(qū)用XhoI和NotI切斷，依次插入到pTrc99A-Fab-myc載體中?！秾?shí)施例4:轉(zhuǎn)化》轉(zhuǎn)化是使用GenePulser(BIO-RAD),通過(guò)電穿孔法進(jìn)行。4吏JM83菌林為感受態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，涂布在含有50)ag/ml氨千青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，在30。C下培養(yǎng)過(guò)夜。將所得克隆進(jìn)行分離、培養(yǎng)，通過(guò)常規(guī)方法制備質(zhì)粒，分析DNA堿基序列。《實(shí)施例5:DNA堿基序列分析》使用CEQDTCSQuickStartKit(BECKMANCOULTER)確定經(jīng)修飾的VL基因的DNA堿基序列。對(duì)所構(gòu)建的表達(dá)抹進(jìn)行DNA堿基序列分析，確認(rèn)其為所設(shè)計(jì)的序列。《實(shí)施例6:修飾型Fab表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建》以野生型Fab表達(dá)質(zhì)粒為模板，使用將突變導(dǎo)入位點(diǎn)的密碼子作為NNK(N為A或C或G或T,K為G或T)的低聚DNA,與上述同樣，通過(guò)PCR法擴(kuò)增VL基因，與野生型Fab表達(dá)質(zhì)粒的VL區(qū)置換。轉(zhuǎn)化JM83，將所得克隆在96孔微量滴定板上誘導(dǎo)其表達(dá)?！秾?shí)施例7:通過(guò)培養(yǎng)板培養(yǎng)誘導(dǎo)Fab的表達(dá)》在加入到96孔板(COSTAR)的含有50^g/ml氨千青霉素的2xYT培養(yǎng)基上接種上述得到的克隆和作為對(duì)照的野生型Fab表達(dá)菌株，在30。C下培養(yǎng)5-6小時(shí)，添加IPTG,使終濃度為lmM,再培養(yǎng)過(guò)夜，資導(dǎo)Fab的表達(dá)。培養(yǎng)結(jié)束后離心回收菌體，懸浮于含有l(wèi)mMEDTA的PBS中，將菌體放置在冰中30分鐘。接著以2,000rpm離心15分鐘，回收上清，制成周質(zhì)組分?！秾?shí)施例8:斑點(diǎn)印跡法》表達(dá)量的分析通過(guò)斑點(diǎn)印跡法進(jìn)行。在0.45pm硝基纖維素濾膜(Millipore)上點(diǎn)樣上面所得到的周質(zhì)組分，用含有2。/。脫脂乳的PBS-0.05吐溫20進(jìn)行封閉，然后用過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記抗-FabAb(CAPPEL)檢測(cè)。對(duì)與野生型相比表達(dá)量可能高的克隆與上述同樣地進(jìn)行DNA堿基序列分析，對(duì)于可以確認(rèn)為一個(gè)氨基酸置換體的克隆進(jìn)行以下評(píng)價(jià)?！秾?shí)施例9:通過(guò)搖瓶培養(yǎng)誘導(dǎo)Fab的表達(dá)》將大腸桿菌懸浮液涂布在含有50昭/ml氨千青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，在3(TC下培養(yǎng)過(guò)夜，然后將單一集落接種在含有50jiig/ml氨千青霉素的2xYT培養(yǎng)基上，在30。C下培養(yǎng)至O.D.600nm=0.5-1.0,添加IPTG,使終濃度為lmM，進(jìn)一步培養(yǎng)過(guò)夜，誘導(dǎo)Fab的表達(dá)。培養(yǎng)結(jié)束后離心菌液，將上清作為培養(yǎng)上清組分。將沉淀的菌體懸浮于含有l(wèi)mMEDTA的PBS中，在冰中將菌體放置30分鐘。接著用8,900xg離心l5分鐘，回收上清，制成周質(zhì)組分?！秾?shí)施例10:通過(guò)ELISA進(jìn)行SEB反應(yīng)性的評(píng)1^介》在4。C下，將表達(dá)并純化的重組SEB以200ng/100jil/孔在ELISA板(Nunc)上固定過(guò)夜，洗滌，在4。C下，用P/。BSA-PBS封閉過(guò)夜。使用SEB3-2-7的野生型/突變體的周質(zhì)組分或培養(yǎng)上清組分，用1%BSA-PBS稀釋，以IOO)al/孔在"。C下反應(yīng)l小時(shí)。檢測(cè)是將生物素化抗-KappaAb(SouthernBiotechnology)和過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記鏈霉親和素(VectorLab.)組合進(jìn)行。用讀板儀Vmax(MolecularDevices)測(cè)定650nm/450nm下的吸光度。《實(shí)施例11:使用SEB3-2-7進(jìn)行的L鏈8位突變體的表達(dá)量的評(píng)價(jià)》對(duì)SEB3-2-7野生型/突變體的周質(zhì)組分進(jìn)行分步稀釋，進(jìn)行ELISA,對(duì)具有功能的Fab蛋白質(zhì)表達(dá)量進(jìn)行比較評(píng)價(jià)。結(jié)果可以確認(rèn)，SEB3-2-7的P8G突變體表達(dá)量提高(圖2)。《實(shí)施例12:使用SEB-2-7進(jìn)行的L鏈8位突變體的熱穩(wěn)定性的評(píng)將SEB3-2-7的野生型/突變體的培養(yǎng)上清組分用P/oBSA-PBS稀釋，制成50pl/管，在42。C的水浴中處理2小時(shí)。然后恢復(fù)至室溫，進(jìn)行ELISA,以所得吸光度相對(duì)于未處理樣品的吸光度的比例作為殘留活性，表示在圖表中。結(jié)果可以確認(rèn)，SEB3-2-7的P8T、P8G、P8R和P8S突變體的熱穩(wěn)定性提高(圖3)《實(shí)施例13:使用SEB3-2-7進(jìn)行的L鏈8位突變體的酸耐性評(píng)價(jià)》將SEB3-2-7野生型/突變體的培養(yǎng)上清組分用P/。BSA-PBS稀釋，制成50pl/管。使用lNHCl和pH計(jì)(HORIBA)調(diào)節(jié)至pH4.5,在25。C下處理2小時(shí)。然后用lMTns-HCl(pH9.5)調(diào)節(jié)至pH7，進(jìn)行ELISA,以所得吸光度相對(duì)于未處理樣品的吸光度的比例作為殘留活性，表示在圖表中。結(jié)果可以確認(rèn)，SEB3-2-7的P8T、P8G、P8R和P8S突變體對(duì)酸的耐性提高(圖4)。《實(shí)施例14:通過(guò)ELISA進(jìn)行的FasL反應(yīng)性的評(píng)價(jià)》對(duì)于FasL，以500ng/100pl/孔將附加了His-tag的市售的重組Fas配體(R&D系統(tǒng))在NI螯合板(Nunc)上、在室溫下固定2小時(shí)。使用RNOK203的野生型/突變體的培養(yǎng)上清組分，用BlockAce(大日本制藥)稀釋，以IOOpl/孔在37。C下反應(yīng)l小時(shí)。檢測(cè)是將生物素化抗-KappaAb(SouthernBiotechnology)和過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記鏈霉親和素(VectorLab.)組合進(jìn)《實(shí)施例15:使用RNOK203進(jìn)行的L鏈12位突變體的表達(dá)量的評(píng)價(jià)》對(duì)RNOK203野生型/突變體的培養(yǎng)上清組分進(jìn)行分步稀釋，進(jìn)行ELISA,對(duì)具有功能的Fab蛋白質(zhì)表達(dá)量進(jìn)行比較評(píng)價(jià)。結(jié)果可以確認(rèn)，RNOKM3突變體表達(dá)量提高(圖5)?！秾?shí)施例16:使用RNOK203進(jìn)行的L鏈12位突變體的熱穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)》將RNOK203的野生型/突變體的培養(yǎng)上清組分用BlockAce稀釋，制成50)il/管，在4(TC的水浴中處理2小時(shí)。然后恢復(fù)至室溫，進(jìn)行ELISA,以所得吸光度相對(duì)于未處理樣品的吸光度的比例作為殘留活性，在突變體之間進(jìn)行比4支。結(jié)果可以確i人，RNOK203的P12S、P12H、P12V、P12G、P12L、P12R、P12F、P12M和P12E突變體的熱穩(wěn)定性提高。代表性的例子如圖表所示(圖6),其余的突變體的各殘留活性與野生型的殘留活性的比率匯總于表l中。[表l]<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>《實(shí)施例17:使用RNOK203進(jìn)行的L鏈12位突變體的酸耐性評(píng)價(jià)》成50(!l/管。用1NHCl和pH計(jì)(HORIBA)調(diào)節(jié)至pH4.0,在25。C下處理2小時(shí)。然后用lMTris-HCl(pH9.5)調(diào)節(jié)至pH7，進(jìn)行ELISA，以所得吸光度相對(duì)于未處理樣品的吸光度的比例作為殘留活性，表示在圖表中。結(jié)果可以確認(rèn)，RNOK203的P12V突變體對(duì)酸的耐性提高(圖7)?！秾?shí)施例18:使用RNOK203進(jìn)行的L鏈12位突變體的凍融耐性評(píng)到的樣品和只進(jìn)行l(wèi)次得到的樣品，進(jìn)行ELISA,以凍融6次的樣品的吸光度相對(duì)于凍融l次的樣品的吸光度的比例作為殘留活性，表示在圖表中。結(jié)果可以確認(rèn)，RNOK203的P12S、P12V、P12G、P12L、P12R和P12F突變體對(duì)凍融的耐性提高(圖8)。《實(shí)施例19:通過(guò)ELISA進(jìn)行的CTLA-4反應(yīng)性的評(píng)價(jià)》對(duì)于CTLA-4，是將市售的重組CTLA-4(R&Dsystems制備)以100ng/100jal/孔在ELISA板(Nunc)上、在室溫下固定l小時(shí)，洗滌后用BlockAce在室溫下封閉1小時(shí)。使用CTLA-4-3-1的野生型/突變體的周質(zhì)組分，用BlockAce稀釋，以100fil/孔在37。C下反應(yīng)1小時(shí)。才企測(cè)是將生物素化抗-KappaAb(SouthernBiotechnology)和過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記鏈霉親和素(VectorLab.)組合進(jìn)行。用讀板儀Vmax(MolecularDevices)測(cè)定650nm/450nm下的吸光度。《實(shí)施例20:使用CTLA4-3-1進(jìn)行的L鏈15位突變體表達(dá)量的評(píng)價(jià)》對(duì)CTLA4-3-l的野生型/突變體的周質(zhì)組分進(jìn)行分步稀釋，進(jìn)行ELISA,對(duì)具有功能的Fab蛋白質(zhì)表達(dá)量進(jìn)行比4交評(píng)〗介。結(jié)果可以確認(rèn)，CTLA4-3-l的P15R、P15S和P15G突變體表達(dá)量提高(圖9)。特別是P15R突變體，可見(jiàn)升高約100倍的劇烈效果，僅通過(guò)一個(gè)氨基酸的置換就使具有功能的Fab蛋白的表達(dá)量升高到如此程度，這樣的例子目前尚未有報(bào)導(dǎo)?！秾?shí)施例21:CTLA4-3-lFab-E野生型/P15R突變體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建》為了進(jìn)一步確認(rèn)在實(shí)施例20中確認(rèn)的P15R突變導(dǎo)致的表達(dá)量的提高，進(jìn)行Fab表達(dá)質(zhì)粒的修飾。向Fd鏈(是指H鏈中由VH至CHl的區(qū))的C末端插入編碼Etag的合成低聚DNA,構(gòu)建CTLA4-3-lFab的野生型/P15R突變體的表達(dá)質(zhì)粒(圖10)。以下，將含有附加了Etag的Fd鏈的Fab稱為Fab-E。使JM83菌林為感受態(tài)，進(jìn)行轉(zhuǎn)化，通過(guò)DNA堿基序列分析確認(rèn)是設(shè)計(jì)的序列。由此，對(duì)于構(gòu)成Fab的Fd鏈和L鏈，F(xiàn)d鏈可利用Etag、L鏈可利用c-myctag進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于構(gòu)建的CTLA4-3-lFab-E野生型/P15R突變體，與實(shí)施例9同樣地通過(guò)搖瓶培養(yǎng)誘導(dǎo)其表達(dá)，回收培養(yǎng)上清組分和周質(zhì)組分?！秾?shí)施例22:通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行CTLA4-3-lFab-E野生型/P15R突變體的表達(dá)量的評(píng)價(jià)》對(duì)于實(shí)施例21所得的培養(yǎng)上清組分和周質(zhì)組分，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行Fd鏈和L鏈的檢測(cè)。Fd鏈通過(guò)HRP標(biāo)記抗畫(huà)EtagAb(AmershamBiosciences),L鏈通過(guò)HRP標(biāo)記抗-c-myctagAb(Roche)檢測(cè)，在野生型中均未檢測(cè)出Fd鏈和L鏈，而在P15R突變體中則幾乎在設(shè)計(jì)的分子量(Fd鏈、L鏈分別約為27kDa和約26kDa)的位置上檢測(cè)出條帶(圖ll)。由該結(jié)果可以確認(rèn)，通過(guò)P15R突變，F(xiàn)d鏈和L鏈的表達(dá)量均提高?！秾?shí)施例23:通過(guò)夾層ELISA進(jìn)行的CTLA4-3-lFab-E野生型/P15R突變體表達(dá)量的評(píng)價(jià)》將Fd鏈和L鏈裝配，為了了解是否正確地形成了Fab的分子形態(tài)，通過(guò)以下的夾層ELISA系統(tǒng)進(jìn)行研究。以200ng/100pl/孔將抗-c-myctagAb9ElO在ELISA板(Nunc)上、在室溫下固定1小時(shí)，洗滌后用1%BSA-PBS在室溫下封閉l小時(shí)。對(duì)各回收組分用1。/。BSA-PBS稀釋，以100pl/孔在37t:下反應(yīng)l小時(shí)。4全測(cè)是通過(guò)HRP標(biāo)記抗-EtagAb進(jìn)行，通過(guò)讀板4義測(cè)定650nm/450nm下的吸光度。結(jié)果可以確認(rèn)，在野生型中未檢測(cè)出，但在P15R突變體中可見(jiàn)濃度相關(guān)性的反應(yīng)，特別是在周質(zhì)組分中，可確認(rèn)P15R突變體有數(shù)十倍高的反應(yīng)(圖12)。由該結(jié)果可以確認(rèn)，通過(guò)P15R突變，F(xiàn)d鏈和L鏈復(fù)合體形式的表達(dá)量大幅提高?！秾?shí)施例24:使用CTLA4-3-l進(jìn)行的L鏈15位突變體的熱穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)》將CTLA4-3-l的野生型/突變體的周質(zhì)組分用BlockAce稀釋，制成50pl/管，在28。C的水浴中處理2小時(shí)。然后恢復(fù)至室溫，進(jìn)行ELISA，以所得吸光度相對(duì)于未處理樣品的吸光度的比例作為殘留活性，表示在圖表中。結(jié)果可以確^人，CTLA4-3-l的P15R、P15S、P15G和P15F突變體的熱穩(wěn)定性提高(圖13)?！秾?shí)施例25:使用CTLA4-3-1進(jìn)行的L鏈15位突變體的酸耐性評(píng)價(jià)》將CTLA4-3-l的野生型/突變體的周質(zhì)組分用BlockAce稀釋，制成50ILil/管。用lNHCl和pH計(jì)(HORIBA)調(diào)節(jié)至pH4.0或pH3.5,在冰上處理2小時(shí)。然后用lMTris-HCl(pH9.5)調(diào)節(jié)至pH7，進(jìn)行ELISA,以所得吸光度相對(duì)于未處理樣品的吸光度的比例作為殘留活性，表示在圖表中。結(jié)果可以確認(rèn)，CTLA4-3-l的P15R、P15S、P15G、P15S突變體對(duì)酸的耐性提高(圖14)。《實(shí)施例26:RNOK203的L鏈15位突變體的構(gòu)建》探討實(shí)施例20至實(shí)施例25所示的將L鏈15位改為Arg或Ser的效果是否可在RNOK203(L鏈15位為L(zhǎng)eu)中出現(xiàn)。以野生型Fab表達(dá)質(zhì)粒作為模板，使用L鏈15位的密碼子為CGT(Arg)和TCT(Ser)的低聚DNA,與上述同樣，通過(guò)PCR法擴(kuò)增VL基因，與野生型Fab表達(dá)質(zhì)粒的VL區(qū)置換。轉(zhuǎn)化JM83，對(duì)于所得克隆進(jìn)行DNA堿基序列分析，確認(rèn)得到了設(shè)計(jì)的序列?！秾?shí)施例27:使用RNOK203進(jìn)行的L鏈15位突變體表達(dá)量的評(píng)價(jià)》ELISA，對(duì)具有功能的Fab蛋白質(zhì)表達(dá)量進(jìn)行比較評(píng)價(jià)。結(jié)果可以確認(rèn)，RN0K^3的L1SR突變體表達(dá)量提高(圖1》?！秾?shí)施例28:使用RNOK203進(jìn)行的L鏈15位突變體的酸耐性評(píng)價(jià)》將RNOK203的野生型/突變體的培養(yǎng)上清組分用BlockAce稀釋，制成50pl/管。用1NHCl和pH計(jì)(HORIBA)調(diào)節(jié)至pH5.0,在25。C處理2小時(shí)。然后用lMTns-HCl(pH9.5)調(diào)節(jié)至pH7，進(jìn)行ELISA,以所得吸光度相對(duì)于未處理樣品的吸光度的比例作為殘留活性，表示在圖表中。結(jié)果可以確認(rèn)，RNOK203的L15R突變體對(duì)酸的耐性提高(圖16)?！秾?shí)施例29:SEB3-2-7的L鏈的15位突變體的構(gòu)建》探討實(shí)施例20至實(shí)施例28所示的將L鏈15位改為Arg或Ser的效果是否可在SEB3-2-7(L鏈15位為Val)中出現(xiàn)。以野生型Fab表達(dá)質(zhì)粒作為模板，使用L鏈15位的密碼子為CGT(Arg)和TCT(Ser)的低聚DNA,與上述同樣，通過(guò)PCR法擴(kuò)增VL基因，與野生型Fab表達(dá)質(zhì)粒的VL區(qū)置換。轉(zhuǎn)化JM83,對(duì)于所得克隆進(jìn)行DNA堿基序列分析，確認(rèn)得到了設(shè)計(jì)的序列?！秾?shí)施例30:使用SEB3-2-7進(jìn)行的L鏈15位突變體的熱穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)》將SEB3-2-7的野生型/突變體的培養(yǎng)上清組分用ly。BSA-PBS稀釋，制成50pl/管，在42。C的水浴中處理2小時(shí)。然后恢復(fù)至室溫，進(jìn)行ELISA,以所得吸光度相對(duì)于未處理樣品的吸光度的比例作為殘留活性，表示在圖表中。結(jié)果可以確認(rèn)，SEB3-2-7的V15R和V15S突變體的熱穩(wěn)定性提高(圖17)?！秾?shí)施例31:使用SEB3-2-7進(jìn)行的L鏈15位突變體的酸耐性評(píng)價(jià)》將SEB3-2-7的野生型/突變體的培養(yǎng)上清組分用P/。BSA-PBS稀釋，制成50)li1/管。用1NHCl和pH計(jì)(HORIBA)調(diào)節(jié)至pH4.5或pH4.0,在25。C處理2小時(shí)。然后用lMTris-HCl(pH9.5)調(diào)節(jié)至pH7，進(jìn)行ELISA,以所得吸光度相對(duì)于未處理樣品的吸光度的比例作為殘留活性，表示在圖表中。結(jié)果可以確認(rèn)，SEB3-2-7的V15R和V15S突變體對(duì)酸的耐性提高(圖1S)。《實(shí)施例32:使用RNOK203進(jìn)行的L鏈18位突變體的熱穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)》將RNOK203的野生型/突變體的培養(yǎng)上清組分用BlockAce稀釋，制成50pl/管，在45。C的水浴中處理2小時(shí)。然后恢復(fù)至室溫，進(jìn)行ELISA,以所得吸光度相對(duì)于未處理樣品的吸光度的比例作為殘留活性，表示在圖表中。結(jié)果可以確認(rèn)，RNOK203的P18R、P18S和P15F突變體的熱穩(wěn)定性提高(圖19)。《實(shí)施例33:使用RNOK203進(jìn)行的L鏈18位突變體的酸耐性評(píng)價(jià)》成50pl/管。用1NHCl和pH計(jì)(HORIBA)調(diào)節(jié)至pH4.0,在25。C處理2小時(shí)。然后用lMTns-HCl(pH9.5)調(diào)節(jié)至pH7，進(jìn)行ELISA,以所得吸光度相對(duì)于未處理樣品的吸光度的比例作為殘留活性，在突變體之間進(jìn)行比較。結(jié)果可以確認(rèn)，RNOK203的P18F、P18A、P18R、P18Q和P18S突變體對(duì)酸的耐性提高。代表例子如圖表所示(圖20),其余的突變體的各殘留活性相對(duì)與野生型殘留活性的比率匯總于表2中。[表2]<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>《實(shí)施例34:使用RNOK203進(jìn)行的L鏈18位突變體的凍融耐性評(píng)價(jià)》到的樣品和只進(jìn)行l(wèi)次得到的樣品，進(jìn)行ELISA,以凍融6次的樣品的吸光度相對(duì)于凍融1次的樣品的吸光度的比例作為殘留活性，表示在圖表中。結(jié)果可以確認(rèn)，RNOK203的P18R、P18S、P18F和P18L突變體對(duì)凍融的耐性提高(圖21)。產(chǎn)業(yè)實(shí)用性照^CabatnumbLing)的至少^個(gè)氨基酸置換為除脯氨酸或半胱^氨酸之外的其它氨基酸，通過(guò)對(duì)所述抗體的特征部位的僅一個(gè)氨基酸的置換，即可以得到表達(dá)量和/或穩(wěn)定性提高的抗體。因此，由本發(fā)明的方法得到的表達(dá)量和/或穩(wěn)定性提高的人抗體或人源化抗體同時(shí)具有高抗原特異性、低免疫原性、高產(chǎn)率和穩(wěn)定性高等優(yōu)異特征，作為以疾病相關(guān)抗原作為靶的特異性抗體，在人的診斷或治療等臨床中非常有用。權(quán)利要求1.改良人抗體或人源化抗體以得到表達(dá)量和/或穩(wěn)定性提高的抗體的方法，其特征在于將人抗體或人源化抗體的可變區(qū)輕鏈，即VL鏈的、按照Kabat記數(shù)的第8位、12位、15位或18位的至少其中一個(gè)氨基酸置換為除脯氨酸或半胱氨酸之外的其它氨基酸。2.權(quán)利要求l的方法，其特征在于將位于VL鏈的8位、12位、15位或18位的至少一個(gè)脯氨酸、或15位的氨基酸置換為除脯氨酸或半胱氨酸之外的其它氨基酸。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中，置換后的各位置的氨基酸分別選自下述的任意一種氨基酸8位:Gly、Thr、Arg或Ser12位:Ser、His、Val、Gly、Leu、Arg、Phe、Met或Glu15位Arg、Ser、Gly或Phe18位:Arg、Ser、Phe、Ala、Trp、Leu或Gln4.權(quán)利要求l-3中任一項(xiàng)的方法，其中，該VL鏈屬于人Vid家族、人Vk2家族或人Vk3家族的其中之一。5.權(quán)利要求l-4中任一項(xiàng)的方法，其中，屬于人VKl家族的VL鏈在置換后的各位置的氨基酸分別選自下述任意一種氨基酸8位Gly、Thr、Arg或Ser15位Arg或Ser6.權(quán)利要求5的方法，其中，該屬于人VKl家族的VL鏈在置才奐前的FR1具有來(lái)自GenBank檢索號(hào)No.X59315的DPK9的序列。7.權(quán)利要求5或6中任一項(xiàng)的方法，其中，置換后的屬于人Vk1家族的VL鏈的FR1是選自SEQIDNo.2-7中的氨基酸序列的氨基酸序列。8.權(quán)利要求l-4中任一項(xiàng)的方法，其中，屬于人VK2家族的VL鏈在置換后的各位氨基酸分別選自下述任意一種氨基酸12位:Ser、His、Val、Gly、Leu、Arg、Phe、Met或Glu15位Arg1M立Arg、Ser、Phe、Ala、Trp、Leu或Gln9.權(quán)利要求8的方法，其中，屬于該人VK2家族的VL鏈在置換前的FR1具有來(lái)自GenBank檢索號(hào)No.X63403的DPK18的序列。10.權(quán)利要求8或9中任一項(xiàng)的方法，其中，置換后的屬于人Vk2家族的VL鏈的FR1是選自SEQIDNo.9-25的氨基酸序列的氨基酸序列。11.權(quán)利要求l-4中任一項(xiàng)的方法，其中，屬于人VK3家族的VL鏈在置換后的各位氨基酸選自下述任意一種氨基酸15位Arg、Ser、Gly或Phe12.權(quán)利要求ll的方法，其中，屬于該人VK3家族的VL鏈在置換前的FR1具有來(lái)自GenBank檢索號(hào)No.X59315的DPK22的序列。13.權(quán)利要求11或12中任一項(xiàng)的方法，其中，置換后的屬于人Vk3家族的VL鏈的FR1是選自SEQIDNo.27-30的氨基酸序列的氨基酸序列。14.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的方法，其中，該抗體是完全抗體、或者Fab、Fab，、F(ab，)2、scAb、scFv、雙抗體或scFv-Fc的抗體片段、或者它們與其它蛋白的融合抗體或融合抗體片段、結(jié)合有低分子標(biāo)記物的抗體或抗體片段、被高分子修飾物修飾的抗體或抗體片段。15.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的方法，該方法是通過(guò)基因重組技術(shù)進(jìn)行氨基酸置換。16.人抗體或人源化抗體、或者人抗體片段或人源化抗體片段，它們由權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的方法得到，表達(dá)量和/或穩(wěn)定性提高。17.人抗體或人源化抗體、或者人抗體片段或人源化抗體片段的制備方法，該方法是將人抗體或人源化抗體、或者人抗體片段或人源化抗體片段的可變區(qū)輕鏈，即VL鏈的、按照Kabat記數(shù)的第8位、12位、15位或18位的至少一個(gè)氨基酸用除脯氨酸或半胱氨酸之外的其它氨基酸置換，得到表達(dá)量和/或穩(wěn)定性提高的抗體的方法，該方法包含以下步驟制備編碼含有置換后的VL鏈的氨基酸序列的該人抗體或人源化抗體、或者人抗體片段或人源化抗體片段的氨基酸序列的基因，將該基因轉(zhuǎn)化真核系統(tǒng)或原核系統(tǒng)生物的宿主，使該人抗體或人源化抗體、或者人抗體片段或人源化抗體片段在該宿主中表達(dá)，接著回收該人抗體或人源化抗體、或者人抗體片段或人源化抗體片段。18.人抗體或人源化抗體、或者人抗體片段或人源化抗體片段，它們是由權(quán)利要求17的方法制備的，表達(dá)量和/或穩(wěn)定性提高。全文摘要本發(fā)明提供改善抗體的表達(dá)量或穩(wěn)定性等性狀的方法。其特征在于將人抗體或人源化抗體的可變區(qū)輕鏈，即VL鏈的、按照Kabat記數(shù)的第的8位、12位、15位或18位的至少其中一個(gè)氨基酸置換為脯氨酸或半胱氨酸之外的其它氨基酸。本發(fā)明還提供改善人抗體或人源化抗體、獲得表達(dá)量和/或穩(wěn)定性的抗體的方法；以及由該方法得到的表達(dá)量和/或穩(wěn)定性提高的人抗體或人源化抗體、或者人抗體或人源化抗體的片段。文檔編號(hào)C07K16/46GK101155832SQ20068001135公開(kāi)日2008年4月2日申請(qǐng)日期2006年2月7日優(yōu)先權(quán)日2005年2月8日發(fā)明者中島敏博,鳥(niǎo)飼正治申請(qǐng)人:財(cái)團(tuán)法人化學(xué)及血清療法研究所