專利名稱：一種與帕金森病相關(guān)的果蠅源蛋白cg2233及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本專利涉及一種與帕金森病相關(guān)的果蠅源蛋白CG2233及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
帕金森病(Parkinson' s disease, PD)是一種常見(jiàn)的老年性進(jìn)行性祌經(jīng)系統(tǒng)變性 疾病，在60歲以上人群中的發(fā)病率為1-2%。臨床癥狀為靜止性震顫、肌肉強(qiáng)直、運(yùn) 動(dòng)遲緩、平衡失調(diào)或震顫等，在病理學(xué)上主要表現(xiàn)為黑質(zhì)致密部的多巴胺能神經(jīng)元損 失和Lewy小體聚集物的形成，到目前為止沒(méi)有很好的治療方法，只能針對(duì)性的用藥 如左旋多巴等來(lái)緩解癥狀。
果蠅已成為研究諸如帕金森病之類的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的一種重要模式生物。利 用UAS/GAL4系統(tǒng)，已經(jīng)能夠較為容易的實(shí)現(xiàn)基因的異位表達(dá)從而構(gòu)建果蠅的帕金森 病模型。蛋白質(zhì)組學(xué)以及生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，雙向電泳之類的高新技術(shù)手段在實(shí) 驗(yàn)室中運(yùn)用，給予了我們從一個(gè)整體的，蛋白的角度研究帕金森病分子發(fā)病機(jī)制的良 好平臺(tái)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種與帕金森病相關(guān)蛋白CG223。 本發(fā)明的目的之二在于提供了與帕金森病相關(guān)蛋白CG223在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體
囊泡介導(dǎo)的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)中的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的之三在于提供了與帕金森病相關(guān)蛋白CG223在細(xì)胞內(nèi)的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)
中的應(yīng)用。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案 一種與帕金森病相關(guān)的果蠅源蛋白CG2233。
一種上述與帕金森病相關(guān)的果蠅源蛋白CG2233在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體囊泡介導(dǎo)的 蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)中的應(yīng)用。
一種上述與帕金森病相關(guān)的果蠅源蛋白CG2233在細(xì)胞內(nèi)的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)中的應(yīng)用。 我們通過(guò)在果蠅腦部特異性人源alpha-synclein A53T，構(gòu)建了確為可靠的果蠅 帕金森病模型。然后通過(guò)腦部全蛋白雙向電泳及質(zhì)譜鑒定，找出了發(fā)病組和對(duì)照組果 蠅腦部的差異表達(dá)蛋白。為了更好的研究這些蛋白之間的關(guān)系，我們使用了生物信息 學(xué)的手段分別構(gòu)成了人源和果蠅源這些蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，從而更透徹的了解了PD發(fā)病的分子機(jī)制。


圖1為果蠅PD模型二維電泳圖，圖中標(biāo)示出點(diǎn)所有差異點(diǎn)，其中C297, C342, C389 為與帕金森病相關(guān)的果蠅源蛋白CG2233的3種異構(gòu)體。
圖2為與帕金森病相關(guān)的果蠅源蛋白CG2233的質(zhì)譜分析報(bào)告。
圖3為果蠅帕金森病相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)圖，圖中正方形表示的點(diǎn)為質(zhì)譜測(cè)試所得的差 異蛋白點(diǎn)，左下角三角形表示的蛋白點(diǎn)為CG2233。
圖4為人類帕金森病相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)圖，圖中正方形表示的點(diǎn)為質(zhì)譜測(cè)試所得的差 異蛋白點(diǎn)，右下角八邊形表示的蛋白點(diǎn)為人類a-synuclein，左下角三角形表示的蛋 白點(diǎn)為CG2233在人類中的功能對(duì)應(yīng)點(diǎn)095487。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一果蠅帕金森病模型與對(duì)照組的蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了蛋白CG2233
1. 果蠅帕金森病模型的構(gòu)建a -symiclein A53T基因的在果蠅腦部異位表達(dá)可以利 用在UAS/GAL4系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。將UAS-syn A53T品系果蠅與TH-GAL4品系果蠅進(jìn)行雜交， 收集Fl代，構(gòu)建了果蠅a -synuclein A53T帕金森病模型。通過(guò)基因組PCR， realtime PCR，腦部免疫組化，以及行為學(xué)試驗(yàn)(CounterCurrent Assay)，我們驗(yàn)證了此模 型確實(shí)導(dǎo)致了果蠅腦部PPM1/2區(qū)域的多巴胺能神經(jīng)元特異性降解，并且導(dǎo)致果蠅爬 壁能力的降低。而多巴胺能神經(jīng)元特異性降解以及運(yùn)動(dòng)障礙正是人類帕金森病的重要 特點(diǎn)。
2. 雙向電泳及質(zhì)譜分析我們采用了蛋白組學(xué)的研究手段對(duì)果蠅腦部全蛋白進(jìn)行分 析。實(shí)驗(yàn)分為2組表達(dá)a -synuclein A53T的果蠅(羽化后19天)與CantonS果 蠅(羽化后19天)，每組3個(gè)重復(fù)。上樣蛋白量為每塊膠40mg。
(1)采用ph3-10NL (24cm)膠條進(jìn)行第一項(xiàng)等電聚焦，其運(yùn)行參數(shù)設(shè)置為第一步Stp100V ll:OOhr (水化)
第二步Stp500Vl:00hr (等電聚焦)
第三步Grd1000V l:00hr (等電聚焦)
第四步Grd8000V 3:00hr (等電聚焦)
第五步Stp8000V 36000Vhr (等電聚焦)
第六步Stp500V24hr (低電場(chǎng)維持)
(2)膠條進(jìn)行平衡，其流程為DTT平衡，碘乙酰胺平衡以及IPG膠條的轉(zhuǎn)移。(3)進(jìn)行單一濃度12.5% SDS-PAGE垂直電泳，電泳參數(shù)設(shè)定為 溫度25°C
第一步 每塊膠2w 45分鐘
第二步 每塊膠17w (max 100W) 約6小時(shí)
(3) 銀染，試驗(yàn)結(jié)果(參考膠電泳圖)見(jiàn)圖l。其過(guò)程中切勿使用戊二醇。在每 塊膠上約1500個(gè)蛋白點(diǎn)。
(4) 通過(guò)應(yīng)用軟件(ImageMaster 2D Platinum 6.0)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析(處 理凝膠，斑點(diǎn)檢測(cè)和凝膠匹配，差異數(shù)據(jù)分析)以后，我們一共找出了 33個(gè)表達(dá)量 發(fā)生差異的蛋白點(diǎn)(差異蛋白點(diǎn)選取條件蛋白含量差異大于2倍，p〈0.05)。
(5) 在經(jīng)過(guò)膠內(nèi)挖點(diǎn)，酶解，以及蛋白質(zhì)指紋譜和二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF-TOF) 的檢測(cè)后，其中18個(gè)蛋白點(diǎn)得到了高可信度的鑒定。在18個(gè)表達(dá)發(fā)生差異的點(diǎn)中， 發(fā)現(xiàn)了一個(gè)未知功能蛋白點(diǎn)CG2233,其在圖1中標(biāo)示處以3種異構(gòu)體形式存在(C297， C342， C389)，并且這3中異構(gòu)體表達(dá)量在實(shí)驗(yàn)組中都下調(diào)了。質(zhì)譜鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2。
實(shí)施例二蛋白CG2233的功能預(yù)測(cè)
我們以DIP數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)構(gòu)造了果蠅的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)PIN-fly，在PIN-fly 中找到實(shí)驗(yàn)獲得的13個(gè)蛋白質(zhì)以及和這13個(gè)蛋白質(zhì)之間存在直接相互作用的蛋白 質(zhì)，并找出所有這些蛋白質(zhì)之間的相互作用，我們構(gòu)造了果蠅的與帕金森病相關(guān)的蛋 白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，如圖3所示。網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)代表蛋白質(zhì)，邊代表蛋白質(zhì)之間的相 互作用，正方形節(jié)點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)獲得的差異表達(dá)蛋白質(zhì)。三角形節(jié)點(diǎn)即為未知功能蛋白 CG2233。
兼顧蛋白質(zhì)序列的相似性和蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的相似性，我們開(kāi)發(fā)蛋 白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)搜索算法在PIN-human中找到了和圖3中的目標(biāo)網(wǎng)絡(luò)最相似的結(jié)果 網(wǎng)絡(luò)，并根據(jù)PIN-human中a -synuclein和其它蛋白質(zhì)的相互作用數(shù)據(jù)，將a -synuclein及與其有相互作用的蛋白質(zhì)加到這個(gè)結(jié)果子網(wǎng)絡(luò)中，并找出這些蛋白質(zhì) 和圖中原有蛋白質(zhì)之間的相互作用，結(jié)果如圖4所示。
通過(guò)我們的算法，未知蛋白CG2233與人類蛋白095487有對(duì)應(yīng)關(guān)系。為了使預(yù)測(cè) 更加準(zhǔn)確，我們選取了一條在兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)中共有的以CG2233/095487為起點(diǎn)的路徑 CG2233 -CG1472 -CG17342路徑(果蠅)還是095487 -Q15436-Q07002路徑(人類)， 研究指出這些路徑中包含的節(jié)點(diǎn)蛋白都參與了從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的蛋白運(yùn)輸。因 此，我們認(rèn)為CG2233必定也涉及到了從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的蛋白運(yùn)輸。
權(quán)利要求
1. 一種與帕金森病相關(guān)的果蠅源蛋白CG2233。
2. —種根據(jù)權(quán)利要求1所述與帕金森病相關(guān)的果蠅源蛋白CG2233在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾 基體囊泡介導(dǎo)的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)中的應(yīng)用。
3. —種根據(jù)權(quán)利要求1所述與帕金森病相關(guān)的果蠅源蛋白CG2233在細(xì)胞內(nèi)的蛋白 轉(zhuǎn)運(yùn)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種與帕金森病相關(guān)的果蠅源蛋白CG2233及其應(yīng)用。通過(guò)果蠅alpha-synclein A53T帕金森病模型的構(gòu)建，以及系統(tǒng)生物學(xué)，生物信息學(xué)手段的輔助，我們得到了多個(gè)與帕金森病密切相關(guān)的蛋白，并且發(fā)現(xiàn)了一種新蛋白CG2233。借助人類中以alpha-synclein為中心的蛋白作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，我們還預(yù)測(cè)這個(gè)蛋白的功能內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體囊泡介導(dǎo)的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)以及細(xì)胞內(nèi)的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)。
文檔編號(hào)C07K14/435GK101280011SQ200810037700
公開(kāi)日2008年10月8日 申請(qǐng)日期2008年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月20日
發(fā)明者淑 俞, 文鐵橋, 江 謝, 顧知立 申請(qǐng)人:上海大學(xué)