專利名稱：從大腸桿菌中制備純化Exendin-4的工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及Exendin—4的純化工藝，具體涉及一種從大腸桿菌中制備純 化Exendin—4的工藝。
背景技術(shù)：
利用基因工程方法制備有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的蛋白質(zhì)成功的關(guān)鍵在于，其一是篩 選高產(chǎn)菌株，其二在于優(yōu)化純化方案，提高目的蛋白的純度和產(chǎn)量。二者缺 一不可。尤其是象Exendin—4，含39個(gè)氨基酸殘基、分子量僅4.2kD的小蛋 白純化難度更大。由于其極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值(7000元/mg， 2-型糖尿病治療的特 效新藥)以及將來用于工業(yè)化生產(chǎn)，從大腸桿菌中制備純化Exendin—4的工 藝極為重要，因?yàn)樗鼪Q定了Exendin—4的產(chǎn)量、純度及工業(yè)化生產(chǎn)的可行性。 Qiagene及Invitrogen兩大國際生物公司建立了從大腸桿菌中制備目的蛋白的 純化工藝，包括細(xì)菌培養(yǎng)、裂解、親和層析純化目的蛋白和用腸激酶切除N 端融合肽等，由于該工藝在裂解液配方、洗脫液配方和洗脫方法上還存在不 足，因此用該方法純化的目的蛋白，尤其是Exendin—4的產(chǎn)量和純度均不能 令人滿意。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種操作工藝簡單的 從大腸桿菌中制備純化Exendin—4的工藝，用該工藝能獲得高純度、高產(chǎn)量 的Exendin—4。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明的從大腸桿菌中制備純化Exendin — 4的工藝是按下述步驟進(jìn)行
的
(l )一個(gè)單克隆接種量200ml AMP—LB培養(yǎng)基，25"C過夜靜置培養(yǎng)12h; 然后在37。C， 220rpm條件下培養(yǎng)至菌液OD6(K)達(dá)到0.6后，置于冰上冷卻， 加入IPTG至濃度為lmM，在3(TC、 220rpm條件下誘導(dǎo)6h，收獲菌液于一 20'C保存?zhèn)溆谩?br> (2)將步驟(1)保存的菌液于冰上融化后，每克細(xì)菌用10ml裂解液懸 浮沉淀冰浴30min，超聲波破碎；所用裂解液的組成為50mM NaH2P04、
3500mMNaCl、 10mM咪唑、0.01 %Trition 100、 2%甘油、10mM(3-巰基乙醇、 0.1%PMSF、 lmMMgCl2、 lURNase、 lUDNase。
(3)將上述裂解液于4。C， 8000rpm離心30min;將上清液與樹脂按2:1 混合，4。C緩慢振蕩吸附3h; 4°C， 300011)111離心51^11，棄去上清。-
(4 )每10ml細(xì)菌裂解液向上述樹脂中加入40ml漂洗緩沖液，4"C緩慢 振蕩30min; 4°C， 3000rpm離心5min,棄上清；用10ml漂洗緩沖液重懸浮樹 脂，轉(zhuǎn)移到層析柱中；收集漂洗緩沖液最后1.5ml，用于鑒定洗液中是否還有雜 蛋白。漂洗緩沖液組成為50mMNaH2PO4; 500 mMNaCl; 20 mM咪唑； pH8.0。
(5) 先用洗脫液I以1.5ml/min的流速洗脫，收集洗脫液I ;再用洗脫 液II以1.5ml/min的流速洗脫，收集洗脫液II得到純化融合蛋白；所用洗脫液 I的組成為50mMNaH2PO4、 500mMNaCl、 40 mM咪唑、2%甘油、lOmMp-巰基乙醇，；所用洗脫液II的組成為50mMNaH2PO4、 500mMNaCl、 80 mM 咪唑、2%甘油、lOmMp-巰基乙醇。
(6) 每3mg重組Exendin—4加入1U腸激酶，4"C消化6h，將酶消化液 與樹脂混合吸附3h后，過層析柱得到的洗脫液即純化的Exendin—4溶液。
在步驟(5)中，所用洗脫液I的體積為llml，收集6.5ml后，再分部收 集3管，每管1.5ml。
在步驟(5)中，所用洗脫液II的體積為9ml，每管1.5ml，共收集6管。
由于本發(fā)明對(duì)裂解液和洗脫液的配方作出了改進(jìn)，采用梯度洗脫工藝， 從而增加了目的蛋白的產(chǎn)量和純度，另外本發(fā)明和現(xiàn)有技術(shù)相比，簡化了操 作程序，操作步驟簡便易行，適合工業(yè)化大批生產(chǎn)。


圖l是利用親和層析分離純化大腸桿菌中的重組Exendin-4，其中1:誘 導(dǎo)6h菌體；2-8: 40mM咪唑濃度洗脫液洗脫融合蛋白；9-14: 80mM咪唑濃度 洗脫液洗脫融合蛋白；7:純度74.67%; 8:純度75.69% ; 9:純度86.39%; 10:純度98.10%; 11-14:純度100%。
圖2是用腸激酶去除重組Exendin-4的N端融合肽，其中
1:重組Exendin-4融合蛋白；
2:融合蛋白用腸激酶消化6h，
3:純化的Exendin-4。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說明。 1.試劑的配制
(1 )裂解緩沖液100ml的配置
50mMNaH2PO4 0.690gNaH2P04.H20(MW 137.99g/mol) 300mMNaCl1.754gNaCl(MW 58.44g/mol) 10mM咪唑 0.068g咪唑(MW 68.08g/mol)
用NaOH調(diào)pH至8.0。 現(xiàn)用現(xiàn)力口:Trition 100， 0.01%;甘油，2%; p-巰基乙醇，10mM; PMSF， 0.1%;lOOmM MgCl2，lmM;lOOmM MnCl2,lmM; RNase， 1U; DNase， 1U
(2 )漂洗緩沖液100ml的配制
50mM NaH2PO40.690gNaH2P04.H20(MW 137.99g/mol)
300mM NaCl 1.754g NaCl (MW 58.44g/mol)
20mM咪唑0.068g咪唑(MW 68.08g/mol)
用NaOH調(diào)pH至8.0。 現(xiàn)用現(xiàn)加:甘油，2%; (3-巰基乙醇，10mM (3 )洗脫緩沖液100ml的配制
50mM NaH2P04 0.690g NaH2P04.H20(MW 137.99g/mol)
300mM NaCl1.754g NaCl (MW 58.44g/mol)
250mM咪唑 0.068g 咪唑(MW 68.08g/mol)
用NaOH調(diào)pH至8.0。
現(xiàn)用現(xiàn)加:甘油，2%; |3-巰基乙醇，10mM
3. Exendin-4高產(chǎn)工程菌株的構(gòu)建方法 (1 ) Exendin-4基因的改造將Genebank中登錄編號(hào)為AAB22006的 Exendin-4基因改造為具有SEQ ID No.l所示核苷酸序列的Exendin-4基因；人工合 成Exendin-4基因，采用PCR方法，以5'GGTACCGACGACGACGACAAGC 3'為 正向引物，以5'CCATGGTTATCAAGATGGTGGCG 3'為反向引物，在Exendin-4 基因5'端加上限制性內(nèi)切酶Kpnl位點(diǎn)；在KpnI位點(diǎn)后添加編碼腸激酶識(shí)別位點(diǎn) DDDDK的核酸序列GACGACGACGACAAG，使腸激酶識(shí)別位點(diǎn)的核酸序列與 Exendin-4基因緊密相連；在Exendin-4基因3'端添加兩個(gè)相連的終止密碼子TGATAA和限制性內(nèi)切酶NcoI (CCATGG)位點(diǎn)；
(2) 克隆載體pMD19-T-Exendin-4的構(gòu)建利用PCR擴(kuò)增的改造后的 Exendin-4，純化后與pMD19-T載體連接，構(gòu)建克隆載體pMD19-T-Exendin-4;
(3) 高效表達(dá)載體pET-32a (+) - Exendin-4的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Nco I雙酶切pMD19-T-Exendin-4質(zhì)粒，回收目的片斷；用限制性內(nèi)切酶Kpn l和Nco I消化表達(dá)載體質(zhì)粒pET-32a (+)，回收載體pET-32a ( + )大片段，將 二者連接即重組￡乂61^^1-4表達(dá)載體？611-323( + )- Exendin-4;將表達(dá)載體pET-32a
(+) - Exendin-4轉(zhuǎn)化入大腸桿菌工程菌BL21(DE3)pLYS中，得到Exendin-4 高產(chǎn)工程菌株BL21(DE3)pLYS—pET-32a ( + ) -Exendin-4。 3.從大腸桿菌中制備純化Exendin—4的工藝 (1 )細(xì)菌培養(yǎng) 一個(gè)單克隆接種量200mlAMP—LB培養(yǎng)基，25"C過夜 靜止培養(yǎng)12h;然后在37"， 220rpm條件下培養(yǎng)約2h，菌液OD,達(dá)到0.6 后，置于冰上迅速冷卻，并加入IPTG，使其終濃度達(dá)lmM。在3(TC、 220rpm 條件下誘導(dǎo)6h，粗蛋白產(chǎn)量最高，軟件分析表明達(dá)到細(xì)菌蛋白質(zhì)總量的15%， 且為可溶蛋白。收獲菌液，4000rpm、 4。C離心10min后，獲得約lg細(xì)菌，將 沉淀置于一2(TC保存，備用。
(2) 裂解將步驟(1) 一20。C保存的細(xì)菌于冰上融化后，每克細(xì)菌用 10ml 4r保存的裂解液懸浮沉淀，冰浴30min，然后用250W超聲波破碎30min，
(工作5S間歇5S)。所用裂解液的組成為50mMNaH2PO4、 500mMNaCl、 10mM咪唑、0.01%Trition 100、 2%甘油、10mM卩-巰基乙醇、0.1%PMSF、 lmMMgCl2、 lURNase、 lUDNase。
(3) 吸附將上述裂解液于4。C， 8000rpm離心30min;將上清液與樹脂 按2:1混合，4'C緩慢振蕩吸附3h; 4°C， 3000rpm離心5min，棄去上清。
(4) 去雜蛋白每10ml細(xì)菌裂解液上清液向樹脂中加入40ml漂洗緩 沖液(50mMNaH2PO4; 500mMNaCl; 20 mM咪唑；pH8.0)， 4。C緩慢振蕩 30min; 4°C， 3000rpm離心5min，棄上清；用10ml漂洗緩沖液重懸浮樹脂， 轉(zhuǎn)移到層析柱中；收集漂洗緩沖液洗脫液1管(1.5ml),用于鑒定洗液中是否還 有雜蛋白。漂洗緩沖液的用量是細(xì)菌裂解液的5倍。
(5 )洗脫先用恒流泵向?qū)游鲋辛骷觢lml洗脫液I ，以1.5ml/min 的流速洗脫，收集6.5ml后，再分部收集3管，每管1.5ml。 SDS-PAGE膠分 析及核酸檢測儀測定表明最后兩管可獲得純度約75%，濃度約lmg/ml的重組Exendin-4融合蛋白(lg細(xì)菌)。所用洗脫液I的組成為50mMNaH2PO4、 500mMNaCl、 40 mM咪唑、2%甘油、10mMP-巰基乙醇。
再用恒流泵向?qū)游鲋辛骷?ml洗脫液II以1.5ml/min的流速洗脫，部分 收集，每管1.5ml，共收集6管，洗脫液II洗脫9ml收集6管，每管1.5ml， 第1管純度約86%，濃度約lmg/ml的目的蛋白(lg細(xì)菌)；在2-9管獲得純 度98。^以上，濃度約lmg/ml-0.2 mg/ml依次遞減的目的蛋白，該高純度的重 組Exendin-4融合蛋白產(chǎn)量為6.44mg/g細(xì)菌。所用洗脫液II的組成為50mM NaH2P04、 500mMNaCl、 80 mM咪唑、2%甘油、10mM卩-巰基乙醇。
(6 )用腸激酶去除N端融合肽為了去除目的蛋白N端的融合肽，首 先用20倍體積的去離子水透析洗脫的純化融合蛋白12hr。然后，每3mg重組 Exendin—4加入1U腸激酶，4'C消化6h，將酶消化液與樹脂混合吸附3h后， 過層析柱得到的洗脫液即純化的Exendin—4。
本發(fā)明中涉及的質(zhì)粒制備、感受態(tài)細(xì)胞制備、轉(zhuǎn)化及凝膠電泳等均按照《分 子克隆》操作步驟進(jìn)行。
限制性內(nèi)切酶消化、DNA的回收與純化均按寶生物公司的使用說明進(jìn)行操 作，所有用到的試劑材料均購于市售。
7<110>河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120>從大腸桿菌中制備純化Exendin—4的工藝 <160> 1
<170> Patentln Version 3.3
<210> 1 <211> 117 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> misc一feature <222> (1)…(117) <223>大腸桿菌嗜性
<400> 1
acggtgaag gtactttcac ctctgacctg tctaaacaga tggaagaaga agctgttcgt 60 ctgttcatcg aatggctgaa aaacggtggt ccgtcttctg gtgctccgcc accatct 11權(quán)利要求
1.一種從大腸桿菌中制備純化Exendin-4的工藝，其特征在于它是按下述步驟進(jìn)行的(1)一個(gè)單克隆接種量200ml AMP-LB培養(yǎng)基，25℃過夜靜置培養(yǎng)12h；然后在37℃，220rpm條件下培養(yǎng)至菌液OD600達(dá)到0.6后，置于冰上冷卻，加入IPTG至濃度為1mM，在30℃、220rpm條件下誘導(dǎo)6h，收獲菌液于-20℃保存?zhèn)溆茫?2)將步驟(1)保存的菌液于冰上融化后，每克細(xì)菌用10ml裂解液懸浮沉淀，冰浴30min，超聲波破碎；所用裂解液的組成為50mM NaH2PO4、500mM NaCl、10mM咪唑、0.01％Trition 100、2％甘油、10mMβ-巰基乙醇、0.1％PMSF、1mM MgCl2、1U RNase、1U DNase；(3)將上述裂解液于4℃，8000rpm離心30min；取上清液與Ni-樹脂按2∶1混合，4℃緩慢振蕩吸附3h；4℃，3000rpm離心5min，棄去上清；(4)向步驟(3)的樹脂中加入細(xì)菌裂解液4倍體積的漂洗緩沖液，4℃緩慢振蕩30min；4℃，3000rpm離心5min，棄上清；用1倍細(xì)菌裂解液體積的漂洗緩沖液重懸浮樹脂，轉(zhuǎn)移到層析柱中；收集漂洗緩沖液最后1.5ml，用于鑒定洗液中是否還有雜蛋白；漂洗緩沖液組成為50mM NaH2PO4；500mMNaCl；20mM咪唑；pH 8.0；(5)先用洗脫液I以1.5ml/min的流速洗脫，收集洗脫液I；再用洗脫液II以1.5ml/min的流速洗脫，收集洗脫液II得到純化融合蛋白；所用洗脫液I的組成為50mM NaH2PO4、500mM NaCl、40mM咪唑、2％甘油、10mMβ-巰基乙醇，；所用洗脫液II的組成為50mM NaH2PO4、500mM NaCl、80mM咪唑、2％甘油、10mMβ-巰基乙醇；(6)每3mg重組Exendin-4加入1U腸激酶，4℃消化6h，將酶消化液與Ni-樹脂混合后吸附3h后，過層析柱得到的洗脫液即純化的Exendin-4溶液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從大腸桿菌中制備純化Exendin—4的工 藝，其特征在于在步驟(5)中，所用洗脫液I的體積為llml，收集5.5ml 后，再分部收集3管，每管1.5ml及洗脫液I的配方。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l或2所述的從大腸桿菌中制備純化Exendin—4的工藝， 其特征在于在步驟(5)中，所用洗脫液II的體積為9ml，每管1.5ml，共收 集6管及洗脫液II的配方。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種從大腸桿菌中制備純化Exendin-4的工藝。將Exendin-4高產(chǎn)工程菌株經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)、非變性親和層析、用腸激酶去除N端融合肽步驟得到純化的Exendin-4。和現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明對(duì)裂解液和洗脫液的配方作出了改進(jìn)，采用梯度洗脫工藝，從而增加了目的蛋白的產(chǎn)量和純度，另外本發(fā)明簡化了操作程序，操作步驟簡便易行，適合工業(yè)化大批生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07K1/14GK101586138SQ20081004981
公開日2009年11月25日 申請(qǐng)日期2008年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月19日
發(fā)明者王小純, 祖向陽, 陳紅歌 申請(qǐng)人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)