專利名稱：一種抗腫瘤融合蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗腫瘤融合蛋白，及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
(二)
背景技術(shù)：
腫瘤壞死因子超家族(TNF superfamily, FNFSF )成員眾多，空間結(jié)
構(gòu)相似，有不同程度的同源性。配體為n型跨膜蛋白，能以膜結(jié)合或可溶
性形式發(fā)揮作用；受體為I型或III型膜蛋白，受體與配體結(jié)合，啟動(dòng)下游 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡，在組織自穩(wěn)、炎癥的免疫調(diào)節(jié)中 發(fā)揮重要作用。
TNFSF10最初是利用與FasL、 TNF的同源性從人的表達(dá)序列標(biāo)簽 (EST)文庫中發(fā)現(xiàn)的。與TNF超家族中的其它成員一樣，TNFSF10屬 典型的II型5爭(zhēng)膜蛋白，由281個(gè)氨基酸組成，分子量為32KDa。 N端第 15-40位氨基酸殘基為疏水區(qū)，形成^爭(zhēng)膜結(jié)構(gòu)；C端(胞外區(qū))可4皮金屬 蛋白酶從細(xì)胞膜上切下，得到具有生物學(xué)活性的可溶性分子。重組人可溶 性TNFSF10蛋白在體外能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，包括肺癌細(xì)胞、乳腺 癌細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞、腎癌細(xì)胞以及結(jié)腸癌細(xì)胞等，而對(duì)大多數(shù)正常組 織細(xì)胞則無誘導(dǎo)凋亡作用。
研究資料表明，TNFSF10有五種受體，包括DR4(death receptor 4 or TNFSF10-R1) 、 DR5(TNFSF10-R2) 、 DCR1(TNFSF10-R3)、 DCR2(TNFSF10-R4)以及OPG(osteoprotegerin)。 DR4和DR5屬于TNFR 超家族成員中的死亡受體，細(xì)胞內(nèi)區(qū)域含有高度保守的與TNFR、 Fas同 源的死亡結(jié)構(gòu)域(DD, death domain),可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；DCR1和DCR2
3盡管細(xì)胞外區(qū)域和死亡受體高度同源，但是細(xì)胞內(nèi)區(qū)域要么結(jié)構(gòu)域不完整
(DCR2)，要么根本就沒有(DCR1),因此，二者均不能傳導(dǎo)凋亡信號(hào)， 被稱為誘騙受體；OPG則是一種特殊受體，以分泌糖蛋白形式存在；后 三種受體可通過竟?fàn)幮砸种芓NFSF10與死亡受體的結(jié)合來調(diào)控其誘導(dǎo)的 細(xì)胞凋亡。
為進(jìn)一步研究TNFSF10蛋白的作用機(jī)理以及在抗肺瘤藥物方面的應(yīng) 用潛力，研究人員利用基因工程重組技術(shù)，構(gòu)建了多種可溶性TNFSF10 蛋白，包括含胞外區(qū)95 281位氨基酸殘基的TNFSF1095-2引蛋白(SEQLD NO: 2)、含胞外區(qū)114 281位氨基酸殘基的TNFSF10114-281蛋白(SEQID NO: 3)以及融合有標(biāo)簽蛋白(如His、 FLAG)的TNFSF10融合蛋白。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，重組人可溶性TNFSF10蛋白對(duì)多種移植到小鼠體內(nèi)的月中 瘤模型有顯著療效,且對(duì)鼠科及非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的正常組織器官無明顯毒 副作用，顯示出其在抗腫瘤藥物領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用前景。目前，重組人 可溶性TNFSF10114_281蛋白在國內(nèi)外均已進(jìn)入臨床研究階段。
晶體結(jié)構(gòu)顯示，可溶性TNFSF10蛋白呈同源三聚體結(jié)構(gòu)， 一個(gè)Zn" 隱藏在三聚體的中心，與三個(gè)Cys230殘基及一個(gè)氯原子配對(duì)，Zn"的存 在對(duì)維持人可溶性TNFSF10蛋白的結(jié)構(gòu)和功能具有重要作用。另有研究 資料表明，天然重組人可溶性TNFSF10蛋白在溶液中有多種存在形式， 主要包括三聚體、二聚體以及單體，其中最主要的及活性最高的形式是同 源三聚體。然而，研究表明相當(dāng)一部分可溶性TNF超家族蛋白，在溶液 中僅僅由細(xì)胞外區(qū)域構(gòu)成的同源三聚體是不穩(wěn)定的。例如，人們?cè)诒容^ TNFa和LT功能時(shí)就曾發(fā)現(xiàn)天然可溶性的TNFa三聚體在生理?xiàng)l件下是 不穩(wěn)定的；又如，人們?cè)谠噲D將CD40L開發(fā)成治療藥物的研究過程中發(fā) 現(xiàn)，CD40L可溶性三聚體活性較低的重要原因之一是其在溶液中的穩(wěn)定性較差。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TNFSF10蛋白也存在同樣的穩(wěn)定性不理想的問題，這 不僅影響其保存，且可能與其在動(dòng)物體內(nèi)的半衰期短等問題有關(guān)。
為了提高具有醫(yī)療價(jià)值蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性，包括提高單位活性、熱 力學(xué)穩(wěn)定性、血液半衰期、保質(zhì)期。人們常常對(duì)天然蛋白進(jìn)行修飾。目前 有多種途徑可以改善藥用蛋白的生物活性，一種方法是通過化學(xué)結(jié)合諸如 PEG這樣的試劑來提高蛋白分子量，從而提高生物學(xué)活性的方法。該法 也叫PEG化，起初是為了降低免疫原性。據(jù)報(bào)道，已有多種蛋白藥物進(jìn) 行PEG化。另一種方法是將目標(biāo)蛋白和人血清白蛋白(HA)融合，形成 一特殊氨基酸序列。專利WO01/79840就是用這種方法來提高h(yuǎn)GH蛋白 穩(wěn)定性和半衰期，據(jù)報(bào)道其生物學(xué)活性提高是由hGH-HA融合蛋白穩(wěn)定 性增加造成的。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提高TNFSF10蛋白穩(wěn)定性和抗腫瘤活性，提供一種新 型的抗腫瘤融合蛋白，及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
一種抗肺瘤融合蛋白，包括至少一個(gè)生物活性分子和巻曲螺旋結(jié)構(gòu) 域，所述生物活性分子源自TNFSF10或其改構(gòu)體，所述巻曲螺旋結(jié)構(gòu)域 源自能天然形成多聚體的蛋白質(zhì)，或者源自才艮據(jù)能天然形成多聚體蛋白質(zhì) 的巻曲結(jié)構(gòu)域進(jìn)行人工合成的多肽。
所述生物活性分子源自TNFSF10,是指所述生物活性分子可為 TNFSF10的全部或部分氨基酸序列的片段(尤其是胞外多肽片段，優(yōu)選 為95~281或114~281位的多肽片段)，所述"改構(gòu)體"指相對(duì)于原始 TNFSF10的全部或部分多肽序列，僅涉及單個(gè)或多個(gè)氨基酸的點(diǎn)突變， 突變后多肽的功能發(fā)生了變化，但主要的序列和結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯改變。這里的TNFSF10蛋白是按照TNF超家族(TNFSF )統(tǒng)一命名法則得 來的，其序列如SEQIDNO: 1所示。
所述巻曲螺旋結(jié)構(gòu)域，是一種能與其它類似或相同的巻曲螺旋相互作 用的肽、多肽。這里的相互作用是指能形成多肽或蛋白質(zhì)多聚體的類型， 這種相互作用是由多聚體結(jié)構(gòu)域之間的共價(jià)健、氫鍵、疏水作用、范得華 力以及鹽橋等作用力共同作用形成的。巻曲螺旋(coiled coil)是存在于 多種天然蛋白質(zhì)中的結(jié)構(gòu)模式，巻曲螺旋的 一個(gè)共同特點(diǎn)是在它們的 一級(jí) 結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)重復(fù)的由7個(gè)氨基酸組成的"七肽單元"(abcdefg)。每個(gè)單 元中的a、 d位多為非極性疏水氨基酸殘基，如亮氨酸(Leu)、異亮氨酸
(lie)、纈氨酸(Val)等，這些位置的氨基酸殘基特異性地位于巻曲螺 旋結(jié)構(gòu)的內(nèi)側(cè)；e、 g位多為極性帶電氨基酸，如賴氨酸(Lys)、谷氨酸
(Glu)等，這些氨基酸殘基位于a、 d位氨基酸殘基相互作用所形成的疏 水核心的外側(cè)。巻曲螺旋結(jié)構(gòu)域能天然形成穩(wěn)定的二聚體、三聚體、多聚 體。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，將至少一個(gè)TNFSF10多肽分子和巻曲螺旋結(jié)構(gòu)域融 合而構(gòu)成的抗腫瘤融合蛋白，其生物學(xué)活性有明顯提高。因此本發(fā)明為腫 瘤治療提供另 一種潛在的可供選擇的新型抗腫瘤融合蛋白。
所述"生物活性提高"包括根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的融合蛋白比天然 TNFSF10蛋白具有更高的抗胂瘤活性。
所述"生物活性提高"也包括比天然TNFSF10蛋白具有更高的熱力 學(xué)穩(wěn)定性、制備過程抗理化因素影響能力較強(qiáng)、具有更長(zhǎng)的保質(zhì)期等。
所述"生物活性提高"還包括幾種功能的結(jié)合，例如，新型抗腫瘤融 合蛋白抗肺瘤活性提高的同時(shí)，穩(wěn)定性也有明顯提高?？梢灶A(yù)料，本發(fā)明 提供的融合蛋白與天然TNFSF10蛋白相比，血液半衰期也將會(huì)延長(zhǎng)、有 效用藥量將會(huì)減少。優(yōu)選的，所述生物活性分子為具有下列氨基酸序列的多肽之一① SEQIDNO: 1 (TNFSF10);②SEQIDNO: 2 (TNFSF1095.281 );欲EQID NO: 3 (TNFSF10 4-281 )。
優(yōu)選的，所*曲結(jié)構(gòu)域源自Al申表面活性蛋白D( S^factoW Prated D )， 或者源自根據(jù)/J市表面活性蛋白D的巻曲結(jié)構(gòu)域人工合成的多肽。所i^4曲 螺旋結(jié)構(gòu)域還可以來源于其它能天然形成多聚體的蛋白質(zhì)，包括 tetranectin、 collectin等蛋白家族中的巻曲螺旋結(jié)構(gòu)域。
優(yōu)選的，所述巻曲結(jié)構(gòu)域?yàn)榫哂蠸EQIDNO: 4所示的tt酸序列的多肽 或其改構(gòu)體。所述"改構(gòu)體"指相對(duì)于SEQ ID NO: 4所示的ttH序列，僅 涉及單個(gè)或多個(gè)氨基酸的點(diǎn)突變，突變后多肽的功能發(fā)生了變化，但主要 的序列和結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯改變。
優(yōu)選的，所述巻曲螺旋結(jié)構(gòu)域來自人SPD蛋白中的巻曲螺旋結(jié)構(gòu)， 簡(jiǎn)稱SPDcc。該結(jié)構(gòu)域能形成三聚化的a螺旋巻曲螺》走結(jié)構(gòu)，其氨基酸序 列如SEQ ID NO: 4所述。該巻曲螺:旋的三聚化作用是通過一個(gè)SPDcc 中的巻曲螺旋和另外兩個(gè)SPDcc中的巻曲螺旋形成3a螺旋三聚體，該三 聚體出人意料的在相對(duì)較寬的pH條件下仍很穩(wěn)定。術(shù)語SPDcc也可指 SPD蛋白家族中天然巻曲螺旋的改構(gòu)體，包括不損害其形成a螺旋三聚 體能力、在氨基^列上有變化的改構(gòu)體。由此，本發(fā)明中的融合蛋白可 以包含SPD中的巻曲螺旋結(jié)構(gòu)域，具有氨基S交序列同SEQ ID NO: 4至 少有72%同源的多肽，優(yōu)選79%,進(jìn)一步優(yōu)選85。/。，更優(yōu)選95%,最優(yōu) 選為990/。。
優(yōu)選的，所述巻曲結(jié)構(gòu)域?yàn)镾EQIDNO: 6所示核苷酸序列編碼的多肽。 優(yōu)選的，所述抗腫瘤融合蛋白具有SEQIDNO: 5所示的萄JJ愛序列。在已
知其tt酸序列的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可按照本領(lǐng)域常規(guī)方法方便的合成
所需要的融M白、達(dá)到相應(yīng)4支術(shù)承文果。
7<植的，所述抗腫瘤融M白為SEQIDNO: 7所示核苦ii^列編碼的多肽。
生物活性分子連接于所述巻曲螺旋結(jié)構(gòu)域的N端或C端，所述生物 活性分子與所述巻曲螺旋結(jié)構(gòu)域之間可通過柔性連接鏈共價(jià)連接，所述連 接鏈為1 20個(gè)氨基酸組成的多肽，優(yōu)選連接鏈為2 10個(gè)氨基酸殘基， 更優(yōu)選為3 7個(gè)氨基酸殘基。連接鏈在本質(zhì)上是無免疫原性的，不易被 蛋白酶水解以及不含易與其它殘基發(fā)生作用的氨基酸(如Gly)。優(yōu)選的， 連接鏈不損害連接蛋白的功能，或至少不明顯損害連接蛋白中的 一種蛋白 功能。更加優(yōu)選的連接鏈被用于連接包含巻曲螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白。
下面是連接鏈的實(shí)例，據(jù)信這些連接鏈適合TNFSF10蛋白與巻曲螺 旋結(jié)構(gòu)域之間的連接。
基于Fibronectin的連接鏈優(yōu)選的氨基酸序列為PGTSGQQPSVGQ Q,對(duì)應(yīng)于Fibronectin第2037 - 2049位氨基酸殘基，更加優(yōu)選的片斷為 GTSGQ,對(duì)應(yīng)第2038-2042位氨基酸殘基。這種構(gòu)建的優(yōu)點(diǎn)是/>認(rèn)對(duì)蛋 白酶水解具有很強(qiáng)抗性，同時(shí)因?yàn)镕ibronectin在血液中濃度高，因此被 認(rèn)為不會(huì)產(chǎn)生很高的免疫原性。
基于人IgG3鉸鏈上面部分的連接鏈來源于IgG3 4交鏈區(qū)上面部分 的10個(gè)氨基酸殘基，PKPSTPPGSS，已被應(yīng)用于通過巻曲螺旋形成二聚 體的抗體。該序列被認(rèn)為在人體中不會(huì)產(chǎn)生免疫原性。
可能的連接鏈還包括SGGTSGSTSGTGST、 AGSSTGSSTGPGSTT或 GGSGGAP。這些序列以前已一皮應(yīng)用于巻曲螺旋和其它蛋白結(jié)構(gòu)域之間的 連接。
本發(fā)明融合蛋白可按照本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行制備，具體為利用基 因工程技術(shù)將具有生物學(xué)活性的多肽或蛋白與巻曲螺旋結(jié)構(gòu)域重組為一特殊 M酉銀列，其中所述的巻曲螺旋結(jié)構(gòu)域能天然形成穩(wěn)定的3a螺旋，從而 并維持整個(gè)新型融合蛋白形^l定的三聚體或多聚體結(jié)構(gòu)。具體的，本發(fā)明提供了一種新型抗腫瘤融合蛋白的制備方法，即將編
碼人肺表面活性蛋白巻曲螺旋結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列和編碼TNFSFIO細(xì)胞 外114 281位氨基酸序列的cDNA以及一個(gè)哺乳動(dòng)物蛋白基因表達(dá)載體 連接起來，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞，然后通過發(fā)酵培養(yǎng)制得，該融合蛋白 命名為SPDcc-TNFSFlO,其^tJ^酸序列如SEQIDNO: 5所示。
所述"載體"是指能在宿主細(xì)胞中擴(kuò)增的任何核酸實(shí)體。因此，該載體
可以是自主復(fù)制的載體，即作為染色體外實(shí)體存在的載體，其復(fù)制不依賴 于染色體復(fù)制，例如質(zhì)粒。或者，該載體可以是導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)整合進(jìn)宿 主細(xì)胞基因且與其所整合的染色體一起復(fù)制的載體。載體的選擇通常取決 于其將要導(dǎo)入的宿主細(xì)胞。載體包括，但不限于質(zhì)粒、噬菌體、病毒或粘
粒o
所述"宿主"包括細(xì)菌、酵母以及高等動(dòng)物和植物細(xì)胞。 本發(fā)明中"肽"、"多肽"和"蛋白質(zhì)"在全文可以相互交換使用。本發(fā)明
所述的多肽的氨基酸位點(diǎn)序列號(hào)遵循天然完整蛋白的常規(guī)序列計(jì)數(shù)方法。
本發(fā)明還涉^J斤述的抗腫瘤融M白在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。所述應(yīng)
用包括用根據(jù)本發(fā)明提供的抗腫瘤融合蛋白即多肽復(fù)合物治療哺乳動(dòng)物
疾病以及作為治療藥物的 一種成分。
經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本發(fā)明提供的新型重組人可溶性SPDcc-TNFSF10蛋白 在體外的穩(wěn)定性明顯優(yōu)于天然TNFSFIO。
經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本發(fā)明提供的新型重組人可溶性SPDcc-TNFSF10蛋白 在體外對(duì)多種人體肺瘤細(xì)胞具有顯著的凋亡誘導(dǎo)作用，且其抗胂瘤活性明 顯優(yōu)于天然TNFSFIO。具體的，本發(fā)明提供的新型重組人可溶性 SPDcc-TNFSFlO蛋白對(duì)接種于棵鼠體內(nèi)的人結(jié)腸癌(HCT-8 )具有明顯 地肺瘤生長(zhǎng)抑制作用，且其抗腫瘤效果優(yōu)于天然TNFSFIO。劑量為10 mg/kg的SPDcc-TNFSFlO蛋白的抗肺瘤活性與30 mg/kg的天然TNFSFIO相當(dāng)。
本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供了一種新型融合蛋白，其中巻曲
螺旋結(jié)構(gòu)域能天然形成穩(wěn)定的3a螺旋，從而促進(jìn)融合蛋白形成穩(wěn)定的三 聚體結(jié)構(gòu)，相比于天然TNFSF10,穩(wěn)定性好、半衰期長(zhǎng)、利于保存，在 體外對(duì)多種人體肺瘤細(xì)胞具有更顯著的凋亡誘導(dǎo)作用，其抗肺瘤活性有明 顯提南。
(四)


圖1為pET-28a- SPDcc-TNFSFlO質(zhì)粒的酶切鑒定；其中M表示Marker, 1表示沒有酶切的pET-28a-SPDcc-TNFSF10質(zhì)粒，2表示雙酶切后的 pET-28a- SPDcc-TNFSFlO質(zhì)粒。
圖2為新型重組人可溶性SPDcc-TNFSFlO融合蛋白制備及純度分析。其 中M表示蛋白Marker, 1誘導(dǎo)前菌體總蛋白；2表示誘導(dǎo)6h后菌體總蛋 白；3~6表示純化過程中的SPDcc-TNFSFlO融合蛋白；7表示純化后的 SPDcc-TNFSFlO融合蛋白，經(jīng)Bio-red凝膠成像分析軟件分析，其純度為 96.2% (上樣量30ug，考馬斯亮蘭染色)。
圖3穩(wěn)定性比較。正方形和圓形曲線分別代表SPDcc-TNFSFlO和天然 TNFSF10,縱坐標(biāo)表示在4。C保存不同時(shí)間后溶液上清殘余蛋白濃度。 圖4為不同腫瘤細(xì)胞的體外抗腫瘤活性比4交。圖4A: HL-60,圖4B: A549,圖4C: HCT-8;正方形和圓形曲線分別代表SPDcc-TNFSFlO和天 然TNFSF10,橫坐標(biāo)表示加入樣品的濃度，縱坐標(biāo)表示樣品加入后作用 72h的抑瘤率。
(五)
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述,但本發(fā)明的保護(hù)范圍 并不僅限于此實(shí)施例1: 一種新型重組人可溶性SPDcc-TNFSFlO融合蛋白基因工程菌 的構(gòu)建
按大腸桿菌密碼子偏好性人工合成編碼人SPD蛋白N端221~252位 氨基酸序列的核苷酸序列(見SEQIDNO: 8),其5，端包含一個(gè)Ncol酶 切位點(diǎn)和一個(gè)起始氨基酸Met的序列，3'端包含編碼TNFSF10胞外 114 118位氨基酸序列的核苷酸序列。
設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增SPDcc-WFSF10融合序列(見SEQIDNO: 9)，引物
為
Pl: 5， AAAATTCCATGGTTGCTTCTCTGCGT P2: 5， ACCTCTTTCTCTCACAGGGAACAACTCA P3: 5， TGAGTTGTTCCCTGTGAGAGAAAGAGGT P4: 5， CGCCCGAATTCTTAGCCAACTAAAAA
利用重疊PCR技術(shù)擴(kuò)增SPDcc-TNFSFlO融合序歹'j ，即先以人工合成 的人SPD螺旋結(jié)構(gòu)域(見SEQIDNO: 8)為模板，用Pl、 P2擴(kuò)增SPD 螺旋結(jié)構(gòu)域序列；再以pET-28a-TNFSF10為模板，用P3 、 P4擴(kuò)增 TNFSF10cDNA片斷。將擴(kuò)增得到的片段割膠回收，然后以回收得到的兩 個(gè)從cDNA片斷為模板、以Pl 、 P4為引物擴(kuò)增融合序列。
融合序列的5，和3'端分別包含Nco I和Eco R I酶切位點(diǎn)。融合序列 和原核表達(dá)載體pET-28a經(jīng)酶切、回收、連4妄后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞， 挑取陽性轉(zhuǎn)化克隆，抽提質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切、DNA測(cè)序等方法鑒定，得到 陽性重組表達(dá)載體質(zhì)粒pET-28a-SPDcc-TNFSF10,(圖1，圖1為pET-28a-SPDcc-TNFSF10質(zhì)粒的鑒定)。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),得到 表達(dá)SPDcc-TNFSF10融合蛋白的工程菌。挑取大量單菌落，經(jīng)誘導(dǎo)、篩選，最終得到一株穩(wěn)定的、表達(dá)量高的工程菌，命名為pET-28a-SPDcc-TNFSF 10-BL21 (DE3)。
實(shí)施例2:新型重組人可溶性SPDcc-TNFSFlO融合蛋白的制備 發(fā)酵培養(yǎng)基組成
甘油2.5mL
蛋白胨10g
酵母提取物5g
NaCl5g
K2HP044g
KH2P042g
Na2HP047g
MgS04.7H20lg
泡敵(GPE )1.5mL
自來水定容至IL。
發(fā)酵培養(yǎng)過程
種子培養(yǎng)取-80。C保存的pET-28a-SPDcc-TNFSF10-BL21(DE3)工程 菌保藏液1支，從中挑取1環(huán)，劃線至含Kan(Kan)的LB平板，37。C培 養(yǎng)過夜。次日挑取一個(gè)邊緣整齊、生長(zhǎng)良好的單菌落接種到含50昭/mL Kan的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基裝量為搖瓶的20 % ,搖床轉(zhuǎn)速200rpm, 37。C培養(yǎng)12h。
罐上發(fā)酵按l: 50接種量將過夜培養(yǎng)物接種到含3.5L發(fā)酵培養(yǎng)基 的NBS Bioflo 110發(fā)酵罐中發(fā)酵，37。C培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6 ~ 0.8左右 后，力。IPTG至終濃度為1 mM誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)添加ZnS04至終濃度為
1280uM。繼續(xù)培養(yǎng)6h放罐。中途補(bǔ)料約200mL25%( v/v)甘油、150mL 17% (w/v)的酵母提取物和150mL 17% (w/v)的蛋白胨，發(fā)酵過程中pH控 制在7.0、溶氧控制在50%。
每升發(fā)酵液可得50 80g濕菌體，目標(biāo)蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白的 50%以上。將100g菌體用IO倍體積的50mMTris-HCl(pH7.0)破壁緩沖液 懸浮，超聲破碎，離心、去除沉淀。上清先用0.45uM膜過濾，再用3KD Pall超慮膜超慮至200ml,用200ml 50mM PB(pH6.4)稀釋后繼續(xù)超慮至 200ml,重復(fù)上述步驟直至溶液pH達(dá)到6.4為止。將超慮后的樣品上到 已用50mM PB(pH6.4)緩沖液平纟軒好的SP離子交換柱上，；降樣品上完后 分別用50mM PB(pH6.4)和50mM PB(pH6.4) + 300mM NaCl兩種緩沖液清 洗去雜，然后用50mM PB(pH6.4) + 600mM NaCl緩沖液將目標(biāo)蛋白洗脫 下來。往SP柱洗脫樣品緩慢添加硫酸銨至60%飽和度，4。C靜置2h， 10000rpm離心20min,去上清；蛋白沉淀用20mMPB(pH7.5)重懸，用 0.45uM膜過濾后，分多次上到已用同樣緩沖液平衡好的Superdex75分子 篩上，收集洗脫峰。通過上述純化步驟得到的新型重組人可溶性 TNFSF10-SPD融合蛋白(見SEQIDNO: 5)電泳純度達(dá)96.2% (見圖2, 圖2為新型重組人可溶性SPDcc-TNFSFlO融合蛋白制備及純度分析)。
實(shí)施例3:穩(wěn)定性比較
將天然TNFSF10蛋白和實(shí)施例2得到的新型重組人可溶性 SPDcc-TNFSF10融合蛋白分別用20mM PBS (pH7.4)稀釋到3mg/ml，用 0.2pm膜過濾除菌后，置于4。C水箱中保存。分別于不同時(shí)間取樣， 10000rpm離心20min,測(cè)上清中殘余的蛋白濃度。結(jié)果(圖3，穩(wěn)定性比 較)表明，天然TNFSF10蛋白在4。C保存一天后，濃度由3mg/ml快速降到1.3mg/ml,而新型重組人可溶性SPDcc-TNFSF10融合蛋白在整個(gè)實(shí)驗(yàn) 觀察期內(nèi)蛋白濃度無明顯變化。表明添加SPD蛋白螺旋結(jié)構(gòu)域后， TNFSF10蛋白穩(wěn)定性在4 °C中有顯著提高。
實(shí)施例4:體外生物學(xué)活性
將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞(人白血病細(xì)胞HL-60，人肺癌細(xì)胞A549 以及人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8),用0.25%胰酶消化后，加入含10%胎牛血清 的RPMI-1640培養(yǎng)基中，吹打細(xì)胞使形成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，以lxl05cell/ml 重新接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100pd/孔。同時(shí)加入對(duì)倍連續(xù)稀釋的實(shí)施 例2得到的新型重組人可溶性SPDcc-TNFSFlO融合蛋白。37。C培養(yǎng)72 小時(shí)后，棄上清加入MTT，繼續(xù)孵化6小時(shí)，加入DMSO，振蕩IO分鐘， 用酶標(biāo)4義測(cè)570 nm處的OD值。結(jié)果(圖4,圖4為體外抗腫瘤活性比 較)顯示二者對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)均有一定程度的抑制作用，并呈劑量 依賴性。雖然對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效果和腫瘤類型有關(guān)，但是 SPDcc-TNFSFlO的抗肺瘤效果均明顯強(qiáng)于天然TNFSF10 。 SPDcc-TNFSFlO抑制50%人白血病細(xì)胞HL-60生長(zhǎng)所需的濃度只需約 lng/ml，而天然TNFSF10則需要10ng/ml左右。
實(shí)施例5:體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，
無菌條件下取生長(zhǎng)旺盛的人體腸癌HCT-8體內(nèi)第三代肺瘤模型，采 用插塊法約2mm^中瘤組織/鼠，異種移植于T細(xì)胞免疫缺陷棵小鼠右腋 皮下，棵小鼠置于層流架中飼養(yǎng)，所用的飼料、墊料、籠具及接觸的器械 等均應(yīng)高壓消毒后使用。待腫瘤生長(zhǎng)至50~70 mm3后(胂瘤接種后7天)， 開始給藥空白對(duì)照(生理鹽水，連續(xù)給藥IO天)、實(shí)施例2得到的新型重組人可溶性SPDcc-TNFSFlO (30、 10mg/kgiv連續(xù)10天)以及陽性對(duì) 照天然TNFSF10 ( 30、 10mg/kg iv連續(xù)10天)。其間每3~5天體外對(duì)腫 瘤(以卡尺測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑a、短徑b，腫瘤體積axb2)進(jìn)行動(dòng)態(tài)測(cè)量。 結(jié)果顯示SPDcc-TNFSFlO分別給藥30和10mg/kg靜脈注射連續(xù)給藥10 天后，人體腸癌HCT-8異種移植于T細(xì)胞免疫缺陷棵小鼠模型的相對(duì)肺 瘤增長(zhǎng)率分別為22.97%和30.07%;而天然TNFSF10分別30 mg/kg和 10mg/kg靜脈注射連續(xù)給藥10天后，相對(duì)腫瘤增長(zhǎng)率分別38.22%和 64.22%，表明SPDcc-TNFSF10體內(nèi)抗肺瘤效果明顯優(yōu)于天然TNFSFIO。序列表—ST25
<110>
<120〉
〈130〉
<160〉
<170>
<210> <211〉 〈212〉 <213〉
SEQUENCE LISTING
浙江大學(xué)
一種抗腫瘤融合蛋白及其應(yīng)用
Patentln version 3.4
1
281 PRT
Human astrovirus
<400〉 1
Met Ala Met Met Glu Val Gin Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gin Thr Cys 15 10 15
Val Leu lie Val lie Phe Thr Val Leu Leu Gin Ser Leu Cys Val Ala 20 25 30
Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gin Met Gin Asp Lys 35 40 45
Tyr Ser Lys Ser Gly lie Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr 50 55 60
Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gin Val 65 70 75 80
Lys Trp Gin Leu Arg Gin Leu Val Arg Lys Met lie Leu Arg Thr Ser 85 90 95
Glu Glu Thr lie Ser Thr Val Gin Glu Lys Gin Gin Asn lie Ser Pro 100 105 110
Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gin Arg Val Ala Ala His lie Thr Gly 115 120 125
Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu 130 135 140
Lys Ala Leu Gly Arg Lys lie Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly 145 150 155 160
His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val lie 165 170 175
His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr lie Tyr Ser Gin Thr Tyr Phe Arg Phe 180 185 190
Gin Glu Glu lie Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gin Met Val Gin 195 200 205
Tyr lie Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro lie Leu Leu Met Lys 210 215 220Ser Ala Arg 225AsnSerCys 230TrpSerLysAspAla 235序列表—ST25 Glu Tyr Gly LeuTyr 240
Ser lie TyrGinGly 245GlyliePheGluLeu 250LysGlu AsnAspArg 255lie
Phe Val SerVal 260ThrAsnGluHisLeu 265lieAspMet AspHis 270GluAla
Ser Phe Phe 275GlyAlaPheLeuVal 280Gly
<210> 2 〈211> 187 <212〉 PRT <213〉 Human astrovirus
<400〉 2
Thr Ser Glu 1GluThr 5lieSerThrValGin 10GluLys GinGinAsn 15lie
Ser Pro LeuVal 20ArgGluArgGlyPro 25GinAxgVal AlaAla 30Hislie
Thr Gly Thr 35ArgGlyArgSerAsn 40ThrLeuSerSer Pro 45AsnSerLys
Asn Glu Lys 50AlaLeuGlyArg 55LyslieAsnSerTrp Glu 60SerSerArg
Ser Gly His 65SerPheLeu 70SerAsnLeuHisLeu 75Arg AsnGlyGluLeu 80
Val lie HisGluLys 85GlyPheTyrTyrlie 90TyrSer GinThrTyr 95Phe
Arg Phe GinGlu 100GlulieI>ysGluAsn 105Thrl>ysAsn AspLys 110GinMet
Val Gin Tyr 115lieTyrLysTyrThr 120SerTyrProAsp Pro 125lieLeuLeu
Met Lys Ser 130AlaArgAsnSer 135CysTrpSerLysAsp Ala 140GluTyrGly
Leu Tyr Ser 145lie丁yrGin 150GlyGlyliePheGlu 155Leu LysGluAsnAsp 160
Arg lie PheValSer 165ValThrAsnGluHis 170Leulie AspMetAsp 175His
Glu Ala SerPhePheGlyAlaPheLeuValGly
180
185
<210〉 3
<211> 168
<212〉 PRT
<213〉 Human astrovirus
17序列表一ST25
<400> 3
Val Arg Glu Arg Gly Pro Gin Arg Val Ala Ala His lie Thr Gly Thr 15 10 15
Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys 20 25 30
Ala Leu Gly Arg Lys lie Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His 35 40 45
Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val lie His 50 55 60
Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr lie Tyr Ser Gin Thr Tyr Phe Arg Phe Gin 65 70 75 80
Glu Glu lie Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gin Met Val Gin Tyr 85 90 95
lie Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro lie Leu Leu Met Lys Ser 100 105 110
Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser 115 120 125
lie Tyr Gin Gly Gly lie Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg lie Phe 130 135 140
Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu lie Asp Met Asp His Glu Ala Ser 145 150 155 160
Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly 165
〈210> 4 <211> 32 <212> PRT
<213〉 Hu脇n astrovirus 〈400〉 4
Val Ala Ser Leu Arg Gin Gin Val Glu Ala Leu Gin Gly Gin Val Gin 15 10 15
His Leu Gin Ala Ala Phe ,Ser Gin Tyr Lys Lys Val Glu Leu Phe Pro 20 25 30
<210> 5 <211> 200 <212〉 PRT
〈213〉 Human astrovirus <400> 5
Val Ala Ser Leu Arg Gin Gin Val Glu Ala Leu Gin Gly Gin Val Gin 15 10 15
His Leu Gin Ala Ala Phe Ser Gin Tyr Lys Lys Val Glu Leu Phe Pro 20 25 30序列表一ST25
Val Arg Glu Arg Gly Pro Gin Arg Val Ala Ala His lie Thr Gly Thr35 40 45
Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys50 55 60
Ala Leu Gly Arg Lys lie Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His65 70 75 80
Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val lie His85 90 95
Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr lie Tyr Ser Gin Thr Tyr Phe Arg Phe Gin100 105 110
Glu Glu lie Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gin Met Val Gin Tyr115 120 125
lie Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro lie Leu Leu Met Lys Ser130 135 140
Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser145 150 155 160
lie Tyr Gin Gly Gly lie Phe Glu Leu Lys Glu Asn A印Arg lie Phe165 170 175
Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu lie Asp Met Asp His Glu Ala Ser180 185 190
Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly195 200
<210〉 6
<211〉 96
<212〉 DNA
<213> Unknown
〈220〉
<223>人工合成
〈400〉 6
gttgcttctc tgcgtcagca ggttgaggcccttcagggtc
gctttctctc aatacaagaa agttgagttgttccct
〈210〉 7
<211> 600
〈212〉 膽
<213> .Human astrovirus
<400> 7
6096
gttgcttctctgcgtcagcaggttgaggcccttcagggtc aagttcaaca cctccaggct60
gctttctctc3atac犯g犯ag"ttgagUgttccctgtga gagaaagaggtcctcagaga120
gtagcagctcacataactgggaccagaggaeLgeiagceL￡LC￡L cattgtcttctccaaactcc180
aagaatgaaaaggctctgggccgcaaaata aactcctggg aatcatcaaggagtgggcat240
tcattcctgagcaacttgcacttgaggaatggtgaactgg tcatccatga300序列表—ST25
atactttcgatttc鄉(xiāng)agg360
aacgsc肌acaaatggtccaatatatttacaaatacacaagttatcctgaccctatattg420
ttgatgaaaagtgctagaaatagttgttggtctaaagatgc解朋tatggactctattcc480
atct3tcaaggggg組atttgagctt犯ggaatttttgtttctgtaaca540
aatga^gcacttgatagacatggaccatgaagccagtttttttggggcctttttagttggc600
<210> 8 <211> 118 〈212> 腿 <213> Unknown
<220> 〈223〉 人工序列
〈400〉 8 aattccatggttgcttctctgcgtcagcaggttgaggcccttxagggtcaagttcaacac60
ctccaggctgctttctctcagttgagttgttccctgtgag柳a卿g118
<210> 9 <211〉 632 〈212〉 腿 〈213〉 Unknown
〈220〉 〈223〉 人工序列
〈400〉 9 aattccatggttgcttctc"tgcgtcagcaggttgaggcccttcagggtcaagttcaacac60
CtCC3ggCtgc"tttctc"tcaatac犯gaaagttgagttgttccctgtgag120
cctcagagagtagcagctcacataactgggaccagaggaagaagcaacacattgtcttct180
ccaaactccaagaatgaaaaggctctgggccgcaaaataaactcctgggaatcatcaagg240
agtgggcattcattcctgagcaacttgcacttgaggaatggtgaactggtcatccstg犯300
aaagggttttactacatctattcccaaacatactttcgatttcaggaggaaataaaagaa360
acg3caaac￡iaatggtccaaaatacacaagttatcctgac420
cctatattgttgatgaa肪gtgctagaaatctaaagatgcagaatstgga480
ctctattccatctatxaagggggaatatttgagcttaaggaatttttgtt540
atgagcacttgatagacatggaccatgaagccagtttttttggggccttt600
ttagttggctaagaattcgtcgacctgcatat632
20
權(quán)利要求
1. 一種抗腫瘤融合蛋白，包括至少一個(gè)生物活性分子和卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域，所述生物活性分子源自TNFSF10或其改構(gòu)體，所述卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域源自能天然形成多聚體的蛋白質(zhì)，或者源自根據(jù)能天然形成多聚體蛋白質(zhì)的卷曲結(jié)構(gòu)域進(jìn)行人工合成的多肽。
2. 如權(quán)利要求1所述的抗腫瘤融合蛋白，其特征在于所述生物活性分子 為具有下列氨基酉拼列的多肽之一①SEQIDNO: 1;②SEQIDNO: 2; ③SEQIDNO: 3。
3. 如權(quán)利要求1所述的抗肺瘤融好白，^^4于所錄曲結(jié)構(gòu)域源自A^ 表面活性蛋白D (&咖cto"/D),或者源自根據(jù)A^申表面活性蛋白 D的巻曲結(jié)構(gòu)域進(jìn)行人工合成的多肽。
4. 如權(quán)利要求3所述的^y中瘤融M白，其特4i^于所i^4曲結(jié)構(gòu)域?yàn)榫哂?SEQ ID NO: 4所示的MS菱序列的多肽或其改構(gòu)體。
5. 如權(quán)利要求3所述的抗腫瘤融M白，^4村球于所tt曲結(jié)構(gòu)域?yàn)镾EQ ID NO: 6所示核普S錄列編碼的多肽。
6. 如權(quán)利要求1所述的抗腫瘤融M白，^4寺4球于所述抗腫瘤融M白具有 SEQIDNO: 5所示的MJ錄列。
7. 如權(quán)利要求1所述的抗月中瘤融M白，^#4￡^于所述抗月中瘤融^"白為SEQ ID NO: 7所示核苷l姊列編碼的多肽。
8. 如權(quán)利要求1 7之一所述的抗腫瘤融好白，^^#棘于所述生物活性分子 與所述巻曲螺旋結(jié)構(gòu)域之間通過柔性連接鏈共價(jià)連接，所述柔性連接 鏈為1~20個(gè)氨基酸組成的多肽。
9. 如權(quán)利要求8所述的抗腫瘤融M白，^4^碌于所述柔性連接鏈為2 10 個(gè)氨基酸組成的多肽。
10. 如權(quán)利要求1 7之一所述的^U中瘤融M白在制備抗月中瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
提供一種新型的抗腫瘤融合蛋白，及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述抗腫瘤融合蛋白包括至少一個(gè)生物活性分子和卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域，所述生物活性分子源自TNFSF10或其改構(gòu)體，所述卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域源自能天然形成多聚體的蛋白質(zhì)，或者源自根據(jù)能天然形成多聚體蛋白質(zhì)的卷曲結(jié)構(gòu)域進(jìn)行人工合成的多肽。本發(fā)明新型融合蛋白中的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域能天然形成穩(wěn)定的3α螺旋，從而促進(jìn)融合蛋白形成穩(wěn)定的三聚體結(jié)構(gòu)，相比于天然TNFSF10，穩(wěn)定性好、利于保存，在體外對(duì)多種人體腫瘤細(xì)胞具有更顯著的凋亡誘導(dǎo)作用，其抗腫瘤活性有明顯提高。
文檔編號(hào)C07K19/00GK101456913SQ20081012147
公開日2009年6月17日 申請(qǐng)日期2008年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月14日
發(fā)明者吳雪昌 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)