專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種抗寒蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種抗寒蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，特別涉及一種來(lái)源于南極魚(yú)的耐寒蛋白及其編碼基因，與它們?cè)谔岣咧参锟购灾械膽?yīng)用。技術(shù)背景南極魚(yú)是已知的最耐寒的魚(yú)類(lèi)，其細(xì)胞可以在-l。C-2。C的低溫中完成包括個(gè)體發(fā)育在內(nèi)的所有生命活動(dòng)，寒冷環(huán)境下進(jìn)化形成的基因組編碼了低溫下生存所需的所有功能分子，是重要的基因資源(Gordon,A.L.2003.Oceanography:Thebrawniestretroflection.Nature421:904-905)。因此，對(duì)生活在不同溫度環(huán)境下的南極魚(yú)類(lèi)基因組的比較分析，以及相關(guān)基因的克隆鑒定、功能分析及其作用機(jī)制研究，有助于我們理解南極魚(yú)類(lèi)在0°C以下這樣極端的低溫環(huán)境下生存的機(jī)制。生活在南極的魚(yú)類(lèi)表現(xiàn)出了一系列與抗寒相關(guān)的生理和生化性狀，如抗凍蛋白的進(jìn)化(DeVries，A.L.1971.Glycoproteinsasbiologicalantifreezeagentsinantarcticfishes.Science172:1152-1155;Cheng,A.L.D.a.C,H.C.2005.AntifreezeProteinsandOrganismalFreezingAvoidanceinPolarFishes.FishPhysiology22:155-201;DeVries,A.L.C.,C.-H.C.2005.Antifreezeproteinsandorganismalfreezingavoidanceinpolarfishes,fishphysiologyseriesThephysiologyofpolarfishes(eds.Farrell,A.P.&Steffenson,J.F.).SanDiego,CA:ElsevierAcademicPress22:155-201)、熱休克應(yīng)答(theheat-shockresponse,HSR)的缺失(Hofmann,G.E.,Buckley,B.A.,Airaksinen,S.，Keen,J.E.,Somero,G.N.，2000.2000.Heat-shockproteinexpressionisabsentintheAntarcticfishTrematomusbernacchii(FamilyNototheniidae).J.Exp.Biol.203:2331—2339)，血液中紅血球大量減少甚至消失(Verde，C.,E.Parisi,andG.diPrisco.2006.Theevolutionofthermaladaptationinpolarfish.Gene385:137-145)，肌纖維的數(shù)目減少，直徑卻增大等等。那么這些低溫適應(yīng)的分子基礎(chǔ)是什么？在幾千萬(wàn)年的寒冷篩選后，魚(yú)類(lèi)產(chǎn)生了哪些功能上特異抗寒的基因？冷暖空氣的活動(dòng)是天氣變化的基本原因之一。在特定的天氣形勢(shì)下，聚積在高緯度地區(qū)的強(qiáng)冷空氣迅速南下，入侵我國(guó)，造成大范圍的劇烈降溫，并伴有大風(fēng)、雨雪、凍害等現(xiàn)象，這類(lèi)天氣過(guò)程稱(chēng)為寒潮或強(qiáng)冷空氣，由此所造成的損失稱(chēng)為寒潮與冷凍災(zāi)害。寒冷的氣候會(huì)造成農(nóng)作物的大量減產(chǎn)，在美國(guó)，每年由于寒冷而導(dǎo)致農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失達(dá)幾十億美元，例如1998年12月份，加利福尼亞州由于冰凍災(zāi)害而柑橘大面積死亡，直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)5億9千萬(wàn)美元。在中國(guó)每年平均有6—7億畝農(nóng)田蒙受寒冷的氣候的危害，糧食減收200億公斤(中國(guó)可持續(xù)發(fā)展信息網(wǎng)2003.10.13)。若能利用已發(fā)現(xiàn)的抗寒基因培育出新型的具有抗寒的轉(zhuǎn)基因植物，能夠使轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物具有更強(qiáng)的耐寒能力，在室外溫度突然下降的情況下保持其生理活性，從而使農(nóng)作物免受寒冷的災(zāi)害。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種抗寒蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的抗寒蛋白，名稱(chēng)為Calmodulin,來(lái)源于南極鱈魚(yú)(歷'"osWc力^/^MOTi)，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)自序列表中的SEQIDW2.2的氨基端殘基序列；2)將自序列表中的SEQIDW.2的氨基端殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗寒活性的蛋白質(zhì)。其中，序列表中的序列2由149個(gè)氨基酸殘基組成。所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。為了使l)中的Calmodulin便于純化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的N端或C端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表l.標(biāo)簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>上述2)中的Calmodulin可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述2)中的Calmodulin的編碼基因可通過(guò)將序列表中SEQIDW2:l的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)編碼氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。為了便于蛋白的分泌表達(dá)，還可在所述Calmodulin的氨基末端添加上信號(hào)肽序列。上述抗寒蛋白的編碼基因(Gene1—Calmodulin)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述抗寒蛋白的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDW2:1的核苷酸序列；2)編碼序列表中SEQIDJV2:2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQIDW:1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。上述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為在O.lxSSPE(或O.lxSSC)，0.1。/。SDS的溶液中，在65°C下雜交并洗膜。其中，序列表中的SEQIDW2:1由450個(gè)脫氧核苷酸組成。自序列表中SEQIDJV2:1的5，端的第1至450位核苷酸為Genel_Calmodulin的開(kāi)放閱讀框(OpenReadingFrame,ORF),序列表中序列1編碼序列表中序列2的核苷酸序列。含有本發(fā)明基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的抗寒基因以南極鱈魚(yú)(歷'"^Wc力^歷s^朋力這個(gè)特殊的物種為研究材料，利用cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和測(cè)序的技術(shù)發(fā)現(xiàn)并利用RT-PCR的方法獲得全長(zhǎng)序列。將本發(fā)明的抗寒基因轉(zhuǎn)入煙草中，獲得了可穩(wěn)定表達(dá)本發(fā)明的抗寒基因的轉(zhuǎn)基因煙草，經(jīng)過(guò)低溫實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)入本發(fā)明抗寒基因的煙草在低溫(4°C)下生長(zhǎng)20天仍保持旺盛的生長(zhǎng)狀態(tài)，沒(méi)有萎蔫，證實(shí)本發(fā)明的抗寒基因具有抗寒功能，可轉(zhuǎn)入植物中提高植物的抗寒性。對(duì)改善植物，特別是糧食和經(jīng)濟(jì)作物的耐寒品質(zhì)，提高其抵抗自然低溫災(zāi)害的能力對(duì)我們經(jīng)濟(jì)發(fā)展有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。圖1為pCAPE3的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為野生型植株熒光鑒定照片。圖3為轉(zhuǎn)pCAPE3煙草植株熒光鑒定。圖4為轉(zhuǎn)基因煙草RT-PCR鑒定電泳圖。圖5為4。C處理20天的轉(zhuǎn)pCAPE-Calmodulin煙草和對(duì)照的表型。圖6為23"C恢復(fù)生長(zhǎng)15天表型的轉(zhuǎn)pCAPE-Calmodulin煙草和對(duì)照的表型。圖7為正常培養(yǎng)30天和在4度處理20天轉(zhuǎn)pCAPE-Calmodulin煙草和對(duì)照的Fv/Fm值。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中的百分含量，如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。實(shí)施例l、抗寒基因及其編碼蛋白的獲得及其抗寒應(yīng)用一、本發(fā)明的抗寒基因及其編碼蛋白的獲得本發(fā)明的發(fā)明人通過(guò)構(gòu)建了南極鱈魚(yú)(歷'ssM"c力ws/a3『s朋力的cDNA文庫(kù)，并對(duì)該文庫(kù)的EST序列進(jìn)行了大規(guī)模測(cè)序，最后通過(guò)序列拼接和BLAST分析得到了一系列感興趣的基因，并對(duì)其中一個(gè)可能具有抗寒功能的基因進(jìn)行分析研究，并按照下述方法獲得該基因的序列。設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，引物序列如下所示上游弓I物CaM-F:5'-CGCCGACGCGTATGGCTGATCAGCTTACAGA-3'下游弓I物CaM-R:5'-CGCCGGAATTCTCACTTCGCCGTCATCATTT-3'利用TRIZOL試劑提取南極鱈魚(yú)(ZV^sosz^c/iAs鵬MOT力(Karl-HermannKockl,Ke他Reid，JohnCroxallandStephenNicol2007FisheriesintheSouthernOcean:anecosystemapproachPhil.Trans.R.Soc.B362,2333-2349，中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所)的肝臟RNA，以此RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA，反轉(zhuǎn)錄具體方法如下所述在EP管中加入RandomPrimers1.0fil(100ng)，南極鱈魚(yú)(歷^sos"c力iAs歷a『s朋力的肝臟RNA2.0^(5(ig)，dNTPmix(10mM)1.0pl，水(RNA-free)8.0在65。C溫育5min，至于冰上5min，然后加入5Xfirst-strandBuffer4.0|il，DTT(0.1M)2.0|il，Rnaseout(40U/(il)1.0(il，混勻后，25。C放置2min;加入1.0jilSuperSeripteIIRT輕輕混勻，25°(3下放置10min。將混合物置于42t:反應(yīng)50min，置于7(TC下加熱15min終止反應(yīng)，即得第一鏈cDNA。以此cDNA為模板，在引物CaM-F和引物CaM-R的引導(dǎo)下，用常規(guī)PCR法擴(kuò)增抗寒基因的cDNA序列。其中，反應(yīng)體系(50fil體系)為上述獲得的含第一鏈cDNA的反應(yīng)液2fi1，10Xbuffer5(il，dNTP混合液(25mM)2)iil，CaM-F(lO(iM)2pl，CaM-R(10HM)2fil，TaqDNA聚合酶(2.5U/fi1)0.5(il，滅菌水36.5^1。反應(yīng)程序?yàn)?5。C預(yù)變性5min;然后95。C變性30s，56。C退火30s，72。C延伸lmin進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72'C延伸10min，4°C下保存。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1X瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收并純化得到450bp的DNA片段，將該片段進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增得到的片段具有序列表中序列1的核苷酸序列，將其命名為Genel一Calmodulin。序列表中序列1的核苷酸序列是由450個(gè)脫氧核苷酸組成，自序列表中序列1的5'端第1-450位核苷酸序列為編碼序列(0RF)，編碼具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。將該蛋白命名為Calmodulin二、利用本發(fā)明的抗寒基因及其編碼蛋白提高植物抗寒性的應(yīng)用1、可在植物中表達(dá)本發(fā)明的抗寒基因的重組表達(dá)載體的構(gòu)建將pCAPE2(來(lái)自PEBV-VIGS載體系統(tǒng)(由兩個(gè)T-DNA質(zhì)粒(pCAPEl,pCAPE2)組成)，Constantin,G.D.,B.N.Krath,S.A.MacFarlane，M.Nicolaisen,I.E.Johansen,andO.S.Lund.2004.Virus-inducedgenesilencingasatoolforfunctionalgenomicsinalegumespecies.PlantJ40:622-631;中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所)進(jìn)行了改造。增加了MluI、EcoRI、Sall、Sacl、Ncol酶識(shí)別位點(diǎn)。具體的改造方法為合成含有上述酶切位點(diǎn)的核苷酸片段插入到pCAPE2的NcoI和EcoRI酶切位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒。將鑒定正確的增加了M/mI、五coRI、5"acl、A^oI酶識(shí)別位點(diǎn)的重組質(zhì)粒命名為pCAPE3(其結(jié)構(gòu)示意圖如圖l所示)。按照步驟一的方法擴(kuò)增Genel—Calmodulin基因，然后用MM和￡coRI雙酶切后，將酶切得到Genel—Calmodulin基因片段插入到pCAPE3的M/"I和五coRI酶切位點(diǎn)之間得到重組載體，將該重組載體進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定，將鑒定正確的含有Genel—Calmodulin基因片段的重組載體命名為pCAPE-Calmodulin。2、轉(zhuǎn)入本發(fā)明的抗寒基因的轉(zhuǎn)基因煙草的獲得1)轉(zhuǎn)pCAPE-Calmodulin煙草的獲得分別pCAPEl、pCAPE3及pCAPE-Calmodulin轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌GV3101(購(gòu)自promega公司)后，鑒別，挑取轉(zhuǎn)化成功的克隆，劃線(xiàn)28i:培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定，將鑒定表明正確的含有pCAPEl的工程菌株命名為GV-pCAPEl，將鑒定表明正確的含有pCAPEl的工程菌株命名為GV-pCAPE3，將鑒定正確的含有pCAPE-Calmodulin的工程菌株命名為GV-pCAPE-Calmodulin;挑取上述GV-pCAPE1、GV-pCAPE3或GV-pCAPE-Calmodulin分別接種到5ml添加50mg/L利福平(Rif)和50mg/L卡那霉素(Kana)的LB培養(yǎng)基中28。C培養(yǎng)過(guò)夜；然后將培養(yǎng)過(guò)夜的菌液分別轉(zhuǎn)接到50ml添加50mg/L利福平(Rif)、50mg/L卡那霉素(Kana)、20乙酰丁香酮(Acetosyringone)和10mM2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES)(MES)的LB培養(yǎng)基中，28。C培養(yǎng)過(guò)夜；離心收集上述GV-pCAPEl、GV-pCAPE3或GV-pCAPE-Calmodulin菌液，然后重懸在添加了10mMMgCl2、10mM2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES)(MES)+200乙酰丁香酮(Acetosyringone)的LB培養(yǎng)基中，調(diào)OD6(K)=2.0，在室溫下靜置3小時(shí)得到OD,為2.0的GV-pCAPEl、GV-pCAPE3或GV-pCAPE-Calmodulin菌液。將上述獲得的OD,為2.0的GV-pCAPEl菌液分別與GV-pCAPE3菌液或GV-pCAPE-Calmodulin菌液按照1:1的體積比混合，得到GV-pCAPEl與GV-pCAPE3的混合菌液和GV-pCAPEl與GV-pCAPE-Calmodulin的混合菌液。將煙草本氏煙(Nicotianabenthamiana，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所)播種于蛭石中，在25"C培養(yǎng)間內(nèi)，16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗培養(yǎng)，長(zhǎng)到5-6片展開(kāi)葉時(shí)用于農(nóng)桿菌注射。將上述得到的GV-pCAPEl與GV-pCAPE3的混合菌液或者GV-pCAPEl與GV-pCAPE-Calmodulin的混合菌液分別注射上述5-6片展開(kāi)葉的煙草，注射時(shí)要注射近軸端的嫩葉。將注射后的煙草于23度，40%濕度，16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗溫室下培養(yǎng)25天得到轉(zhuǎn)pCAPE-Calmodulin煙草或轉(zhuǎn)pCAPE3煙草。2)轉(zhuǎn)pCAPE-Calmodulin煙草的鑒定A、轉(zhuǎn)pCAPE3煙草的鑒定將步驟l)得到的轉(zhuǎn)pCAPE3煙草進(jìn)行表達(dá)情況熒光鑒定，具體方法為取l平方厘米的轉(zhuǎn)pCAPE3煙草和野生型煙草本氏煙(Nicotianabenthamiana)(作為野生型對(duì)照，WT)葉片，置于蓋玻片上，滴蒸餾水一滴，壓片，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)入pCAPE3和pCAPEl的陽(yáng)性植株在激光共聚焦顯微鏡的470nm激發(fā)下顯示綠色熒光；同時(shí)用激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)pCAPE3煙草和野生型煙草本氏煙(Nicotianabenthamiana)的葉綠體熒光作為對(duì)照。結(jié)果如圖2和圖3所示，結(jié)果表明有6株轉(zhuǎn)pCAPE3煙草全部為成功轉(zhuǎn)入pCAPE3和pCAPEl并且可在煙草中正常表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草。圖2中，A為野生型煙草的GFP熒光照片，B為野生型煙草的葉綠體熒光照片，C為A和B所示熒光的重疊。圖3中，A為轉(zhuǎn)pCAPE3煙草的GFP熒光照片，B為轉(zhuǎn)pCAPE3煙草的葉綠體熒光照片，C為A和B所示熒光的重疊。B、轉(zhuǎn)pCAPE-Calmodulin煙草的鑒定將上述步驟1)得到的轉(zhuǎn)pCAPE-Calmodulin煙草通過(guò)RT-PCR的鑒定，RT-PCR的引物為上游引物Cal-up:TGAGTTCAAGGAGGCATTTTCG;下游弓I物Cal國(guó)down:CACTTCGCCGTCATCATTTGTA。以步驟1)獲得的轉(zhuǎn)pCAPE-Calmodulin煙草的第一鏈cDNA模板為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。同時(shí)以26SrRNA作為對(duì)照，PCR擴(kuò)增引物為5'端上游引物為GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC;3，端下游引物為T(mén)CTCCCTTTAACACCAACGG。其中，反應(yīng)體系(50fJ體系)為含轉(zhuǎn)pCAPE-Calmodulin煙草的第一鏈cDNA2[il(O.lug)，10xbuffer5|il，dNTP混合液(25mM)2fil，Cal-up(10嗎/L)2pl，Cal—down(10|ig/L)2jil，TaqDNA聚合酶(2.5U/iul)0.5|ul，滅菌水36.5|il。反應(yīng)程序?yàn)?5t:預(yù)變性5min;然后95。C變性30s，56"C退火30s，72。C延伸lmin進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72"延伸10min，4°C下保存。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，440bp的DNA片段即是目標(biāo)片段。結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明有6株轉(zhuǎn)pCAPE-Calmodulin煙草中Gene1—Calmodulin基因已全部成功通過(guò)pCAPE-Calmodulin轉(zhuǎn)入煙草中并在該轉(zhuǎn)pCAPE-Calmodulin煙草中正常表達(dá)。3、轉(zhuǎn)入本發(fā)明的抗寒基因的煙草(轉(zhuǎn)pCAPE-Calmodulin煙草)抗寒性的鑒定將步驟2鑒定陽(yáng)性的轉(zhuǎn)pCAPE3煙草(對(duì)照)、轉(zhuǎn)pCAPE-Calmodulin煙草和煙草本氏煙(Nicotianabenthamiana，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所)的種子萌發(fā)后生長(zhǎng)25天，然后分別置于4。C，16h光照/8h黑暗，生長(zhǎng)20天，然后再在23。C，16h光照/8h黑暗，恢復(fù)生長(zhǎng)15天，同時(shí)設(shè)置在23"C，16h光照/8h黑暗的條件下生長(zhǎng)，其余條件相同的轉(zhuǎn)pCAPE3煙草(對(duì)照)、轉(zhuǎn)pCAPE-Calmodulin煙草和野生型煙草作為陽(yáng)性對(duì)照。在培養(yǎng)的過(guò)程中對(duì)植株進(jìn)行表型觀察。如圖5所示，轉(zhuǎn)基因煙草在4°C，16h光照/8h黑暗，生長(zhǎng)20天后，對(duì)照組植株(轉(zhuǎn)pCAPE3煙草，圖5中對(duì)照)有明顯的冷傷害的表型，植株精干彎曲，葉片萎靡，而轉(zhuǎn)pCAPE-Calmodulin煙草(圖5中Genel—Calmodulin)則在4"C低溫處理后生長(zhǎng)依舊良好，低溫處理并沒(méi)有導(dǎo)致其有不良反應(yīng)。在植株4r冷處理20天后，置于23'C，16h光照/8h黑暗，恢復(fù)生長(zhǎng)15天后其表型如圖6所示，可以看到，對(duì)照組植物(圖6中對(duì)照)在冷處理受到低溫傷害后再置于正常溫度下培養(yǎng)，依舊不能恢復(fù)到正常的生長(zhǎng)狀態(tài)，說(shuō)明4r的低溫處理對(duì)煙草的傷害是永久性的，不可恢復(fù)的，而轉(zhuǎn)pCAPE-Calmodulin煙草(圖6中Genel—Calmodulin)，4。C冷處理20天后，置于23。C恢復(fù)生長(zhǎng)15天后，植株能夠繼續(xù)正常生長(zhǎng)發(fā)育，沒(méi)有表現(xiàn)出任何低溫所造成的傷害性狀。為了進(jìn)一步證實(shí)轉(zhuǎn)基因植株的抗寒能力，我們進(jìn)一步測(cè)定了上述轉(zhuǎn)pCAPE-Calmodulin煙草在正常培養(yǎng)30天和在4度處理20天的光合作用系統(tǒng)II光化學(xué)效率(Fv/Fm)這一生理指標(biāo)(Tarantino,D.,Vianelli,A.,Carraro，L.andSoave,C.(1999)AnuclearmutantofJraZnVin9拜'sselectedforenhancedsensitivitytolight-chillstressisalteredinPSIIelectrontransportactivity.尸/zj^Zo/.尸/awt107,361-371)，以轉(zhuǎn)pCAPE3煙草為對(duì)照。結(jié)果如圖7所示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明對(duì)照組植株的FV/Fm下降明顯，而轉(zhuǎn)pCAPE-Calmodulin煙草植株FV/Fm下降很小，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)Genel—Calmodulin煙草植株對(duì)低溫有明顯的抗性。表明Genel—Calmodulin具有抗寒的功能。序列表<160>2<210〉1<211>450<212>DNA〈213〉南極魚(yú)雪魚(yú)("i5^0SZ^'C力WS/Za^5^72力<400〉1atggctgatcagcttacagaagagcagattgctgagttcaaggaggcattttcgctcttt60gacaaggatggcgatggcaccatcaccaccaaagagctgggcacagtgatgcgctctctg120ggccagaaccccactgaggcagagctgcaggacatgatcaatgaagtggatgctgatgga180aatgg犯cg3tsgscttccc3geigttcctcaccatgeitggccsgga3g3tgaaggscaca240gacagcgaggaggagatcagagaagcattccgtgtctttgacaaggatggcaatggatac300atcagtgctgctgagctgcgccatgtgatgacaaacctgggggagaagctgactgacgag360gaagtggacgagatgatcagagaagcagacattgacggagatggtcaggtcaactatgaa420gagttcgtacaaatgatgacggcgaagtga450〈210〉2<211〉149<212>PRT〈213〉南極鱈魚(yú)(Z^5^5^'C力W51鵬『SO/2力〈400〉2MetAlaAspGinLeuThrGluGluGinlieAlaGluPheLysGluAla151015PheSerLeuPheAspLysAspGlyAspGlyThrlieThrThrLysGlu202530LeuGlyThrValMetArgSerLeuGlyGinAsnProThrGluAlaGlu354045LeuGinAspMetlieAsnGluValAspAlaAspGlyAsnGlyThrlie505560AspPheProGluPheLeuThrMetMetAlaArgLysMetLysAspThr65707580AspSerGluGluGlulieArgGluAlaPheArgValPheAspLysAsp859095GlyAsnGlyTyrlieSerAlaAlaGluLeuArgHisValMetThrAsn100105110LeuGlyGluLysLeuThrAspGluGluValAspGluMetlieArgGlu115120125AlaAsplieAspGlyAspGlyGinValAsnTyrGluGluPheValGin130135140MetMetThrAlaLys14權(quán)利要求1、一種抗寒蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)自序列表中的SEQID№.2的氨基酸殘基序列；2)將自序列表中的SEQID№.2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗寒活性的蛋白質(zhì)。2、權(quán)利要求l所述的抗寒蛋白的編碼基因。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述抗寒蛋白的cDNA基因具有下述核苷酸序列之一1)自序列表中SEQIDW2:l的核苷酸序列；2)編碼序列表中SEQIDW:2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQIDW:1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。4、含有權(quán)利要求2或3所述的抗寒蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體。5、含有權(quán)利要求2或3所述的抗寒蛋白的編碼基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。6、含有權(quán)利要求2或3所述的抗寒蛋白的編碼基因的宿主菌。7、權(quán)利要求1所述的抗寒蛋白在提高植物或動(dòng)物的抗寒性中的應(yīng)用。8、權(quán)利要求2或3所述的抗寒蛋白的編碼基因在提高植物或動(dòng)物的抗寒性中的應(yīng)用。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為煙草。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種抗寒蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。該蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQID№2；2)將序列表中SEQID№2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗寒活性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的抗寒基因具有抗寒功能，可轉(zhuǎn)入植物中提高植物的抗寒性。對(duì)改善植物，特別是糧食和經(jīng)濟(jì)作物的耐寒品質(zhì)，提高其抵抗自然低溫災(zāi)害的能力對(duì)我們經(jīng)濟(jì)發(fā)展有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。文檔編號(hào)C07K14/435GK101402678SQ20081022651公開(kāi)日2009年4月8日申請(qǐng)日期2008年11月13日優(yōu)先權(quán)日2008年11月13日發(fā)明者波馮,王道文,鵬胡,許廣會(huì),陳良標(biāo)申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所