專(zhuān)利名稱(chēng)：：新型吲哚衍生化合物以及包含它們的藥物組合物的制作方法新型吲哚衍生化合物以及包含它們的藥物組合物具有早期終止密碼子的mRNA的降解方法(無(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解，NMD)是定性控制的方法，在迄今為止的所有真核生物研究中得以確認(rèn)(CONTI和IZAURRALDE,2005;MAQUAT,2004a)。這種機(jī)理的功用之一是降解具有提前終止密碼子(PTC)的mRNA以阻止截短蛋白的合成，所述截短蛋白是無(wú)功能或其功能對(duì)細(xì)胞可能有害。此外，已確認(rèn)在酵母、果蠅和哺乳動(dòng)物的基因調(diào)控中涉及NMD路徑(HE等人，2003;MENDELL等人，2002;REHWINKEL等人，2005;SUREAU等人，2001;WOLLERTON等人，2004)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，NMD在前信使RNA的拼接之后發(fā)生，并在大部分情況下，通過(guò)位于外顯子-外顯子拼接(exon-exonjunction)上游的20-24核苷酸的蛋白質(zhì)復(fù)合物調(diào)節(jié)(Conti禾QIzaurralde,2005;Lejeune和Maquat,2005;Maquat，2004b)。推測(cè)被稱(chēng)為外顯子拼接復(fù)合物EJC的該蛋白質(zhì)復(fù)合物募集留存的UPF蛋白質(zhì)，其在NMD中擔(dān)當(dāng)重要角色，迄今為止并未被表征。在"第一轉(zhuǎn)換周期"(Ishigaki等人2001)期間，識(shí)別到PTC，且目標(biāo)mRNA通過(guò)5，向3'消化被降解，涉及帽(cap)以及外切核酸酶如hXRNl和hXRN2/hRATl的除去，和通過(guò)3，向5，消化被降解，涉及脫腺苷酸化和胞外體(exosome)(Chen和Shyu,2003;Couttet和Grange,2004;Lejeune等人，2003)。UPF1為磷蛋白，其在NMD過(guò)程中經(jīng)歷磷酸化/脫磷酸化循環(huán)(Ohnishi等人，2003;Page等人，1999;Pal等人，2001)。顯示出UPF1與酵母中(Czaplinski等人，1998)和哺乳動(dòng)物中(Kashima等人，2006)的轉(zhuǎn)化終止因子相互作用，因此可為EJC和轉(zhuǎn)化終止復(fù)合物之間的連接。最近在哺乳動(dòng)物細(xì)胞(Hosoda等人，2005)中顯示了hUPFl和帽結(jié)合蛋白質(zhì)CBP80之間的直接相互作用，表明hUPFl在第一轉(zhuǎn)化循環(huán)之前或其過(guò)程中建立復(fù)合物相互作用。顯示hUPFl的磷酸化通過(guò)hSMGl進(jìn)行，所述hSMGl為與PI3有關(guān)的激酶(Page等人，1999;Pal等人，2001;Yamashita等人，2001)，并需要hUPF2和hUPF3(Kashima等人，2006)的存在。與此相反，hUPFl的脫磷酸化需要多-蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在，所述多蛋白質(zhì)由hSMG5、hSMG6、hSMG7和(PP)-2A磷酸酯酶蛋白質(zhì)(Chiu等人，2003;Ohnishi等人，2003)組成。hSMG5和hSMG7蛋白質(zhì)主要位于細(xì)胞質(zhì)中，其部分存在于處理小體(processingbodies,P-小體)(Unterholzner和Izaurralde,2004)。hSMG6也是細(xì)胞質(zhì)類(lèi)蛋白質(zhì)，其在某些細(xì)胞質(zhì)集合體(cytoplasmicfod)富集，該某細(xì)胞質(zhì)集合體似乎與P-小體不同，其性質(zhì)仍然探索之中(Unterholzner和Izaurralde,2004)。已描述了P-小體在高級(jí)和低級(jí)真核細(xì)胞中(Cougot等人，2004;Sheth和Parker,2003)。在哺乳動(dòng)物中，這些細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)包含參與mRNA降解的多種因子，包括除去用于帽的機(jī)理的組分，如DCPla(Ingelfinger等人，2002)、DCP2(Ingelfmger等人，2002;vanDijk等人，2002)、GE1(Yu等人，2005)也稱(chēng)作HEDLS(Fenger-Gron等人，2005)、p54/RCK(Cougot等人，2004)、去腺嘌呤酶CCR4(Cougot等人，2004)、XRN1(Bashkirov等人，1997)、參與涉及RNA方法的不同方面的LSM1-7復(fù)合物(Cougot等人，2004;Ingelfmger等人，2002)，和NMD機(jī)械的組分，其為hUPFl、hSMG5和hSMG7(Fukuhara等人，2005;Unterholzner和lzaurralde,2004)。P-小體的功能仍不確定，但它們可用作非-轉(zhuǎn)化的mRNA和參與mRNA降解(Brengues等人，2005;Pillai等人，2005;Teixeira等人，2005)和/或位于RNA降解點(diǎn)(Cougot等人，2004;Sheth和Parker,2006)的蛋白質(zhì)的儲(chǔ)藏室。如今，將近三分之一的人類(lèi)遺傳疾病源自早期終止密碼子(Frischmeyer和Dietz,1999;Kuzmiak和Maquat,2006)的出現(xiàn)。在許多情況下，通過(guò)NMD機(jī)理，終止密碼子引起帶有其的mRNA降解。結(jié)果是相關(guān)基因不表達(dá)，并且當(dāng)所涉及的突變將允許功能截短蛋白轉(zhuǎn)化時(shí)依然如此。通過(guò)抑制感染該病變的病人體內(nèi)的NMD機(jī)理，可能恢復(fù)功能截短蛋白的表達(dá)，這是關(guān)注的方向。發(fā)明人已表明特定的吲哚衍生物能特定地在體外和在體內(nèi)抑制NMD，所述化合物使得感染杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(DMD)的病人細(xì)胞系中帶有提前終止密碼子的抗肌萎縮蛋白(dystrophin)的mRNA表達(dá)水平上升。相應(yīng)地，本發(fā)明的第一目的涉及對(duì)應(yīng)于下列通式II的衍生自n引哚的化合物，所述化合物藥學(xué)上可接受的鹽、它們的異構(gòu)體和/或其混合物R5R7通式n其中X代表N、CR8或脫水基質(zhì)N+R8，其中R8代表氫原子、任選地被苯基取代的羥基或烷基或甲氧基，優(yōu)選R8代表氫原子，R2、R3和R4獨(dú)立地代表氫原子或鹵原子或任選地被取代的烷基、胺、烯烴、酉旨、氨磺酰、醚基團(tuán)，如甲氧基或三氟甲氧基，或芐基，-R5代表氫原子或任選地被取代的飽和或不飽和的烷基、胺、芐基，R6代表任選地被取代的Cl-C3烷基，優(yōu)選甲基或乙基，且更優(yōu)選R6代表甲基，R7代表氫原子或任選地被取代的Cl-C3烷基，當(dāng)環(huán)A在b位置時(shí)不存在R7，和R9和R10—起代表碳鍵或獨(dú)立地代表R11、ORll、SRll、NR11R12基團(tuán)，其中R11和R12獨(dú)立地代表氫原子、氧原子、任選地被取代的飽和或不飽和的Cl-C3烷基，其可包含一個(gè)或多個(gè)硫、氧或氮原子。優(yōu)選當(dāng)Rll和/或R12代表被取代的垸基時(shí)，該烷基被鹵素，優(yōu)選氟取代。A代表環(huán)，當(dāng)A在a或b位置時(shí)，對(duì)應(yīng)于<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>其中Rl代表氫、氧或鹵原子，或任選地被取代的、直鏈或支鏈的和/或不飽和的垸基或胺基團(tuán)，和Z代表R1基團(tuán)；涉及所述化合物的藥學(xué)上可接受的鹽，它們的異構(gòu)體和/或其混合"鹵原子"表示F、Cl、Br和I，和更特別地為C1。"不飽和的烷基"表示具有至少一個(gè)雙鍵的烷基。有利地X代表N或脫水基質(zhì)N+R8。在當(dāng)X代表脫水基質(zhì)^R8和當(dāng)R5代表氫的情況下，在下述兩種形式之間存在平衡有利地，R2、R3和R4各自獨(dú)立地代表氫原子或鹵原子或任選地被取代的烷基、胺、烯烴或芐基。還有利地，R2、R3和R4各自獨(dú)立地代表氫原子或鹵原子或Cl-C4烷基，和優(yōu)選R2、R3和R4代表氫原子。優(yōu)選R2、R3和/或R4各自獨(dú)立地代表選自F，Cl，Br或I的卣原子，優(yōu)選所述鹵原子為C1原子。有利地，R5代表氫原子或飽和或不飽和的垸基，如甲基、乙基、丙基或丁基，和更優(yōu)選R5代表氫原子。有利地，R7代表甲基或乙基，和更優(yōu)選R7代表甲基。有利地，Rl為氫、氧或鹵原子。有利地，R9和R10各自獨(dú)立地代表氫原子、Rll、ORll或SRll基團(tuán)。在第一特定具體實(shí)施方式中，當(dāng)R9代表不為氫原子的基團(tuán)時(shí)，則有利地，R9代表ORll基團(tuán)，其中R11代表氫原子、任選地被取代的飽和或不飽和的Cl-C3烷基(其可包含一個(gè)或多個(gè)硫、氧或氮原子)，優(yōu)選甲基。優(yōu)選，通式I的化合物符合下述通式在第二特定具體實(shí)施方式中，當(dāng)R10代表不為氫原子的基團(tuán)時(shí)，則R9代表氫原子。有利地，R9和R10均代表氫原子。通式II的化合物則符合下述通式Ia:其中R2、R3、R4、R5、R6、R7、X和環(huán)A如之前所定義。優(yōu)選的通式Ia的化合物為5,8-二甲基-6(5-甲基-吡啶-2-基胺)-異喹啉。通式Ia的另一優(yōu)選的化合物為5，8-二甲基-6-(吡啶-2-基氨基)-2&異喹啉-l-酮。優(yōu)選，R9和R10代表氫，X代表N或脫水基質(zhì)N+R8。在第三特定具體實(shí)施方式中，R9和R10—起代表碳鍵，則通式II的化合物符合下述通式Ib:R5^通式Ib其中R2、R3、R4、R5、R6、R7、X和環(huán)A如之前所定義。通式Ia還有利地，環(huán)A在a位置。在第四特定具體實(shí)施方式中，環(huán)A代表R1其中R1代表氫、氧或鹵原子，或任選地被取代的、直鏈或支鏈的和/或不飽和的烷基或胺基團(tuán)。當(dāng)環(huán)A具有下列通式時(shí)其可無(wú)差別地代表基團(tuán)R1R1,R13丄<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>或其中R13代表氫原子或任選地被取代的Cl-C4垸基，且Rl如之前所定義。有利地，環(huán)A代表基團(tuán)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>其中R1代表氧原子，胺基團(tuán)或任選地被取代的、直鏈或支鏈的和z或不飽和的垸基，且R13代表任選地被取代的Cl-C4烷基。還有利地，環(huán)A代表基團(tuán)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>其中R1代表氫、氧或卣原子，或任選地被取代的、直鏈或支鏈的和/或不飽和的烷基或胺基團(tuán)，優(yōu)選氫原子或鹵素，優(yōu)選氯原子。在另一優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，A選自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>在根據(jù)本發(fā)明所述的具體實(shí)施方式中，通式n的衍生自吲哚的化合物符合下列通式I:R2、<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>通式I其中R2、R3、R4、R5、R6、R7、X和環(huán)A如之前所定義；X、Rl、R2、R3、R4、R5、R6、R7和環(huán)A如之前所定義。通過(guò)通式I，設(shè)計(jì)了下述通式的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>根據(jù)另一優(yōu)選的具體實(shí)施方式，衍生自吲哚的化合物選自6-氯-5,10-二甲基-llH-吡啶并[3，，2，:4,5]吡咯并[3,2-g]異喹啉(化合物70);5,10-二甲基-llH-吡啶并[3，,2，:4，5]吡咯并[3,2-g]異喹啉(化合物71);5，8-二甲基-6-(吡啶-2-基氨基)-2//-異喹啉-1-酮;(化合物72);8-二甲基-6-(3-甲氧基-卩比啶-2-基氨基)-異喹啉-l-酮(化合物497);和5,8-二甲基-6(5-甲基-P比啶-2-基氨基)-異喹啉(化合物500)。優(yōu)選，衍生自吲哚的化合物選自5,8-二甲基-6-(吡啶-2-基氨基)-2//-異喹啉-l-酮、6-(3-甲氧基-卩比啶-2-基氨基)-異喹啉-l-酮或5,8-二甲基-6(5-甲基-吡啶-2-基氨基)-異喹啉。有利地，衍生自吲哚的化合物為5，8-二甲基-6-(吡啶-2-基氨基)-2//-異喹啉-l-酮。本發(fā)明的另一目的在于包含至少一種之前所述的吲哚衍生物和任選的藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。作為藥學(xué)上可接受的載體的例子，組合物可包含乳液、微乳液、水包油乳液、無(wú)水類(lèi)脂和油包水乳液，或其他類(lèi)型的乳液。根據(jù)本發(fā)明所述的組合物可進(jìn)一步包含一種或多種添加劑，如稀釋劑、賦形劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。這些添加劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，牛寺另(J描述于"t/〃w"""》五"cyc/o/e(i/aT/^wWn'a/CTzew/s^y,6'￡d"(不同編輯，1989-1998,MarcelDekker);禾B"P/7am7acew"ca/Dosagei>wgZ)e//ver_yS;^stg附s"(ANSEL等人,1994,WILLIAMS&WILKINS)中。第三目的在于至少一種如前所述的吲哚衍生物在制備治療受試者遺傳疾病的藥物中的用途，所述遺傳疾病由至少一種誘導(dǎo)早期終止密碼子出現(xiàn)的突變引發(fā)。如在本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)"受試者"對(duì)應(yīng)于哺乳動(dòng)物如嚙齒動(dòng)物、貓科動(dòng)物、犬科動(dòng)物、靈長(zhǎng)類(lèi)的動(dòng)物或人類(lèi)，優(yōu)選所述受試者是人類(lèi)。由至少一種誘導(dǎo)早期終止密碼子出現(xiàn)的突變引發(fā)的這類(lèi)遺傳疾病是眾所周知的，并占據(jù)了現(xiàn)今遺傳疾病的近三分之一?？商峒暗倪@類(lèi)遺傳疾病的例子有P-地中海貧血、馬方氏綜合征、杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(DMD)、貝克爾氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(DMD)、烏利希氏病(Ullrich'sdisease)、胡爾勒氏綜合征或囊性纖維化(CF)，其更為人所知的名稱(chēng)是粘稠物阻塞癥，和在所述遺傳疾病中，受試者在涉及的基因中具有提前終止密碼子。優(yōu)選，使用所述突變畢竟可得到功能截短蛋白。根據(jù)本發(fā)明所述的化合物實(shí)際具有抑制NMD機(jī)理和使得具有提前終止密碼子的mRNA轉(zhuǎn)化的能力。功能蛋白質(zhì)是指允許野生表型(wildphenotype)恢復(fù)的蛋白質(zhì)。有利地，"功能蛋白質(zhì)"是指相對(duì)于野生蛋白質(zhì)具有足夠的活性，以提供與野生蛋白質(zhì)相同的功能并允許得到野生表型的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的第四目的在于治療受試者由至少一種誘導(dǎo)早期終止密碼子出現(xiàn)的突變引發(fā)的遺傳疾病的方法，該方法包含給予治療有效量的如前所述的藥物組合物。"治療有效量"是指可誘導(dǎo)NMD的抑制的量。本領(lǐng)域技術(shù)人員以其普通常識(shí)或通過(guò)實(shí)施例中所描述的方法將能夠決定所述治療有效化合物可使用任何給藥模式給藥，例如通過(guò)肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、口服途徑等等。提供下述實(shí)施例用作解釋說(shuō)明，并不限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例-I-材料和方法1-1吲哚化合物所有使用的多環(huán)吲哚化合物以20mg/mL懸浮在DMSO中，然后在10%(v/v)DMSO中制備為5mM的稀釋液。測(cè)試的化合物如下表I所示表I<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>1-3根據(jù)本發(fā)明所述的化合物的合成化合物17、35和39的合成如下述公開(kāi)所述RIVALLE等人，JC7z亂1983，26,181-185。通過(guò)與化合物17、35和39相同的步驟，從公開(kāi)中描述的化合物8a和烯丙基胺得到化合物81?；衔?7、70禾n71的合成描述于RIVALLE等人，7^ra/2^/ra"1981;37,2097-2103中。化合物13、15和37的合成描述于BISAGNI等人，//eterac少c/es1988，27，1671-1678中。化合物29通過(guò)下列合成方法得到將在RIVALLE等人，(/^fedC&m.1983，26,181-185)的公開(kāi)中描述的化合物la懸浮在DMF中。過(guò)量加入碘甲垸(IO當(dāng)量)。將反應(yīng)介質(zhì)加熱至80°C持續(xù)lh，然后冷卻至室溫。加入2MNa2C03溶液，并將反應(yīng)介質(zhì)帶至80°C持續(xù)18小時(shí)。用二氯甲烷萃取產(chǎn)物?；衔?2、497和500通過(guò)下列合成方法得到在2moiy。的Pd(Oac)2、3.5mol。/。的4,5-雙二苯基膦-9，9-二甲基氧雜蒽(Xantphos)和2.4當(dāng)量的CS2C03存在下，將合適的溴吡啶(l當(dāng)量)和胺(l當(dāng)量)置于叔丁醇中。將反應(yīng)介質(zhì)帶至90°C持續(xù)48小時(shí)，然后在硅藻土上過(guò)濾，再然后在硅膠柱(CH2Cl2/EtOH95:5)上純化。為了合成化合物72，使用2-溴吡啶(bromopridine)和6-氨基-5,8-二甲基-2//-異喹啉-1-酮(作為胺)。該胺描述于DUCROCQ等人，(re/raWraw1979,35,142)中。為了合成化合物497，使用2-溴-3-甲氧基吡啶和6-氨基-5,8-二甲基-2//-異喹啉-1-酮(作為胺)。為了合成化合物500，使用2-溴-5-甲基吡啶和5，8-二甲基-異喹啉-6-基胺(作為胺)。該胺描述于BALKAN等人，(JMWra//aJowr"a/C7em/W^,1969，22，2489)中。1-3構(gòu)建體使用正義弓l物(senseprimer)5'GCAACCTCAAGCTTACACCATGGTGCACCTGAC3，(SEQIDNO:l)禾口反義弓l物(antisenseprimer)5，AGAAAGCAGATCTGCTTAGTGATACTTGTG3，(SEQIDNO:2)，通過(guò)卩-珠蛋白WT和NS39的PCR擴(kuò)增(Thermann等人，1998)得到構(gòu)建體卩-珠蛋白Norm和Ter。在包含24個(gè)MS2位的改性的質(zhì)體pRSVbgal(Fusco等人，2003)的HindlII/Bgin位置克隆被擴(kuò)增的片段。1-4使用RT-PCR的NMD測(cè)量在60mm碟中，在DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco，sMedifiedEagleMedium，GIBCO-BRL)，補(bǔ)充37°C的10。/。(v/v)胎牛血清和5%C02中使HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)。然后根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)使用LIPOFECTAMINEPLUSREAGENT(INVITROGEN)試劑盒，用3|ig測(cè)試質(zhì)體pmCMV-Gl(Norm或39Ter)(Sun等人,1998)或3jigpf測(cè)試質(zhì)體pmCMV-GPxl(Norm或46Ter)(Moriarty等人,1998)和l)ig參比質(zhì)體phCMV-MUP(Belgrader禾口Maquat,1994)轉(zhuǎn)染細(xì)胞(lx106)。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，用5pM待測(cè)試的每種化合物處理細(xì)胞20小時(shí)，或用0.01。/。(v/v)DMSO處理作為對(duì)照。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)使用TRI試齊l」(SIGMA-ALDRICH)純化整個(gè)RNA，然后在"P-放射性標(biāo)記的dCTP核苷酸存在下、在PCR擴(kuò)增之前進(jìn)行mRNAGl、GPxl和MUP的逆轉(zhuǎn)錄。PCR條件和分析方法如前所述(Ishigaki等人，2001)。PCR產(chǎn)物在Typhoon9200(AmershamBiosciences)上定量。1-5翻譯效率的測(cè)試用2嗎質(zhì)體pFluc和lpg質(zhì)體pRluc轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，在收獲細(xì)胞前，在0.01%(v/v)DMSO或待測(cè)試的不同化合物(5)iM)存在下培養(yǎng)細(xì)胞20小時(shí)，或在10(Vg/mL環(huán)己酰亞胺存在下培養(yǎng)細(xì)胞4小時(shí)。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)使用DualGlo熒光素酶試劑盒(Promega)，在2xl()5細(xì)胞當(dāng)量上于microLumatLB96P(EG&GBerthold)定量熒光素酶活性。然后針對(duì)Fluc和RlucmRNA水平對(duì)熒光素酶活性歸一化。1-6在NMD抑制化合物存在下，用于測(cè)量siRNA降解路線(xiàn)整體性的熒光素酶活性在6-孔板中使細(xì)胞生長(zhǎng)，并使用具有50ngRLperfect報(bào)告RNA(Pillai等人，2005)、200ng為'^^乂座j^^^素縻編碼的pG13質(zhì)體和4figpTzU6質(zhì)體的LipofectaminePlusReagent(Invitrogen)試齊!j盒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，將待測(cè)試的化合物加入對(duì)應(yīng)的孔。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)用DualGlo熒光素酶試劑盒(Promega)測(cè)量熒光素酶活性。1-7通過(guò)2D凝膠分析測(cè)量FLAG-hUPFl的磷酸化水平根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)使用LipofectaminePlusReagent(Invitrogen)試劑盒用l|ig的p7UG-/zL^7質(zhì)體(Sun等人，1998)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞(106)。12小時(shí)后，從培養(yǎng)基中移除血清持續(xù)24小時(shí)，然后加入5pM待測(cè)試的化合物，或作為對(duì)照，在37°C和5%002移除10%(v/v)DMSO持續(xù)3小時(shí)。然后在37°C和5。/。C02再加入10%血清持續(xù)1小時(shí)。用裂解緩沖液純化全部蛋白質(zhì)，所述裂解緩沖液包含8M尿素、2MCHAPS和40mM的Tris堿。根據(jù)AMERSHAM-BIOSCIENCES為2D電泳描述的程序，用固定的pH梯度進(jìn)行一維遷移。使用ImmobilineDryStrip在pH3-10(18cm)來(lái)根據(jù)其等電點(diǎn)分離蛋白質(zhì)。然后，二維通過(guò)將一維負(fù)載在10%SDS-PAGE凝膠上來(lái)進(jìn)行。最后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，之后在4°C用含0.05%吐溫的TBS中的抗-FLAG抗體(SIGMA-ALDRICH)培養(yǎng)它們過(guò)夜，然后用結(jié)合至過(guò)氧化物酶(PIERCE)的抗-小鼠山羊抗體培養(yǎng)。然后通過(guò)使用"SuperSignalWestFemtoMaximumSensitivitySubstrate"(PIERCE)檢測(cè)蛋白質(zhì)。1-8阻止NMD的歩驟的測(cè)定該實(shí)驗(yàn)如前所述進(jìn)行(Hosoda等人，2005)。1-9免疫熒光法，圖像分析下的FISH測(cè)試在10%(v/v)FBSDMEM中在12mm載玻片上生長(zhǎng)HeLa細(xì)胞。將細(xì)胞(105)用500ng質(zhì)體pGFP-GEl(Yu等人，2005)、pYFP-hSmg5、pYFP-hSmg6、YFP-hSmg7(Unterholzner禾口Izaurralde，2004)、pGFP畫(huà)CCR4、pCFP-DCPla(Cougot等人，2004)、pCI-neo-FLAG-hUpfl(Sun等人，1998)、pcDNA3誦hUpf3a畫(huà)FLAG、pcDNA3-hUpf3b-FLAG(Lykke-Andersen等人，2000)、pmCMV-Gl(Norm或39Ter)(Sun等人，1998)或pmCMV-GPxl(Norm或46Ter)(Moriarty等人，1998)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，用5pM待測(cè)試的化合物或作為對(duì)照的0.001%(v/v)DMSO處理細(xì)胞。20小時(shí)后，在室溫下使用福爾馬林(formaline)溶液(SIGMA-ALDRICH)固定(fix)細(xì)胞10分鐘，并在4。C用70%乙醇溶液透化過(guò)夜。為免疫熒光法測(cè)試，在室溫下用抗-FLAG小鼠抗體(SIGMA-ALDRICH)培養(yǎng)固定細(xì)胞2小時(shí)，在PBS中洗滌三次，并在室溫下用與Cy3或FITC(JACKSONIMMUNORESEARCH)結(jié)合的小鼠抗體培養(yǎng)1小時(shí)。最后，在室溫下煙酸己可堿(2pgL)(SIGMA-ALDRICH)中培養(yǎng)2分鐘之前，在PBS中洗滌細(xì)胞三次。對(duì)于FISH實(shí)驗(yàn)，37。C在組織培養(yǎng)培養(yǎng)箱中，在預(yù)雜交緩沖液(tRNA125pg/mL，青魚(yú)DNA500pg/mL，BSA1mg/mL，葡聚糖硫酸酉旨0.1g/mL，50%甲酰胺，2XSSC緩沖液)中培養(yǎng)固定細(xì)胞1小時(shí)。然后，在組織培養(yǎng)培養(yǎng)箱中，用雜交緩沖液(具有Cy3標(biāo)記的探針的預(yù)雜交緩沖液)培養(yǎng)固定細(xì)胞過(guò)夜，37°C在SSC2X緩沖液中洗滌三次，在室溫下IXSSC緩沖液中洗滌三次，最后，在室溫下用煙酸己可堿(2ngL)(SIGMA-ALDRICH)培養(yǎng)2分鐘。使用在5'和3，端以Cy3標(biāo)記的探針5'CGATCTGCGTTCTACGGTGGT3，(SEQIDNO:3)來(lái)檢測(cè)GlTer或GPX1TermRNA。用DMRA顯微鏡(Leica)、具有A4濾光器(對(duì)煙酸己可堿)，GFP和Y3濾光器(對(duì)Cy3)的油物鏡PLAPO63x(NA1.32)觀(guān)察固定細(xì)胞。I-10免疫純化和蛋白質(zhì)印跡分析根據(jù)之前描述的程序(Lejeune和Maquat,2004)使用抗-hUPFl抗體(Ohnishi等人，2003)進(jìn)行hUPFl的免疫純化和蛋白質(zhì)印跡分析。通過(guò)使用抗-hUPFl、抗-hSMG5、抗-hSMG6或抗-hSMG7兔抗體(Ohnishi等人，2003)的1/250稀釋液、抗-hUPF3/3X兔抗體(Ishigaki等人，2001)或抗-TUBILIN小鼠抗體(SIGMA-ALDRICH)的1/1000稀釋液進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。通過(guò)使用"SuperSignalWestPicoChemil腿inescentSubstrate"或"SuperSignalWestFemtoMaximumSensitivitySubstrate"(PIERCE)檢測(cè)蛋白質(zhì)。n-結(jié)果II-l新型NMD抑制劑的鑒定用兩種測(cè)試質(zhì)體轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，所述測(cè)試質(zhì)體編碼P-珠蛋白(Gl)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶l(GPxl)的RNA，并具有或提前(Ter)或不提前(Norm)的終止密碼子。GlmRNA用于與非-紅系細(xì)胞中的核相關(guān)的NMD(Thermann等人，1998;Zhang等人，1998)，而GPxlmRNA用于細(xì)胞質(zhì)NMD(Moriarty等人，1998)。此外，也將編碼嚴(yán)重尿蛋白(MUP)的mRNA的參比質(zhì)體引入細(xì)胞(Ishigaki等人，2001)。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，用DMSO(X)作為對(duì)照或用5pM表I中所示的口引哚化合物培養(yǎng)細(xì)胞20小時(shí)。20小時(shí)后，最終純化總的RNA和用RT-PCR分析。不同測(cè)試的化合物的結(jié)果總結(jié)于表II。表II<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>結(jié)果表明在30種測(cè)試的化合物中，其中5種既可以穩(wěn)定TerGlmRNA水平又可以穩(wěn)定TerGPxlmRNA水平，并且其是以劑量依賴(lài)的方式。該結(jié)果可通過(guò)RPA方法進(jìn)一步確認(rèn)。這些結(jié)果提供下述結(jié)論化合物70、71、72、497和500是NMD的抑制劑，其既在細(xì)胞核又在細(xì)胞質(zhì)。應(yīng)當(dāng)注意到，對(duì)這些化合物觀(guān)察到的抑制水平與用其他NMD抑制劑觀(guān)察到的類(lèi)似，所述其他NMD抑制劑如環(huán)己酰亞胺或用編碼hDCP2或hPARN的基因表達(dá)的siRNA滅活(Ishigaki等人，2001;Lejeune等人,2003)，這些化合物在實(shí)驗(yàn)條件下并不表現(xiàn)出任何細(xì)胞毒性(測(cè)試的最高濃度125pM)。在該水平，在不同體系(不抑制內(nèi)含子的拼接，不抑制轉(zhuǎn)化，和不形成應(yīng)力顆粒(stressgranule)中測(cè)試鑒別化合物的特性，該特性能表明這些化合物是新型特定NMD抑制劑。II-2在hUPFl上游抑制NMD:為了鑒別已識(shí)別的化合物的抑制模式，在mRNA上模擬NMD因子序列募集(sequentialrecruitment)的體系上測(cè)試所述化合物(Kim等人，2005;Lykke-Andersen等人,2000)。為了這樣做，用兩種類(lèi)型的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，其中一種構(gòu)建體編碼貴乂A黃^^素磨fy7^的mRNA，在其3'UTR包含8個(gè)MS2蛋白質(zhì)的結(jié)合部位的mRNA;第二種為編碼MS2蛋白質(zhì)或下列融合蛋白之一MS2-hUPFl、MS2-hTPF2或MS2-hUPF3X。此外，也用編碼ie"/〃a^!i^素蘑f^/wc)的mRNa的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞以歸一化分析的RNA水平。然后用化合物70，或用DMSO(-)作為陰性對(duì)照培養(yǎng)細(xì)胞20小時(shí)。然后如前所述測(cè)定i/wc和F/wcmRNA的水平(Hosoda等人，2005)。作為對(duì)照，每種MS2融合蛋白的表達(dá)通過(guò)蛋白質(zhì)印跡測(cè)定。結(jié)果表明在每種情況下，化合物70不影響MS2融合蛋白的表達(dá)水平，該水平從未高于內(nèi)源蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。如同所預(yù)料到的和在DMSO存在下，與僅表達(dá)MS2的細(xì)胞相比，F(xiàn)/wcmRNA的表達(dá)水平在表達(dá)MS2-hUPF融合蛋白之一的細(xì)胞中較低。另一方面，結(jié)果表明化合物70干擾MS2-hUPF2或MS2-hUPF3X誘導(dǎo)的降解，但對(duì)MS2-hUPFl誘導(dǎo)的降解無(wú)影響。應(yīng)當(dāng)注意，F(xiàn)/Mc/7/McmRNA的比例和化合物70誘導(dǎo)的抑制水平與對(duì)應(yīng)編碼hCBP80的基因表達(dá)的siRNA滅活中觀(guān)察到的那些(Hosoda等人,2005)非常類(lèi)似。最后，結(jié)果表明化合物70的NMD抑制在hUPF3X或hUPF2的募集的下游，和在hUPFl功能的上游。II-3化合物70不阻止hUPFl和hUPF3X之間的相互作用從前面的結(jié)果看，應(yīng)想到化合物70能夠通過(guò)與其他hUPF蛋白質(zhì)的相互作用，阻止hUPFl至EJC的募集。為了這個(gè)目的，在保持mRNP整體性的條件下從HeLa細(xì)胞提取物免疫沉淀hUPFl蛋白質(zhì)(Lejeune和Maquat，2004)。在免疫沉淀(IP)前，將DMSO(-)的化合物70加入細(xì)胞培養(yǎng)物20小時(shí)。目前表現(xiàn)出，hPF2蛋白質(zhì)在NMD的某些情況下不是必要的(Geh環(huán)等人,2005)，分析聚焦于在每種免疫沉淀中存在的hUPF3X蛋白質(zhì)。作為特性對(duì)照，在每種免疫沉淀中顯示了微管蛋白缺失，并用其中未檢測(cè)到蛋白質(zhì)的常規(guī)兔血清進(jìn)行了非-特定免疫沉淀。結(jié)果表明，即使當(dāng)預(yù)先用化合物70培養(yǎng)過(guò)細(xì)胞時(shí)，hUPF3X蛋白質(zhì)在hUPFl免疫沉淀中仍存在。因此，化合物70并未消除hUPFl和hUPF3X之間的相互作用，這一點(diǎn)表明該化合物并不抑制hUPFl至EJC的募集。II-4化合物70穩(wěn)定超磷酸化形式的hUPFl:目前，NMD過(guò)程中hUPFl要求磷酸化和脫磷酸化循環(huán)(Ohnishi等人，2003)，在化合物70存在下測(cè)試磷酸化的水平。為了這個(gè)目的，通過(guò)2D凝膠分析在化合物70或DMSO(-)培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)測(cè)試hUPFi的磷酸化水平。目前，血清影響hUPFl的磷酸化(Pal等人，2001)，使用293T細(xì)胞代替HeLa細(xì)胞，因?yàn)樗鼈兙哂性谘迦笔У那闆r下在細(xì)胞循環(huán)的同一步驟阻止其細(xì)胞分裂的能力。用表達(dá)載體pCI-neo-FLAG-hUpfl(Sun等人，1998)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，通過(guò)血清缺失12小時(shí)同步細(xì)胞。最后，加入DMSO或5pM化合物70持續(xù)3小時(shí)，之后加入血清持續(xù)1小時(shí)。結(jié)果表明，不加入血清的情況下，F(xiàn)LAG-hUPFl蛋白質(zhì)遷移和僅形成對(duì)應(yīng)于非-磷酸化的蛋白質(zhì)的單個(gè)點(diǎn)(Pal等人，2001)。加入血清后，當(dāng)用DMSO培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，觀(guān)察到FLAG-hUPFl蛋白質(zhì)的中等磷酸化，當(dāng)用化合物70培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，觀(guān)察到FLAG-hUPFl的其他磷酸化的亞型禾急定。因此，使用化合物70則可能穩(wěn)定hUPFl蛋白質(zhì)的超磷酸化亞型。目前認(rèn)為，當(dāng)將其超磷酸化時(shí)，蛋白質(zhì)hUPFl位于P-小體(Unterholzner和Izaurralde，2004)，在化合物70存在和缺失的情況下測(cè)試FLAG-hUPFl蛋白質(zhì)在HeLa細(xì)胞中的細(xì)胞定位(localization)。結(jié)果表明，當(dāng)用DMSO培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，外源的hUPFl蛋白質(zhì)均勻分布在細(xì)胞質(zhì)中，之前對(duì)非-處理的細(xì)胞(Menddl等人，2002)已經(jīng)表明這一點(diǎn)，除了在hSMG7蛋白質(zhì)共表達(dá)的實(shí)驗(yàn)中(其誘導(dǎo)hUPFl蛋白質(zhì)在P-小體的募集(Unterholzner和Izaurralde,2004))。另一方面，當(dāng)用化合物70預(yù)處理細(xì)胞時(shí)，在結(jié)構(gòu)中觀(guān)察到FLAG-hUPFl的細(xì)胞質(zhì)富集，其共定位(co-localize)GFP-GEl、UFP-hSMG7、或CFP-hDCPla，為P-小體的常用標(biāo)記物。因此，化合物70或通過(guò)刺激磷酸化或通過(guò)抑制脫磷酸化誘導(dǎo)hUPFl的超磷酸化亞型在P-小體聚積。為了確定己鑒別的化合物誘導(dǎo)兩種機(jī)理之中的何種機(jī)理，進(jìn)行hUPFl蛋白質(zhì)從HeLa細(xì)胞免疫沉淀的補(bǔ)充分析，或用化合物70培養(yǎng)或不存在化合物70。在第一階段，用其脫磷酸化復(fù)合物進(jìn)行hUPFl的分析。結(jié)果表明可在用DMS0處理的細(xì)胞中檢測(cè)到hSMG5、hSMG6和hSMG7，但另一方面，當(dāng)預(yù)先用化合物70培養(yǎng)HeLa細(xì)胞時(shí)不可檢測(cè)到hSMG5。因此，結(jié)果表明化合物70使得hUPFl和hSMG5之間的相互作用失穩(wěn)。最后，在用或不用化合物70培養(yǎng)的細(xì)胞上進(jìn)行的免疫沉淀中，hSMGl和hUPF3X的存在強(qiáng)烈表明已鑒別的化合物對(duì)hUPFl與其磷酸化復(fù)合物之間的相互作用無(wú)影響(圖3A)。所得結(jié)果維護(hù)了下述事實(shí)觀(guān)察到的hUPFl超磷酸化態(tài)涉及缺乏脫磷酸化，尤其是缺乏hUPFl和hSMG5之間的相互作用，而不是涉及磷酸化的激活。最后，該結(jié)論與確認(rèn)hSMG5是hUPFl脫磷酸化的必要組分相符(Ohnishi等人,2003)。II-5在化合物70存在下從P-小體除去hSMG5:公知hSMG5和hSMG7位于細(xì)胞質(zhì)中，更特定地位于P-小體(Unterholzner禾口Izaurralde,2004)。用編碼YFP棚hSMG5、YFP畫(huà)hSMG6或YFP-hSMG7((Unterholzner和Izaurralde，2004)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，并用CFP-hDCPla作為P-小體的標(biāo)記物。24小時(shí)后，在DMSO或5pM化合物70存在下培養(yǎng)細(xì)胞。如之前所表明的，在缺乏抑制劑的情況下，YFP-hSMG5、YFP-hSMG6禾CIYFP-hSMG7富集在細(xì)胞質(zhì)集合體中(Fukuhara等人，2005;Unterholzner和Izaurralde，2004)，當(dāng)使用CFP-DCPla作為P-小體的標(biāo)記物時(shí)，鑒定該集合體大部分在P-小體中。在化合物70存在下，包含YFP-hSMG6或YFP-hSMG7的細(xì)胞質(zhì)集合體用P-小體的標(biāo)記物CFP-DCPla共定位。另一方面，在細(xì)胞質(zhì)集合體中不再觀(guān)察到hSMG5，但在化合物70處理的細(xì)胞中具有廣泛的細(xì)胞質(zhì)分布。目前表明化合物70抑制NMD和誘導(dǎo)hUPFl在P-小體中的富集，如用外源的或內(nèi)源hUPFl蛋白質(zhì)顯示的，測(cè)試三種內(nèi)源蛋白質(zhì)hSMG在細(xì)胞質(zhì)集合體的定位。該定位未曾被觀(guān)察到，因?yàn)檫@些蛋白質(zhì)太低的表達(dá)。通過(guò)用化合物70處理細(xì)胞，使得這些因子在P-小體內(nèi)的穩(wěn)定是可以理解的。結(jié)果表明，對(duì)于用DMSO處理的細(xì)胞，在細(xì)胞質(zhì)集合體未檢測(cè)到內(nèi)源蛋白質(zhì)。另一方面，當(dāng)用化合物70培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，結(jié)果表明hSMG6和hSMG7蛋白質(zhì)在P-小體富集，而在細(xì)胞質(zhì)集合體未曾檢測(cè)到hSMG5，證實(shí)了用外源的蛋白質(zhì)得到的結(jié)果。最后，結(jié)果表明化合物70通過(guò)將其排除出P-小體改變了hSMG5的細(xì)胞定位。這種觀(guān)察與當(dāng)用化合物70培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，UPF1和SMG5之間失去相互作用一致。II-6當(dāng)用化合物70阻止NMD時(shí)，hUPF3禾HhUPF3X定位在P-小體因?yàn)槟承㎞MD的因子，如hUPFl、hSMG5、hSMG6或hSMG7定位在P-小體(Unterholzner和Izaurralde,2004)，認(rèn)為其他NMD因子至少瞬時(shí)可進(jìn)入P-小體。因?yàn)榛衔?0在hUPFl被限定在P-小體的步驟中阻止NMD，測(cè)試在處理和非-處理的細(xì)胞中的hUPF3和hUPF3X的細(xì)胞定位。表明兩種蛋白質(zhì)均主要為在非-處理的細(xì)胞中的核蛋白質(zhì)(Serin等人，2001)。用編碼hUPF3-FLAG或hUPF3X-FLAG的表達(dá)載體和下列P-小體標(biāo)記物中的一種轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞YFP-hSMG6、YFP-hSMG7、GFP-GE1禾口CFP-hDCPla。在進(jìn)行免疫熒光法實(shí)驗(yàn)之前，用DMSO或化合物70處理細(xì)胞。至于非-處理的細(xì)胞(Serin等人，2001)，當(dāng)用DMSO(-)培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，hUPF3或hUPF3X基本定位在細(xì)胞核。另一方面，在在化合物70存在下培養(yǎng)細(xì)胞后，結(jié)果表明hUPF3和hUPF3X的細(xì)胞質(zhì)定位在對(duì)應(yīng)于P-小體的集合體內(nèi)聚積。II-7在化合物70存在下，包含PTC的mRNA聚集在P-小體目前，在化合物70存在下NMD因子聚集在P-小體，研究了NMD基質(zhì)的定位。在酵母中，最近實(shí)際表明當(dāng)NMD因子聚集在P-小體中時(shí)，當(dāng)NMD被阻止，包含PTC的mRNA也聚集在P-小體中(Sheth和Parker，2006)。用TerpmCMV-Gl或TerpmCMV-GPxl載體轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，用下列P-小體的標(biāo)記物分析所得mRNA的定位GFP-GEl、YFP-hSMG6、YFP-hSMG7、CFP-hDCPl、GFP-hCCR4、FLAG隱hUPFl、hUPF3扁FLAG和hUPF3X孔AG。結(jié)果表明不存在抑制劑的情況下，不能檢測(cè)到包含PTC的mRNA，或許是因?yàn)樗麄兺ㄟ^(guò)NMD快速降解。另一方面，用化合物70處理后，使得包含PTC的mRNA穩(wěn)定和基本在與每個(gè)測(cè)試過(guò)的hUPF融合蛋白共定位的細(xì)胞質(zhì)聚集體被檢測(cè)。最后，結(jié)果表明包含PTC的mRNA存在于P-小體中或當(dāng)用化合物70抑制NMD時(shí)，與后者相鄰。也通過(guò)更有效的方法確認(rèn)了當(dāng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中阻止NMD時(shí)，包含PTC的mRNA在P-小體的聚積。在后者中，用24個(gè)SM2重復(fù)標(biāo)記mRNA，這使得可以通過(guò)原位雜交檢測(cè)獨(dú)特的mRNA分子(Fusco等人，2003)。結(jié)果表明在參比細(xì)胞中，基本在細(xì)胞核檢測(cè)到包含PTC的mRNA，被檢測(cè)的細(xì)胞質(zhì)分子不在P-小體聚集。當(dāng)用化合物70抑制NMD時(shí)，結(jié)果表明包含PTC的mRNA在細(xì)胞質(zhì)水平聚積，更特定地，在與P-小體共定位的結(jié)構(gòu)中聚積。因此，這些結(jié)果確認(rèn)了當(dāng)其降解被抑制時(shí)，針對(duì)NMD的mRNA在P-小體聚集，該結(jié)果看起來(lái)并不是細(xì)胞-特有的。最后，結(jié)果表明用化合物70培養(yǎng)后，在P-小體中沒(méi)有檢測(cè)到野生型mRNA，其確認(rèn)了已鑒別化合物的特定NMD-抑制功能，而不是抑制mRNA降解的普通功能。II-8具有提前終止密碼子的抗肌萎縮蛋白的mRNA穩(wěn)定抗肌萎縮蛋白的基因由79個(gè)外顯子組成，包括編碼部分蛋白質(zhì)、對(duì)該蛋白質(zhì)在肌肉中的功能不重要的外顯子70-79。在染上杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(DMD)的患者中，存在在外顯子70-79之一帶有無(wú)義突變的患者。然而，因?yàn)橥ㄟ^(guò)NMD的mRNA降解，盡管該截短蛋白是有功能的，這些患者并不表達(dá)該抗肌萎縮蛋白。因此，在這些患者體內(nèi)的NMD抑制將允許合成該截短但有功能的蛋白質(zhì)。使用源自分別用DMD感染的患者的兩個(gè)細(xì)胞系，因?yàn)閮?nèi)含子70的保留提供終止密碼子，外顯子75-76的刪除引起讀框移位并從而引起在該mRNA上激活NMD的早期終止密碼子的出現(xiàn)。將這兩個(gè)細(xì)胞系用化合物70、71或72，或在DMSO存在下處理48小時(shí)。然后提取RNA并在定量條件下進(jìn)行RT-PCR。結(jié)果表明大約通過(guò)因子4，接著用化合物70、71或72處理之后，抗肌萎縮蛋白mRNA穩(wěn)定。1I-9在體內(nèi)的NMD抑制對(duì)NMD機(jī)理使用兩種小鼠模型(murinemodel)來(lái)研究化合物70在體內(nèi)的作用。第一模型稱(chēng)為mdx小鼠。這些小鼠在抗肌萎縮蛋白基因的外顯子23帶有無(wú)義突變。這種無(wú)義密碼子通過(guò)NMD誘導(dǎo)抗肌萎縮蛋白mRNA降解。這些小鼠在肌肉內(nèi)接受DMSO(50iiL)、20,200或2，000nmol的化合物70注射。6、24和32小時(shí)后，處死小鼠，對(duì)注射過(guò)的肌肉取樣以從其提取RNA和蛋白質(zhì)。初步結(jié)果顯示抗肌萎縮蛋白mRNA在用化合物70注射的小鼠中穩(wěn)定，在用DMSO注射的小鼠中不穩(wěn)定。進(jìn)一步地，截短的抗肌萎縮蛋白蛋白質(zhì)本身也在用化合物70注射的小鼠體內(nèi)檢出，而在接受DMSO注射的小鼠體內(nèi)未檢出。使用的第二小鼠模型通過(guò)在鴉片受體的基因)i的外顯子3上存在無(wú)義突變(MOR)定義。該終止密碼子激活該MORmRNA上的NMD。MOR基因僅在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，這使得該模型成為研究化學(xué)化合物通過(guò)血腦屏障的可能性的非常有趣的工具。遵從與對(duì)mdx小鼠同樣的程序，區(qū)別僅在于注射在小鼠的頸部在皮下進(jìn)行，和在實(shí)驗(yàn)的不同階段對(duì)腦部取樣。在此處再一次地，第一結(jié)果顯示MORmRNA在用化合物70注射的小鼠中穩(wěn)定，在僅用DMSO注射的小鼠中不穩(wěn)定。MOR蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)印跡分析表明在同一用化合物70注射的小鼠中存在截短蛋白，在僅接受DMSO注射的小鼠中不存在。這些結(jié)果表明化合物70在體內(nèi)活躍，并且其可能穿過(guò)血腦屏障，這使得該化合物為影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)和涉及NMD的病癥的潛在治療劑。m-討論通過(guò)本研究，可顯示吲哚衍生物的NMD抑制能力。這些化合物通過(guò)阻止hUPFl和hSMG5之間的相互作用而發(fā)揮效力，其結(jié)果是將hSMG5逐出P-小體，以及hUPFl的超磷酸化形式的穩(wěn)定。最后，根據(jù)這些結(jié)果，可顯示這些吲哚衍生物能夠在體內(nèi)抑制NMD和通過(guò)血腦屏障，這使得它們成為治療許多與NMD有關(guān)的病變的良好候選。進(jìn)一步地，證明這些化合物是通過(guò)之前從未可能的一種方法研究NMD機(jī)理的優(yōu)異工具，之前從未可能是因?yàn)槿狈μ囟ㄒ种圃撨^(guò)程的工具。從而，實(shí)驗(yàn)室研究該NMD機(jī)理的好處是很可以想象到的。參考文獻(xiàn)Balkan,F.;Elmes，B.C.;Loder,J.W.C72倒/M/j1969，22,2489.Bashkirov,V.I"H.Scherthan，J.A.Solinger,J.M.Buerstedde,andW.D.Heyer.1997.Amousecytoplasmicexoribonuclease(mXRNlp)withpreferenceforG4tetraplexsubstrates.JCe〃傷o/.136:761-73.Belgrader,R，andL.E.Maquat.1994.NonsensebutnotmissensemutationscandecreasetheabundanceofnuclearmRNAforthemousemajorurinaryprotein,whilebothtypesofmutationscanfacilitateexonskipping.Mo/Ce//5/o/.14:6326-36.Brengues,M.，D.Teixeira,andRParker.2005.MovementofeukaryoticmRNAsbetweenpolysomesandcytoplasmicprocessingbodies.Sc/ewce.310:486-9.Bisagni,E.，Rautureau,M.，Huel,C.//etera—1988,27,1671-1678Chen,C.Y.,andA.B.Shyu.2003.RapiddeadenylationtriggeredbyanonsensecodonprecedesdecayoftheRNAbodyinamammaliancytoplasmicnonsense-mediateddecaypathway.iWo/Ce〃S/o/.23:4805-13.Chin,S.Y"G.Serin，O.Ohara,andL.E.Maquat.2003.CharacterizationofhumanSmg5/7a:aproteinwithsimilaritiestoCaenorhabditiselegansSMG5andSMG7thatflmctionsinthedephosphorylationofUpfl.9:77-87.Conti,'E.,andE.Izaurralde.■2005.Nonsense-mediatedmRNAdecay:molecularinsightsandmechanisticvariationsacrossspecies.CWrOp/wCW/腺.17:316-25.Cougot，N.,S.Babajko,andB.Seraphin.2004.CytoplasmicfociaresitesofmRNAdecayinhumancells.JCe〃165:31-40.Couttet，P"andT.Grange.2004.PrematureterminationcodonsenhancemRNAdecappinginhumancells.7Vwc/e/c爿c油32:488-94.Czaplinski,K.，M丄Ruiz-Echevarria,S.V.Paushkin,X.Han,Y.Weng,H.A.Perlick,H.C.Dietz,M.D.Ter-Avanesyan,andS.W.Peltz.1998.ThesurveillancecomplexinteractswiththetranslationreleasefactorstoenhanceterminationanddegradeaberrantmRNAs.GewesDev.12:1665-77.Ducrocq，C.,Bisagni，E.,Rivalle.C.,Lhoste,J.M.7^ra/2et/raw1979,35，142Fenger-Gron,M.，C.Fillman，B.Norrild,andJ.Lykke-Andersen.2005.MultipleprocessingbodyfactorsandtheAREbindingproteinTTPactivatem脂Adecapping.Mo/Ce〃.20:905-15.Fukuhara,N.，J.Ebert,L.Unterholzner，D.Lindner,E.Izaurralde,andE.Conti.2005.SMG7'isa14-3-3-likeadaptorinthenonsense-mediatedm脂Adecaypathway.Mo/CW/.17:537-47.Fusco,D.,N.Accornero，B.Lavoie，S.M.Shenoy,J.M.Blanchard，R.H.Singer,andE.Bertrand.2003.SinglemRNAmoleculesdemonstrateprobabilisticmovementinlivingmammaliancells.Cw/r說(shuō)o/.13:161-7.Frischmeyer,P.A.andDietz,H.C.1999.Nonsense-mediatedmRNAdecayinhealthanddisease,//wwawMo/ecw/arGewWcs,8(10):1893-1900.Gehring,N.H.，J.B.Kunz,G.Neu-Yilik，S.Breit,M.H.Viegas,M.W.Hentze,andA.E.Kulozik.2005.Exon-junctioncomplexcomponentsspecifydistinctroutesofnonsense-mediatedmRNAdecaywithdifferentialcofactorrequirements.Mo/Ce〃.20:65-75.He,R，X.Li,P.Spatrick,R.Casillo,S.Dong,andA.Jacobson.2003.GenomewideanalysisofmRNAsregulatedbythenonsense-mediatedand5'to3'mRNAdecaypathwaysinyeast.Mo/Ce〃.12:1439-52.Hosoda,N.，YK.Kim,RLejeune,andL.E.Maquat.2005.CBP80promotesinteractionofUpflwithUpf2duringnonsense-mediatedmRNAdecayinmammaliancells.7V^5Vn/cfMo/所o/.12:893-901.Ingelfinger,D.,DJ.Amdt-Jovin,R.Lulumann，andT.Acbsel.2002.ThehumanLSml-7proteinscolocalizewiththemRNA-degradingenzymesDcpl/2andXmlindistinctcytoplasmicfoci,i肌8:1489-501.Ishigaki,Y"X.Li,GSerin,andL.E.Maquat.2001.EvidenceforapioneerroundofmRNAtranslation:mRNAssubjecttononsense-mediateddecayinmammaliancellsareboundbyCBP80andCBP20.Ce〃.106:607-17.Kashima,I.，A.Yamashita，N.Izumi,N.Kataoka,R.Morishita,S.Hoshino,M.Ohno，G.DreyfUss,andS.Ohno.2006.BindingofanovelSMG隱l-Upfl-eRFI-eRF3complex(SURF)totheexonjunctioncomplextriggersUpflphosphorylationandnonsense-mediatedmRNAdecay.Gewas1Dev.20:35567.Kedersha,N.，G.Stoecklin,M.Ayodele,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