專利名稱：：抗病毒肽的半胱磺酸衍生物的制作方法與相關(guān)申請的交叉參考本申請要求2007年5月16日提交的美國順序號No.60/938,380和No.60/938,394的優(yōu)先權(quán)。上述申請的內(nèi)容在此以其全文引為參考。
背景技術(shù)：
：I型人類免疫缺陷病毒(HIV-I)進入未感染細胞包括三個主要步驟(i)gp120與CD4受體的結(jié)合，(ii)隨后與共同受體CXCR4或CCR5結(jié)合，以及(iii)HIV-I跨膜糖蛋白gp41的胞外結(jié)構(gòu)域的一系列構(gòu)象變化，這些變化對于引發(fā)膜融合事件、最終允許感染發(fā)生是重要的。諸如呼吸道合胞病毒(RSV)、3型人類副流感病毒(HPIV-3)、麻疹病毒和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)這樣的病毒與HIV顯示出高度的結(jié)構(gòu)和功能相似性，包括gp41樣蛋白。幾種小分子藥物候選物，包括抑制與CD4或與CCR5共同受體結(jié)合的那些，正處于人類臨床實驗中或者快要上市(MeanwellNA，KadowJF(2003)CurrOpinionDrugDisc&Develop6451-461；OlsonWC，MaddonPJ(2003)CurrDrugTargets-InfectiousDisord3283-294)。已知有幾種合成的肽抑制或破壞與膜融合相關(guān)的事件，包括例如抑制反轉(zhuǎn)錄病毒向未感染細胞傳播。例如，合成肽C34、T1249、DP-107和T-20(DP-178)源于gp41內(nèi)分開的結(jié)構(gòu)域，是HIV-I感染和HIV誘導的細胞-細胞融合的有效抑制劑。T-20(DP-178，恩夫韋地(enfuvirtide)，Trimeris/RocheAppliedSciences)是基于HIV-Igp41的CHR序列的合成肽，被認為靶定gp41的構(gòu)象重排。已經(jīng)廣泛地認為，T-20抑制是由于它與gp41的NHR區(qū)域的疏水溝結(jié)合、導致抑制六螺旋束形成的能力(KligerY，ShaiY(2000)JMolBiol295163-168)。與這種觀點相反，最近的研究提示，T-20能夠靶定gp41和gp120中的多個位點(LiuS等，(2005)JBiolChem28011259-11273)。例如，T-20在膜的表面上結(jié)合并低聚化，由此抑制了gp41在受感染細胞的質(zhì)膜上的募集和低聚化(Munoz-BarrosoI等，(1998)JCellBiol140315-23；KligerY等，(2001)JBiolChem2761391-1397)。此外，已經(jīng)顯示，緊鄰肽序列為666WASLWNWF673的跨膜結(jié)構(gòu)域的區(qū)域內(nèi)的gp41的胞外結(jié)構(gòu)域，構(gòu)成了與gp41的NHR相比，對T-20具有更高親和性的位點(Munoz-BarrosoI等，(1998)同上，140315-23；KligerY等，(2001)同上)。另一個C-肽C34，由與T-20重疊但是包含gp41卷曲螺旋腔結(jié)合殘基628WMEW631的肽序列構(gòu)成，已知其與gp41的CHR競爭NHR區(qū)域的疏水溝(LiuS等，(2005)JBiolChem28011259-11273)。盡管在本
技術(shù)領(lǐng)域：
描述的許多抗病毒或抗融合(anti-fusogenic)肽顯示出有效力的抗病毒和/或抗融合活性，但這些肽具有在生理pH下的水性制劑中溶解性差、以及體內(nèi)細胞質(zhì)半衰期短的缺點。因此，對于增加現(xiàn)有抗病毒和/或抗融合肽的溶解度和延長其半衰期、從而提供在體內(nèi)水溶性、作用較長的抗病毒和/或抗融合肽的方法，存在著需求。發(fā)明概述本發(fā)明至少部分涉及修飾的抗病毒和/或抗融合肽，它們與修飾前的肽相比，在生理pH下的水性溶液溶解度增加。在一個實施方案中，對本發(fā)明的肽進行修飾，以包含一個或多個極性基團或部分，例如一個或多個半胱磺酸，由此增加它們在水性溶液中的溶解度。修飾的肽可以進一步包含化學反應性部分，使得修飾的肽可以與血液成分或載體蛋白例如白蛋白(例如人血清白蛋白或重組白蛋白)上的可用官能團發(fā)生反應，從而增加修飾的肽的體內(nèi)穩(wěn)定性。在實施方案中，修飾的肽與血液成分或載體蛋白例如白蛋白(例如人血清白蛋白，重組白蛋白或其它載體蛋白)結(jié)合。由此，這些修飾的肽或其結(jié)合物，減少了例如對頻繁或甚至連續(xù)地施用肽的需要。本發(fā)明的修飾的肽可以例如預防性和/或治療性地用于改善多種病毒的感染，包括人類免疫缺陷病毒(HIV)、人類呼吸道合胞病毒(RSV)、人類副流感病毒(HPIV)、麻疹病毒(MeV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。參與病毒感染(例如肝炎、EB病毒和其它相關(guān)病毒)的其它肽的修飾，也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，一方面，本發(fā)明的特點是修飾的抗病毒和/或抗融合肽，其與修飾前的肽相比，在大約5到8的pH范圍內(nèi)(例如生理pH下)是在水性或水溶液中溶解度增加。在一個實施方案中，修飾的抗病毒和/或抗融合肽在濃溶液中(例如在水性溶液(例如等滲或高鹽水性溶液)中，濃度在大約10到500mg/ml、大約10到400mg/ml、大約10到300mg/ml、大約10到200mg/ml、大約10到180mg/ml、大約40到180mg/ml、大約60到180mg/ml或大約90到100mg/ml的范圍內(nèi))保持基本上溶解(例如在大約5到8的pH范圍內(nèi)(例如生理pH下)，在水或水性溶液中沉淀少于大約40％、30％、20％、10％)。在實施方案中，修飾的抗病毒和/或抗融合肽顯示出溶度極限(即維持澄清溶液的最高濃度)比修飾前的肽高至少大約1.3、1.5、1.8、2、2.3、2.5、2.8、3或3.5倍。在實施方案中，修飾的抗病毒和/或抗融合肽，在pH范圍為大約5到8的水性等滲溶液中的溶度極限為至少大約20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml或40mg/ml。本文中使用的“水性溶液”包括但不限于在適合給藥于對象(例如人類對象)、例如皮下、靜脈內(nèi)、肺部、肌肉內(nèi)或腹膜內(nèi)給藥的pH下的水、鹽水溶液(例如等滲溶液)、在水中制成的緩沖液(例如磷酸鈉緩沖液)、水性凝膠，以及水性制劑；或在適合制造工藝的pH下的制劑。在實施方案中，修飾的抗病毒和/或抗融合肽包含一個或多個極性部分。在一個實施方案中，修飾的抗病毒和/或抗融合肽包含一個或多個在生理pH下帶電或不帶電的極性部分。在某些實施方案中，側(cè)鏈可以是中性的，并可以通過例如形成氫鍵或其它非共價相互作用，增加修飾的肽在水性溶液中的總體溶解度。例如，在某些情況下，帶有氧或氮基團的中性側(cè)鏈能夠與主體溶劑形成氫鍵，并可用于增加肽的總體溶解度。在某些實施方案中，側(cè)鏈可以是任何非天然的極性或中性側(cè)鏈，例如在20種天然存在的氨基酸中沒有發(fā)現(xiàn)的側(cè)鏈。在實施方案中，修飾的抗病毒和/或抗融合肽的極性部分包含下列結(jié)構(gòu)例如，修飾的抗病毒和/或抗融合肽可以包含一個或多個半胱磺酸。在實施方案中，半胱磺酸具有下列結(jié)構(gòu)本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通專業(yè)人員在得益于本公開內(nèi)容后，將容易選擇其它能夠增加本文公開的肽的溶解度的合適側(cè)鏈。在其它實施方案中，將一個或多個極性部分(例如半胱磺酸)添加到抗病毒和/或抗融合肽的N-末端或C-末端上。在其它實施方案中，一個或多個極性部分被添加到抗病毒和/或抗融合肽的內(nèi)部序列上。在一個實施方案中，修飾的抗病毒和/或抗融合肽包含gp41卷曲螺旋腔結(jié)合殘基的至少一部分。例如，肽可以包含殘基628WMEW631(SEQIDNO1)，或在其上具有最多1個氨基酸取代(例如，保守或非保守取代)或添加的氨基酸序列。在其它實施方案中，抗病毒和/或抗融合肽包含來自氨基酸628WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL661(對應于氨基酸C1到C34)的C34的全部或部分天然氨基酸序列，或?qū)ζ溥M行多達5、4、3、2或1個氨基酸取代(例如，保守或非保守取代)、缺失或添加。在其它實施方案中，修飾的抗病毒和/或抗融合肽包含DP107和DP178肽及其類似物的氨基酸序列，包括含有來自其它(非HIV)病毒的氨基酸序列的肽，所述其它病毒的氨基酸序列對應于DP107和DP178來源的HIV的gp41區(qū)域，并表現(xiàn)出抗病毒和/或抗融合活性。更具體來說，這些肽可以表現(xiàn)出尤其是針對人類呼吸道合胞病毒(RSV)、人類副流感病毒(HPV)、麻疹病毒(MeV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的抗病毒活性。本發(fā)明還涉及了US05/0070475的SEQIDNO1到SEQIDNO86的修飾的肽，在此特別引為參考。在實施方案中，本發(fā)明的修飾的抗病毒和/或抗融合肽還包含一個或多個化學反應性部分或基團，使得修飾的肽可以與血液成分或載體蛋白上的可用官能團發(fā)生反應，形成穩(wěn)定的共價鍵，由此產(chǎn)生結(jié)合的肽形式。在一個實施方案中，修飾的肽包含一個或多個反應性基團，與一種或多種血液成分(例如白蛋白)上的一個或多個氨基、羥基或巰基發(fā)生反應，形成穩(wěn)定的共價鍵。例如，肽-反應性基團白蛋白結(jié)合物的肽與白蛋白的摩爾比例可以是大約1∶1。通常通過反應性基團與白蛋白例如人白蛋白的34位氨基酸(Cys34)之間的共價鍵發(fā)生結(jié)合。在另一個實施方案中，反應性基團可以是含有馬來酰亞胺的基團(例如MPA(馬來酰亞胺丙酸)或GMBA(γ-馬來酰亞胺-丁酰胺))，它與血液蛋白、包括移動的血液蛋白例如白蛋白上的巰基具有反應性。反應性修飾或基團還可以包含一個或多個接頭。在實施方案中，接頭選自下面的一個或多個(2-氨基)乙氧基乙酸(AEA)，[2-(2-氨基)乙氧基)]乙氧基乙酸(AEEA)，乙二胺(EDA)；一個或多個烷基鏈(C1-C10)，例如8-氨基辛酸(AOA)，8-氨基丙酸(APA)或4-氨基苯甲酸(AphA)。帶有或不帶接頭的反應性基團，可以添加到抗病毒和/或抗融合修飾的肽的N-或C-末端上，通常是抗病毒和/或抗融合修飾的肽的C-末端上。在其它實施方案中，反應性基團連接到修飾的肽的內(nèi)部殘基上(例如連接到內(nèi)部賴氨酸殘基的ε-NH2基團上；內(nèi)部絲氨酸殘基(例如C34的13位絲氨酸)的羥基上)。C34修飾的肽的非限制性例子公開在WO02/096935中，其全部內(nèi)容在此以其全文引為參考。典型地，當一個或多個極性部分(例如半胱磺酸)被添加到修飾的抗病毒和/或抗融合肽的一個末端(例如N-末端)時，反應性基團則被添加到相反末端上(例如C-末端)。例如，修飾的肽可以具有下列構(gòu)型之一[極性部分(例如半胱磺酸)-修飾的肽-接頭n-反應性基團](VI)；或[反應性基團-接頭n-修飾的肽-極性部分(例如半胱磺酸)](VII)。其中反應性基團可以是例如含有馬來酰亞胺的基團，帶有或不帶有接頭，例如n可以是0、1、2、3、4或更多個接頭。當存在一個以上接頭時，接頭可以是相同的，例如AEEA-AEEA，或是不同的，例如AEEA-EDA或AEA-AEEA。在某些實施方案中，包含在修飾的抗病毒和/或抗融合肽中的其它基團可以是具有式(I)的化合物。(VIII)(R1)m-X-(R2)n在式(VIII)中，m和n的和至少為1，m和n各為0或更大的整數(shù)。例如，當m為0時，n為1以上，當n為0時，m為1以上。X是抗病毒和/或抗融合肽，例如C34、T20、T1249或其類似物或衍生物，包括例如其馬來酰亞胺衍生物。當R1存在而R2不存在時，R1存在于X基團的N-末端。當R1不存在而R2存在時，R2存在于X基團的C-末端。在某些實施例中I，R1和R2可以各自獨立地選自具有式(IX)的化合物。式(IX)的核心結(jié)構(gòu)與氨基酸相似，包含氨基、α碳和羧基。根據(jù)R1和R2基團在肽衍生物中的準確位置，基團可以通過式(IX)的不同原子與肽結(jié)合。例如，當R1是具有式(IX)的化合物時，R1可以通過式(IX)的羧基與肽結(jié)合，在R1的羧基與肽的氨基之間提供肽鍵。當R2是具有式(IX)的化合物時，R2可以通過式(IX)的氨基與肽結(jié)合，在R2的氨基與肽的羧基之間提供肽鍵。在某些實施方案中，式(IX)的R3基團可以是除了在20種天然存在的氨基酸中通常發(fā)現(xiàn)的極性、不帶電荷的基團之外的任何極性、不帶電荷的基團。例如，R3基團可以是或可以包含磺?；?HS＝(O)2)、亞砜基(HS＝O)、磺酸基(HO-S＝(O)2)、鹵代烷基、仲胺、叔胺、羥基，或其它極性或甚至中性并能夠增加肽衍生物在水性溶液中的總體溶解度的側(cè)鏈基團。例如，具有能夠形成氫鍵的基團的側(cè)鏈可用于增加肽的總體溶解度。在某些實施例中，側(cè)鏈優(yōu)選無反應性，使得與接頭或其它物類的不想要的副反應不會發(fā)生到任何顯著的程度。在某些實施例中，上面提到的用于R3的基團可以與α碳隔開，例如1-3個碳原子。在某些實施例中，可以選擇R3以提供具有式(X)-(XV)的化合物。本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通專業(yè)人員受益于本公開內(nèi)容，將容易選擇可以增加本文公開的肽的溶解度的其它合適側(cè)鏈。在某些實施方案中，R1和R2基團基本上不影響肽結(jié)合物的總體二級結(jié)構(gòu)，或在某些情況下的三級結(jié)構(gòu)。由于基本上不影響肽結(jié)合物的二級結(jié)構(gòu)，肽結(jié)合物的總體活性將不會顯著低于未衍生的肽。在其它實施方案中，肽衍生物可以采取在式(XVI)中顯示的組合物的形式。(XVI)X1-(R1)m-X2-(R2)n在式(XVI)中，X1和X2表示肽的部分，它們連接在一起時將提供例如C34、T20或T1249，或其變體。在式(XVI)中，R1和R2可以是任何上面有關(guān)式(IX)時討論的那些基團，m與n的和是大于或等于1的整數(shù)，m或n有可以為0的可能性。在式(XVI)中，基團被插入到肽鏈的中間。這樣的插入可以使用許多不同方法來進行，包括用酶消化肽，然后將R1或R2基團或二者插入，然后將肽片段連接在一起。在某些實施方案中，本文公開的化合物，可以連接到肽的N-末端、C-末端的一個或多個附加基團上或通過肽的一個或多個氨基酸的側(cè)鏈連接。例如，可以產(chǎn)生在式(XVII)-(XX)中示意顯示的組合物。在式(XVII)-(XX)中，L是接頭，例如(2-氨基)乙氧基乙酸(AEA)、乙二胺(EDA)、2-[2-(2-氨基)乙氧基]乙氧基乙酸(AEAA)、烷基鏈基序(C1-C10)例如甘氨酸、3-氨基丙酸(APA)、8-氨基辛酸(AOA)、4-氨基苯甲酸(AphA)等，R1和R2可以是本文討論的任何基團。接頭可以通過肽的任何氨基酸連接到肽上，例如通過賴氨酸的氨基基團、肽的一個或多個氨基酸側(cè)鏈殘基中的巰基、羥基；或者連接到肽的N-末端或C-末端上。X、X1和X2基團是肽(X)或肽片段(X1和X2)。在式(XIX)和(XX)中顯示的P基團，表示可以通過接頭L與衍生的肽結(jié)合的蛋白。說明性的蛋白包括血液蛋白或載體蛋白(例如人血清白蛋白，重組白蛋白，免疫球蛋白或其片段，轉(zhuǎn)鐵蛋白或其它適合的蛋白)。蛋白結(jié)合物(式(XIX)和(XX))可以離體或體內(nèi)生產(chǎn)。在進行體內(nèi)生產(chǎn)時，可以將化合物，例如在式(XVII)和(XVIII)中顯示的化合物，導入到對象中，與體內(nèi)蛋白例如白蛋白反應。本發(fā)明的抗病毒和/或抗融合肽可以具有一個或多個氨基酸取代或添加。例如，肽可以具有一個或多個保守的或非保守的取代。在某些實施方案中，修飾的肽可以進一步包含一個或多個氨基酸殘基。例如C34的修飾的肽可以任選在28位的天然賴氨酸(Lys28)被精氨酸取代，和/或添加Lys殘基(或在其ε-氮原子上被修飾的賴氨酸殘基，直接或間接地共價連接到位于C-末端的本文描述的反應性基團上(例如AEEA-MPA)。應該理解，在基團Lys(ε-AEEA-MPA)中，AEEA-MPA連接到賴氨酸的ε-NH2基團上。本發(fā)明的C34的修飾的抗病毒和/或抗融合修飾的肽的非限制性的例子，包括下列序列CA化合物I(半胱磺酸(CA)與C34直接相連；在本文中也被稱為CA-C34(SEQIDNO3))。CA化合物II(半胱磺酸(CA)與28位天然賴氨酸(Lys28)被精氨酸取代的C34直接相連；在本文中也被稱為CA-C34(Arg28)(SEQIDNO4))CA化合物III(半胱磺酸(CA)與在35位具有附加的賴氨酸殘基(Lys35)的C34直接相連，其中賴氨酸的ε-NH2基團通過接頭(AEEA-MPA)與反應性基團相連；在本文中也被稱為CA-C34-Lys35(ε-AEEA-MPA)(SEQIDNO5))。以及CA化合物IV(半胱磺酸(CA)與在28位的天然賴氨酸(Lys28)被精氨酸取代、在35位具有附加的賴氨酸殘基(Lys35)且其中賴氨酸的ε-NH2基團通過接頭(AEEA-MPA)與反應性基團相連的C34直接相連；在本文中也被稱為CA-C34(Arg28)-Lys35(ε-AEEA-MPA)(SEQIDNO6))。另一方面，本發(fā)明的特點是本文描述的具有一個或多個化學反應性修飾的修飾的抗病毒和/或抗融合肽與一種或多種血液成分上的可用官能團結(jié)合的結(jié)合物。在本發(fā)明的一個實施方案中，修飾的肽含有反應性基團，它們與血液成分上的氨基、羥基或巰基結(jié)合，形成了穩(wěn)定的共價鍵。馬來酰亞胺基團可以與修飾的肽直接結(jié)合，或者可以例如通過接頭(例如本文描述的接頭)間接結(jié)合。在本發(fā)明的另一個實施方案中，反應性基團可以是馬來酰亞胺，它與血液蛋白、包括移動的血液蛋白例如白蛋白上的巰基反應。肽-反應性基團白蛋白結(jié)合物可以是大約1∶1的肽與白蛋白的摩爾比例。通常，通過反應性基團與人類白蛋白的34位氨基酸(Cys34)之間的共價鍵發(fā)生結(jié)合。修飾的抗病毒和/或抗融合肽可以包含反應性部分，例如含有馬來酰亞胺的基團，所述部分具有與一種或多種血液成分例如血清白蛋白形成共價鍵、從而形成結(jié)合物的能力。結(jié)合步驟可以在體內(nèi)發(fā)生，例如在將修飾的肽施用于對象之后?；蛘?，結(jié)合步驟可以離體(Exvivo)或在體外發(fā)生，例如通過將含有反應性基團的修飾的肽與血液成分例如白蛋白相接觸。結(jié)合物C34、DP107、DP178等的制備和使用，公開在WO02/096935和US05/0070475中，在此以其全文引為參考。體內(nèi)或離體形成的結(jié)合物可用于在對象、例如人類對象中抑制病毒和/或病毒的融合活性，所述病毒例如HIV、RSV、HPV、MeV或SIV。另一方面，本發(fā)明的特點在于含有本文描述的一種或修飾的抗病毒和/或抗融合肽以及可藥用載體的組合物，例如藥物組合物。在實施方案中，組合物適合于注射(例如皮下或血管內(nèi)注射)，以及肺部、肌內(nèi)和/或腹膜內(nèi)投送。在其它實施方案中，組合物適用于制造工藝。在其它實施方案中，組合物在pH范圍為大約5到8的水性溶液(例如等滲或高鹽水性溶液)中是濃縮的，例如濃度為大約10到500mg/ml、大約10到400mg/ml、大約10到300mg/ml、大約10到200mg/ml、大約10到180mg/ml、大約40到150mg/ml、大約60到125mg/ml或大約90到100mg/ml。另一方面，本發(fā)明的特點在于用于預防和/或治療病毒感染的方法和組合物，包含本文描述的修飾的抗病毒和/或抗融合肽或其結(jié)合物。方法包括對需要治療的對象(人類對象)施用有效量的、例如預防或治療量的本文描述的修飾的抗病毒和/或抗融合肽或其結(jié)合物，以減輕與病毒感染有關(guān)的一種或多種癥狀。可以治療或預防的示例性病毒感染包括AIDS、人類呼吸道合胞病毒(RSV)、人類副流感病毒(HPV)、麻疹病毒(MeV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。因此，公開了使用修飾的抗病毒和/或抗融合肽，或其結(jié)合物，來減輕或抑制與病毒相關(guān)的疾病或病癥的一種或多種癥狀、或預防或延遲其發(fā)作的方法。在預防性應用的情況下(例如預防、減輕或延遲疾病或病癥的一種或多種癥狀的發(fā)作或復發(fā))，對象可以具有或可以不具有疾病或病癥的一種或多種癥狀。例如，可以在任何可檢測到的癥狀出現(xiàn)之前，或者在檢測到至少部分但不是所有癥狀之后，施用修飾的抗病毒和/或抗融合肽或其結(jié)合物。在治療性應用的情況下，治療可以在對象中改善、治愈、維持疾病或病癥，或減少疾病或病癥的持續(xù)時間。在治療性應用中，對象可以具有部分或全部表現(xiàn)出的癥狀。在典型的情況下，治療將對象的疾病或病癥改善到可以被醫(yī)生察覺到的程度，或者防止疾病或病癥的惡化。公開了在對象、例如人類對象中抑制HIV、RSV、HPV、MeV或SIV的一種或多種活性的方法和組合物。方法包括給需要治療的對象施用有效量的、例如預防或治療量的本文描述的修飾的抗病毒和/或抗融合肽或其結(jié)合物。本發(fā)明的修飾的肽也可用于便利純化和制造工藝，因為修飾的肽的溶解度增加允許了更濃的反應溶液，因此便于大規(guī)模制造工藝。因此，本發(fā)明的特點還在于增強抗病毒和/或抗融合肽的溶解度的方法。方法包括提供含有一個或多個極性部分(例如一個或多個半胱磺酸)的修飾的抗病毒和/或抗融合肽，例如本文描述的修飾的肽；以及制備修飾的肽的溶液(例如本文描述的藥物組合物，或生產(chǎn)制備物)。方法可以任選包括測定修飾的抗病毒和/或抗融合肽在溶液中的溶解度(例如通過獲得修飾的抗病毒和/或抗融合肽在溶液中的樣品，并評估樣品的濁度和/或乳光)。另一方面，本發(fā)明的特點在于改進抗病毒和/或抗融合肽的制備、例如結(jié)合(例如大規(guī)模結(jié)合)的方法。方法包括提供含有一個或多個極性部分(例如一個或多個半胱磺酸)的修飾的抗病毒和/或抗融合肽，例如本文描述的修飾的肽；以及制備具有高濃度修飾的肽(例如本文描述的高濃度)的修飾的肽的溶液。本文中使用的無數(shù)量詞的對象是指一個或一個以上的(例如至少一個)語法對象。本文中使用的術(shù)語“或”意味著術(shù)語“和/或”，并可以與它互換使用，除非上下文明確表示不是這樣。術(shù)語“蛋白”和“多肽”在本文中可以互換使用。“大約(About)”和“近似(approximately)”一般將意味著測量到的量給出測量值的本質(zhì)或精確性的可接受的誤差程度。示例性的誤差程度在給定值或值的范圍的20百分率(％)內(nèi)，通常在10％以內(nèi)，更通常在5％以內(nèi)。在通篇本申請中引用的所有出版物、待審專利申請、公布的專利申請(包括WO02/096935和US05/0070475)以及公布的專利的內(nèi)容，在此以其全文引為參考。本發(fā)明的其它特點、目標和優(yōu)點從說明書和附圖以及從權(quán)利要求書中將變得明顯。附圖簡述圖1是線形圖，顯示了在存在對照(實心菱形)的情況下，與天然C34(空心方塊)相比，在外周血單核細胞(PBMC)中HIV-IIIIB復制的抑制。圖2是線形圖，顯示了在存在對照(實心菱形)的情況下，與C34-Lys35(ε-AEEA-MPA)與人血清白蛋白結(jié)合(C34-Lys35(ε-AEEA-MPA)HSA)(空心方塊)相比，在PBMC中HIV-IIIIB復制的抑制。圖3是線形圖，顯示了在存在對照(實心菱形)的情況下，與在N-末端具有半胱磺酸、在C-末端添加的賴氨酸的ε-NH2上結(jié)合有AEEA-MPA的C34(CA-C34-Lys35(ε-AEEA-MPA))與人血清白蛋白的白蛋白結(jié)合物(CA-C34-Lys35(ε-AEEA-MPA)HSA)(空心方塊)相比，在PBMC中HIV-IIIIB復制的抑制。圖4是線形圖，顯示了在存在對照(實心菱形)的情況下，與白蛋白通過MPA-AEEA接頭連接到C34的色氨酸的N-末端α氨基上的結(jié)合物(其也被稱為PC-1505；MPA-(AEEA)-C34)(空心方塊)相比，在PBMC中HIV-IIIIB復制的抑制。圖5A顯示了C34肽和化合物VIII(其也被稱為PC-1505；MPA-(AEEA)-C34；和AC-CpdVIII)在靜脈或皮下給藥到Sprague-Dawley大鼠中后的藥代動力學曲線。圖5B顯示了在靜脈或皮下給藥到Sprague-Dawley大鼠中之后，化合物VIII與rHA的藥代動力學曲線的比較。曲線的重疊，為連接馬來酰亞胺基-化合物VIII與人類血清白蛋白的半胱氨酸-34的化學鍵的穩(wěn)定性、以及化合物VIII對腎臟清除和肽酶降解的穩(wěn)定性，提供了決定性的支持依據(jù)。圖6是表，匯總了使用HIVIIIB時，幾種修飾的抗融合肽在PBMC中的活性的結(jié)果。發(fā)明詳述公開了修飾的抗病毒和/或抗融合肽，它們與修飾前的肽相比，在生理pH下的水性溶液中具有增加的溶解度。在一個實施方案中，本發(fā)明的肽被修飾，以包含一個或多個極性部分，例如一個或多個半胱磺酸，從而增加了它們在水性溶液中的溶解度。修飾的肽還可以包含化學反應性部分，使得修飾的肽可以與血液成分或載體蛋白例如白蛋白上的可用官能團反應，從而增加修飾的肽的體內(nèi)穩(wěn)定性。本發(fā)明的修飾的肽可以例如預防性和/或治療性應用，用于緩解多種病毒的感染，包括人類免疫缺陷病毒(HIV)、人類呼吸道合胞病毒(RSV)、人類副流感病毒(HPV)、麻疹病毒(MeV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。本文中的某些術(shù)語定義如下抗病毒肽本文使用的“抗病毒肽”應當是指通過例如抑制細胞-細胞融合或游離病毒感染，來抑制細胞的病毒感染的肽。感染的途徑可涉及膜融合，如在包膜病毒的情況中發(fā)生的，或某些涉及病毒和細胞結(jié)構(gòu)的其它融合事件。抑制特定病毒的病毒感染的肽，可以針對該具體病毒進行指稱，特別是例如抗HIV肽、抗RSV肽?？谷诤想摹翱谷诤想摹笔窍鄬τ诓淮嬖陔牡那闆r下發(fā)生的膜融合水平，被證明具有抑制或降低兩個或多個實體、例如病毒-細胞或細胞-細胞之間的膜融合事件水平的能力的肽。HIV和抗HIV肽造成獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)的人類免疫缺陷病毒(HIV)，是反轉(zhuǎn)錄病毒的慢病毒科的成員。有兩種主要類型的HIV，HIV-1和HIV-2，已經(jīng)鑒定到了每種的各種不同毒株。HIV的靶為CD-4+細胞，病毒的進入依賴于HIV蛋白gp41與CD-4+細胞表面受體的結(jié)合?？笻IV肽是指表現(xiàn)出針對HIV的抗病毒活性的肽，包括抑制游離病毒對CD-4+細胞的感染，和/或抑制感染與未感染的CD-4+細胞之間HIV誘導的合胞體形成。SIV和抗SIV肽猿猴免疫缺陷病毒(SIV)是在易感猴子中引起獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)樣疾病的慢病毒?？筍IV肽是表現(xiàn)出針對SIV的抗病毒活性的肽，包括抑制SIV病毒對細胞的感染，和抑制感染與未感染細胞之間形成合胞體。RSV和抗RSV肽呼吸道合胞病毒(RSV)是呼吸病原體，在嬰兒和幼兒中特別危險，它在其中可以引起毛細支氣管炎(小氣道的炎癥)和肺炎。RSVs是負義單鏈RNA病毒，是副粘病毒科病毒的成員。RSV的感染途徑典型是通過呼吸道的粘膜，即鼻、咽、氣管、支氣管和細支氣管?？筊SV肽是對RSV表現(xiàn)出抗病毒活性的肽，包括抑制游離RSV病毒對粘膜細胞的感染以及感染與未感染細胞之間的合胞體形成。HPV和抗HPV肽人類副流感病毒(HPIV或HPV)，與RSV類似，是呼吸道疾病的另一種主因，并與RSVs類似，是負義單鏈RNA病毒，是副粘病毒科病毒的成員。HPIV有四種已識別的血清型——HPIV-1、HPIV-2、HPIV-3和HPIV-4。HPIV-1是兒童假膜性喉炎的主因，HPIV-1和HPIV-2都引起上和下呼吸道疾病。HPIV-3更通常與細支氣管炎和肺炎相關(guān)。抗HPV肽是對HPV表現(xiàn)出抗病毒活性的肽，包括抑制游離HPV病毒的感染和感染與未感染細胞之間的合胞體形成。MeV和抗Mev肽麻疹病毒(VM或MeV)是包膜的負義單鏈RNA病毒，屬于副粘病毒科的病毒。與RSV和HPV類似，MeV引起呼吸疾病，并且也產(chǎn)生免疫抑制作用，造成其它的機會感染。在某些情況下，MeV可以建立腦部感染，導致嚴重的神經(jīng)并發(fā)癥?？筂eV肽是對MeV表現(xiàn)出抗病毒活性的肽，包括抑制游離MeV病毒的感染和感染與未感染細胞之間的合胞體形成。C34和C34類似物術(shù)語“C34”是指gp41卷曲螺旋腔結(jié)合殘基的一部分。例如，肽可以包含gp41的殘基628WMEW631(SEQIDNO1)，或gp41的628WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL661(SEQIDNO2)。C34類似物可以包括它的截短物、缺失物、插入物和/或氨基酸取代物(例如保守或非保守取代)。缺失物可以由從C34肽中移除一個或多個氨基酸殘基構(gòu)成，并可以包括移除肽序列的單個連續(xù)的部分或多個部分。插入物可以包括單個氨基酸殘基或成段殘基，并可以在C34肽的羧基或氨基末端或在肽內(nèi)部的位置上進行。DP-178和DP178類似物除非明確或由上下文另行指明，DP-178是指36個氨基酸的DP-178肽，對應于HIV-1分離株LAI(HIVLAI)的gp41糖蛋白的氨基酸殘基638-673，具有下面的序列YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQIDNO7)。DP178的類似物包括它的截短物、缺失物、插入物和/或氨基酸取代物(例如保守或非保守取代)。肽的截短物可以包含3-36個氨基酸之間的肽。缺失物可以由從DP178肽中移除一個或多個氨基酸殘基組成，并可以包括移除肽序列的單個連續(xù)部分或多個部分。插入物可以包括單個氨基酸殘基或成段殘基，并可以在DP178肽的羧基或氨基末端或在肽內(nèi)部的位置上進行。DP178肽類似物是這樣的肽，其氨基酸序列包含HIV-1LAI之外的病毒與DP178來源的gp41區(qū)域?qū)碾膮^(qū)域的氨基酸序列，及其截短物、缺失物或插入物。這些其它的病毒可以包括但不限于其它的HIV分離株例如HIV-2NIHZ，呼吸道合胞病毒(RSV)，人類副流感病毒(HPV)，猿猴免疫缺陷病毒(SIV)和麻疹病毒(MeV)。DP178類似物也指通過在美國專利Nos.6,013,263、6,017,536和6,020,459中描述并且合并在本文中的ALLMOTI5、107X178X4和PLZIP搜索基序鑒定并識別的那些肽序列，其與DP178具有結(jié)構(gòu)和/或氨基酸基序相似性。DP178類似物還指描述為“DP178樣”的肽，該術(shù)語定義在美國專利Nos.6,013,263、6,017,536和6,020,459中。DP-107和DP107類似物除非明確地或由上下文另行指明，DP-107是指38個氨基酸的DP-107肽，對應于HIV-1分離株LAI(HIVLAI)的gp41蛋白的氨基酸殘基558-595，并具有下列序列NNLLRAIEAQQHLLQLTVWQIKQLQARILAVERYLKDQ(SEQIDNO8)。DP107的類似物可以包括它的截短物、缺失物、插入物和/或氨基酸取代物(例如保守或非保守取代)。肽的截短物可以包含3-38個氨基酸之間的肽。缺失物可以由從DP107肽中移除一個或多個氨基酸殘基組成，并可以包括移除肽序列的單個連續(xù)部分或多個部分。插入物可以包括單個氨基酸殘基或成段殘基，并可以在DP107肽的羧基或氨基末端或在肽內(nèi)部的位置上進行。DP107肽類似物是這樣的肽，其氨基酸序列包含病毒除HIV-1LAI之外的、對應于DP107來源的gp41區(qū)域的肽區(qū)域的氨基酸序列，及其截短物、缺失物或插入物。這些其它的病毒可以包括但不限于其它的HIV分離株例如HIV-2NIHZ，呼吸道合胞病毒(RSV)，人類副流感病毒(HPV)，猿猴免疫缺陷病毒(SIV)和麻疹病毒(MeV)。DP107類似物也指通過在美國專利Nos.6,013,263、6,017,536和6,020,459中描述的、并且合并在本文中的ALLMOTI5、107X178X4和PLZIP搜索基序鑒定并識別肽序列，與DP107具有結(jié)構(gòu)和/或氨基酸基序相似性。DP107類似物還指描述為“DP178樣”的肽，該術(shù)語的定義在美國專利Nos.6,013,263、6,017,536和6,020,459中。反應性基團反應性基團是能夠形成共價鍵的化學基團。這樣的反應性基團連接或鍵合到C34、DP-107、DP-178或T-1249肽或其類似物或其它感興趣的抗病毒或抗融合肽上。一般來說，反應性基團在水性環(huán)境中將是穩(wěn)定的，并通常是羧基、磷酰基，或作為酯或混合酸酐的方便的酰基，或亞胺酯，由此能夠與流動的血液成分上靶位點處的官能團，例如氨基、羥基或巰基形成共價鍵。大多數(shù)情況下，酯包括苯酚化合物，或是巰基酯、烷基酯、磷酸酯等。官能團官能團是血液成分上的基團，修飾的抗病毒肽上的反應性基團與它反應以形成共價鍵。官能團包括與酯的反應性本體成鍵的羥基；與馬來酰亞胺、亞胺酯和硫酯基團成鍵的巰基；與羧基、磷酰基或?；涉I的氨基，以及與氨基基團成鍵的羧基。血液成分或載體蛋白血液成分可以是固定的或移動的。固定血液成分是不移動的血液成分，包括組織、膜受體、間質(zhì)蛋白、纖維蛋白、膠原蛋白、血小板、內(nèi)皮細胞、上皮細胞以及它們的相關(guān)膜和膜受體、體細胞、骨骼肌和平滑肌細胞、神經(jīng)元成分、骨細胞和破骨細胞，以及所有身體組織、特別是與循環(huán)和淋巴系統(tǒng)有關(guān)的組織。移動的血液成分是不具有任何較長時期的固定位置的血液成分，一般不超過5分鐘、更通常不超過1分鐘。這些血液成分不是膜結(jié)合的，在血液中長時間存在，并且以至少0.1.mu.g/ml的最小濃度存在。移動的血液成分包括載體蛋白。移動的血液成分包括血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、鐵蛋白和免疫球蛋白例如IgM和IgG。移動的血液成分的半衰期為至少大約12小時。血液成分的其它例子包括鐵蛋白、類固醇結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、甲狀腺素結(jié)合蛋白，以及α-2-巨球蛋白。通常，血清白蛋白和IgG是更優(yōu)選的，血清白蛋白例如人血清白蛋白是最優(yōu)選的。白蛋白也可以來自于重組或基因組來源，例如酵母、細菌(例如大腸桿菌(E.coli))、哺乳動物細胞(例如中華倉鼠卵巢(CHO)細胞)、轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因動物。因此，術(shù)語“血液成分”包括從對象生物化學純化的蛋白，以及重組制造的蛋白。保護性基團保護性基團是用于保護肽衍生物免于與它們自身反應的化學基團。在本文和美國專利No.5,493,007中公開了各種保護性基團，該專利在此引為參考。這樣的保護性基團包括乙?；?、芴甲氧羰基(Fmoc)、叔丁氧基羰基(Boc)、苯甲基氧基羰基(CBZ)等。具體的被保護的氨基酸顯示在表1中。連接基團連接(間隔)基團是連接或聯(lián)接反應性本體與抗病毒或抗融合肽的化學部分。連接基團可以包含一個或多個烷基部分、烷氧部分、烯基部分、炔基部分或氨基部分，它們被烷基部分、環(huán)烷基部分、多環(huán)部分、芳基部分、多芳基部分、取代的芳基部分、雜環(huán)部分和取代的雜環(huán)基取代。連接基團可以包括(2-氨基)乙氧基乙酸(AEA)、[2-(2-氨基)乙氧基)]乙氧基乙酸(AEEA)、乙二胺(EDA)，一種或多種烷基鏈(C1-C10)例如8-氨基辛酸(AOA)、8-氨基丙酸(APA)或4-氨基苯甲酸(APhA)。敏感官能團敏感官能團是代表了抗病毒和/或抗融合肽上潛在反應位點的原子的基團。如果存在，敏感功能基團可以被選擇為接頭-反應性基團修飾的連接點。敏感官能團包括但不限于羧基、氨基、巰基和羥基基團。修飾的肽修飾的肽是通過連接反應性基團進行了修飾的抗病毒和/或抗融合肽。反應性基團可以通過連接基團、或任選不使用連接基團連接到肽上。還考慮到了一個或多個其它氨基酸可以添加到肽上，以便于反應性本體的連接。修飾的肽可以體內(nèi)施用，以便在體內(nèi)發(fā)生與血液成分的結(jié)合，或者它們可以首先在體外與血液成分或載體蛋白結(jié)合(例如使用重組生產(chǎn)的蛋白，例如重組白蛋白、免疫球蛋白或轉(zhuǎn)運蛋白)，并將由此產(chǎn)生的結(jié)合肽(在下面定義)施用于體內(nèi)。結(jié)合肽結(jié)合肽是通過在修飾的肽的反應性基團與血液成分的官能團之間使用或不使用連接基團形成的共價鍵，與血液成分結(jié)合的修飾的肽。在本申請通篇中使用時，術(shù)語“結(jié)合肽”可以更具體地指稱特定的結(jié)合肽，例如“結(jié)合的C34”或“結(jié)合的DP107”。在實施方案中，本發(fā)明的修飾的抗病毒和/或抗融合肽包含含有馬來酰亞胺的基團，該基團具有共價鍵合血液成分、更具體是血清白蛋白以形成結(jié)合物的能力。向?qū)ο笫┯每共《竞?或抗融合肽的馬來酰亞胺衍生物，可以導致肽與血液成分例如血清白蛋白的體內(nèi)結(jié)合。通過將修飾的抗病毒和/或抗融合肽與血液成分或載體蛋白、例如血清白蛋白相接觸，來制備離體(或體內(nèi))結(jié)合物，也包括在本發(fā)明中。在這種情況下，白蛋白可以從不同的來源提供，例如在血液樣品中、純化的白蛋白、重組的白蛋白(包括白蛋白的修飾形式，例如具有氨基酸取代、插入和/或缺失)等。C34與白蛋白的結(jié)合物的制備和使用，已經(jīng)在WO02/096935中充分公開，類似的制備和使用也適用于本發(fā)明的結(jié)合物。在對象體內(nèi)形成的結(jié)合物與離體制備的結(jié)合物，在施用于對象時，都可用于表現(xiàn)出相應的融合肽抑制劑的抗融合活性，因此，在對象中抑制HIV、RSV、HPV、MeV或SIV的活性?？紤]到這些定義，本發(fā)明利用了現(xiàn)有的抗病毒和抗融合肽的性質(zhì)?？梢员浑囊种频牟《荆ǖ幌抻谠诶缑绹鴮＠鸑os.6,013,263、6,017,536和6,020,459中表V-VII和表IX-XIV列出的所有病毒株。這些病毒包括例如人類反轉(zhuǎn)錄病毒，包括HIV-1、HIV-2和人類T-淋巴細胞病毒(HTLV-I和HTLV-II)，以及非人類反轉(zhuǎn)錄病毒，包括牛白血病病毒、貓肉瘤病毒、貓白血病病毒、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、猿猴肉瘤病毒、猿猴白血病和綿羊進行性肺炎病毒。本發(fā)明的肽也可以抑制非反轉(zhuǎn)錄病毒，包括人類呼吸道合胞病毒(RSV)、犬瘟熱病毒、新城疫病毒、人類副流感病毒(HPIV)、流感病毒、麻疹病毒(MeV)、EB病毒、乙肝病毒和猿猴Mason-Pfizer病毒。非包膜的病毒也可以被本發(fā)明的肽抑制，包括但不限于小核糖核酸病毒例如脊髓灰質(zhì)炎病毒、甲肝病毒、腸道病毒、?？刹《尽⒖滤_奇病毒，乳頭多瘤空泡病毒例如乳頭狀瘤病毒、細小病毒、腺病毒和呼腸弧病毒。例如，如同在本申請的背景部分中所討論，已經(jīng)描述了HIV融合肽的作用機制，肽的抗病毒和抗融合性質(zhì)也已經(jīng)很好地建立。對應于羧基末端胞外結(jié)構(gòu)域序列(例如B型HIV-1的LAI毒株的氨基酸殘基643-678或來自類似毒株的殘基638-673以及殘基558-595)的合成肽，已經(jīng)顯示出在低濃度下完全抑制病毒介導的細胞-細胞融合。本發(fā)明的肽與天然病毒gp41的亮氨酸拉鏈區(qū)競爭，從而導致了干擾病毒融合/感染到細胞中。本發(fā)明還提供了用于以DACTM(藥物活性復合物)技術(shù)修飾選定的抗病毒和/或抗融合肽的方法和試劑，通過肽在蛋白載體上的選擇性結(jié)合，賦予該肽改進的生物利用度、延長的半衰期和更好的分布，而不改變肽的抗病毒性質(zhì)。被選擇(但不限于)用于本發(fā)明的載體是白蛋白，通過它的游離巰基被馬來酰亞胺部分修飾的抗病毒和/或抗融合肽結(jié)合?？共《竞?或抗融合抑制劑在文獻中，已經(jīng)描述了幾種肽序列高效防止HIV-1融合/感染。例如，肽C34、DP107和DP178結(jié)合到gp41與融合相關(guān)的構(gòu)象上。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，修飾了C34-、DP178-和DP178-樣的肽。同樣地，本發(fā)明的其它實施方案包括用于對抗HIV的C34-、DP107和DP107-樣的肽的修飾，以及在RSV、HPV、MeV和SIV病毒中發(fā)現(xiàn)的與DP107和DP178類似的肽。修飾的C34肽或類似物在某些實施方案中，本發(fā)明的修飾的C34肽包括包含在肽中的附加基團，它們可以是具有式(I)的化合物。(VIII)(R1)m-X-(R2)n在式(VIII)中，m與n的和至少為1，m和n各為0或大于0的整數(shù)。例如，當m為0時，n為1或以上，當n為0時，m為1或以上。X是肽、肽片段或蛋白，例如C34、T20、T1249或其衍生物，包括例如其馬來酰亞胺衍生物。當R1存在而R2不存在時，R1存在于X基團的N-末端。當R1不存在而R2存在時，R2存在于X基團的C-末端。在某些實施例中，R1和R2可以各自獨立地選自具有式(IX)的化合物。式(IX)的核心結(jié)構(gòu)與氨基酸相似，包含氨基、α碳和羧基。根據(jù)R1和R2基團在肽衍生物中的準確位置，基團可以通過式(IX)的不同原子與肽結(jié)合。例如，當R1是具有式(IX)的化合物時，R1可以通過式(IX)的羧基與肽結(jié)合，在R1的羧基與肽的氨基之間提供肽鍵。當R2是具有式(IX)的化合物時，R2可以通過式(IX)的氨基與肽結(jié)合，在R2的氨基與肽的羧基之間提供肽鍵。在某些實施例中，式(IX)的R3基團可以是除了在20種天然存在的氨基酸中通常發(fā)現(xiàn)的極性、不帶電荷的基團之外的任何極性、不帶電荷的基團。例如，R3基團可以是或可以包含磺?；?HS＝(O)2)、亞砜基(HS＝O)、磺酸基(HO-S＝(O)2)、鹵代烷基、仲胺、叔胺、羥基，或其它極性的或甚至中性的并能夠增加肽衍生物在水性溶液中的總體溶解度的側(cè)鏈基團。例如，具有能夠形成氫鍵的基團的側(cè)鏈可用于增加肽的總體溶解度。在某些實施例中，側(cè)鏈優(yōu)選無反應性，使得與接頭或其它物類的不想要的副反應不會以任何顯著的程度發(fā)生。在某些實施例中，上面提到的用于R3的基團可以與α碳隔開，例如1-3個碳原子。在某些實施例中，可以選擇R3以提供具有式(X)-(XV)的化合物。本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通專業(yè)人員受益于本公開內(nèi)容，將容易選擇出可以增加本文公開的肽的溶解度的其它合適側(cè)鏈。在某些實施方案中，R1和R2基團基本上不影響肽結(jié)合物的總體二級結(jié)構(gòu)，或在某些情況下的三級結(jié)構(gòu)。由于基本上不影響肽結(jié)合物的二級結(jié)構(gòu)，肽結(jié)合物的總體活性將不會顯著低于未衍生的肽。在其它實施方案中，肽衍生物可以采取在式(XVI)中顯示的組合物的形式。(XVI)X1-(R1)m-X2-(R2)n在式(XVI)中，X1和X2表示肽的部分，它們連接在一起時將提供例如C34、T20或T1249。在式(XVI)中，R1和R2可以是任何上面就式(IX)討論的那些基團，m與n的和是大于或等于1的整數(shù)，m或n有可以為0的可能性。在式(XVI)中，基團被插入到肽鏈的中間。這樣的插入可以使用許多不同的方法來進行，包括酶法消化肽，然后將R1或R2基團或二者插入，然后將肽片段連接在一起。本文描述的C34的半胱磺酸衍生物的合成，是使用自動的固相過程，在十二通道(Symphony)肽合成儀上進行的，在肽的產(chǎn)生過程中進行了手工干預(參見本文的實施例1-5)。合成在Fmoc保護的拉每(Ramage)酰胺接頭樹脂上，使用Fmoc保護的氨基酸來進行。使用O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)作為活化劑混合物，在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中進行連接。Fmoc保護基團使用20％哌啶/DMF除去。Boc-保護的氨基酸用于N-末端，以便一旦肽從樹脂上裂解下來，就產(chǎn)生游離的Nα-末端。在合成過程中使用Sigmacote處理過(Sigmacoted)的玻璃反應容器。在某些實施方案中，一部分肽可以使用常規(guī)的固相合成技術(shù)來合成，例如在Merrifield，1986.固相合成(Solidphasesynthesis.)Science.232341-347中描述的。簡單來說，將阻斷基團加到氨基酸的N-末端，氨基酸的羧基可以通過與二環(huán)己基碳二亞胺(DCCD)反應來活化?；罨陌被峥梢耘c結(jié)合在樹脂或珠子上的具有游離N-末端和C-末端的氨基酸反應。在形成了氨基阻斷的二肽基化合物后，酸處理產(chǎn)生了異丁烯、二氧化碳和結(jié)合到樹脂或珠子上的二肽。通過重復這些步驟，可以將其它氨基酸添加到二肽珠子上。此外，本文公開的氨基酸衍生物，也可以使用類似的反應添加到肽鏈上沿著肽鏈的任何位點。因此，可以將R1或R2基團插入到所需多肽中的任何位點處，以提供具有式(IX)的化合物。在某些實施方案中，本文公開的化合物可以連接到肽的N-末端、C-末端的一個或多個附加基團上或通過肽的一個或多個氨基酸的側(cè)鏈連接。例如，可以產(chǎn)生在式(XVII)-(XX)中示意顯示的組合物。在式(XVII)-(XX)中，L是接頭，例如(2-氨基)乙氧基乙酸(AEA)、乙二胺(EDA)、2-[2-(2-氨基)乙氧基]乙氧基乙酸(AEAA)、烷基鏈基序(C1-C10)例如甘氨酸、3-氨基丙酸(APA)、8-氨基辛酸(AOA)、4-氨基苯甲酸(AphA)等，R1和R2可以是本文討論的任何基團。接頭可以通過肽的任何氨基酸、例如通過肽的賴氨酸的ε-氨基基團在肽的N-末端或C-末端與肽連接。X、X1和X2基團是肽(X)或肽的片段(X1和X2)。在式(XIX)和(XX)中顯示的P基團代表可以通過接頭L與衍生的肽結(jié)合的蛋白。說明性的蛋白包括血液蛋白、人血清白蛋白、重組白蛋白或其它適合的蛋白。蛋白結(jié)合物(式(XIX)和(XX))可以離體或體內(nèi)生產(chǎn)。在進行體內(nèi)生產(chǎn)時，可以將化合物，例如在式(XVII)和(XVIII)中顯示的化合物，導入到對象中，與體內(nèi)蛋白例如白蛋白反應。本發(fā)明的C34的修飾的抗病毒和/或抗融合修飾的肽的非限制性例子，包括下列序列CA化合物I(半胱磺酸(CA)與C34直接相連；在本文中也被稱為CA-C34(SEQIDNO3))。CA化合物II(半胱磺酸(CA)與在28位的天然賴氨酸(Lys28)被精氨酸取代的C34直接相連；在本文中也被稱為CA-C34(Arg28)(SEQIDNO4))CA化合物III(半胱磺酸(CA)與在35位具有附加的賴氨酸殘基(Lys35)的C34直接相連，其中賴氨酸的ε-NH2基團通過接頭(AEEA-MPA)與反應性基團相連；在本文中也被稱為CA-C34-Lys35(ε-AEEA-MPA)(SEQIDNO5))。CA化合物IV(半胱磺酸(CA)與在28位的天然賴氨酸(Lys28)被精氨酸取代、在35位具有附加的賴氨酸殘基(Lys35)的C34直接相連，其中賴氨酸的ε-NH2基團通過接頭(AEEA-MPA)與反應性基團相連；在本文中也被稱為CA-C34(Arg28)-Lys35(ε-AEEA-MPA)(SEQIDNO6))?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明的講述進行修飾的修飾的C34肽的其它例子也包含下面的氨基酸序列N末端-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL-C末端(SEQIDNO8)；N末端-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQERNEQELK-C末端(SEQIDNO9)；N末端-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQERNEQEKL-C末端(SEQIDNO10)；N末端-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQERNEQKLL-C末端(SEQIDNO11)；N末端-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQERNEKELL-C末端(SEQIDNO12)；N末端-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQERNKQELL-C末端(SEQIDNO13)；N末端-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQERKEQELL-C末端(SEQIDNO14)；N末端-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQERNEQELLK-C末端(SEQIDNO15)；以及N末端-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLK-C末端(SEQIDNO16)。修飾的C34肽的非限制性的例子是下面顯示的式I-VIII的化合物，它們能夠與血液成分上的巰基在體內(nèi)或離體發(fā)生反應，形成穩(wěn)定的共價鍵。這些化合物的合成描述在WO02/096935中，其內(nèi)容在此特別引為參考。DP178和DP107DP178肽DP178肽對應于來自HIV-1LAI分離株的跨膜蛋白gp41的氨基酸殘基638到673，具有36個氨基酸的序列(從氨基向羧基末端讀)NH2-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-COOH(SEQIDNO7)除了全長的DP17836-mer之外，本發(fā)明的肽還包括DP178肽的截短物，含有3到36個氨基酸殘基之間的肽(即肽的大小在三肽到36-mer多肽的范圍內(nèi))。這些截短的肽顯示在表2和3中。此外，DP178肽的氨基酸取代物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。HIV-1和HIV-2包膜蛋白在結(jié)構(gòu)上截然不同，但是在HIV-1和HIV-2的DP178相應區(qū)域中存在著顯著的氨基酸保守性。氨基酸保守性具有周期性性質(zhì)，表明一定的結(jié)構(gòu)和/或功能保守。因此，一類可能的氨基酸取代將包括預期穩(wěn)定本發(fā)明的DP178肽的結(jié)構(gòu)的氨基酸改變。利用本文描述的DP178和DP178類似物序列，專業(yè)技術(shù)人員可以容易地編譯出DP178的共有序列，并據(jù)此確定能夠代表優(yōu)選的氨基酸取代的保守氨基酸殘基。氨基酸取代可以是保守或非保守的性質(zhì)。保守的氨基酸取代物由將DP178肽序列的一個或多個氨基酸用電荷，大小和/或疏水性特征相似的氨基酸代替而構(gòu)成，例如谷氨酸(E)對天冬氨酸(D)的氨基酸取代。非保守取代由將DP178肽序列的一個或多個氨基酸用具有不相似的電荷、大小和/或疏水性特征的氨基酸代替而構(gòu)成，例如谷氨酸(E)取代纈氨酸(V)。DP178的氨基酸插入可以由單個氨基酸殘基或成段殘基組成。插入可以在DP178或DP178的截短肽的羧基或氨基末端進行，以及在肽內(nèi)部的位置上進行。這樣的插入一般來說長度在2到15個氨基酸的范圍內(nèi)?？紤]到在目標肽的羧基或氨基末端進行的插入可以具有較寬的尺寸范圍，優(yōu)選為大約2到大約50個氨基酸?？梢栽贒P178或DP178截短物中導入一個或多個這樣的插入，只要這樣的插入產(chǎn)生的肽仍然可以被上面描述的107x178x4、ALLMOTI5或PLZIP搜索基序識別即可。優(yōu)選的氨基或羧基末端插入是長度為大約2到大約50個氨基酸殘基的肽，分別對應于實際的DP178gp41氨基酸序列的氨基或羧基方向的gp41蛋白區(qū)域。因此，優(yōu)選的氨基末端或羧基末端氨基酸插入將包含在gp41蛋白的緊接DP178區(qū)域氨基或羧基方向發(fā)現(xiàn)的gp41氨基酸序列。DP178或DP178截短物的缺失也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這樣的缺失包括由從DP178或DP178樣肽序列中除去一個或多個氨基酸而組成，產(chǎn)生的肽序列的下限長度為4到6個氨基酸。這樣的缺失可以包括肽序列的單個連續(xù)的或一個以上不連續(xù)的部分?？梢栽贒P178或DP178截短物中導入一個或多個這樣的缺失，只要這樣的缺失產(chǎn)生的肽仍然可以被上面描述的107x178x4、ALLMOTI5或PLZIP搜索基序識別即可。DP107肽DP107是表現(xiàn)出有效抗病毒活性的38個氨基酸的肽，對應于HIV-1LAI分離株的跨膜(TM)gp41糖蛋白的殘基558到595，顯示如下NH2-NNLLRAIEAQQHLLQLTVWQIKQLQARILAVERYLKDQ-COOH(SEQIDNO17)除了全長DP10738-mer之外，DP107肽還包括DP107肽的截短物，含有3到38個氨基酸殘基之間的肽(即肽的尺寸在三肽到38-mer多肽的范圍內(nèi))。這些肽顯示在US2005/0070475的表4和5中。此外，氨基酸取代的DP107肽也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。至于DP178，在HIV-1和HIV-2的DP107相應區(qū)域中也存在著強烈的氨基酸保守性，也具有周期性性質(zhì)，表明了結(jié)構(gòu)和/或功能的保守性。因此，一類可能的氨基酸取代包括預計穩(wěn)定本發(fā)明的DP107肽結(jié)構(gòu)的氨基酸改變。利用本文描述的DP107和DP107類似物序列，專業(yè)技術(shù)人員可以容易地編譯出DP107的共有序列，并據(jù)此確定能夠代表優(yōu)選的氨基酸取代的保守氨基酸殘基。氨基酸取代可以是保守或非保守的性質(zhì)。保守的氨基酸取代由將DP107肽序列的一個或多個氨基酸用具有相似的電荷、大小和/或疏水性特征的氨基酸代替而構(gòu)成，例如谷氨酸(E)對天冬氨酸(D)的氨基酸取代。非保守取代由將DP107肽序列的一個或多個氨基酸用具有不相似的電荷、大小和/或疏水性特征的氨基酸代替而構(gòu)成，例如谷氨酸(E)取代纈氨酸(V)。氨基酸插入可以由單個氨基酸殘基或成段殘基構(gòu)成。插入可以在DP107或DP107的截短肽的羧基或氨基末端進行，以及在肽內(nèi)部的位置上進行。這樣的插入一般來說長度在2到15個氨基酸之間?？紤]到了在目標肽的羧基或氨基末端進行的插入可以具有較寬的尺寸范圍，優(yōu)選為大約2到大約50個氨基酸?？梢栽贒P107或DP107截短物中導入一個或多個這樣的插入，只要這樣的插入產(chǎn)生的肽仍然可以被上面描述的107x178x4、ALLMOTI5或PLZIP搜索基序識別即可。優(yōu)選的氨基或羧基末端插入是長度為大約2到大約50個氨基酸殘基的肽，分別對應于實際的DP107gp41氨基酸序列的氨基或羧基方向的gp41蛋白區(qū)域。因此，優(yōu)選的氨基末端或羧基末端氨基酸插入將包含在gp41蛋白緊接DP107區(qū)域的氨基或羧基方向上發(fā)現(xiàn)的gp41氨基酸序列。DP107或DP107截短物的缺失也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這樣的缺失由從DP107或DP107樣肽序列中除去一個或多個氨基酸構(gòu)成，產(chǎn)生的肽序列的下限長度為4到6個氨基酸。這樣的缺失可以包括肽序列的單個連續(xù)的或一個以上不連續(xù)的部分?？梢栽贒P107或DP107截短物中導入一個或多個這樣的缺失，只要這樣的缺失產(chǎn)生的肽仍然可以被上面描述的107x178x4、ALLMOTI5或PLZIP搜索基序識別即可。DP107和DP107截短物在美國專利No.5,656,480中進行了更全面的描述。DP107和DP178類似物對應于上面描述的本發(fā)明的DP178、DP178截短物、DP107和DP107截短物序列的類似物的肽，可以在其它病毒中發(fā)現(xiàn)，包括例如非HIV-1包膜病毒、非包膜病毒和其它非病毒生物體。這樣的DP178和DP107類似物，可以對應于例如包膜病毒的跨膜(“TM”)蛋白中存在的肽序列，和可以對應于非包膜和非病毒生物體中存在的肽序列。這樣的肽可以表現(xiàn)出抗融合活性、抗病毒活性，更具體來說是對在其中發(fā)現(xiàn)它們天然序列的病毒具有特異性的抗病毒活性，或可表現(xiàn)出調(diào)節(jié)涉及卷曲螺旋肽結(jié)構(gòu)的細胞內(nèi)過程的能力。DP178類似物DP178類似物，是其氨基酸序列含有例如對應于DP178來源的gp41肽區(qū)域的其它(即HIV-1之外)病毒肽區(qū)域氨基酸序列的肽。這樣的病毒可以包括但不限于其它HIV分離株和HIV-2分離株。源于其它(即非HIV-1LAI)HIV-1分離株的相應gp41肽區(qū)域的DP178類似物，可以包含例如下面顯示的肽序列。NH2-YTNTIYTLLEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-COOH(SEQIDNO18)NH2-YTGIIYNLLEESQNQQEKNEQELLELDKWANLWNWF-COOH(SEQIDNO19)NH2-YTSLIYSLLEKSQIQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-COOH(SEQIDNO10)SEQIDNO18、SEQIDNO19和SEQIDNO20的肽分別源自HIV-1SF2、HIV-1RF和HIV-1MN。其它的DP178類似物包括源于HIV-2的，包括US2005/0070475的SEQIDNO6和SEQIDNO7的肽，它們分別源于HIV-2ROD和HIV-2NIHZ。其它有用的類似物包括US2005/0070475的SEQIDNO8和SEQIDNO9的肽，它們已被證實顯示出抗病毒活性。在本發(fā)明中，優(yōu)選DP178類似物表示其氨基酸序列對應于gp41蛋白的DP178區(qū)域的肽，此外，還考慮到本文公開的肽還可以包含長度為大約2到大約50個氨基酸殘基范圍的氨基酸序列，其對應于實際的DP178氨基酸序列的氨基或羧基方向的gp41蛋白區(qū)域。US2005/0070475的表6和表7顯示了HIV-2NIHZDP178類似物的一些可能的截短物，它們可以含有3到36個氨基酸殘基之間的肽(即肽的大小從三肽到36-mer多肽)。這些表中的肽序列是從氨基(左)到羧基(右)末端列出的。其它的DP178類似物和DP107類似物DP178和DP107類似物是例如通過使用上面描述的107x178x4、ALLMOTI5或PLZIP計算機輔助搜索策略識別或鑒定的。搜索策略鑒定了預計具有類似DP107和/或DP178的結(jié)構(gòu)和/或氨基酸序列特征的其它肽區(qū)域。搜索策略在美國專利Nos.6,013,263、6,017,536和6,020,459的第9節(jié)顯示的實施例中進行了充分的描述。盡管該搜索策略部分是基于從DP107和DP178推導的一級氨基酸基序，但它不僅僅是基于搜索一級氨基酸序列同源性，因為這樣的蛋白序列同源性存在于病毒的主要類別之內(nèi)，而不是之間。例如，在HIV-1不同毒株的TM蛋白內(nèi)、或在猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的不同分離株的TM蛋白內(nèi)，一級氨基酸序列同源性是高的。在美國專利Nos.6,013,263、6,017,536和6,020,459中公開的計算機搜索策略，成功地鑒定了與DP107和DP178相似的蛋白區(qū)域。該搜索策略被設(shè)計成用于可商購的序列數(shù)據(jù)包，優(yōu)選PC/Gene。在美國專利Nos.6,013,263、6,017,536和6,020,459中，設(shè)計并工程化了一系列搜索基序107x178x4、ALLMOTI5和PLZIP基序，其嚴緊性范圍從嚴格到寬泛，其中107x178x4是優(yōu)選的。通過這些基序鑒定到的序列，例如在美國專利Nos.6,013,263、6,017,536和6,020,459的表V-XIV中列出的序列，潛在地表現(xiàn)出抗融合、例如抗病毒的活性，可以另外用于抗融合例如抗病毒的化合物的鑒定。其它的抗病毒肽抗RSV肽抗RSV肽包括從RSV中相應的肽序列中鑒定到的DP178和/或DP107類似物，它們已經(jīng)被進一步鑒定為抑制RSV引起的病毒感染。這些目標肽包括US2005/0070475的表16的肽以及SEQIDNO10到SEQIDNO30的肽。合成這些肽的詳細方案公開在US2005/0070475中，其內(nèi)容在此特別引為參考。其中特別有利的是下面的肽YTSVITIELSNIKENKCNGAKVKLIKQELDKYK(SEQIDNO21)TSVITIELSNIKENKCNGAKVKLIKQELDKYKN(SEQIDNO22)VITIELSNIKENKCNGAKVKLIKQELDKYKNAV(SEQIDNO23)IALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDK(SEQIDNO24)US2005/0070475的SEQIDNO10的肽源自于RSV的F2區(qū)域，并在美國專利Nos.6,103,236和6,020,459中使用了所描述的搜索基序鑒定為對應于DP107和DP178肽(即“DP107/178樣”)。SEQIDNO21到SEQIDNO23的肽各具有包含在SEQIDNO10中的氨基酸序列，且每個都已被顯示表現(xiàn)出抗RSV活性，具體來說，在低于50μg/ml的濃度下抑制RSV感染的與未感染的Hep-2細胞之間的融合和合胞體形成。US2005/0070475的SEQIDNO11的肽源自于RSV的F1區(qū)域，并在美國專利Nos.6,103,236和6,020,459中使用了所描述的搜索基序鑒定為對應于DP107(即“DP107樣”)。SEQIDNO24的肽所含的氨基酸序列包含在US2005/0070475的SEQIDNO10內(nèi)，并同樣已被顯示表現(xiàn)出抗RSV活性，具體來說，在低于50μg/ml的濃度下抑制RSV感染的與未感染的Hep-2細胞之間的融合和合胞體形成?？笻PIV肽抗HPIV肽包括從HPIV中相應的肽序列中鑒定到的、已被進一步鑒定為抑制HPIV引起的病毒感染的DP178和/或DP107類似物。這些目標肽包括US2005/0070475的表17的肽以及SEQIDNO31到SEQIDNO62的肽。合成這些肽的詳細方案公開在US2005/0070475中，其內(nèi)容在此特別引為參考。其中特別感興趣的是下面的肽VEAKQARSDIEKLKEAIRDTNKAVQSVQSSIGNLI(SEQIDNO25)RSDIEKLKEAIRDTNKAVQSVQSSIGNLIVAIKSV(SEQIDNO26)NSVALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKL(SEQIDNO27)ALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSI(SEQIDNO28)LDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSIG(SEQIDNO29)DPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSIGN(SEQIDNO30)PIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSIGNW(SEQIDNO31)IDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSIGNWH(SEQIDNO32)US2005/0070475的SEQIDNO31的肽源自于HPIV-3的F1區(qū)域，并在美國專利Nos.6,103,236和6,020,459中使用了所描述的搜索基序鑒定為對應于DP107(即“DP107樣”)。SEQIDNO25和SEQIDNO26的肽各具有包含在US2005/0070475的SEQIDNO30的肽內(nèi)的氨基酸序列，且每個都已被顯示表現(xiàn)出抗HPIV-3活性，具體來說，在低于1μg/ml的濃度下抑制HPIV-3感染的Hep2細胞與未感染的CV-1W細胞之間的融合和合胞體形成。US2005/0070475的SEQIDNO32的肽源自于HPIV-3的F1區(qū)域，并在美國專利Nos.6,103,236和6,020,459中使用了所描述的搜索基序鑒定為對應于DP178的(即“DP178樣”)。SEQIDNO27和SEQIDNO28到SEQIDNO32的肽各具有包含在US2005/0070475的SEQIDNO32的肽內(nèi)的氨基酸序列，并每個也已被顯示表現(xiàn)出抗HPIV-3活性，具體來說，在低于1μg/ml的濃度下抑制HPIV-3感染的Hep2細胞與未感染的CV-1W細胞之間的融合和合胞體形成?？筂eV肽抗MeV肽是從麻疹病毒(MeV)中相應的肽序列中鑒定到的DP178和/或DP107類似物，其已被進一步鑒定為抑制麻疹病毒引起的病毒感染。這些特定的目標肽包括US2005/0070475的表19的肽以及SEQIDNO74到SEQIDNO86的肽。合成這些肽的詳細方案公開在US2005/0070475中，其內(nèi)容在此特別引為參考。其中特別感興趣的是下面列出的肽HRIDLGPPISLERLDVGTNLGNAIAKLEAKELLE(SEQIDNO33)IDLGPPISLERLDVGTNLGNAIAKLEAKELLESS(SEQIDNO34)LGPPISLERLDVGTNLGNAIAKLEAKELLESSDQ(SEQIDNO35)PISLERLDVGTNLGNAIAKLEAKELLESSDQILR(SEQIDNO36)源自于麻疹病毒的序列，在美國專利Nos.6,103,236和6,020,459中使用所描述的搜索基序鑒定為對應于DP178(即“DP178樣”)。SEQIDNO33、SEQIDNO34、SEQIDNO35和SEQIDNO36的肽各具有如此鑒定的氨基酸序列，且每個都已被顯示表現(xiàn)出抗MeV活性，具體來說，在低于1μg/ml的濃度下抑制MeV感染的Hep2細胞與未感染的人用狂犬病純化疫苗(Vero)細胞之間的融合和合胞體形成?？筍IV肽抗SIV肽是從SIV中相應的肽序列中鑒定到的DP178和/或DP107類似物，其已被進一步鑒定為抑制SIV引起的病毒感染。這樣的目標肽包括US2005/0070475的表18的肽以及SEQIDNO63到SEQIDNO73的肽。合成這些肽的詳細方案公開在US2005/0070475中，其內(nèi)容在此特別引為參考。其中特別感興趣的是下面的肽WQEWERKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQK(SEQIDNO37)QEWERKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKL(SEQIDNO38)EWERKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLN(SEQIDNO39)WERKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNS(SEQIDNO40)ERKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSW(SEQIDNO41)RKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSWD(SEQIDNO42)KVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSWDV(SEQIDNO43)VDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSWDVF(SEQIDNO44)DFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFG(SEQIDNO45)FLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFGN(SEQIDNO46)源自于SIV跨膜融合蛋白的序列，在美國專利Nos.6,103,236和6,020,459中使用了所描述搜索基序鑒定為對應于DP178(即“DP178樣”)。SEQIDNO37到SEQIDNO46的肽各具有這樣鑒定的氨基酸序列，且每個作為粗肽都已被顯示表現(xiàn)出有效力的抗SIV活性。其它病毒和融合抑制劑“病毒抑制劑衍生物”的表述目的是指選自抗融合化合物或進入抑制劑(或非抗融合)化合物的病毒抑制劑的任何修飾或衍生物?？谷诤匣衔锇ǖ幌抻诙鞣蝽f地，C34，T-1249，TRI-899，TRI-999，5-螺旋，N36Mut(例如)，NCCG-gp41，DP-107，M41-P，N36，M87o，F(xiàn)M-006，ADS-J1，C14林克美(linkmid)，C34卷曲，溶血素A，IQN17，IQN23，SC34EK，SPI-30，014，SPI-70，038，T-1249-HSA，T-649，T-651，TRI-1144，C14，MBP-107，scC34；SJ-2176，T-1249-轉(zhuǎn)鐵蛋白，p26，p38，ADS-J2，C52L，克隆3抗體，D5IgG，D5scFc，F(xiàn)240scFv，西夫韋肽(sifuvirtide)，IZN-36，T-1249模擬體，N-36-E，NB-2，NB-64，S-29-I，茶黃素-3，3′-二沒食子酸，VIRIP，西霉素(siamycin)I，西霉素(siamycin)II。進入抑制劑(或非抗融合)化合物包括但不限于AMD-070，SPC-3，KRH-2731，AMD-8664，F(xiàn)C-131，HIV-1Tat類似物，KRH-1120，KRH-1636，POL-2438，T-134，T-140，基質(zhì)細胞衍生因子1，ALX40-4C，AMD-3100，T-22，TJN-151，AM-1401，EradicAide病毒巨噬細胞炎性蛋白II，AMD-3451，考諾科萬(conocurvone)，馬拉韋羅(maraviroc)，維克韋羅(vicriviroc)，INCB-9471，INCB-15，050，DAPTA，PRO-140，HGS-004，SCH-C，TAK-652，TAK-220，尼非韋羅(nifeviroc)，AMD-887，抗CD63MAb，AOP-RANTES，CPMD-167，E-913，F(xiàn)LSCR/T-IgG1，HGS-101，NIBR-1282，諾大肯(nonakine)，PSC-RANTES，sCD4-17b，SCH-350，634，MIP-1α，MIP-1β，RANTES，阿普韋羅(aplaviroc)，肽T，TAK-779，pCLXSN載體，UCB-35，625，J-113，863，CLIV，1-309，EGCG，表沒食子兒茶素沒食子酸酯，HB-19，λ角叉菜膠，PC-515，可得蘭膠(curdlan)硫酸酯，OKU-40，OKU-41，VGV-1，凈特韋(Zintevir)，AR-177，T-30，177，琥珀酸化白蛋白，NSC0-658，586，ISIS-5320，RP-400c，SA-1042，C31G，沙維(Savvy)，PRO-542，rCD4-IgG2，BMS-488，043，BMS-378，806，DES-6，12p1，阿克汀文(Actinohivin)，BlockAide/VP，CD4M33，CT-319，CT-326，西亞諾韋林(cyanovirin)-N，DCM-205，DES-10，格里夫辛(griffithsin)，HNG-105，NBD-556，NBD-557，PEG-西亞諾韋林(cyanovirin)-N，西托韋林(scytovirin)，sCD4，葡聚糖-2-硫酸酯，F(xiàn)-105，F(xiàn)P-21，399，TNX-355，B4MAb，R-15-K，sCD38(51-75)MBP，PRO-2000，NSC-13，778，SB-673，461M，SB-673，462M，rsCD4，Ac(Ala10，11)RANTES(2-14)，IC-9564，RPR-103，611，阿木迪爾(Immudel)-gp120，蘇力高韋(suligovir)，IQP-0410，乙酰三碘甲狀腺原氨酸，SP-01A，DEB-025，CSA-54，HGS-H/A27，SP-10，VIR-5103，BMS-433，771，TMC-353，121，NSC-650，898，麥克拉敏(Michellamine)B，NSC-692，906，TG-102，VIR-576，MEDI-488，CovX體，CNI-H0294?？共《竞涂谷诤想牡男揎棻景l(fā)明考慮到了對表現(xiàn)出抗病毒和/或抗融合活性的肽進行修飾，包括DP-107和DP-178及其類似物這樣的修飾。這樣的修飾的肽可以與血液成分上的可用反應性官能團通過共價鍵發(fā)生反應。本發(fā)明也涉及了這樣的修飾、這樣的與血液成分的組合，以及它們的使用方法。這些方法包括與向患者施用未結(jié)合的肽相比，延長結(jié)合的抗病毒肽衍生物的有效治療期限。修飾的肽是一類被命名為DACTM(藥物親和復合物)的肽，含有抗病毒肽分子和連接基團，以及能夠與移動的血液蛋白的反應性官能團反應的化學反應性基團。通過與血液成分或蛋白反應，修飾的肽或DAC可以經(jīng)血液投送到適當?shù)奈稽c或受體。為了與蛋白上的官能團形成共價鍵，人們可以使用多種多樣的活性羧基基團作為反應性基團，特別是酯，其中羥基部分在修飾的肽所需的水平下是生理可接受的。盡管許多不同的羥基可以用在這些反應性基團中，但最方便的是N-羥基琥珀酰亞胺或(NHS)、N-羥基-硫代琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，蛋白上的官能團將是巰基，反應性基團將是含有馬來酰亞胺的基團，例如γ-馬來酰亞胺-丁酰胺(GMBA)或馬來酰亞胺基丙酸(MPA)。伯胺是NHS酯的首要靶。蛋白N-末端上存在的可接近的α-氨基與NHS酯發(fā)生反應。但是，蛋白上的α-氨基對于NHS連接來說可能是不想要的或不可用的。盡管有5種氨基酸在其側(cè)鏈上具有氮，但是只有賴氨酸的ε-氨基與NHS酯發(fā)生顯著反應。當NHS酯結(jié)合反應與伯胺發(fā)生反應釋放出N-羥基琥珀酰亞胺時，形成了酰胺鍵，如下面的示意圖所示。NHS-酯反應圖在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，該蛋白上的官能基團將是巰基，化學反應性基團將是含有馬來酰亞胺的基團，例如MPA或GMBA(γ-馬來酰亞胺-丁酰胺)。當反應混合物的pH保持在6.5到7.4之間時，馬來酰亞胺基團對肽上的巰基最具選擇性。在pH7.0下，馬來酰亞胺基團與巰基的反應速率比與胺快1000倍。在馬來酰亞胺基團與巰基之間形成了穩(wěn)定的硫醚鍵，其在生理條件下不能被裂解，如下面的示意圖所示。馬來酰亞胺反應圖特異性標記優(yōu)選，本發(fā)明的修飾的肽被設(shè)計成與移動的血液蛋白上的巰基特異性反應。優(yōu)選這樣的反應通過將用馬來酰亞胺連接修飾的肽(例如從GMBA、MPA或其它馬來酰亞胺制備)共價鍵合到移動的血液蛋白例如血清白蛋白或IgG的巰基上來建立。在某些情況下，使用馬來酰亞胺特異性標記提供了優(yōu)于使用基團例如NHS和N-羥基-硫代琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)對移動蛋白進行非特異性標記的幾個優(yōu)點。巰基在體內(nèi)不如氨基豐富。因此，本發(fā)明的馬來酰亞胺基修飾的肽，即馬來酰亞胺肽，將與較少的蛋白共價鍵合。例如，在白蛋白(最豐富的血液蛋白)中，只有一個巰基。因此，肽-馬來酰亞胺-白蛋白結(jié)合物將傾向于包含大約1∶1摩爾比例的肽與白蛋白。除了白蛋白之外，IgG分子(II類)也具有游離巰基。因為IgG分子與血清白蛋白占血液中可溶性蛋白的絕大部分，因此它們也占血液中可用于與馬來酰亞胺修飾的肽共價鍵合的游離巰基的絕大部分。此外，即使在含有游離巰基的血液蛋白、包括IgGs中，由于白蛋白本身的獨特性質(zhì)，用馬來酰亞胺進行特異性標記也導致優(yōu)先形成肽-馬來酰亞胺-白蛋白結(jié)合物。在物種間高度保守的白蛋白的單個游離巰基，位于34位氨基酸殘基上(Cys34)。最近已經(jīng)證明，白蛋白的Cys34相對于其它含有游離巰基的蛋白上的游離巰基來說，具有增加的反應性。這部分是由于白蛋白的Cys34的pK值非常低，僅為5.5。這遠低于一般的半胱氨酸殘基的典型pK值，其典型為大約8。由于這種低的pK，在正常生理條件下，白蛋白的Cys34主要為離子化形式，這急劇增加了它的反應性。除了Cys34的低pK值之外，增強Cys34的反應性的另一個因素是它的位置，它在接近白蛋白V區(qū)的一個環(huán)的表面的裂隙中。該位置使Cys34非?？捎糜谒蟹N類的配體，并在Cys34作為自由基捕集器和游離巰基清除劑的生理角色中是一個重要因素。這些性質(zhì)使得Cys34與馬來酰亞胺-肽具有高度反應性，其反應速率的加速與馬來酰亞胺-肽和其它含有游離巰基的蛋白的反應速率相比，可以高達1000倍。肽-馬來酰亞胺-白蛋白結(jié)合物的另一個優(yōu)點是重復性，這和Cys34處肽與白蛋白特異性的1∶1載荷有關(guān)。其它技術(shù)，例如，游離胺的戊二醛、DCC、EDC和其它化學活化，缺少這種選擇性。例如，白蛋白含有52個賴氨酸殘基，其中25-30個位于白蛋白的表面上，因此可用于結(jié)合?；罨@些賴氨酸殘基，或可選地對肽進行修飾以通過這些賴氨酸殘基連接，將產(chǎn)生結(jié)合物的異質(zhì)群體。即使使用1∶1摩爾比例的肽與白蛋白，結(jié)果也將由多種結(jié)合產(chǎn)物構(gòu)成，某些在每個白蛋白上含有0、1、2或以上的肽，并且每個都在25-30個可用賴氨酸位點的任何一個或多個上隨機連接有肽。由于大量的可能組合，對每個結(jié)合物批次的精確組成和性質(zhì)的表征變得困難，批與批的可重復性幾乎不可能，使得這樣的結(jié)合物不適合用作治療藥物。此外，盡管似乎通過白蛋白的賴氨酸殘基的結(jié)合將至少具有每個白蛋白分子投送更多治療藥劑的優(yōu)點，但研究顯示，治療藥劑與白蛋白的1∶1比例是優(yōu)選的。在Stehle等的文章“裝載比率決定了氨甲蝶呤-白蛋白結(jié)合物在大鼠中的腫瘤靶定性質(zhì)”(TheLoadingRateDeterminesTumorTargetingpropertiesofMethotrexate-AlbuminConjugatesinRats)，Anti-CancerDrugs，Vol.8，pp.677-685(1988)中，作者報道了抗癌氨甲喋呤與白蛋白以1∶1的比例通過戊二醛結(jié)合，給出了最有希望的結(jié)果。這些結(jié)合物被腫瘤細胞優(yōu)先攝取，而帶有5∶1到20∶1的氨甲喋呤分子的結(jié)合物具有改變的HPLC譜，并在體內(nèi)被肝臟快速攝取。據(jù)推測，在這些較高的比例下，白蛋白的構(gòu)象變化降低了它作為治療藥物載體的有效性。通過在體內(nèi)受控施用馬來酰亞胺-肽，人們可以控制體內(nèi)白蛋白和IgG的特異性標記。在典型的施用中，施用的馬來酰亞胺-肽的80-90％將標記白蛋白，少于5％將標記IgG。游離巰基例如谷胱甘肽的痕量標記也將發(fā)生。這樣的特異性標記對于體內(nèi)應用來說是優(yōu)選的，因為它允許精確地計算所施用的藥劑的估計半衰期。除了提供受控的特異性體內(nèi)標記之外，馬來酰亞胺-肽還可以提供血清白蛋白和IgG的離體特異性標記。這樣的離體標記包括向血液、血清或含有血清白蛋白和/或IgG的鹽溶液中加入馬來酰亞胺-肽。一旦與馬來酰亞胺-肽發(fā)生離體結(jié)合之后，血液、血清或鹽溶液可以重新施用于患者的血液中，用于體內(nèi)治療。與NHS-肽相反，馬來酰亞胺-肽在存在水性溶液和存在游離胺的情況下一般相當穩(wěn)定。因為馬來酰亞胺-肽只與游離巰基發(fā)生反應，因此一般不需要保護性基團來防止馬來酰亞胺-肽與它本身反應。此外，修飾的肽的穩(wěn)定性增加，允許使用進一步的純化步驟例如HPLC來制備適合于體內(nèi)應用的高純度產(chǎn)物。最后，增加的化學穩(wěn)定性提供了具有更長的儲存期限的產(chǎn)品。非特異性標記本發(fā)明的抗病毒肽也可以被修飾，用于非特異性標記血液成分。也可以使用與氨基基團成鍵，特別是形成酰胺鍵來進行非特異性標記。為了形成這樣的鍵，人們可以使用多種多樣的活性羧基基團作為化學反應性基團，特別是酯，其中羥基部分在所需的水平下是生理可接受的。盡管這些連接劑可以使用許多不同的羥基，但最方便的是N-羥基琥珀酰亞胺或(NHS)和N-羥基-硫代琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)。其它可以使用的連接劑描述在美國專利5,612,034中。修飾的肽的化學反應性基團可以在體內(nèi)與之反應的各種位點包括細胞，特別是血紅細胞(紅細胞)，和血小板以及蛋白，例如免疫球蛋白包括IgG和IgM，血清白蛋白，鐵蛋白，類固醇結(jié)合蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白，甲狀腺素結(jié)合蛋白，α-2-巨球蛋白等。修飾的肽與之反應的那些受體不是長期存活的，一般在大約3天內(nèi)從人類宿主中消除。上面指出的蛋白(包括細胞的蛋白)，根據(jù)在血液中的濃度，特別是針對半衰期來說，將保持至少3天，并可能保持5天以上(通常不超過60天，更通常不超過30天)。反應絕大部分將與血液中的移動成分發(fā)生，特別是血液蛋白和細胞，更特別是血液蛋白和紅細胞?！耙苿拥摹笔侵赋煞植痪哂腥魏屋^長時期的固定位置，一般不超過5分鐘，更通常為1分鐘，盡管某些血液成分可以相對靜止較長的時期。一開始，存在著功能化蛋白和細胞的相對異質(zhì)群體。但是，絕大部分群體在幾天內(nèi)將與最初的群體相比有顯著變化，這取決于功能化蛋白在血流中的半衰期。因此，通常在大約3天或更多天內(nèi)，IgG將變成血流中的主要功能化蛋白。通常，到給藥后5天，IgG、血清白蛋白和紅細胞將為血液中結(jié)合成分的至少大約60摩爾％，通常為至少大約75摩爾％，其中IgG、IgM(程度明顯降低)和血清白蛋白為非細胞結(jié)合成分的至少大約50摩爾％，通常至少大約75摩爾％，更通常至少大約80摩爾％。非特異性修飾的肽與血液成分的所需結(jié)合物，可以通過將修飾的肽給患者施用而在體內(nèi)制備，患者可以是人類或其它哺乳動物。施用可以快速推注的形式進行，或者使用計量流量通過滴注隨時間緩慢導入，等等。如果需要，也可以通過將血液與本發(fā)明的修飾的肽混合，使修飾的肽與血液成分上的反應性官能團共價鍵合，然后將結(jié)合的血液返回或施用于宿主，來離體制備目標結(jié)合物。此外，以上也可以通過首先純化個體的血液成分或有限數(shù)量的成分例如血紅細胞、免疫球蛋白、血清白蛋白等，并將成分與化學反應性修飾的肽離體混合來實現(xiàn)。然后可以將功能化的血液或血液成分返回到宿主，在體內(nèi)提供目標治療有效性結(jié)合物。也可以對血液進行處理，以防止在離體操作期間發(fā)生凝結(jié)。修飾的抗病毒和抗融合肽的合成A.肽合成本發(fā)明的抗病毒和/或抗融合肽可以通過本
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的普通專業(yè)人員已知的固相肽化學標準方法來合成。例如，可以按照Steward和Young描述的程序(Steward，J.M.和Young，J.D.，《固相肽合成》(第二版)，SolidPhasePeptideSynthesis，2ndEd.，PierceChemicalCompany，Rockford，111.，(1984))，使用AppliedBiosystem的合成儀，通過固相化學技術(shù)來合成肽。類似地，可以合成多個肽片段，然后連接在一起形成較大的肽。這些合成的肽也可以在特定位置進行氨基酸取代。對于固相肽合成來說，許多技術(shù)的匯總可以在J.M.Stewart和J.D.Young的《固相肽合成》(SolidPhasePeptideSynthesis，W.H.FreemanCo.(SanFrancisco)，1963)和J.Meienhofer的《激素蛋白和肽》(第二卷)(HormonalProteinsandPeptides，vol.2，p.46，AcademicPress(NewYork)，1973)中找到。對于經(jīng)典的溶液合成，參見G.Schroder和K.Lupke的《肽》(第一卷)(ThePeptides，Vol.1，AcacemicPress(NewYork))。一般來說，這些方法包括向增長的肽鏈連續(xù)添加一個或多個氨基酸或適合的受保護的氨基酸。通常，第一個氨基酸的氨基或羧基基團被適當?shù)谋Ｗo基團所保護。然后通過加入具有受到適當保護的互補(氨基或羧基)基團的序列中的下一個氨基酸，并在適合于形成酰胺鍵的條件下，將被保護的或衍生的氨基酸連接到惰性固相支持物上，或用在溶液中。然后從該新添加的氨基酸殘基上除去保護基團，并加入下一個氨基酸(被適當保護的)，依此類推。在所有所需的氨基酸已經(jīng)連接到適合的序列中后，相繼或同時地移除任何剩余的保護基團(以及任何固相支持物)，以獲得最終的多肽。通過對該通用程序進行簡單的修改，有可能可以向增長的鏈一次添加一個以上的氨基酸，例如，通過將受保護的三肽與適當保護的二肽連接(在不使手性中心消旋的條件下)，在去保護后，形成了五肽。制備本發(fā)明化合物的特別優(yōu)選的方法，包括固相肽合成，其中氨基酸的α-N-末端被酸或堿敏感性基團所保護。這樣的保護基團應該具有在肽鍵形成條件下穩(wěn)定的性質(zhì)，同時容易被移除而不破壞增長的肽鏈或使其中包含的任何手性中心消旋。適合的保護基團是9-芴甲氧羰基(Fmoc)、叔丁氧基羰基(Boc)、苯甲基氧基羰基(Cbz)、二苯基異丙氧基羰基、叔戊氧基羰基、異冰片基氧基羰基、α，α-二甲基-3，5-二甲氧基苯甲氧基羰基、鄰硝基苯基氧硫基、2-氰基-叔丁氧基羰基等。9-芴甲氧羰基(Fmoc)保護基團對于合成本發(fā)明的肽來說是特別優(yōu)選的。其它優(yōu)選的側(cè)鏈保護基團是用于例如賴氨酸和精氨酸的側(cè)鏈氨基基團的2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-璜?；?pmc)、硝基、對甲苯璜?；?、4-甲氧基苯璜酰基、Cbz、Boc和金剛烷氧基羰基；用于酪氨酸的苯甲基、鄰溴苯甲氧基羰基、2，6-二氯苯甲基、異丙基、叔丁基(t-Bu)、環(huán)己基、環(huán)戊基和乙?；?Ac)；用于絲氨酸的叔丁基、苯甲基和四氫吡喃基；用于組氨酸的三苯甲基、苯甲基、Cbz、對甲苯璜?；?，4-二硝基苯基；用于色氨酸的甲?；挥糜谔於彼岷凸劝彼岬谋郊谆褪宥』?，以及用于半胱氨酸的三苯基甲基(三苯甲基)。在固相肽合成方法中，α-C-末端氨基酸連接到適合的固相支持物或樹脂上?？捎糜谏鲜龊铣傻倪m合的固相支持物，是對于逐級縮合-去保護反應的試劑和反應條件惰性，并在使用的介質(zhì)中不溶的材料。用于α-C-末端羧基肽合成的優(yōu)選固相支持物是4-羥甲基苯氧基甲基-共聚(苯乙烯-1％二乙烯基苯)。用于α-C-末端酰胺肽的優(yōu)選固相支持物是可以從AppliedBiosystems(FosterCity，Calif)獲得的4-(2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)-苯氧基乙酰氨基乙基樹脂。α-C-末端氨基酸如下連接到樹脂上在溶劑例如二氯甲烷或DMF中，在10℃到50℃之間的溫度下，通過N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N，N′-二異丙基碳二亞胺(DIC)或O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲-六氟磷酸酯(HBTU)，使用或不使用4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、1-羥基苯并三唑(HOBT)、苯并三唑-1-基氧基-三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸酯(BOP)或雙(2-氧-3-惡唑烷基)氯化膦(BOPCl)，介導連接大約1到大約24小時。當固相支持物是4-(2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)-苯氧基-乙酰氨基乙基樹脂時，在與上述的α-C-末端氨基酸連接之前，F(xiàn)moc基團使用仲胺裂解，優(yōu)選為哌啶。用于與去保護的4-(2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)-苯氧基-乙酰氨基乙基樹脂連接的優(yōu)選方法，是DMF中的O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲-六氟磷酸酯(HBTU，1當量)和1-羥基苯并三唑(HOBT，1當量)。隨后的受保護氨基酸的連接可以在自動多肽合成儀中按照本
技術(shù)領(lǐng)域：
熟知的方法進行。在優(yōu)選實施方案中，增長的肽鏈的α-N-末端氨基酸用Fmoc保護。從增長的肽的α-N-末端一側(cè)除去Fmoc保護基團，是通過用仲胺、優(yōu)選哌啶進行處理來完成。然后以大約3倍摩爾過量導入每種受保護的氨基酸，連接優(yōu)選在DMF中進行。連接劑通常為O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲-六氟磷酸酯(HBTU，1當量)和1-羥基苯并三唑(HOBT，1當量)。在固相合成結(jié)束時，將多肽從樹脂上移除并去保護，這可以相繼進行或在單獨的操作中進行。在單獨操作中，多肽的移除和去保護可以通過用含有茴香硫醚、水、乙二硫醇和三氟乙酸的裂解試劑處理樹脂結(jié)合的多肽來完成。在多肽的α-C-末端是烷基酰胺的情況下，樹脂通過用烷基胺進行氨解來裂解?；蛘?，肽可以通過例如與甲醇的轉(zhuǎn)酯反應、然后進行氨解，或直接轉(zhuǎn)酰胺來移除。受保護的肽可以在這時進行純化，或直接帶入下一個步驟。使用上面描述的裂解混合物來完成側(cè)鏈保護基團的移除。完全去保護的肽通過一系列層析步驟來純化，使用了任何或所有下列的類型在弱堿性樹脂(乙酸型)上的離子交換；在未衍生的聚苯乙烯-二乙烯苯(例如AmberliteXAD)上的疏水吸附層析；硅膠吸附層析；在羧甲基纖維素上的離子交換層析；分配層析，例如在SephadexG-25、LH-20上或逆流分配；高效液相色譜(HPLC)，特別是在辛基-或十八烷基甲硅烷基-二氧化硅鍵合相柱填料上的反向HPLC。這些ITPs的分子量使用快速原子轟擊(FAB)質(zhì)譜法來測定。N-末端保護基團正如上面討論的，術(shù)語“N-保護基團”是指打算用于保護氨基酸或肽的α-N-末端，或保護氨基酸或肽的氨基基團免于合成過程中的不需要的反應的基團。常用的N-保護基團公開在Greene的《有機合成中的保護基團》(ProtectiveGroupsInOrganicSynthesis，JohnWiley&Sons，NewYork(1981))中，在此引為參考。此外，保護基團可用作前體藥物，可以在體內(nèi)容易地被例如酶法水解切開，釋放出生物活性母體。α-N-保護基團包括低級烷?；缂柞；?、乙酰基(“Ac”)、丙?；⑷谆阴；⑹宥』阴；龋黄渌；鶊F包括2-氯乙?；?、2-溴乙酰基、三氟乙酰基、三氯乙酰基、鄰苯二甲酰基、鄰硝基苯氧乙酰基、-氯丁?；⒈郊柞；?-氯苯甲?；?、4-溴苯甲?；?-硝基苯甲酰基等；磺?；绫交酋；?、對甲苯磺酰基等；氨基甲酸酯形成基團例如苯甲氧基羰基、對氯苯甲氧基羰基、對甲氧基苯甲氧基羰基、對硝基苯甲氧基羰基、2-硝基苯甲氧基羰基、對溴苯甲氧基羰基、3，4-二甲氧基苯甲氧基羰基、3，5-二甲氧基苯甲氧基羰基、2，4-二甲氧基苯甲氧基羰基、4-乙氧基苯甲氧基羰基、2-硝基-4，5-二甲氧基苯甲氧基羰基、3，4，5-三甲氧基苯甲氧基羰基、1-(對聯(lián)二苯基)-1-甲基乙氧基羰基、α，α-二甲基-3，5-二甲氧基苯甲氧基羰基、二苯甲氧基羰基、叔丁氧基羰基(Boc)、二異丙基甲氧基羰基、異丙氧基羰基、乙氧基羰基、甲氧基羰基、烯丙氧基羰基、2，2，2，-三氯乙氧基羰基、苯氧基羰基、4-硝基苯氧基羰基、芴基-9-甲氧基羰基、環(huán)戊基氧基羰基、金剛烷氧基羰基、環(huán)己基氧基羰基、苯基硫代羰基等；芳烷基例如苯甲基、三苯基甲基、苯甲氧基甲基、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)等，以及甲硅烷基例如三甲基甲硅烷基等。羧基保護基團正如上面討論的，術(shù)語“羧基保護基團”是指當進行涉及化合物的其它功能性位點的反應時，用于阻斷或保護羧酸官能團的羧酸保護性酯或酰胺基團。羧基保護基團公開在Greene的《有機合成中的保護基團》(“ProtectiveGroupsInOrganicSynthesis”pp.152-186(1981))中，在此引為參考。此外，羧基保護基團可以用作前體藥物，藉此羧基保護基團在體內(nèi)容易通過例如酶法水解切開，釋放出生物活性母體。這樣的羧基保護基團對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員來說是熟知的，已經(jīng)廣泛用于在青霉素和頭孢菌素領(lǐng)域中保護羧基基團，如美國專利Nos.3,840,556和3,719,667中所述，其公開內(nèi)容在此引為參考。代表性的羧基保護基團是C1-C8低級烷基(例如甲基、乙基或叔丁基等)；芳烷基例如苯乙基或苯甲基或其取代的衍生物例如烷氧基苯甲基或硝基苯甲基等；芳烷烯基例如苯乙烯基等；芳基及其取代的衍生物例如5-茚滿基等；二烷基氨基烷基例如二甲基氨基乙基等；烷?；趸榛缫阴Ｑ趸谆?、丁酰氧基甲基、戊酰氧基甲基、異丁酰氧基甲基、異戊酰氧基甲基、1-(丙酰氧基)-1-乙基、1-(三甲基乙酰氧基)-1-乙基、1-甲基-1-(丙酰氧基)-1-乙基、三甲基乙酰氧基甲基、丙酰氧基甲基等；環(huán)烷?；趸榛鶊F例如環(huán)丙羰基氧基甲基、環(huán)丁羰基氧基甲基、環(huán)戊羰基氧基甲基、環(huán)己羰基氧基甲基等；芳?；趸榛绫郊柞；趸谆?、苯甲?；趸一?；芳烷基羰基氧基烷基例如苯甲基羰基氧基甲基、2-苯甲基羰基氧基乙基等；烷氧基羰基烷基或環(huán)烷氧基羰基烷基例如甲氧基羰基甲基、環(huán)己基氧基羰基甲基、1-甲氧基羰基-1-乙基等；烷氧基羰基氧基烷基或環(huán)烷氧基羰基氧基烷基例如甲氧基羰基氧基甲基、叔丁氧基羰基氧基甲基、1-乙氧基羰基氧基-1-乙基、1-環(huán)己氧基羰基氧基-1-乙基等；芳氧基羰基氧基烷基例如2-(苯氧基羰基氧基)乙基、2-(5-茚滿基氧基羰基氧基)乙基等；烷氧基烷基羰基氧基烷基例如2-(1-甲氧基-2-甲基丙-2-酰氧基)乙基等；芳烷氧基羰基氧基烷基例如2-(苯甲氧基羰基氧基)乙基等；芳基烯氧基羰基氧基烷基例如2-(3-苯基丙烯-2-基氧基羰基氧基)乙基等；烷氧基羰基氨基烷基例如叔丁氧基羰基氨基甲基等；烷基氨基羰基氨基烷基例如甲基氨基羰基氨基甲基等；烷?；被榛缫阴；被谆?；雜環(huán)羰基氧基烷基例如4-甲基哌嗪基羰基氧基甲基等；二烷基氨基羰基烷基例如二甲基氨基羰基甲基、二乙基氨基羰基甲基等；(5-(低級烷基)-2-氧-1，3-二氧戊-烯-4-基)烷基例如(5-叔丁基-2-氧-1，3-二氧戊烯-4-基)甲基等；以及(5-苯基-2-氧-1，3-二氧戊烯-4-基)烷基例如(5-苯基-2-氧-1，3-二氧戊烯-4-基)甲基等。代表性的酰胺羧基保護基團是氨基羰基和低級烷基氨基羰基基團。本發(fā)明優(yōu)選的羧基被保護的化合物，是這樣的化合物，其中被保護的羧基基團是低級烷基、環(huán)烷基或芳烷基酯，例如甲酯、乙酯、丙酯、異丙酯、丁酯、仲丁酯、異丁酯、戊酯、異戊酯、辛酯、環(huán)己酯、苯乙酯等，或烷?；趸榛?、環(huán)烷?；趸榛?、芳?；趸榛蚍纪榛驶趸榛?。優(yōu)選的酰胺羧基保護基團是低級烷基氨基羰基基團。例如，天冬氨酸可以在α-C-末端被酸不穩(wěn)定基團(例如叔丁基)保護，在β-C-末端被氫化不穩(wěn)定基團(例如苯甲基)保護，然后在合成過程中選擇性去保護。肽修飾依賴于包含肽的各種元件的性質(zhì)，產(chǎn)生本發(fā)明的修飾的肽的方式也將廣泛變化。選擇合成程序是要簡單、提供高的產(chǎn)量、以及允許獲得高純度的穩(wěn)定產(chǎn)物。一般來說，化學反應性基團在合成的最后階段產(chǎn)生，例如對于羧基來說，酯化以形成活性酯。用于生產(chǎn)本發(fā)明的修飾的肽的具體方法描述在下面。具體來說，對所選的肽首先進行抗病毒活性分析，然后只用連接基團在肽的N-末端、C-末端或內(nèi)部進行修飾。然后分析該修飾的肽-連接基團的抗病毒活性。如果抗病毒活性沒有急劇降低(即降低少于10倍)，那么通過其體內(nèi)壽命測量修飾的肽-連接基團的穩(wěn)定性。如果穩(wěn)定性沒有增加到所需水平，那么在另一個位點對肽進行修飾，并重復該過程，直到獲得所需的抗病毒和穩(wěn)定性水平。更具體來說，被選擇用接頭和反應性本體基團進行修飾的每個肽，將按照下面的標準進行修飾如果肽上的末端羧基可用并且對于保持抗病毒活性不是關(guān)鍵的，并且在肽上沒有其它敏感官能基團，那么被選擇羧酸作為接頭-反應性基團修飾的連接點。如果末端羧基參與抗病毒活性，或者如果沒有羧酸可用，那么將選擇任何其它對于保留抗病毒活性不關(guān)鍵的敏感官能基團，作為接頭-反應性基團修飾的連接點。如果在肽上有幾個敏感官能基團可用，那么將使用保護基團的組合，使得在添加接頭/反應性本體并將所有被保護的敏感官能基團去保護后，仍然獲得抗病毒活性的保留。如果在肽上沒有敏感官能基團可用，或者如果需要更簡單的修飾途徑，合成工作將可以是修飾原始的肽，使得維持保留抗病毒性。在這種情況下，修飾將發(fā)生在肽的相反末端。NHS衍生物可以在肽中不存在其它敏感官能基團的情況下，從羧酸合成。具體來說，這樣的肽在無水CH2Cl2和EDC中與N-羥基琥珀酰亞胺反應，將產(chǎn)物通過層析純化或從適合的溶劑系統(tǒng)重結(jié)晶，以給出NHS衍生物。或者，NHS衍生物可以從含有氨基和/或巰基和羧酸的肽合成。當分子中存在游離氨基或巰基基團時，優(yōu)選在進行NHS衍生物的添加之前保護這些敏感官能基團。例如，如果分子含有游離氨基，在進行上面描述的化學之前，將胺轉(zhuǎn)化成Fmoc或優(yōu)選轉(zhuǎn)化成tBoc保護的胺是必要的。在制備了NHS衍生物之后，胺官能團將不被去保護。因此，這種方法只適用于不需要其胺基游離來誘導所需的抗病毒效應的化合物。如果需要氨基游離來保持分子的原始性質(zhì)，那么將不得不進行下面描述的另一種類型的化學。此外，NHS衍生物可以從含有氨基或巰基但沒有羧基的肽合成。當所選的分子不含羧酸時，可以使用一批雙官能接頭將分子轉(zhuǎn)變成反應性NHS衍生物。例如，將乙二醇-雙(琥珀酰亞胺基琥珀酸)(EGS)和三乙胺溶解在DMF中并加入到含有游離氨基的分子中(10∶1的比例，有利于EGS)，將產(chǎn)生單NHS衍生物。為了從巰基衍生分子產(chǎn)生NHS衍生物，人們可以使用DMF中的N-[-馬來酰亞胺丁酰氧基]琥珀酰亞胺酯(GMBS)和三乙胺。馬來酰亞胺基團將與游離巰基反應，并通過在硅土上層析或通過HPLC，從反應混合物中純化NHS衍生物。NHS衍生物也可以從含有多個敏感官能基團的肽合成。必須對每種情況進行分析并通過不同的方式解決。但是，受惠于可商購的大量保護基團和雙官能接頭，本發(fā)明可應用于任何肽，優(yōu)選只有一個化學步驟來修飾肽(如上所述)，或兩個步驟(如上所述包括敏感基團的預先保護)或三個步驟(保護，活化和去保護)。只有在例外的情況下，才需要多步驟(超過三個步驟)的合成，將肽轉(zhuǎn)化成活性的NHS或馬來酰亞胺衍生物。馬來酰亞胺衍生物也可以從含有游離氨基和游離羧酸的肽合成。為了從氨基衍生分子生產(chǎn)馬來酰亞胺衍生物，人們可以使用DMF中的N-[γ-馬來酰亞胺丁酰氧基]琥珀酰亞胺酯(GMBS)和三乙胺。琥珀酰亞胺酯基團將與游離氨基反應，并通過結(jié)晶或通過在硅土上層析或通過HPLC，從反應混合物中純化馬來酰亞胺衍生物。最后，馬來酰亞胺衍生物可以從含有多個其它敏感官能基團并不含游離羧酸的肽合成。當所選的分子不含羧酸時，可以使用一批雙官能交聯(lián)試劑將分子轉(zhuǎn)變成反應性NHS衍生物。例如，使用在DMF中的HBTU/HOBt/DIEA活化，通過游離胺與MPA的羧基反應，馬來酰亞胺丙酸(MPA)可以與游離胺連接，產(chǎn)生馬來酰亞胺衍生物。當需要時，可以備選使用許多其它可商購的異雙官能交聯(lián)試劑。有大量的雙官能化合物可用于連接本體。說明性的試劑包括疊氮基苯甲酰酰肼、N-[4-(對疊氮基水楊酸基氨基)丁基]-3′-[2′-吡啶基二硫代丙酰胺)、雙-磺基琥珀酰亞胺基辛二酸酯、己二亞胺二甲基酯、酒石酸二琥珀酰亞胺基酯、N-γ-馬來酰亞胺丁酰氧基琥珀酰亞胺酯、N-羥基磺基琥珀酰亞胺基-4-疊氮基苯甲酸酯、N-琥珀酰亞胺基[4-疊氮基苯基]-1，3′-二-硫代丙酸酯、N-琥珀酰亞胺基[4-碘代乙酰基]氨基苯甲酸酯、戊二醛以及琥珀酰亞胺基4-[N-馬來酰亞胺基甲基]環(huán)己烷-1-羧酸。修飾的抗病毒肽的應用本發(fā)明的修飾的抗病毒肽，可以在患有病毒感染的患者的治療中用作治療劑，并可以按照下面描述的方法以及本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的其它方法給患者施用。修飾的肽的有效治療劑量可以通過本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員熟知的程序、并考慮到對肽的潛在毒性的任何顧慮來確定。修飾的肽也可以預防性施用于以前未感染的個體。在個體遭受暴露于病毒的高度風險的情況下，如當個體已經(jīng)與存在病毒傳播的高風險的感染個體接觸時是可發(fā)生的，這將是有利的。當已知在對病毒、例如HIV病毒進行治療時，這可能是格外有利的。例如，在保健工作人員暴露于來自HIV感染個體的血液的情況下，或者在個體參加了使該個體潛在暴露于HIV病毒的高?；顒拥钠渌闆r下，預防性施用修飾的抗HIV肽將是有利的。修飾的抗病毒和抗融合肽的施用一般來說，修飾的肽將在生理可接受的介質(zhì)中施用，例如去離子水、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、鹽水、乙醇或其它醇的水溶液、血漿、蛋白溶液、甘露糖醇、葡萄糖水溶液、醇類、植物油等。其它可以包含的添加劑包括緩沖劑，其中介質(zhì)通常被緩沖到大約5到10的pH范圍內(nèi)，其中緩沖液的濃度一般為大約50到250mM的范圍內(nèi)，鹽，其中鹽濃度一般在大約5到500mM的范圍內(nèi)，生理可接受的穩(wěn)定劑等。組合物可以被冷凍干燥以便于儲存和運輸。本修飾的肽絕大部分將通過腸胃外施用，例如靜脈內(nèi)(IV)、動脈內(nèi)(IA)、肌內(nèi)(IM)、皮下(SC)等。在適合的情況下，可以通過輸注施用。在某些情況下，當官能基團的反應相對較慢時，施用可以是經(jīng)口、經(jīng)鼻、經(jīng)直腸、透皮或氣溶膠，其中結(jié)合物的性質(zhì)允許它轉(zhuǎn)移到血管系統(tǒng)。通常使用單次注射，雖然如果需要的話，也可以使用一次以上的注射。修飾的肽可以通過任何方便的手段施用，包括注射器、套管針、導管等。在某些實施方案中，修飾的肽將通過本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的方法通過肺部方式施用。用于深部肺投送氣溶膠干粉形式的肽或蛋白的技術(shù)由Patton等(1997)Chemtech27(12)34-38公開。其它公開了肽的肺部施用的參考文獻包括Senior，K.等(2000)PSTTVol3281-282，Gumbleton，M.(2006)AdvancedDrugDeliveryReviews58993-995；Newhouse，M.T.(2006)《制藥技術(shù)百科全書》(EncyclopediaofPharmaceuticalTechnology)，題為“藥物投送肺部投送”(″DrugDeliveryPulmonaryDelivery″)，以及Labiris，N.R.(2003)J.Clin.Pharmacology56600-612。所有這些參考文獻的內(nèi)容在此引為參考。施用的具體方式將根據(jù)施用的量、是單次快速推注還是連續(xù)施用等而變化。優(yōu)選，施用將是血管內(nèi)的，其中導入位點對于本發(fā)明并不重要，優(yōu)選在血液流動快的位點，例如靜脈內(nèi)，外周或中央靜脈。當施用與緩釋技術(shù)或保護性基質(zhì)結(jié)合時，可以發(fā)現(xiàn)其它途徑的用處。目的是使修飾的肽有效地分布在血液中，以便能夠與血液成分反應。結(jié)合物的濃度將廣泛變化，一般在大約1pg/ml到50mg/ml的范圍內(nèi)。血管內(nèi)施用的總量一般在大約0.1mg/ml到大約50mg/ml的范圍內(nèi)、大約5mg/ml到40mg/ml、大約10到30mg/ml、大約10到20mg/ml、或大約5到15mg/ml、大約1mg/ml到大約10mg/ml、或大約1到5mg/ml。通過與血液的長壽命成分例如免疫球蛋白、血清白蛋白、紅細胞和血小板鍵合，帶來了許多優(yōu)點。肽的活性延長了數(shù)天到數(shù)周。在該時間期間只需要進行施用一次?？梢垣@得更高的特異性，因為活性的化合物將主要結(jié)合于大分子，這樣它不太可能被攝入到細胞內(nèi)，干擾其它生理過程。監(jiān)測修飾的肽的存在可以對哺乳動物宿主血液中修飾的肽化合物的存在進行一次或多次監(jiān)測。通過獲取宿主血液的一部分或樣品，人們可以確定肽是否已經(jīng)以足夠具有治療活性的量與長壽命的血液成分結(jié)合，并在隨后確定血液中肽化合物的水平。如果需要，人們也可以確定肽與何種血液成分結(jié)合。當使用非特異性修飾的肽時，這是特別重要的。對于特異性的馬來酰亞胺修飾的肽來說，計算血清白蛋白和IgG的半衰期要簡單得多。免疫分析本發(fā)明的另一方面涉及使用肽、肽類似物或它們的衍生物和結(jié)合物的特異性抗體，測定抗病毒肽和/或類似物、或它們的衍生物和結(jié)合物在生物學樣品(例如血液)中的濃度的方法，以及使用這樣的抗體作為與所述肽、類似物和/或它們的衍生物或結(jié)合物潛在相關(guān)的毒性的治療。這是有利的，因為肽在患者體內(nèi)的穩(wěn)定性和壽命增加可能導致治療過程中的新問題，包括毒性增加的可能性。對特定肽、肽類似物或其衍生物具有特異性的單克隆或多克隆抗治療劑抗體可能有助于調(diào)解任何這樣的問題。抗體可以從用特定肽、其類似物或衍生物、或用藥劑的免疫原性片段或?qū)谒巹┑目乖詻Q定簇的合成免疫原免疫的宿主中產(chǎn)生或得到。優(yōu)選的抗體將對肽、肽類似物或衍生物的天然的、修飾的和結(jié)合的形式具有高的特異性和親和性。這樣的抗體也可以用酶、熒光染料或放射性標記物標記。修飾的肽的特異性抗體可以通過使用純化的肽誘導肽特異性抗體來產(chǎn)生?？贵w的誘導，不僅意指通過注射到動物中刺激免疫應答，也指在生產(chǎn)合成的抗體或其它特異性結(jié)合分子中的類似步驟，例如重組免疫球蛋白文庫的篩選。單克隆和多克隆抗體都可以通過本
技術(shù)領(lǐng)域：
熟知的過程來生產(chǎn)。抗肽抗體可用于治療由施用修飾的肽、其類似物或衍生物所引起的毒性，并可以離體或體內(nèi)使用。離體方法包括使用固定于固體支持物的抗治療劑抗體對毒性進行免疫透析治療。體內(nèi)方法包括以有效誘導抗體-藥劑復合物清除的量施用抗治療劑抗體。通過將血液與抗體在無菌條件下進行接觸，可以使用抗體從患者的血液中離體移除修飾的肽、其類似物或衍生物、及其結(jié)合物。例如，抗體可以固定或固定化在柱基質(zhì)上，患者的血液可以從患者取出并通過基質(zhì)。修飾的肽、肽類似物、衍生物或結(jié)合物將與抗體結(jié)合，然后可以將含有低濃度的肽、類似物、衍生物或結(jié)合物的血液返回到患者的循環(huán)系統(tǒng)中。移除的肽化合物的量可以通過調(diào)節(jié)壓力和流速來控制。從患者血液的血漿成分中選擇性去除肽、類似物、衍生物和結(jié)合物，可以例如通過使用半透膜來實現(xiàn)，或者通過本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的方法首先將血漿成分與細胞成分分開，然后將血漿成分通過含有抗治療劑抗體的基質(zhì)來實現(xiàn)?；蛘?，選擇性去除結(jié)合了肽的血細胞、包括血紅細胞，可以通過收集和濃縮患者血液中的血細胞，并將這些細胞與固定的抗治療劑抗體接觸以排除患者血液的血清成分來實現(xiàn)?？怪委焺┛贵w可以腸胃外體內(nèi)施用于已經(jīng)接受了肽、類似物、衍生物或結(jié)合物進行治療的患者?？贵w將與肽化合物和結(jié)合物結(jié)合。一旦結(jié)合，肽的活性將被阻礙，即便不是完全阻斷的話，從而降低了肽化合物在患者血流中的生物學有效濃度，并將有害副作用減到最小。此外，結(jié)合的抗體-肽復合物將便于從患者血流中清除肽化合物和結(jié)合物。參考下面的非限制性實施例，可以對已經(jīng)充分描述的本發(fā)明有進一步的認識和理解。實施例實施例1-5C34半胱磺酸衍生物的合成和純化使用自動化固相方法，在十二通道(Symphony)肽合成儀上進行C34的半胱磺酸衍生物的合成，在肽的產(chǎn)生過程中進行手動干預。合成在Fmoc保護的拉每(Ramage)酰胺接頭樹脂上，使用Fmoc保護的氨基酸進行。連接使用O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)作為活化劑混合物在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中進行。Fmoc保護基團使用20％哌啶/DMF除去。Boc-保護的氨基酸用于N-末端，以便當肽從樹脂上裂解下來后產(chǎn)生游離的Nα-末端。在合成過程中使用Sigmacote處理過的玻璃反應容器。實施例2CA-C34的合成CA-C34具有下列氨基酸序列半胱磺酸-Trp-Met-Glu-Trp-Asp-Arg-Glu-Ile-Asn-Asn-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-CONH2(SEQIDNO2)。CA-C34修飾的肽按照下述合成步驟1使用手動和自動固相合成，十二通道(Symphony)肽合成儀和拉每(Ramage)樹脂，以100μm規(guī)模進行CA-C34的固相肽合成。將下面的被保護氨基酸相繼加到樹脂上Fmoc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-His(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Met-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，Boc-半胱磺酸-OH。將它們?nèi)芙庠贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，并按照順序使用O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)進行活化。使用含20％(V/V)哌啶的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液20分鐘，來完成除去Fmoc保護基團(步驟1)。步驟2使用85％TFA/5％TIS/5％茴香硫醚和5％苯酚，將肽從樹脂上切下，然后用干冰冷卻的(0-4℃)Et2O沉淀和收集。實施例3CA-C34(Arg28)的合成CA-C34(Arg28)具有下面的氨基酸序列半胱磺酸-Trp-Met-Glu-Trp-Asp-Arg-Glu-Ile-Asn-Asn-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Arg-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-CONH2(SEQIDNO3)。步驟1使用手動和自動固相合成、十二通道(Symphony)肽合成儀和拉每(Ramage)樹脂，以100μm規(guī)模進行CA-C34(Arg28)的固相肽合成。將下面的被保護氨基酸相繼加到樹脂上Fmoc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-His(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Met-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，Boc-半胱磺酸-OH。將它們?nèi)芙庠贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，并按照順序使用O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)進行活化。使用含20％(V/V)哌啶的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液20分鐘，來完成除去Fmoc保護基團(步驟1)。步驟2使用85％TFA/5％TIS/5％茴香硫醚和5％苯酚將肽從樹脂上切下，然后用干冰冷卻的(0-4℃)Et2O沉淀和收集。實施例4CA-C34-Lys35(ε-AEEA-MPA)的合成CA-C34-Lys35(ε-AEEA-MPA)具有下面的氨基酸序列半胱磺酸-Trp-Met-Glu-Trp-Asp-Arg-Glu-Ile-Asn-Asn-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-ILe-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-LyS(AEEA-MPA)-CONH2(SEQIDNO4)。步驟1使用手動和自動固相合成、十二通道(Symphony)肽合成儀和拉每(Ramage)樹脂，以100μm規(guī)模進行CA-C34-Lys35(ε-AEEA-MPA)的固相肽合成。將下面的受保護氨基酸相繼加到樹脂上Fmoc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OHFmoc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-His(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Met-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，Boc-半胱磺酸-OH。將它們?nèi)芙庠贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，并按照順序，使用O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)進行活化。使用含20％(V/V)哌啶的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液20分鐘，來完成除去Fmoc保護基團(步驟1)。步驟2Lys(Aloe)基團的選擇性去保護手動進行，并通過用3當量Pd(PPh3)4溶解在5mLC6H6∶CHCl3(1∶1)∶2.5％NMM(v∶v)∶5％AcOH(v∶v)中的溶液處理樹脂2小時來完成(步驟2)。然后將樹脂用CHCl3(6×5mL)、含20％AcOH的DCM(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)進行洗滌。步驟3然后重新自動進行合成，以添加Fmoc-AEEA-OH和3-馬來酰亞胺丙酸(步驟3)。AEEA上的保護基團(Fmoc)按照以前的描述在每次結(jié)合之間移除，將樹脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌3次和用異丙醇洗滌3次。步驟4使用85％TFA/5％TIS/5％茴香硫醚和5％苯酚將肽從樹脂上切下，然后用干冰冷卻的(0-4℃)Et2O沉淀(步驟4)和收集。實施例5CA-C34(Arg28)-Lys35(ε-AEEA-MPA)CA-C34(Arg28)-Lys35(ε-AEEA-MPA)具有下面的序列半胱磺酸-Trp-Met-Glu-Trp-Asp-Arg-Glu-Ile-Asn-Asn-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Arg-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-LyS(AEEA-MPA)-CONH2(SEQIDNO5)。步驟1使用手動和自動固相合成、十二通道(Symphony)肽合成儀和拉每(Ramage)樹脂來進行，以100μm規(guī)模進行CA-C34(Arg28)-Lys35(ε-AEEA-MPA)的固相肽合成。將下面的受保護氨基酸相繼加到樹脂上Fmoc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-His(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Met-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，Boc-半胱磺酸-OH。將它們?nèi)芙庠贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，并按照順序使用O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)進行活化。使用含20％(V/V)哌啶的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液20分鐘，來完成除去Fmoc保護基團(步驟1)。步驟2Lys(Aloc)基團的選擇性去保護手動進行，并通過用3當量Pd(PPh3)4溶解在5mLC6H6∶CHCl3(1∶1)∶2.5％NMM(v∶v)∶5％AcOH(v∶v)的溶液處理2小時來完成(步驟2)。然后將樹脂用CHCl3(6×5mL)、含20％AcOH的DCM(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)進行洗滌。步驟3然后重新自動進行合成，以添加Fmoc-AEEA-OH和3-馬來酰亞胺丙酸(步驟3)。AEEA上的保護基團(Fmoc)按照以前的描述在每次結(jié)合之間移除，將樹脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌3次和用異丙醇洗滌3次。步驟4使用85％TFA/5％TIS/5％茴香硫醚和5％苯酚將肽從樹脂上切下，然后用干冰冷卻的(0-4℃)Et2O沉淀(步驟4)和收集。純化步驟每種C34修飾的肽使用Varian(Dynamax)制備型二元HPLC系統(tǒng)，通過制備型反相HPLC進行純化。示例性的衍生物的純化使用PhenomenexLuna10μ苯基-己基，50mm×250mm柱(粒度10μ)進行，柱用水/TFA混合物(0.1％TFA在H2O中；溶劑A)和乙腈/TFA(0.1％TFA在CH3CN中；溶劑B)平衡。洗脫通過以50mL/min經(jīng)180分鐘運行28-38％B的梯度進行。含有肽的級份通過在214和254nm處的UV吸光度(VarianDynamaxUVDII)來檢測。將級份收集為25mL的等份試樣。含有目標產(chǎn)物的級份通過直接注射到LC/MS上之后，以質(zhì)量檢測來鑒定。然后將選出的級份通過分析型HPLC(經(jīng)20分鐘20-60％B；PhenomenexLuna5μ苯基-己基10mm×250mm柱，0.5mL/min)進行分析，以鑒定純度≥90％的級份用于合并。將合并物使用液氮冷凍干燥，隨后凍干至少2天，以獲得白色粉末。IV-流程圖對于所有衍生物使用同樣的合成路線。在下面的流程圖中示例了CA-C34和CA-C34-Lys35(ε-AEEA-MPA)的路線。當然，對于CA-C34來說，省略了Aloe移除步驟以及添加AEEA和MPA的步驟。實施例6C34的半胱磺酸衍生物的溶解度分析a.溶解度分析在100mM磷酸鈉水溶液(起始pH8)中進行。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，緩沖液濃度高可用于中和在HPLC純化后仍然與C34衍生物在一起的過量的三氟乙酸(TFA)。最終pH5.8-7.0適合維持各種C-34衍生物的溶解度。因此，將起始緩沖液制備成pH8.0；C34衍生物的溶解導致最終pH為大約6.3。表2顯示了在N-末端帶有或不帶有半胱磺酸(CA)和在C-末端帶有或不帶有Lys35(ε-AEEA-MPA)的C34的溶度極限。此外，表1中顯示的最終重量克分子滲透壓濃度顯示出這些最終溶液是等滲的。表21指示的溶度極限是維持透明溶液的最高濃度。濃度被校正成表示不含TFA的C34衍生物的重量。2“N/A”表示發(fā)現(xiàn)化合物不可溶。3觀察到的發(fā)黃的顏色可能是由于(AEEA-MPA)的濃度較高或由于雜質(zhì)所致。天然C34被發(fā)現(xiàn)在15.75mg/ml下可溶，得到的溶液在一分鐘內(nèi)形成凝膠。C34-Lys35(ε-AEEA-MPA)一放入溶液中就形成凝膠，繼續(xù)添加緩沖液也不能成功地使化合物溶解。從可以表1注意到，在這兩種化合物的N-末端添加半胱磺酸，賦予了C34顯著增加的溶解度，即分別為29.3和33.8mg/ml。b.連接有N-末端修飾的AEEA-MPA的C34(W1(AEEA-MPA)-C34)，和N-末端半胱磺酸修飾、在35位添加有賴氨酸并通過AEEK接頭與MPA連接的C34(CAK35(AEEA-MPA-C34))，在500mMpH8.0的磷酸鈉緩沖液中，在30-35mg/ml內(nèi)的溶解度1M磷酸鈉，pH8.0緩沖液A-2M無水磷酸氫二鈉，UQAM，OM-27，S18351M＝141.96g/IL，2M＝13.3568g/40ml納濾純(nanopure)H2O。B-2M一水磷酸二氫鈉，UQAM，OM-27，S18201M＝137.99g/lL，2M＝11.0392g/40ml納濾純H2O。C-混合30ml納濾純H2O+大約28ml磷酸氫二鈉+1.5ml磷酸二氫鈉。證實pH是否為8.0。用磷酸氫二鈉調(diào)整體積。D-調(diào)整到最終pH8(實際值為7.98)。500mM磷酸鈉，pH8.0緩沖液將1M磷酸鈉pH8.0的緩沖液與等體積的納濾純H2O混合(不過濾)。最終pH為8.0。c.W1(AEEA-MPA)-C34和(CAK35(AEEA-MPA-C34))在500mMpH8.0的磷酸鈉緩沖液中，在100mg/ml下的溶解度化合物W1(AEEA-MPA)-C34批次B，批號JC-205-12，存貨號11391M，含鹽＝4769.1＝稱重12.64mg1M，不含鹽＝4541.1＝12.0357mg純度＝90.8％＝10.928mg在109.3μl500mM磷酸鈉pH8.0緩沖液中，得到100mg/ml。注釋將緩沖液加入到玻璃小瓶中的粉末上。在渦旋(中速)1分鐘后溶解。剩余3個顆粒。最終pH6.82(使用ChemicalDepartment的pH計測量，500mMNaPpH8緩沖液為8.1)。(CAK35(AEEA-MPA-C34))批次B，批號PB-262-01，存貨號1352。1M，含鹽＝5165.2＝稱重12.11mg1M，不含鹽＝4820.2＝11.30mg純度＝92.8％＝10.487mg在104.9μl500mM磷酸鈉pH8.0緩沖液中，得到100mg/ml。注釋將緩沖液加入到玻璃小瓶中的粉末上。在渦旋(中速)1分30秒后大部分溶解。在玻璃小瓶的底部有2個小團粒。3分鐘后，這兩個小團粒溶解。最終pH6.75(使用ChemicalDepartment的pH計測量，500mMNaPpH8緩沖液為8.1)。W1(AEEA-MPA)-C34和(CAK35(AEEA-MPA-C34))在溶解后是黃色的。W1(AEEA-MPA)-C34顏色更深。結(jié)論W1(AEEA-MPA)-C34和(CAK35(AEEA-MPA-C34))化合物在500mM磷酸鈉pH8.0緩沖液中，在100mg/ml下是可溶的。它們的最終pH超出可接受的限度，即6.8。這些化合物的可接受的pH限度是6.2。d.W1(AEEA-MPA)-C34和(CAK35(AEEA-MPA-C34))在500mMpH8.0的磷酸鈉緩沖液中，在150mg/ml下的溶解度W1(AEEA-MPA)-C34批次B，批號JC-205-12，存貨號1139。1M，含鹽＝4769.1＝稱重11.97mg，1M，不含鹽＝4541.1＝11.398mg純度＝90.8＝10.35mg在69μl500mM磷酸鈉pH8.0緩沖液中，得到150mg/ml。注釋將緩沖液加入到玻璃小瓶中的粉末上。渦旋(中-快速)1分鐘后溶解。最終pH6.60(使用ChemicalDepartment的pH計測量，500mMNaPpH8緩沖液為8.23)。(CAK35(AEEA-MPA-C34))批次B，批號PB-262-01，存貨號1352。1M，含鹽＝5165.2＝稱重12.48mg1M，不含鹽＝4820.2＝11.64mg純度＝92.8％＝10.808mg在72.05μl500mM磷酸鈉pH8.0緩沖液中，得到150mg/ml。注釋將緩沖液加入到玻璃小瓶中的粉末上。在渦旋(中-快速)1分鐘后大部分溶解。在玻璃小瓶的底部有1個小團粒。10分鐘后，這個小團粒溶解。最終pH6.57(使用ChemicalDepartment的pH計測量，500mMNaPpH8緩沖液為8.23)。W1(AEEA-MPA)-C34和(CAK35(AEEA-MPA-C34))在溶解后是黃色的。W1(AEEA-MPA)-C34顏色更深。結(jié)論W1(AEEA-MPA)-C34和(CAK35(AEEA-MPA-C34))在500mM磷酸鈉pH8.0緩沖液中，在150mg/ml下是可溶的。實施例7C34的半胱磺酸衍生物的活性分析第一種活性分析抗HIV-1誘導的細胞-細胞融合分析使用由紐約血液中心(NewYorkBloodCenter，310East67thStreet，NewYork，NY10021)的ShiboJiang博士及同事設(shè)計的HIV-1誘導的細胞-細胞融合分析，評估了各種抗融合化合物和相應進行的白蛋白結(jié)合物的功效。C34衍生物對HIV誘導的細胞-細胞融合的抑制活性，按照以前的描述進行檢測(Jiang，S.L.等，(2000)AConvenientCellFusionAssayforRapidScrccningforHIVEntryInhibitors，(用于快速篩選HIV進入抑制劑的便捷細胞融合分析)，Proc.SPIE3926212-219)。簡單來說，首先將化合物在磷酸-檸檬酸緩沖液(pH7.0)中稀釋到100μM作為儲液，然后在培養(yǎng)基中進一步稀釋到1000、500、250、100、50、25、5、1nM。將50微升化合物溶液與50μlHIV-1IIIB感染的H9細胞(H9/HIV-1IIIB)混合成2×105個細胞/ml，細胞用鈣熒光素-AM(MolecularProbes，Inc.，Eugene，OR)標記。在37℃共培養(yǎng)2小時后，在倒置熒光顯微鏡(Zeiss，Germany)下分別使用485nm和535nm的濾光片激發(fā)波長，采用目鏡測微盤(10×10mm2)和20x物鏡，對與MT-2細胞融合或未融合的鈣熒光素標記的H9/HIV-1IIIB細胞進行計數(shù)。融合的細胞比未融合的細胞大得多(至少2倍)，因此由于鈣熒光素從一個細胞擴散到兩個或多個細胞，融合的細胞中的熒光強度比未融合細胞弱。每個孔檢測4個視野，通過下面的公式計算細胞融合百分率融合的細胞/(融合的+未融合的細胞)×100％。陽性對照孔加入50μl鈣熒光素標記的HIV感染的細胞。陰性對照孔加入培養(yǎng)基和鈣熒光素標記的未感染的H9細胞。細胞融合的抑制百分率使用下面的公式計算[1-(E-N)/(P-N)]×100％，其中“E”表示實驗組中的細胞融合％，“P”表示沒有加入測試化合物的陽性對照組中的融合％，“N”表示其中鈣熒光素標記的HIV-1IIIB細胞被鈣熒光素標記的H9細胞所代替的陰性對照組中的融合％?？共《净衔飳毎诤系?0％抑制濃度(IC50)，使用由T.C.Chou博士友好提供的計算機程序來計算(Chou，T.C.和Hayball，M.P.，CalcuSynWindowssoftwarefordoseeffectanalysis(CalcuSyn用于量效分析的Windows軟件)，(1991)Ferguson，MO63135，USA，BIOSOFT)。表3顯示了在N-末端帶有或不帶有半胱磺酸、以及有或沒有通過基團Lys(ε-AEEA-MPA)結(jié)合人類血清白蛋白(HSA)的C34的抗融合活性。表3如表3中所示，在C34和CA-C34的抗融合活性之間沒有觀察到顯著差異。因此，在C34的N-末端添加半胱磺酸對C34的抗融合活性沒有負面影響。表2也顯示了將Lys(ε-AEEA-MPA)結(jié)合到C34和CA-C34的C-末端，然后將它們與HAS結(jié)合，對它們的抗融合活性沒有明顯的負面影響。實施例8第二種活性分析HIVIIIB在人類PBMCS中復制的抑制在基于PBMC的分析中使用HIV-1株IIIB進行急性感染后，評估了化合物的抗HIV功效和細胞的細胞毒性。這些實驗在南方研究所的傳染病研究部(SouthernResearchInstitute，InfectiousDiseaseResearchDepartment)，431AviationWay，F(xiàn)rederick，MD進行，按照下述的方案進行。a.PBMCs的HIV-1感染HIV和HBV血清陰性的新鮮人類PBMCs，從篩選的供體分離，并由BiologicalSpecialtyCorporationColmar，PA商業(yè)提供。通過低速離心和重懸浮在PBS中，將細胞沉淀/清洗2-3次，以除去污染性血小板。然后將攜帶白細胞的(leukophoresed)血液用Dulbecco磷酸緩沖鹽水(DPBS)稀釋，在50mL離心管中在淋巴細胞分離培養(yǎng)基(LSM；Mediatech，Inc.；密度為1.078+/-0.002g/ml；目錄號85-072-CL)上分層，然后離心。將淡黃色的覆蓋層從產(chǎn)生的界面上輕輕吸出，然后通過低速離心用PBS洗滌。第三次洗滌后，將細胞重新懸浮在補充有胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素和植物血凝素(PHA-P；Sigma，St-Louis，MO)的RPMI1640中。將細胞在37℃溫育。溫育兩天后，將PBMCs離心，重新懸浮在含有FBS、L-谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素和重組人類IL-2(R&DSystems，Inc.，Minneapolis，MN)的RPMI1640中。在培養(yǎng)基中包含IL-2是為了維持由PHA促有絲分裂刺激引發(fā)的細胞分裂。將細胞在培養(yǎng)物中維持最多兩周，單核細胞由于粘附于組織培養(yǎng)瓶而從培養(yǎng)物中被除去。對于標準PBMC分析來說，將來自至少兩個正常供體的PHA-P刺激的細胞合并，在新鮮培養(yǎng)基中稀釋，鋪在由南方研究所的傳染病研究部開發(fā)的標準格式的96孔圓底微孔板的內(nèi)部孔中。來自一個以上供體的合并PBMCs用于最小化在各個供體之間觀察到的變異性，這種變異性來自于HIV感染的定量和定性差異，以及初級淋巴細胞群體對PHA和IL-2的總體應答。每個板含有病毒/細胞對照孔(細胞+病毒)、試驗孔(化合物+細胞+病毒)和化合物對照孔(化合物+培養(yǎng)基，沒有細胞，為細胞毒性的MTS監(jiān)測所需)。在微量滴定管中制備測試化合物稀釋液，使用標準格式將每種濃度放置在適合的孔中。在向PBMCs加入化合物稀釋液后，然后將病毒儲存溶液的預定稀釋液放置在每個測試孔中(最終的)。病毒儲存溶液從傳代次數(shù)低的臨床分離株HIV-1IIIB制備，該分離株從NIAIDAIDS研究和參比反應試劑項目(NIAIDAIDSResearchandReferenceReagentProgram)獲得。馬上要使用前，將儲存在-80℃的預先滴定過的HIV-1IIIB等份小樣在生物安全柜中快速融化到室溫。因為HIV-1對PBMCs沒有細胞病變效應，因此同樣的分析板可用于抗病毒功效和細胞毒性測定。感染后，將PBMC培養(yǎng)物在37℃、5％CO2下維持7天。b.反轉(zhuǎn)錄酶活性分析利用基于微量滴定板的反轉(zhuǎn)錄酶(RT)反應(Buckheit等，AIDSResearchandHumanRetroviruses7295-302，1991)。將氚化的胸苷三磷酸(3H-TTP，80Ci/mmol，NEN)以1mCi/ml的量加入到1∶1的dH2O∶乙醇中。通過將150μlpolyrA(20mg/ml)與0.5mloligodT(20單位/ml)和5.35ml無菌dH2O進行混合，然后分成等份(1.0ml)并儲存在-20℃，將PolyrAoligodT模板引物(Pharmacia)制備成儲液。RT反應緩沖液以天為基礎(chǔ)新鮮制備，由125μl1.0MEGTA、125μldH2O、125μl20％TritonX100、50μl1.0MTris(pH7.4)、50μl1.0MDTT和40μl1.0MMgCl2組成。最終的反應混合物通過混合1份3H-TTP、4份dH2O、2.5份polyrAoligodT儲液和2.5份反應緩沖液來制備。將10微升該反應混合物放置在圓底微量滴定板中，加入15μl含有病毒的上清液并混合。將板在37℃溫育60分鐘。溫育后，將反應體積點在DE81濾紙墊上(Wallac)，清洗5次，每次在5％磷酸鈉緩沖液或2XSSC(LifeTechnologies)中5分鐘，再清洗2次，每次在蒸餾水中1分鐘，再清洗2次，每次在70％乙醇中1分鐘，然后干燥。摻入的放射活性(每分鐘的計數(shù)，CPM)使用標準液體閃爍技術(shù)定量。c.用于PBMC存活性的MTS染色，以測量細胞毒性在分析結(jié)束時，將分析板用可溶的基于四唑鎓的染料MTS(CellTiterReagent，Promega)進行染色，以確定細胞存活性并對化合物的細胞毒性進行定量。MTS被代謝活性細胞的線粒體酶代謝，產(chǎn)生可溶性的甲臜(formazan)產(chǎn)物，可以快速定量分析細胞的存活性和化合物的細胞毒性。MTS是穩(wěn)定的溶液，不需要在使用前制備。在分析結(jié)束時，向每個孔加入20μlMTS試劑。對于HIVPBMC分析來說，孔在37℃溫育4小時。溫育間期根據(jù)憑經(jīng)驗確定的每種細胞類型中最適的染料還原時間來選擇。使用粘性的板密封劑代替蓋子，將密封的板顛倒幾次以混合可溶的甲臜產(chǎn)物，使用MolecularDevicesVmax讀板器在490/650nm處通過分光光度法讀板。d.數(shù)據(jù)分析使用內(nèi)部自己設(shè)計的計算機程序，計算了IC50(病毒復制的50％抑制)、IC90(病毒復制的90％抑制)、TC50(50％細胞毒性)、TC90(90％細胞毒性)和治療指數(shù)(TI＝TC50/IC50)。抗病毒活性和細胞毒性的原始數(shù)據(jù)以及數(shù)據(jù)的圖示提供在匯總了每種化合物活性的打印輸出中。AZT作為抗HIV分析中的相關(guān)陽性對照化合物，進行了平行評估。e.結(jié)果圖1顯示了天然C34對PBMC中HIV-1IIIB復制的抑制(參見曲線◆)。正如下面顯示的(參見曲線□)，該化合物對PBMCs沒有顯示出任何顯著的細胞毒性效應。圖2顯示了在添加在C-末端的賴氨酸的ε-NH2上具有AEEA-MPA的C34的白蛋白結(jié)合物，即C34-Lys35(ε-AEEA-MPA)HSA，對PBMC中HIV-1IIIB復制的抑制(參見曲線◆)。正如下面所示(參見曲線□)，該化合物對PBMCs沒有顯示出任何細胞毒性效應。圖3顯示了在N-末端具有半胱磺酸、并在添加在C-末端的賴氨酸的ε-NH2上具有AEEA-MPA的C34的白蛋白結(jié)合物，即CA-C34-Lys35(ε-AEEA-MPA)HSA，對PBMC中HIV-1IIIB復制的抑制(參見曲線◆)。正如下面所示(參見曲線□)，該化合物對PBMCs沒有顯示出任何細胞毒性效應。根據(jù)圖1、2和3中顯示的數(shù)據(jù)，這兩種白蛋白結(jié)合物的IC50值給出在表4中，并與天然C34進行了比較。表4表4顯示了天然C34、C34的白蛋白結(jié)合物和CA-C34的白蛋白結(jié)合物的抗HIV活性相似。總之，在N-末端添加半胱磺酸以及它隨后與白蛋白通過Lys35的結(jié)合(ε-AEEA-MPA)，在本分析中對C34的活性沒有負面影響。實施例8其它的抗融合肽衍生物實驗程序下面的步驟在所有實行的實驗中使用，以獲得下面詳細討論的結(jié)果。CHR肽類似物的合成使用自動化固相程序在十二通道(Symphony)肽合成儀上進行，在肽的產(chǎn)生過程中進行了手動干預。合成使用Fmoc保護的氨基酸，在Fmoc保護的拉每(Ramage)酰胺接頭樹脂上進行。連接使用O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)作為活化劑混合物在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中達成。Fmoc保護基團使用20％哌啶/DMF來除去。Boc-保護的氨基酸用在N-末端，以便當肽從樹脂上切下來后產(chǎn)生游離的α-N-末端。在合成過程中使用Sigmacote處理過的玻璃反應容器。當馬來酰亞胺基位于分子的C-末端部分時(表5，白蛋白結(jié)合的化合物VII和乙酰化結(jié)合的化合物X)，肽的固相合成通過加入Fmoc-Lys(Aloc)來起始。Aloc是對酸性介質(zhì)穩(wěn)定的特異性正交保護基團。然后通過順序加入其側(cè)鏈由對酸性介質(zhì)不穩(wěn)定的基團所保護的氨基酸，將肽鏈在固體支持物上延伸。當肽鏈完成時，使用四三苯基膦鈀將C-末端賴氨酸上的Aloc保護基團選擇性移除。然后將Fmoc-氨基乙氧基乙氧基乙酸(AEEA)接頭化學連接到未保護的賴氨酸上。在經(jīng)典的Fmoc去保護規(guī)程后，將馬來酰亞胺丙酸(MPA)化學連接到AEEA間隔基上。最后，將酸不穩(wěn)定的保護基團從肽上移除，然后使用強酸性混合物將肽從固體支持物上切下。當馬來酰亞胺位于分子的N-末端部分時(表5，馬來酰亞胺基化合物VIII，白蛋白結(jié)合的化合物VIII)，以及白蛋白結(jié)合的MPA-AEEA-化合物VIII，肽的固相合成通過融合肽抑制劑的天然氨基酸序列來起始。表5aHSA，人類血清白蛋白bCONH2，羧酰胺cMPA，馬來酰亞胺丙酸dAEEA，氨基乙基乙氧基乙酸eCys34，白蛋白的半胱氨酸-34fAc，乙?；牡募兓糠N產(chǎn)物使用Varian(Dynamax)制備型二元HPLC系統(tǒng)，通過制備型反相HPLC純化。所有DAC肽的純化使用PhenomenexLuna苯基-己基(10微米，50mm×250mm)柱進行，柱用水/TFA混合物(0.1％TFA在H2O中；溶劑A)和乙腈/TFA(0.1％TFA在CH3CN中；溶劑B)平衡。洗脫通過以50mL/min用180分鐘運行各種溶劑B的梯度來進行。含有肽的級份通過在214和254nm處的UV吸光度(VarianDynamaxUVDII)來檢測。將級份收集為25mL的等份試樣。含有目標產(chǎn)物的級份在直接注射到LC/MS上之后通過質(zhì)量來鑒定。然后將選出的級份通過分析型HPLC(用20分鐘20-60％B；PhenomenexLuna5微米苯基-己基，10nmx250mm柱，0.5mL/min)進行分析，以鑒定具有≥90％純度的級份用于合并。然后將合并物使用液氮冷凍干燥，隨后凍干至少2天，以獲得白色粉末。白蛋白結(jié)合物的制備使用疏水相互作用層析法進行馬來酰亞胺基-C34和馬來酰亞胺基-T-20衍生物與HAS的半胱氨酸-34結(jié)合以及隨后純化，最近成為一種有效的方法。結(jié)合步驟包括將每種馬來酰亞胺基-肽與HSA的25％溶液(Cortex-Biochem，SanLeandro，CA)混合，并在37℃溫育30分鐘。使用AKTA純化儀(GEHealthcare)，將得到的混合物以2.5ml/min的流速直接上樣到裝填有丁基瓊脂糖凝膠4FF(butylsepharose4fastflow)樹脂(GEHealthcare)的50ml柱子中，柱子用含有5mM辛酸鈉和750mM(NH4)2SO4的20mM磷酸鈉緩沖液(pH7)平衡。在這些條件下，C34-HSA結(jié)合物吸附在疏水樹脂上，而基本上所有未結(jié)合的HSA洗脫在柱子的空隙體積中。通過施加超過4倍柱體積的(NH4)2SO4濃度逐漸減少(750-0mM)的線性梯度，將每種結(jié)合物從任何游離的(未反應的)馬來酰亞胺基-C34衍生物進一步純化出來。然后使用10kDa超離心過濾裝置(Amicon；Millipore，Bedford，MA)，將每種純化的結(jié)合物在水中脫鹽并濃縮。最后，將每種結(jié)合物溶液重新配制在pH7的等滲緩沖溶液中。每種純化樣品的質(zhì)譜證實了最豐富的蛋白產(chǎn)物對應于HSA與每種馬來酰亞胺基衍生物的1∶1共價復合物，每種純化樣品的反相HPLC分析證實移除了基本上所有未結(jié)合的(游離的)馬來酰亞胺基衍生物。每種白蛋白結(jié)合物使用無菌的0.9％NaCl進行配制，T-20(從舊金山總醫(yī)院藥房(SanFranciscoGeneralHospitalpharmacy)獲得)溶解在無菌注射用水中，并用HCl調(diào)整到pH7。在新鮮的人類PBMCs中的抗HIV功效評估HIV-1IIIB通過NIH的NIAID的AIDS分部的AIDS研究和參比試劑項同(AIDSResearchandReferenceReagentProgram，DivisionofAIDS，NIAID，NIH)獲得，由RobertC.Gallo博士好意提供(PopovicME，Read-ConnoleE，GalloRC(1984)T4positivehumanneoplasticcelllinessusceptibletoandpermissiveforHTLV-III.(對HTLV-III易感和可感染的T4陽性人類腫瘤細胞系)，Lancetii1472-1473；PopovicM，SarngadharanMG，ReadE，GalloRC(1984)Detection，isolation，andcontinuousproductionofcytopathicretroviruses(HTLV-III)frompatientswithAIDSandpre-AIDS.(從患有AIDS和AIDS前期的患者檢測、分離和連續(xù)生產(chǎn)細胞病變性反轉(zhuǎn)錄病毒(HTLV-III))，Science224497-500；RatnerL等，(1985)CompletenucleotidesequenceoftheAIDSvirus，HTLV-III.(AIDS病毒HTLV-III的完整核苷酸序列)，Nature313277-283)。對HIV和HBV血清陰性的新鮮的人類外周血單核細胞(PBMCs)，從篩選的供體的血液中(BiologicalSpecialtyCorporation；Colmar，PA)，使用淋巴細胞分離培養(yǎng)基(LSM；Mediatech，Inc.；密度為1.078+/-0.002g/ml)，按照制造商的說明書進行分離。細胞通過在4μg/mL植物血凝素(PHA；Sigma)中溫育48-72小時，進行刺激。通過向培養(yǎng)基加入20U/mL重組人類IL-2(R&DSystems，Inc)來維持促有絲分裂刺激。將來自至少兩個供體的PHA刺激的PBMCs合并，在新鮮培養(yǎng)基中稀釋，以5×104個細胞/孔加到96孔板中。在存在9種不同濃度的測試化合物(三個重復孔/濃度)下，對細胞進行感染(最終的)，并溫育7天。為了確定病毒抑制的水平，收集無細胞上清液樣品，用于反轉(zhuǎn)錄酶活性分析(BuckheitRW，SwanstromR(1991)CharacterizationofanHIV-1isolatedisplayinganapparentabsenceofvirion-associatedreversetranscriptaseactivity.(顯示出明顯不存在病毒粒子相關(guān)的反轉(zhuǎn)錄酶活性的HIV-1分離株的表征)，AIDSResHumRetrovir7295-302)。在移除上清液樣品后，通過加入3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓(MTS；CellTiter96Reagent，Promega)，按照制造商的說明書來測量化合物的細胞毒性。使用內(nèi)部自己設(shè)計的計算機程序，確定了IC50(病毒復制的50％抑制)、IC90(病毒復制的90％抑制)、TC50(細胞存活性減少50％)和選擇性指數(shù)(IC50/TC50)。AZT(核苷反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑)被用作分析的對照化合物。病毒下面的試劑通過通過NIH的NIAID的AIDS分部的AIDS研究和參比試劑項目(AIDSResearchandReferenceReagentProgram，DivisionofAIDS，NIAID，NIH)獲得pNL4-3來自MalcolmMartin。(AdachiA等，(1986)Productionofacquiredimmunodeficiencysyndrome-associatedretrovirusinhumanandnonhumancellstransfectedwithaninfectiousmolecularclone.(在用感染性分子克隆轉(zhuǎn)染的人類和非人類細胞中生產(chǎn)獲得型免疫缺陷綜合癥相關(guān)的反轉(zhuǎn)錄病毒)，JVirol59284-291.)。來自AIDS試劑項目的NL4-3在gp41中含有未預料到的變異體DIV(G36D)突變，在體外賦予了對T-20的8倍的抗性。通過定點突變將T-20敏感性NL4-3(NL4-3G)改變成與gp41的36位氨基酸處的共有序列匹配(天冬氨酸用甘氨酸代替)。NL4-3G和NL4-3D(原始克隆)的儲液通過轉(zhuǎn)染293T細胞并在第3天收集上清液來制備。病毒儲液通過在PHA活化的PBMCs中進行50％終點分析來滴定，并通過ELISA進行p24檢測。結(jié)果使用基于PBMC分析的體外抗病毒活性使用針對HIV-1IIIB的基于PBMC的分析(PopovicME，Read-ConnoleE，GalloRC(1984)T4positivehumanneoplasticcelllinessusceptibletoandpermissiveforHTLV-III.(對HTLV-III易感和可感染的T4陽性人類腫瘤細胞株)，Lancetii1472-1473；PopovicM，SarngadharanMG，ReadE，GalloRC(1984)Detection，isolation，andcontinuousproductionofcytopathicretroviruses(HTLV-III)frompatientswithAIDSandpre-AIDS.(從患有AIDS和AIDS前期的患者檢測、分離和連續(xù)生產(chǎn)細胞病變性反轉(zhuǎn)錄病毒(HTLV-III))，Science224497-500；RatnerL等，(1985)CompletenucleotidesequenceoftheAIDSvirus，HTLV-III.(AIDS病毒HTLV-III的完整核苷酸序列)，Nature313277-283；BuckheitRW，SwanstromR(1991)CharacterizationofanHIV-1isolatedisplayinganapparentabsenceofvirion-associatedreversetranscriptaseactivity.(顯示出明顯不存在病毒粒子相關(guān)的反轉(zhuǎn)錄酶活性的HIV-1分離株的表征)，AIDSResHumRetrovir7295-302)，比較了每種白蛋白結(jié)合物與原始的肽抑制劑的體外抗病毒活性。有趣的是，PC-1505(白蛋白結(jié)合的化合物VIII)、化合物C(白蛋白結(jié)合的化合物VII)和化合物D(白蛋白結(jié)合的化合物VI)的抗病毒活性，都被發(fā)現(xiàn)在體外與C34肽和T-20基本上等效。也就是說，將反應性馬來酰亞胺基團放置在C34肽的N-末端(PC-1505(白蛋白結(jié)合的化合物VIII)和化合物C(白蛋白結(jié)合的化合物VII))或C-末端(化合物D(白蛋白結(jié)合的化合物VI))，然后進行白蛋白結(jié)合，不改變?nèi)诤弦种苿┑目共《净钚?表7)。在白蛋白與T-20結(jié)合后，當反應性肽被設(shè)計成在肽的N-末端發(fā)生結(jié)合時(化合物E，白蛋白結(jié)合的化合物III)，極好地保留了抗病毒活性，但是當對白蛋白的結(jié)合發(fā)生在肽的C-末端時(化合物F，化合物X——cpdF與Erikson中(化合物I-VIII)等價)，觀察到了該肽的抗病毒活性的顯著降低。表6NA＝?jīng)]有獲得IC50NP＝未進行C34肽、化合物VIII和rHA在大鼠中的藥代動力學特性為了確保在本研究中觀察到的抗病毒活性是由于白蛋白結(jié)合物的的作用，而不是由于游離肽或是馬來酰亞胺和半胱氨酸-C34之間共價鍵的可逆性，在測試前對所有白蛋白結(jié)合物進行了純化，以除去任何未結(jié)合的肽，并在大鼠中對化合物VIII的藥代動力學特性與C34肽(圖5A)和rHA(圖5B)進行了比較。顯然，在白蛋白結(jié)合后，急劇增加了C34肽的暴露，并且預先形成的結(jié)合物-化合物VIII的藥代動力學特性與rHA相重疊，這個事實證實了C34肽采取了與白蛋白接近的半衰期。使用Balb/c小鼠，在靜脈內(nèi)或皮下施用預先形成的結(jié)合物-化合物VIII后，也觀察到了測量C34肽和HSA的藥代動力學曲線重疊了至少30個小時(數(shù)據(jù)未顯示，白蛋白的T1/2在小鼠中比在大鼠中短)。相反，C34肽從結(jié)合物的緩慢持續(xù)釋放將導致這兩個藥代動力學特性不再重疊，因為預先形成的結(jié)合物-化合物VIII的總體暴露將比rHA低下。此外，從結(jié)合物釋放的C34肽在體內(nèi)將經(jīng)歷非常短的半衰期，與長期持續(xù)的預先形成的結(jié)合物-化合物VIII相比，抗病毒功效有限。因此，連接馬來酰亞胺與半胱氨酸-34的鍵在體內(nèi)高度穩(wěn)定，C34肽被賦予了對快速腎臟清除和肽酶降解的更高穩(wěn)定性。合在一起，可以得出結(jié)論。所有白蛋白結(jié)合物在體內(nèi)和體外的抗病毒活性僅僅是由于化學穩(wěn)定的結(jié)合物的作用，而不是由于馬來酰亞胺-半胱氨酸-34鍵的可逆性。討論基于HIVgp41的N-末端螺旋區(qū)域(NHR)和C-末端螺旋區(qū)域(CHR)序列的合成肽，已經(jīng)被顯示出通過在多步融合過程中競爭暴露的gp41結(jié)合位點，而抑制HIV的進入(ChanDC，F(xiàn)assD，BergerJM，KimPS(1997)Corestructureofgp41fromtheHIVenvelopeglycoprotein.(來自HIV包膜糖蛋白的gp41的核心結(jié)構(gòu))，Cell89263-273；ChanDC，ChutkowskiCT，KimPS(1998)EvidencethataprominentcavityinthecoiledcoilofHIVtype1gp41isanattractivedrugtarget.(1型HIVgp41的卷曲螺旋中的顯著的腔是有吸引力的藥物靶的證據(jù))，ProcNatlAcadSciUSA9515613-15617.)。在臨床上，這些肽中最成功的是T-20(來自Trimeris/RocheAppliedSciences的)，源自于gp41的CHR。當與小分子進行比較時，肽的商業(yè)化應用通常受限于它們的成本高，以及它們在體內(nèi)的半衰期短和分布差。我們尋求通過工程化CHR肽(C34和T-20)，使它們與人類白蛋白的半胱氨酸-34共價結(jié)合，來應對這些缺點，這對于其它類型的肽已經(jīng)進行了(HolmesDL等，(2000)Sitespecific1:1opioidalbuminconjugatewithinvitroactivityandlonginvivoduration.(具有體外活性和體內(nèi)持續(xù)時間長的位點特異性的1:1的阿片樣物質(zhì)白蛋白結(jié)合物)，BioconjChem11439-444；LegerR等，(2003)Synthesisandinvitroanalysisofatrialnatriureticpeptide-albuminconjugates.(動脈鈉尿肽-白蛋白結(jié)合物的合成和體外分析)，Bioorg&MedChemLett133571-3575；LegerR等，(2004)Kringle5peptide-albuminconjugateswithanti-migratoryactivity.(具有抗遷移活性的Kringle5肽-白蛋白結(jié)合物)Bioorg&MedChemLett14841-845；LegerR等，(2004)IdentificationofCJC-1131-albuminbioconjugateasastableandbioactiveGLP-1(7-36)analog.(CJC-1131-白蛋白生物結(jié)合物被鑒定為穩(wěn)定的有生物活性的GLP-1(7-36)類似物)，Bioorg&MedChemLett144395-4398；JetteL等，(2005)Humangrowthhormone-releasingfactor(hGRF)1-29albuminbioconjugatesactivatetheGRFreceptorontheanteriorpituitaryinratsIdentificationofCJC-1295asalong-lastingGRFanalog.(人類生長激素釋放因子(hGRF)1-29白蛋白生物結(jié)合物激活大鼠中垂體前葉上的GRF受體鑒定CJC-1295為長期持續(xù)的GRF類似物)，Endocrinology1463052-3058；fhibaudeauK等，(2005)Synthesisandevaluationofinsulin-humanserumalbuminconjugates.(胰島素-人血清白蛋白結(jié)合物的合成和評估)，BioconjChem161000-1008.)。也就是說，我們推斷CHR-肽-HSA結(jié)合物在身體中將經(jīng)歷與白蛋白接近的半衰期，與此相反，原始融合抑制劑的半衰期短得多。本文顯示的結(jié)果表明，gp41的NHR比最初所認為的更容易接近。例如，為了允許這種競爭性抑制發(fā)生，正如使用預先形成的結(jié)合物-化合物VIII所顯示的，gp41可能參與了在不存在靶細胞的情況下(即在無細胞病毒或感染細胞的情況下)暴露NHR區(qū)域的構(gòu)象平衡，或者在“進入爪(entryclaw)”中形成的前發(fā)夾中間體(SougratR等，(2007)ElectrontomographyofthecontactbetweenTcellsandSIV/HIV-1Implicationsforviralentry.(T細胞與SIV-HIV-1之間接觸的電子斷層成像喻示病毒進入)，PLoSPathogens30571-0581.)在形成六螺旋束和隨后的脂類混合和膜刺穿步驟之前，是充分溶劑暴露的。就是說，使用Mw為～71kDa的預先形成的結(jié)合物-化合物VIII，我們的結(jié)果表明，用于接近gp41的NHR-三體的分子量截止值遠大于以前報道的，即＜25kDa(11)。其次，c34肽的N-末端片段628WMEW631，代表了gp41的卷曲螺旋腔結(jié)合殘基，據(jù)推斷其對于C34肽抑制HIV-1進入的能力是基本的(18，19)。因此，在預先形成的結(jié)合物-化合物VIII(含有AEEA接頭)或化合物C預先形成的結(jié)合物-化合物VII(沒有AEEA接頭)的情況下，有多大可能c34肽的628WMEW631片段到達gp41的NHR，并同時永久性鍵合并定位在緊鄰白蛋白的表面？保留預先形成的結(jié)合物-化合物VIII和化合物C預先形成的結(jié)合物-化合物VII的抗病毒活性的一個可能的解釋，是事實上，血清白蛋白是高度柔性的蛋白，能夠被誘導采取幾種構(gòu)象狀態(tài)(PetersT，Jr(1996)Allaboutalbumin-biochemistry，genetics，andmedicalapplications，《關(guān)于白蛋白生物化學、遺傳學和醫(yī)學應用的所有情況》，CopyrightbyAcademicPress，Inc.)。例如，因為C34肽永久連接到白蛋白的半胱氨酸-34，因此有可能白蛋白不受約束的N-末端結(jié)構(gòu)域(即沒有二硫橋)中局部的構(gòu)象重排導致了部分解旋，從而便于將融合抑制劑正確插入到gp41的NHR區(qū)域上。因此，尚不知道，C34肽在白蛋白分子中半胱氨酸-34之外的其它位置定位是否會導致該融合抑制劑同樣保留抗病毒活性(例如賴氨酸殘基，N-末端或C-末端)，或者在C34肽與其它較高分子量的豐富的血清蛋白例如轉(zhuǎn)鐵蛋白或IgG結(jié)合后，是否將觀察到同樣保留的抗病毒活性。因此，也有可能白蛋白分子扮演了主動的參與角色而不僅僅是作為蛋白貨物。例如，馬來?；?、烏頭?；顽牾；陌椎鞍自隗w外起到有效力的HIV-1進入抑制劑的作用(35-38)。此外，既然在C34肽中發(fā)現(xiàn)的34個氨基酸殘基中有24個與T-20中發(fā)現(xiàn)的重疊，那么怎么可能T-20在C-末端修飾后成為白蛋白結(jié)合的不好的候選物，而當T-20在其N-末端修飾時觀察到了抗病毒活性的保留改善？該發(fā)現(xiàn)的一種可能的解釋是最近的證據(jù)，表明由T-20引起的HIV-1的抑制機理與C34肽引起的不同(LiuS等，(2005)JBiolChem28011259-11273；Munoz-BarrosoI等，(199S)JCellBiol140315-23；KligerY等，(2001)JBiolChem2761391-1397.)。例如，已經(jīng)顯示T-20抑制gp41在質(zhì)膜上的召集以及它隨后在脂類混合步驟后的低聚化，而C34肽被發(fā)現(xiàn)在形成六螺旋束之后不能執(zhí)行其抑制效應(LiuS等，(2005)JBiolChem28011259-11273.)。也就是說，已經(jīng)提出，T-20在它插入到質(zhì)膜中以后發(fā)揮這樣的抑制功能，并且T-20的疏水性C-末端區(qū)段666WASLWNWF673，被認為對于實現(xiàn)這些疏水相互作用來說是關(guān)鍵的(Munoz-BarrosoI等，(1998)JCellBiol140315-23；KligerY等，(2001)JBiolChem2761391-1397.)。更具體來說，T-20通過與位于緊鄰質(zhì)膜的gp41中的相應序列結(jié)合，抑制了gp41的召集和低聚化(Munoz-BarrosoI，DurellS，SakaguchiK，AppellaE，BlumenthalR(1998)Dilationofthehumanimmunodeficiencyvirus-1envelopeglycoproteinfusionporerevealedbytheinhibitoryactionofasyntheticpeptidefromgp41.(通過來自gp41的合成肽的抑制作用顯示人類免疫缺陷病毒-1包膜糖蛋白融合核心的擴張)，JCellBiol140315-23；KligerY等，(2001)JBiolChem2761391-1397.)。因此，對于其中666WASLWNWF673序列位于緊鄰自蛋白分子的化合物F化合物X所觀察到的抗病毒活性的急劇喪失，可以歸因于該肽在脂類混合步驟后不能象未結(jié)合的(游離的)T-20肽一樣有效地發(fā)揮功能。相反，在化合物E(化合物IX)的設(shè)計中，666WASLWNWF673序列的構(gòu)象約束較低。概括地說，我們的結(jié)果為表明T-20和C34肽不在HIV-1融合的同樣步驟中發(fā)揮作用的報告，提供了確定性的支持證據(jù)。本文中顯示的結(jié)果，為該新的一類用于抑制HIV或采用了相似的膜融合和病毒進入機理的其它病毒的白蛋白-肽結(jié)合物，建立了原理證明。與未結(jié)合的(游離的)肽抑制劑相比，白蛋白結(jié)合物可以造成對淋巴系統(tǒng)的暴露顯著改善，淋巴系統(tǒng)代表了大約98％的總HIV感染細胞的解剖學棲息地(StebbingJ，GazzardB，DouekDC(2004)WheredoesHIVlive？(HIV生活在哪里？)，NEnglJMed3501872-1880.)?？梢灶A期這種改善，主要是由于觀察到血清白蛋白顯著穩(wěn)態(tài)的淋巴與血漿濃度比率(Bent-HansenL(1991)Wholebodycapillaryexchangeofalbumin.(白蛋白的全身毛細血管交換)，ActaPhysiolScandSuppl6035-10(綜述)；PorterCJH，CharmanSA(2000)Lymphatictransportofproteinsaftersubcutaneousadministration.(蛋白皮下施用后的淋巴運輸)，JPharmSci89297-310.)，以及皮下注射大于16-20kDa蛋白所觀察到的有效的淋巴攝入、運輸和通透性(PorterCJH，CharmanSA(2000)Lymphatictransportofproteinsaftersubcutaneousadministration.(蛋白皮下施用后的淋巴運輸)，JPharmSci89297-310.)。最后，由于在C34肽和許多其它抗融合肽中發(fā)現(xiàn)的疏水性殘基的高含量，白蛋白結(jié)合物也可以幫助改善這類肽當放置在適用于皮下投送的簡單水性制劑中時，通常觀察到的低溶度極限。例如，C34肽的溶度極限，在水性緩沖液中被發(fā)現(xiàn)不超過1mg/ml，而PC-1505的溶度極限被發(fā)現(xiàn)與白蛋白的相似，相當于大約16mg/ml的C34肽(即25％(w/v)溶液＝250mg/mlPC-1505≈16mg/mlC34肽)。概括來說，抗融合肽通過白蛋白的半胱氨酸-34的結(jié)合，克服了通常伴隨著gp41的NHR三體的空間阻礙，因此，為發(fā)現(xiàn)新的較高分子量的、表現(xiàn)出強有力和廣泛的中和活性的分子，提供了希望。白蛋白結(jié)合的C34肽HIV-1融合抑制劑的一個例子，PC-1505，可能比T-20需要的給藥頻度低，并可能是在人類中針對T-20抗性HIV-1的有效藥劑。實施例9其它的抗融合肽衍生物圖6描述的表，顯示了所描述的抗融合肽的幾種結(jié)合物(顯示為PC，預先形成的復合物)的體外抗HIV活性。按照本文實施例中的描述進行分析。盡管已經(jīng)對本發(fā)明的某些實施方案進行了描述和示例，但本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通專業(yè)人員將會理解，本發(fā)明不打算受限于任何這些實施方案的細節(jié)，而是由隨附的權(quán)利要求書限定。序列表<110>康久化學生物技術(shù)公司(CONJUCHEMBIOTECHNOLOGIESINC.)<120>抗病毒肽的半胱磺酸衍生物(CYSTEICACIDDERIVATIVESOFANTI-VIRALPEPTIDES)<130>SCT094204-70<140>PCT/US08/064010<141>2008-05-16<150>60/938,394<151>2007-05-16<150>60/938,380<151>2007-05-16<160>51<170>PatentInversion3.3<210>1<211>4<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>1TrpMetGluTrp1<210>2<211>34<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>2TrpMetGluTrpAspArgGluIleAsnAsnTyrThrSerLeuIleHis151015SerLeuIleGluGluSerGlnAsnGlnGlnGluLysAsnGluGlnGlu202530LeuLeu<210>3<211>35<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<220><221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>Cysteicacid<400>3XaaTrpMetGluTrpAspArgGluIleAsnAsnTyrThrSerLeuIle151015HisSerLeuIleGluGluSerGlnAsnGlnGlnGluLysAsnGluGln202530GluLeuLeu35<210>4<211>35<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<220><221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>Cysteicacid<400>4XaaTrpMetGluTrpAspArgGluIleAsnAsnTyrThrSerLeuIle151015HisSerLeuIleGluGluSerGlnAsnGlnGlnGluArgAsnGluGln202530GluLeuLeu35<210>5<211>36<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<220><221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>Cysteicacid<400>5XaaTrpMetGluTrpAspArgGluIleAsnAsnTyrThrSerLeuIle151015HisSerLeuIleGluGluSerGlnAsnGlnGlnGluLysAsnGluGln202530GluLeuLeuLys35<210>6<211>36<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<220><221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>Cysteicacid<400>6XaaTrpMetGluTrpAspArgGluIleAsnAsnTyrThrSerLeuIle151015HisSerLeuIleGluGluSerGlnAsnGlnGlnGluArgAsnGluGln202530GluLeuLeuLys35<210>7<211>36<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>7TyrThrSerLeuIleHisSerLeuIleGluGluSerGlnAsnGlnGln151015GluLysAsnGluGlnGluLeuLeuGluLeuAspLysTrpAlaSerLeu202530TrpAsnTrpPhe35<210>8<211>38<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>8AsnAsnLeuLeuArgAlaIleGluAlaGlnGlnHisLeuLeuGlnLeu151015ThrValTrpGlnIleLysGlnLeuGlnAlaArgIleLeuAlaValGlu202530ArgTyrLeuLysAspGln35<210>9<211>34<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>9TrpMetGluTrpAspArgGluIleAsnAsnTyrThrSerLeuIleHis151015SerLeuIleGluGluSerGlnAsnGlnGlnGluArgAsnGluGlnGlu202530LeuLys<210>10<211>34<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>10TrpMetGluTrpAspArgGluIleAsnAsnTyrThrSerLeuIleHis151015SerLeuIleGluGluSerGlnAsnGlnGlnGluArgAsnGluGlnGlu202530LysLeu<210>11<211>34<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>11TrpMetGluTrpAspArgGluIleAsnAsnTyrThrSerLeuIleHis151015SerLeuIleGluGluSerGlnAsnGlnGlnGluArgAsnGluGlnLys202530LeuLeu<210>12<211>34<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>12TrpMetGluTrpAspArgGluIleAsnAsnTyrThrSerLeuIleHis151015SerLeuIleGluGluSerGlnAsnGlnGlnGluArgAsnGluLysGlu202530LeuLeu<210>13<211>34<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>13TrpMetGluTrpAspArgGluIleAsnAsnTyrThrSerLeuIleHis151015SerLeuIleGluGluSerGlnAsnGlnGlnGluArgAsnLysGlnGlu202530LeuLeu<210>14<211>34<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>14TrpMetGluTrpAspArgGluIleAsnAsnTyrThrSerLeuIleHis151015SerLeuIleGluGluSerGlnAsnGlnGlnGluArgLysGluGlnGlu202530LeuLeu<210>15<211>35<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>15TrpMetGluTrpAspArgGluIleAsnAsnTyrThrSerLeuIleHis151015SerLeuIleGluGluSerGlnAsnGlnGlnGluArgAsnGluGlnGlu202530LeuLeuLys35<210>16<211>35<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>16TrpMetGluTrpAspArgGluIleAsnAsnTyrThrSerLeuIleHis151015SerLeuIleGluGluSerGlnAsnGlnGlnGluLysAsnGluGlnGlu202530LeuLeuLys35<210>17<211>38<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>17AsnAsnLeuLeuArgAlaIleGluAlaGlnGlnHisLeuLeuGlnLeu151015ThrValTrpGlnIleLysGlnLeuGlnAlaArgIleLeuAlaValGlu202530ArgTyrLeuLysAspGln35<210>18<211>36<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>18TyrThrAsnThrIleTyrThrLeuLeuGluGluSerGlnAsnGlnGln151015GluLysAsnGluGlnGluLeuLeuGluLeuAspLysTrpAlaSerLeu202530TrpAsnTrpPhe35<210>19<211>36<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>19TyrThrGlyIleIleTyrAsnLeuLeuGluGluSerGlnAsnGlnGln151015GluLysAsnGluGlnGluLeuLeuGluLeuAspLysTrpAlaAsnLeu202530TrpAsnTrpPhe35<210>20<211>36<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>20TyrThrSerLeuIleTyrSerLeuLeuGluLysSerGlnIleGlnGln151015GluLysAsnGluGlnGluLeuLeuGluLeuAspLysTrpAlaSerLeu202530TrpAsnTrpPhe35<210>21<211>33<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>21TyrThrSerValIleThrIleGluLeuSerAsnIleLysGluAsnLys151015CysAsnGlyAlaLysValLysLeuIleLysGlnGluLeuAspLysTyr202530Lys<210>22<211>33<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>22ThrSerValIleThrIleGluLeuSerAsnIleLysGluAsnLysCys151015AsnGlyAlaLysValLysLeuIleLysGlnGluLeuAspLysTyrLys202530Asn<210>23<211>33<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>23ValIleThrIleGluLeuSerAsnIleLysGluAsnLysCysAsnGly151015AlaLysValLysLeuIleLysGlnGluLeuAspLysTyrLysAsnAla202530Val<210>24<211>33<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>24IleAlaLeuLeuSerThrAsnLysAlaValValSerLeuSerAsnGly151015ValSerValLeuThrSerLysValLeuAspLeuLysAsnTyrIleAsp202530Lys<210>25<211>35<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>25ValGluAlaLysGlnAlaArgSerAspIleGluLysLeuLysGluAla151015IleArgAspThrAsnLysAlaValGlnSerValGlnSerSerIleGly202530AsnLeuIle35<210>26<211>35<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>26ArgSerAspIleGluLysLeuLysGluAlaIleArgAspThrAsnLys151015AlaValGlnSerValGlnSerSerIleGlyAsnLeuIleValAlaIle202530LysSerVal35<210>27<211>35<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>27AsnSerValAlaLeuAspProIleAspIleSerIleGluLeuAsnLys151015AlaLysSerAspLeuGluGluSerLysGluTrpIleArgArgSerAsn202530GlnLysLeu35<210>28<211>35<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>28AlaLeuAspProIleAspIleSerIleGluLeuAsnLysAlaLysSer151015AspLeuGluGluSerLysGluTrpIleArgArgSerAsnGlnLysLeu202530AspSerIle35<210>29<211>35<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>29LeuAspProIleAspIleSerIleGluLeuAsnLysAlaLysSerAsp151015LeuGluGluSerLysGluTrpIleArgArgSerAsnGlnLysLeuAsp202530SerIleGly35<210>30<211>35<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>30AspProIleAspIleSerIleGluLeuAsnLysAlaLysSerAspLeu151015GluGluSerLysGluTrpIleArgArgSerAsnGlnLysLeuAspSer202530IleGlyAsn35<210>31<211>35<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>31ProIleAspIleSerIleGluLeuAsnLysAlaLysSerAspLeuGlu151015GluSerLysGluTrpIleArgArgSerAsnGlnLysLeuAspSerIle202530GlyAsnTrp35<210>32<211>35<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>32IleAspIleSerIleGluLeuAsnLysAlaLysSerAspLeuGluGlu151015SerLysGluTrpIleArgArgSerAsnGlnLysLeuAspSerIleGly202530AsnTrpHis35<210>33<211>34<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>33HisArgIleAspLeuGlyProProIleSerLeuGluArgLeuAspVal151015GlyThrAsnLeuGlyAsnAlaIleAlaLysLeuGluAlaLysGluLeu202530LeuGlu<210>34<211>34<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>34IleAspLeuGlyProProIleSerLeuGluArgLeuAspValGlyThr151015AsnLeuGlyAsnAlaIleAlaLysLeuGluAlaLysGluLeuLeuGlu202530SerSer<210>35<211>34<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>35LeuGlyProProIleSerLeuGluArgLeuAspValGlyThrAsnLeu151015GlyAsnAlaIleAlaLysLeuGluAlaLysGluLeuLeuGluSerSer202530AspGln<210>36<211>34<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>36ProIleSerLeuGluArgLeuAspValGlyThrAsnLeuGlyAsnAla151015IleAlaLysLeuGluAlaLysGluLeuLeuGluSerSerAspGlnIle202530LeuArg<210>37<211>35<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>37TrpGlnGluTrpGluArgLysValAspPheLeuGluGluAsnIleThr151015AlaLeuLeuGluGluAlaGlnIleGlnGlnGluLysAsnMetTyrGlu202530LeuGlnLys35<210>38<211>35<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>38GlnGluTrpGluArgLysValAspPheLeuGluGluAsnIleThrAla151015LeuLeuGluGluAlaGlnIleGlnGlnGluLysAsnMetTyrGluLeu202530GlnLysLeu35<210>39<211>35<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>39GluTrpGluArgLysValAspPheLeuGluGluAsnIleThrAlaLeu151015LeuGluGluAlaGlnIleGlnGlnGluLysAsnMetTyrGluLeuGln202530LysLeuAsn35<210>40<211>35<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>40TrpGluArgLysValAspPheLeuGluGluAsnIleThrAlaLeuLeu151015GluGluAlaGlnIleGlnGlnGluLysAsnMetTyrGluLeuGlnLys202530LeuAsnSer35<210>41<211>35<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>41GluArgLysValAspPheLeuGluGluAsnIleThrAlaLeuLeuGlu151015GluAlaGlnIleGlnGlnGluLysAsnMetTyrGluLeuGlnLysLeu202530AsnSerTrp35<210>42<211>35<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>42ArgLysValAspPheLeuGluGluAsnIleThrAlaLeuLeuGluGlu151015AlaGlnIleGlnGlnGluLysAsnMetTyrGluLeuGlnLysLeuAsn202530SerTrpAsp35<210>43<211>35<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>43LysValAspPheLeuGluGluAsnIleThrAlaLeuLeuGluGluAla151015GlnIleGlnGlnGluLysAsnMetTyrGluLeuGlnLysLeuAsnSer202530TrpAspVal35<210>44<211>35<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>44ValAspPheLeuGluGluAsnIleThrAlaLeuLeuGluGluAlaGln151015IleGlnGlnGluLysAsnMetTyrGluLeuGlnLysLeuAsnSerTrp202530AspValPhe35<210>45<211>35<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>45AspPheLeuGluGluAsnIleThrAlaLeuLeuGluGluAlaGlnIle151015GlnGlnGluLysAsnMetTyrGluLeuGlnLysLeuAsnSerTrpAsp202530ValPheGly35<210>46<211>35<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>46PheLeuGluGluAsnIleThrAlaLeuLeuGluGluAlaGlnIleGln151015GlnGluLysAsnMetTyrGluLeuGlnLysLeuAsnSerTrpAspVal202530PheGlyAsn35<210>47<211>8<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>47TrpAlaSerLeuTrpAsnTrpPhe15<210>48<211>34<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>48TrpMetGluTrpAspArgGluIleAsnAsnTyrThrLysLeuIleHis151015SerLeuIleGluGluSerGlnAsnGlnGlnGluLysAsnGluGlnGlu202530LeuLeu<210>49<211>34<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>49TrpMetGluTrpAspArgGluIleAsnLysTyrThrSerLeuIleHis151015SerLeuIleGluGluSerGlnAsnGlnGlnGluLysAsnGluGlnGlu202530LeuLeu<210>50<211>34<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>50TrpMetGluTrpAspArgGluIleLysAsnTyrThrSerLeuIleHis151015SerLeuIleGluGluSerGlnAsnGlnGlnGluLysAsnGluGlnGlu202530LeuLeu<210>51<211>37<212>PRT<213>Artificialsequence<220><221>source<223>/note＝″DescriptionofartificialsequenceSyntheticpeptide″<400>51TyrThrSerLeuIleHisSerLeuIleGluGluSerGlnAsnGlnGln151015GluLysAsnGluGlnGluLeuLeuGluLeuAspLysTrpAlaSerLeu202530TrpAsnTrpPheLys3權(quán)利要求1.一種修飾的抗融合肽或其結(jié)合物，其中所述肽被修飾，使其與修飾前的肽相比，在pH范圍大約5到8的水性溶液中具有增加的溶解度，其中所述修飾的肽具有下列性質(zhì)a)在水性溶液中大約10到180mg/ml的濃度范圍下，顯示出低于大約10％的沉淀；b)與修飾前的肽相比，具有高至少大約2.5倍的溶度極限；以及c)在水性溶液中具有至少大約20mg/ml的溶度極限。2.權(quán)利要求1的修飾的抗融合肽或其結(jié)合物，其中所述修飾的肽含有一個或多個在生理pH下帶電或不帶電的極性部分。3.權(quán)利要求2的修飾的抗融合肽或其結(jié)合物，其中所述修飾的肽的一個或多個極性部分含有一個或多個在20種天然存在的氨基酸中沒有發(fā)現(xiàn)的極性或中性側(cè)鏈。4.權(quán)利要求3的修飾的抗融合肽或其結(jié)合物，其中所述修飾的肽的一個或多個極性部分含有一個或多個半胱磺酸。5.權(quán)利要求1或4的修飾的抗融合肽或其結(jié)合物，所述修飾的肽的一個或多個半胱磺酸被加到修飾的抗融合肽的N-末端或C-末端。6.權(quán)利要求3的修飾的抗融合肽或其結(jié)合物，其中所述修飾的肽的一個或多個極性部分基本上不影響肽的二級或三級結(jié)構(gòu)。7.權(quán)利要求1或4的修飾的抗融合肽或其結(jié)合物，其中所述修飾的肽含有g(shù)p41的卷曲螺旋腔結(jié)合殘基的至少一部分。8.權(quán)利要求7的修飾的抗融合肽或其結(jié)合物，其中所述修飾的肽含有來自氨基酸628WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL661(SEQIDNO2)的C34的氨基酸序列，或?qū)ζ渥疃鄡蓚€氨基酸取代、插入或缺失。9.權(quán)利要求7的修飾的抗融合肽或其結(jié)合物，其中所述修飾的肽含有DP107和DP178的氨基酸序列，或?qū)ζ渥疃鄡蓚€氨基酸取代、插入或缺失。10.權(quán)利要求7的修飾的抗融合肽或其結(jié)合物，還含有一個或多個化學反應性部分，使得所述修飾的肽能夠與血液成分或載體蛋白上的可用官能團反應，形成結(jié)合物的穩(wěn)定共價鍵。11.權(quán)利要求10的修飾的抗融合肽或其結(jié)合物，其中反應性部分是含有馬來酰亞胺的基團。12.權(quán)利要求10的修飾的抗融合肽或其結(jié)合物，還含有一個或多個接頭，選自(2-氨基)乙氧基乙酸(AEA)，[2-(2-氨基)乙氧基)]乙氧基乙酸(AEEA)，乙二胺(EDA)；一個或多個烷基鏈(C1-C10)，例如8-氨基辛酸(AOA)，8-氨基丙酸(APA)和4-氨基苯甲酸(AphA)。13.權(quán)利要求10的修飾的抗融合肽或其結(jié)合物，其中帶有或不帶接頭的反應性部分添加到所述修飾的肽的C-末端，和一個或多個極性部分添加到所述修飾的抗融合肽的N-末端。14.權(quán)利要求10的修飾的抗融合肽或其結(jié)合物，其中帶有或不帶接頭的反應性部分添加到所述修飾的肽的N-末端，和一個或多個極性部分添加到所述修飾的抗融合肽的C-末端。15.權(quán)利要求10的修飾的抗融合肽或其結(jié)合物，其中血液成分或載體蛋白是白蛋白。16.權(quán)利要求15的修飾的抗融合肽或其結(jié)合物，其中白蛋白是重組的。17.權(quán)利要求16的修飾的抗融合肽或其結(jié)合物，其中白蛋白是共價連接的。18.一種修飾的抗融合肽或其結(jié)合物，具有下列構(gòu)型[(半胱磺酸)-修飾的肽-接頭n-反應性基團]；或[反應性基團-接頭n-修飾的肽-(半胱磺酸)]，其中反應性基團是使用或不使用接頭，與人血清白蛋白共價連接的含有馬來酰亞胺的基團；n可以是0、1、2、3、4或更多個接頭，選自(2-氨基)乙氧基乙酸(AEA)，[2-(2-氨基)乙氧基)]乙氧基乙酸(AEEA)，乙二胺(EDA)；一個或多個烷基鏈(C1-C10)，例如8-氨基辛酸(AOA)，8-氨基丙酸(APA)和4-氨基苯甲酸(AphA)；并且所述修飾的肽含有來自氨基酸628WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL661(SEQIDNO2)的C34的氨基酸序列，或?qū)ζ渥疃鄡蓚€氨基酸取代或添加。19.一種修飾的抗融合肽或其結(jié)合物，由下式表示(I)(R1)m-X-(R2)n其中在式(I)中，m與n的和至少為1，且m和n各為0或大于0的整數(shù)；X含有C34、DP107、DP178的氨基酸序列，或其類似物；R1存在而R2不存在時，R1存在于X基團的N-末端；和當R1不存在而R2存在時，R2存在于X基團的C-末端。20.權(quán)利要求19的修飾的抗融合肽或其結(jié)合物，其中R1和R2各自獨立地選自下式(II)表示的化合物其中式(II)的核心結(jié)構(gòu)與氨基酸相似，并包含氨基、α碳和羧基；并且其中式(II)的R3基團包括磺?；?HS＝(O)2)、亞砜基(HS＝O)、磺酸基(HO-S＝(O)2)、鹵代烷基、仲胺、叔胺、羥基，或其它極性或甚至中性并能夠增加肽衍生物在水性溶液中的總體溶解度的側(cè)鏈基團。21.權(quán)利要求20的修飾的抗融合肽或其結(jié)合物，其中R1和R2基團基本上不影響肽的總體二級或三級結(jié)構(gòu)。由于基本上不影響所述肽結(jié)合物的二級結(jié)構(gòu)，肽結(jié)合物的總體活性將不會顯著低于未衍生的肽。22.修飾的抗融合肽，具有選自下列的結(jié)構(gòu)CA化合物I(半胱磺酸(CA)與C34直接相連；在本文中也被稱為CA-C34(SEQIDNO3))，CA化合物II(半胱磺酸(CA)與在28位的天然賴氨酸(Lys28)被精氨酸取代的C34直接相連；在本文中也被稱為CA-C34(Arg28)(SEQIDNO4))，CA化合物III(半胱磺酸(CA)與在35位具有附加的賴氨酸殘基(Lys35)的C34直接相連，其中賴氨酸的ε-NH2基團通過接頭(AEEA-MPA)與反應性基團相連；在本文中也被稱為CA-C34-Lys35(ε-AEEA-MPA)(SEQIDNO5))，以及CA化合物IV(半胱磺酸(CA)與在28位的天然賴氨酸(Lys28)被精氨酸取代；在35位具有附加的賴氨酸殘基(Lys35)，其中賴氨酸的εNH2基團通過接頭(AEEA-MPA)與反應性基團相連的C34直接相連；在本文中也被稱為CA-C34(Arg28)-Lys35(ε-AEEA-MPA)(SEQIDNO6))，23.一種結(jié)合物，其含有權(quán)利要求1、4、18、19或22任一項的修飾的抗融合肽。24.一種結(jié)合物，其含有權(quán)利要求8的修飾的抗融合肽，所述修飾的抗融合肽，使用或不使用接頭，與白蛋白上的一個或多個氨基、羥基或巰基結(jié)合，形成穩(wěn)定的共價鍵。25.一種結(jié)合物，其含有權(quán)利要求10的修飾的抗融合肽，所述修飾的抗融合肽，使用或不使用接頭，與白蛋白上的一個或多個氨基、羥基或巰基結(jié)合，形成穩(wěn)定的共價鍵。26.一種結(jié)合物，其含有權(quán)利要求11的修飾的抗融合肽，所述修飾的抗融合肽，使用或不使用接頭，與白蛋白上的一個或多個氨基、羥基或巰基結(jié)合，形成穩(wěn)定的共價鍵。27.一種結(jié)合物，其含有權(quán)利要求12的修飾的抗融合肽，所述修飾的抗融合肽，使用或不使用接頭，與白蛋白上的一個或多個氨基、羥基或巰基結(jié)合，形成穩(wěn)定的共價鍵。28.一種結(jié)合物，其含有權(quán)利要求13的修飾的抗融合肽，所述修飾的抗融合肽，使用或不使用接頭，與白蛋白上的一個或多個氨基、羥基或巰基結(jié)合，形成穩(wěn)定的共價鍵。29.一種結(jié)合物，其含有權(quán)利要求15的修飾的抗融合肽，所述修飾的抗融合肽，使用或不使用接頭，與白蛋白上的一個或多個氨基、羥基或巰基結(jié)合，形成穩(wěn)定的共價鍵。30.一種結(jié)合物，其含有權(quán)利要求22的修飾的抗融合肽，所述修飾的抗融合肽，使用或不使用接頭，與白蛋白上的一個或多個氨基、羥基或巰基結(jié)合，形成穩(wěn)定的共價鍵。31.一種藥物組合物，其含有權(quán)利要求8的修飾的抗融合肽或其結(jié)合物以及適合于皮下、靜脈內(nèi)或肺部給藥的可藥用載體。32.一種藥物組合物，其含有權(quán)利要求22的修飾的抗融合肽或其結(jié)合物以及適合于皮下、靜脈內(nèi)或肺部給藥的可藥用載體。33.一種藥物組合物，其含有權(quán)利要求23的結(jié)合物以及適合于皮下、靜脈內(nèi)或肺部給藥的可藥用載體。34.一種藥物組合物，其含有權(quán)利要求24的結(jié)合物以及適合于皮下、靜脈內(nèi)或肺部給藥的可藥用載體。35.用于在對象中治療或預防病毒的方法，所述病毒選自人類免疫缺陷病毒(HIV)感染、呼吸道合胞病毒(RSV)、3型人類副流感病毒(HPIV-3)、麻疹病毒(MeV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，包括向帶病毒、或處于帶病毒風險的對象施用權(quán)利要求8的修飾的抗融合肽或其結(jié)合物，從而治療或預防感染。36.用于在對象中治療或預防病毒的方法，所述病毒選自人類免疫缺陷病毒(HIV)感染、呼吸道合胞病毒(RSV)、3型人類副流感病毒(HPIV-3)、麻疹病毒(MeV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，包括向帶病毒、或處于帶病毒風險的對象施用權(quán)利要求22的修飾的抗融合肽或其結(jié)合物，從而治療或預防感染。37.用于在對象中治療或預防病毒的方法，所述病毒選自人類免疫缺陷病毒(HIV)感染、呼吸道合胞病毒(RSV)、3型人類副流感病毒(HPIV-3)、麻疹病毒(MeV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，包括向帶病毒、或處于帶病毒風險的對象施用權(quán)利要求23的結(jié)合物，從而治療或預防感染。38.用于在對象中治療或預防病毒的方法，所述病毒選自人類免疫缺陷病毒(HIV)感染、呼吸道合胞病毒(RSV)、3型人類副流感病毒(HPIV-3)、麻疹病毒(MeV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，包括向帶病毒、或處于帶病毒風險的對象施用權(quán)利要求24的結(jié)合物，從而治療或預防感染。39.在對象中抑制人類免疫缺陷病毒(HIV)感染、呼吸道合胞病毒(RSV)、3型人類副流感病毒(HPIV-3)、麻疹病毒(MeV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的一種或多種活性的方法，包括給需要治療的對象施用有效量的權(quán)利要求8的修飾的抗融合肽或其結(jié)合物。40.在對象中抑制人類免疫缺陷病毒(HIV)感染、呼吸道合胞病毒(RSV)、3型人類副流感病毒(HPIV-3)、麻疹病毒(MeV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的一種或多種活性的方法，包括給需要治療的對象施用有效量的權(quán)利要求22的修飾的抗融合肽或其結(jié)合物。41.用于提高抗融合肽的大規(guī)模制備的方法，包括提供權(quán)利要求8的修飾的抗融合肽；以及制備修飾的肽的濃度為至少100mg/ml的修飾的肽溶液。全文摘要本發(fā)明涉及水溶解度改善的C34肽衍生物，它們是病毒感染的抑制劑和/或表現(xiàn)出抗融合性質(zhì)。具體來說，本發(fā)明涉及對人類免疫缺陷病毒(HIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、人類副流感病毒(HPV)、麻疹病毒(MeV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)具有抑制活性的C34衍生物，治療相應病毒感染的作用持續(xù)時間長。文檔編號C07K14/16GK101687911SQ200880022163公開日2010年3月31日申請日期2008年5月16日優(yōu)先權(quán)日2007年5月16日發(fā)明者奧馬·庫雷希,馬丁·羅比塔耶,多米尼克·P·布賴頓申請人:康久化學生物技術(shù)公司