專利名稱：用于檢測恰菲埃里希氏體(vlpt)的方法和組合物的制作方法
用于檢測恰菲埃里希氏體(VLPT)的方法和組合物優(yōu)先權本申請要求2007年9月21日提交的U. S. Ser. No. 60/974, 196的權益，通過完全 引用將其合并在此。
背景技術：
埃里希氏體屬是感染哺乳動物宿主中的循環(huán)淋巴細胞的專性細胞內(nèi)的病原體。犬 埃里希氏體(Ehrlichia canis)和恰菲埃里希氏體(Ehrlichia chaffeensis)是感染犬和 人類的同一亞屬組的成員，可以各自分別引起犬單核細胞埃里希氏體病(CME)和人類單核 細胞埃里希氏體病(HME)。犬疾病的特征在于發(fā)燒、淋巴結(jié)病、體重損失和全血細胞減少。 在人類中，疾病的特征在于發(fā)燒、頭痛、mylagia和白血球減少。早期檢測和治療對于治療 犬和人類埃里希氏體病都是重要的。間接的免疫熒光分析(IFA)和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)經(jīng)常用作這些疾病的診 斷中的輔助。這些分析測量或檢測來自患者的血液、血漿或血清的抗埃里希氏體屬抗體與 受感染細胞、細胞溶胞產(chǎn)物或純化的埃里希氏體屬蛋白質(zhì)的結(jié)合。然而，用于檢測抗恰菲埃 里希氏體抗體或其片段的許多分析在有用性方面是嚴重受限的，因為直接與這些測試中使 用的埃里希氏體屬抗原的不純性質(zhì)相關的敏感性和特異性問題。另外，對犬埃里希氏體接 種的動物由于免疫交叉反應在測試恰菲埃里希氏體時顯示陽性結(jié)果。需要高度純化的、特 異性的試劑來構建更精確的分析。發(fā)明概述本發(fā)明的一個實施方式提供了包含SEQ ID NO 3的純化的多肽，其中所述多肽由 少于約50個連續(xù)的天然存在的恰菲埃里希氏體氨基酸組成；包含SEQ ID NO :2的純化的多 肽，其中所述多肽由少于約50個連續(xù)的天然存在的恰菲埃里希氏體氨基酸組成；包含SEQ IDNO 1的純化的多肽，其中所述多肽由少于約50個連續(xù)的天然存在的恰菲埃里希氏體氨 基酸組成。所述純化的多肽可以由SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :2或SEQ ID N0:1組成。本 發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明的純化的多肽的分離的多核苷酸。本發(fā)明的純化的多肽可以連接到指示物試劑、氨基酸間隔區(qū)、氨基酸接頭、信號序 列、終止轉(zhuǎn)移序列、跨膜結(jié)構域、蛋白質(zhì)純化配體、異源多肽、包含SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6 的一個或更多個另外的多肽，或其組合。本發(fā)明的純化的多肽可以在多肽的氨基末端或羧 基末端或兩個末端包含一個或更多個C氨基酸殘基。本發(fā)明的另一個實施方式提供了檢測特異性結(jié)合測試樣品中的恰菲埃里希氏體 多肽的抗體的方法。所述方法包括在容許多肽/抗體復合物形成的條件下使包含SEQ ID NO :1、2、3、5或6的純化的多肽與所述測試樣品接觸；其中所述純化的多肽由少于約50個 連續(xù)的天然存在的恰菲埃里希氏體氨基酸組成；和檢測所述多肽/抗體復合物。所述多肽/ 抗體復合物的檢出是所述測試樣品中存在特異于恰菲埃里希氏體的抗體的指示，沒有所述 多肽/抗體復合物是所述測試樣品中不存在特異于恰菲埃里希氏體的抗體的指示。所述復 合物可以在進行檢測步驟之前接觸指示物試劑。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述純化的 多肽是SEQ ID NO :1-3、5或6，所述方法不檢測特異性結(jié)合犬埃里希氏體多肽的抗體?？梢詼y定測試樣品中抗體的量。純化的多肽可以附著到基質(zhì)上。純化的多肽可以連接到指示物 試劑、氨基酸間隔區(qū)、氨基酸接頭、信號序列、終止轉(zhuǎn)移序列、跨膜結(jié)構域、蛋白質(zhì)純化配體、 異源蛋白質(zhì)、包含SEQ ID N0:l、2、3、4、5或6的一個或更多個另外的多肽，或其組合。本發(fā)明的再另一個實施方式提供了檢測受試者中恰菲埃里希氏體感染的方法。所 述方法包括從所述受試者獲得生物樣品；在容許多肽/抗體復合物形成的條件下使包含 SEQ ID NO :1、2、3、5或6的純化的多肽與所述生物樣品接觸；其中所述純化的多肽由少于 約50個連續(xù)的天然存在的恰菲埃里希氏體氨基酸組成；和檢測所述多肽/抗體復合物。所 述多肽/抗體復合物的檢出是所述受試者具有恰菲埃里希氏體感染的指示，沒有所述多肽 /抗體復合物是所述受試者沒有恰菲埃里希氏體感染的指示。在本發(fā)明的一個實施方式中， 所述純化的多肽是SEQ ID N0:l、2、3、5或6，所述方法不檢測所述受試者中的犬埃里希氏 體感染。本發(fā)明的另一個實施方式提供了特異性結(jié)合由SEQ ID N0:l、2、3、5或6組成的多 肽的抗體。所述抗體可以是單克隆抗體、多克隆抗體、抗原結(jié)合抗體片段或單鏈抗體。本發(fā)明的又一個實施方式提供了檢測樣品中的恰菲埃里希氏體多肽的方法。所述 方法包括在容許多肽/抗體復合物形成的條件下使特異性結(jié)合由SEQ ID N0:l、2、3、5或6 組成的多肽的抗體與樣品接觸；和檢測所述多肽/抗體復合物。所述多肽/抗體復合物的 檢出是恰菲埃里希氏體多肽存在于所述樣品中的指示，沒有所述多肽/抗體復合物是恰菲 埃里希氏體多肽不存在于所述樣品中的指示。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述純化的多 肽可以是SEQ ID NO :1、2、3、5或6，所述方法不檢測所述樣品中的埃里希氏體屬多肽。所 述抗體可以是單克隆抗體、多克隆抗體、抗原結(jié)合抗體片段或單鏈抗體。所述抗體可以附著 到基質(zhì)上。因而，本發(fā)明提供了用于恰菲埃里希氏體的檢測的組合物和方法。附圖
的簡要描述附圖IA和IB顯示了實驗上用恰菲埃里希氏體感染的狗的血清分析的結(jié)果。 VLPT-I (SEQ ID NO :5)(在附圖中顯示為“肽”)和VLPT-R(SEQ ID NO :4，其中在位置112 的X是P)(在附圖中顯示為“r-蛋白質(zhì)”)不遲于感染后第7天都能夠檢測恰菲埃里希氏 體抗體。發(fā)明的詳細說明恰菲埃里希氏體多肽如在此使用的，單數(shù)形式“一”、和“該”包括復數(shù)的對象，除非上下文中明確地另外 指示。多肽是通過酰胺鍵共價連接的兩個或更多個氨基酸的聚合物。多肽可以被翻譯后 修飾。純化的多肽是基本上沒有細胞材料、其他類型的多肽、化學物質(zhì)前體、多肽的合成中 使用的化學物質(zhì)、或其組合的多肽制品?；旧蠜]有細胞材料、培養(yǎng)基、化學物質(zhì)前體、用于 多肽合成的化學物質(zhì)等的多肽制品具有低于約30%、20%、10%、5%、1%或更低的其他多 肽、培養(yǎng)基、化學物質(zhì)前體和/或用于合成的其他化學物質(zhì)。因而，純化的多肽是大約70%、 80%、90%、95%、99%或更純的。純化的多肽不包括低于70%純度的未純化的或半純化的 細胞提取物或多肽的混合物。術語“多肽”可以指一個或更多個一種類型的多肽(一組多肽)?！岸嚯摹边€可以指兩種或更多種不同類型多肽的混合物(多肽的混合物)。術語“多肽(單數(shù)或復數(shù))”也 可以各自指“一種或更多種多肽”。本發(fā)明的一個實施方式提供了如SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 6中所示的純化的恰菲埃里希氏體多肽。XSDLHXXXXVELXXPSKEEVQXEXDXXXXXX SEQ ID NO 1DSDLHGXFSVELFDPSKEEVQLESDLQQSSN SEQ IDNO 2NSDLHEXSFVELPGPSKEEVQFEDDAKNVVY SEQ ID NO 3對于所有序列，X代表任何氨基酸。在本發(fā)明的一個實施方式中，在SEQ ID NO=I 中，位置1的X是D或N，位置6的X是G或E、位置7的X是P或S、位置8的X是F或S、 位置9的X是S或F、位置13的X是F或P、位置14的X是D或G、位置22的X是L或F、位 置24的X是S或D、位置26的X是L或A、位置27的X是Q或K、位置28的X是Q或N、位 置29的X是S或V、位置30的X是S或V、位置31的X是N或Y。對于SEQ ID NO 2和3， 位置7的X可以是P或S。SEQ ID NO: 1-3的每一個可以具有N-末端C殘基。做為選擇， N-末端C殘基可以是沒有的。多肽VLPT-I是具有氨基末端C殘基的SEQ ID N0:2(S卩，C DSDLHGPFSVELFDPSKEEVQLESDLQQSSN ； SEQ ID NO :5)。多肽 VLPT-2 是具有氨基末端 C 殘基 的 SEQ ID NO :3(即，CNSDLHESSFVELPGPSKEEVQFEDDAKNVVY ；SEQ ID NO 6)。本發(fā)明的另一個實施方式包含純化的多肽，所述多肽包含SEQ IDNO 4 MSQFSEDNIG NIQMPFSNLQ ESSHLELPSL SEKVIHLESG LQQSSDSDSH EPSHLELPSL 60SEEVIQLESD LQQSSNSDLH GSFSVELFDP FKEAVQLGND LQQSSDSDLH GXFSVELFDP 120SKEEVQLESD LQQSSNSDLH ESSFVELPGP SKEEVQFEDD AKNVVYGQDH VSLSELG 177位置112的X可以是P或S。一個實施方式提供了包含SEQ ID NO :1_6的純化的多肽，其中所述多肽由低于約 175、150、125、100、90、80、70、60、50、40、35、34、33、32 或 31 個(或約 31 和約 175 之間的任 何范圍)連續(xù)的天然存在的恰菲埃里希氏體氨基酸組成。在本發(fā)明的一個實施方式中，純 化的多肽由超過約 31、32、33、34、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150 或 175 個(或約 31 和約175之間的任何范圍)連續(xù)的天然存在的恰菲埃里希氏體氨基酸組成(即，所述純化 的多肽不包含完整的天然存在的恰菲埃里希氏體VLPT多肽)。天然存在的恰菲埃里希氏 體氨基酸是由恰菲埃里希氏體生物體天然地產(chǎn)生的任何多肽。也就是說，純化的多肽包含 SEQ ID NO 1-6 中顯示的多肽，但是由少于約 175、150、125、100、90、80、70、60、50、40 或 35 個連續(xù)的天然存在的恰菲埃里希氏體氨基酸組成。多肽SEQ ID NO :1_3和5_6小于全長恰菲埃里希氏體多肽VPLT的事實是重要的， 因為更小的多肽可以具有比全長多肽分析的更大的特異性和/或敏感性。另外，這些更小 的多肽可能是制造上更便宜的，可以以比全長多肽更大的純度獲得。本發(fā)明的一個實施方式提供了少于約175、150、125、100、90、80、70、60、50、40或 35個連續(xù)的天然恰菲埃里希氏體氨基酸和SEQID NO :1_6的大于約10、20、25或30個連續(xù) 氨基酸的純化的多肽。本發(fā)明的一個實施方式提供了包含SEQ ID NO :1_6的至少約10、20、25、30、35、 40、50或更多個連續(xù)的氨基酸的純化的多肽。因而，本發(fā)明的多肽的長度可以是，例如，約35到約40 ；約35到約50 ；約35到約100 ；或約35到約150個氨基酸。在本發(fā)明的一個實 施方式中，所述多肽包含SEQ ID NO :4的約氨基酸殘基120到約氨基酸殘基177 ;SEQ ID NO 4的約氨基酸殘基130到約氨基酸殘基170 ；或SEQ ID NO 4的約氨基酸殘基135到約 168。變體多肽至少約80%、或約 81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、 96、97、98約或99%相同于SEQ ID NO :1_6中所示的多肽序列，并且也是本發(fā)明的多肽。例 如，SEQ ID NO 1-3的變體多肽可以是約至少97% (約1個氨基酸變化)、94% (約2個氨 基酸變化)、90% (約3個氨基酸變化)、87% (約4個氨基酸變化)、84% (約5個氨基酸 變化)或81% (約6個氨基酸變化)相同于SEQ ID N0:l-3。SEQ ID NO :5_6的變體多肽 可以是約至少97% (約1個氨基酸變化)、94% (約2個氨基酸變化)、91% (約3個氨基 酸變化)、88% (約4個氨基酸變化)、84% (約5個氨基酸變化)或81 % (約6個氨基酸 變化)相同于SEQ ID N0:5-6。變體多肽具有一個或更多個保守的氨基酸變異或其他較小 的修飾，并保持了生物學活性，即，是生物學功能等效物。生物學活性等效物當與相應的野 生型多肽比較時，具有基本上相等的功能。在本發(fā)明的一個實施方式中，多肽具有約1、2、3、 4、5、10、20、30、40、50個或更少的保守性氨基酸替換。序列同一性百分比具有本領域公認的含義，存在著許多方法來測量兩個多肽或多 核苷酸序列之間的同一'性。參見,例如 Lesk，Ed.，Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988) ；Smith, Ed. , Biocomputing Informatics And Genome Projects, Academic Press, New York, (1993) ；Griffin & Griffin, Eds., ComputerAnalysis Of Sequence Data, Part I, Humana Press, New Jersey, (1994)； von Heinje, Sequence Analysis In Molecular Biology, Academic Press, (1987)；禾口 Gribskov & Devereux, Eds., Sequence Analysis Primer, MStockton Press, New York, (1991)。比對多核苷酸或多肽的方法被編碼在計算機程序中，包括GCG程序包(Devereux et al. ,Nuc. Acids Res. 12 :387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul et al,J. Molec. Biol. 215 403 (1990))禾口 Bestfit 禾呈序(Wisconsin Sequence AnalysisPackage, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, UniversityResearch Park,575 Science Drive, Madison, WI 53711)其使用了 Smith 和 Waterman 的局部同源性算法(Adv. App. Math，2 482-489(1981))。例如，可以使用采用了 FASTA算法的計算機程序ALIGN，使用缺口開放罰 分-12和缺口延伸罰分-2的仿射(affine)缺口搜索。當利用任何序列比對程序來確定特定的序列是否例如約95%相同于參考序列時， 設置參數(shù)從而同一性的百分比在參考多核苷酸的全長上計算，以及在同一性方面容許最多 5%的參考多核苷酸的核苷酸總數(shù)的缺口。變體多肽一般通過修飾本發(fā)明的多肽序列之一、評估修飾的多肽的性質(zhì)來確定它 是否是生物學等效的來鑒定。如果變體在分析例如免疫組織化學分析、酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫酶分析或Western印跡分析中與本發(fā)明的多肽基本上 相同地起作用，例如，具有原始多肽的90-110%的活性，變體是生物學等效的。在一個實施 方式中，分析是競爭分析，其中該生物學等效的多肽能夠降低本發(fā)明的多肽與相應的反應 性抗原或抗體的結(jié)合約80、95、99或100%。特異性結(jié)合相應的野生型多肽的抗體也特異性 結(jié)合變體多肽。
保守性替換是其中氨基酸替換具有相似性質(zhì)的另一個氨基酸的替換，從而肽化學 領域的技術人員將預計多肽的二級結(jié)構和親水性質(zhì)基本上不變。一般地，以下組的氨基酸 代表了 呆守白勺改變(l)ala, pro, gly, glu, asp, gin, asn, ser, thr ； (2) cys, ser, tyr, thr ； (3) val, ile, leu, met, ala, phe ； (4) lys, arg, his ；禾口(5)phe, tyr, trp, his。本發(fā)明的多肽可以進一步包含信號(或前導區(qū))序列，其在翻譯同時地或翻譯后 地指導蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移。多肽還可以包含便于多肽的合成、純化或鑒定(例如，聚-His)、或增 強多肽與固相支持物的結(jié)合的接頭或其他序列。例如，多肽可以綴合到免疫球蛋白Fc區(qū)域 或牛血清白蛋白。多肽可以共價地或非共價地連接到氨基酸序列，所述氨基酸序列是所述多肽在自 然中通常不相關的，即，異源氨基酸序列。異源氨基酸序列可以來自非恰菲埃里希氏體生物 體、合成的序列或通常不位于本發(fā)明的多肽的羧基或氨基末端的恰菲埃里希氏體序列。另 外，多肽可以共價地或非共價地連接到氨基酸以外的化合物或分子，例如指示物試劑。多 肽可以共價地或非共價地連接到氨基酸間隔區(qū)、氨基酸接頭、信號序列、終止轉(zhuǎn)移序列、跨 膜結(jié)構域、蛋白質(zhì)純化配體或其組合。多肽可以連接到增強免疫反應(例如，細胞因子，如 IL-2)的部分(即，可以是多肽或其他化合物的官能團)、便于純化的部分(例如，親和標 簽，如六-組氨酸標簽、trpE、谷胱甘肽、麥芽糖結(jié)合蛋白)或促進多肽的穩(wěn)定性的部分(例 如，聚乙二醇；氨基末端保護基團例如乙酰基、丙基、琥珀?；?、苯甲基、苯甲氧羰基或t-丁 氧基羰基；羧基末端保護基團，例如，酰胺、甲酰胺和乙酰胺)。在本發(fā)明的一個實施方式 中，蛋白質(zhì)純化配體可以是處在例如本發(fā)明的多肽的氨基末端或羧基末端或兩個末端的一 個或更多個C氨基酸殘基。氨基酸間隔區(qū)是在自然中與本發(fā)明的多肽不相關的氨基酸序 列。氨基酸間隔區(qū)可以包含約1、5、10、20、100或1000個氨基酸。如果希望，本發(fā)明的多肽可以是融合蛋白的部分，所述融合蛋白含有其他氨基酸 序列，例如，氨基酸接頭、氨基酸間隔區(qū)、信號序列、TMR終止轉(zhuǎn)移序列、跨膜結(jié)構域，以及在 蛋白質(zhì)純化中有用的配體，例如，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、組氨酸標簽和葡萄球菌屬蛋白A。本 發(fā)明的超過一種多肽可以存在于本發(fā)明的融合蛋白中。本發(fā)明的多肽可以可操作連接非恰 菲埃里希氏體蛋白質(zhì)或非恰菲埃里希氏體VLPT蛋白質(zhì)來形成融合蛋白。本發(fā)明的融合蛋 白可以包含本發(fā)明的一個或更多個恰菲埃里希氏體多肽、其片段或其組合。融合蛋白不在 自然中存在。術語“可操作連接的”是指本發(fā)明的多肽和其他多肽按閱讀框相互融合到本 發(fā)明的多肽的N-末端或C-末端。本發(fā)明的多肽可以處于多聚的形式。也就是說，多肽可以包含本發(fā)明的恰菲埃里 希氏體多肽的一個或更多個拷貝或其組合。多聚的多肽可以是多抗原肽(MAP)。參見，例如 Tam, J. Immunol. Methods,196 17-32(1996)。本發(fā)明的多肽可以包含被特異于恰菲埃里希氏體的抗體識別的抗原?？乖梢园?含一個或更多個表位(即，抗原決定簇)。表位可以是線性表位、連續(xù)表位或構象表位。本 發(fā)明的多肽內(nèi)的表位可以通過幾種方法鑒定。參見，例如，美國專利4，554，101 Jameson & Wolf, CABI0S4 :181-186(1988)。例如，本發(fā)明的多肽可以被分離和篩選。組合在一起跨越 整個多肽序列的一系列短肽可以通過蛋白水解裂解來制備。從例如30-mer多肽片段(或 更小的片段)開始，每個片段可以在ELISA中測試被識別的表位的存在。例如，在ELISA分 析中，恰菲埃里希氏體多肽，例如30-mer多肽片段，附著到固相支持物，例如，塑料多孔平板的反應孔上?？贵w的群體被標記、添加到固相支持物上，容許在非特異性吸附被阻斷的條 件下結(jié)合于未標記的抗原，任何未結(jié)合的抗體和其他蛋白質(zhì)被洗去。通過例如將無色底物 轉(zhuǎn)化成有色的反應產(chǎn)物的反應來檢測抗體結(jié)合。然后從鑒定的30-mer測試逐漸更小的和 重疊的片段來對感興趣的表位作圖。本發(fā)明的多肽可以重組地產(chǎn)生。編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸可以導入到重組表 達載體中，其可以利用本領域公知的技術在適合的表達宿主細胞系統(tǒng)中表達。各種細菌、酵 母、植物、哺乳動物和昆蟲表達系統(tǒng)是本領域可獲得的，可以使用任何這樣的表達系統(tǒng)。任 選的，編碼多肽的多核苷酸可以在無細胞翻譯系統(tǒng)中翻譯。多肽還可以化學地合成或從恰 菲埃里希氏體細胞獲得。本發(fā)明的免疫原性多肽可以包含SEQ ID NO :1_6中所示的氨基酸序列或其片段。 免疫原性多肽可以引發(fā)抗體或其他免疫反應(例如，免疫系統(tǒng)的T細胞反應)，其識別具有 SEQ ID N0:l-6的多肽的表位。本發(fā)明的免疫原性多肽還可以是具有SEQ ID N0:l_6所示 氨基酸序列的多肽的片段。本發(fā)明的免疫原性多肽片段長度可以是約6、10、15、20、25、30、 40、50、60、70、80、90、100、150、170(或6和170之間的任何范圍)或更多個氨基酸。本發(fā)明 的免疫原性多肽片段長度可以是約170、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、10、6或 更少的氨基酸(或170和6之間的任何范圍)。恰菲埃里希氏體多核苷酸本發(fā)明的多核苷酸含有少于完整的微生物基因組，可以是單鏈或雙鏈的核酸。多 核苷酸可以是RNA、DNA、cDNA、基因組DNA、化學合成的RNA或DNA或其組合。多核苷酸可以 純化的，沒有其他成分，例如，蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和其他多核苷酸。例如，多核苷酸可以是50%、 75%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%純的。處在例如cDNA或基因組文庫、或含 有基因組DNA限制性消化物的凝膠片中的、在數(shù)百到數(shù)百萬個其他核酸分子中存在的核酸 分子不被認為是分離的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸編碼上文描述的本發(fā)明的多肽。在本發(fā)明的一個實施方式中， VLPT多核苷酸編碼SEQ ID NO :1_6中所示的多肽或其片段。 本發(fā)明的多核苷酸可以由少于約530、500、400、300、250、200、150、100或90個 (或90和530之間的任何范圍)連續(xù)的、天然存在的恰菲埃里希氏體多核苷酸組成。本發(fā) 明的多核苷酸可以由大于約90、100、150、200、250、300、400、500、530個(或90和530之間 的任何范圍)或更多連續(xù)的、天然存在的恰菲埃里希氏體多核苷酸組成。純化的多核苷酸 可以包含其他異源的核苷酸(也就是說，不是來自恰菲埃里希氏體的核苷酸)和甚至其他 恰菲埃里希氏體氨基酸，只要它們不是與恰菲埃里希氏體VLPT多核苷酸鄰接地天然存在 的。本發(fā)明的多核苷酸可以包含其他核苷酸序列，例如，編碼接頭、信號序列、TMR終止轉(zhuǎn)移 序列、跨膜結(jié)構域或在蛋白質(zhì)純化中有用的配體，例如，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、組氨酸標簽 和葡萄球菌屬蛋白A的序列。本發(fā)明的一個實施方式提供了包含編碼SEQ ID N0:l-6的至 少約 6、10、15、20、25、30、40、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 個或更 多個連續(xù)核苷酸的純化的多核苷酸。 本發(fā)明的多核苷酸可以被分離。分離的多核苷酸是一種天然存在的多核苷酸，其 與與之天然相關的5'和3'側(cè)翼基因組序列之一或兩者不是直接鄰接的。分離的多核苷 酸可以是，例如，任何長度的重組DNA分子，條件是在天然存在的基因組中天然發(fā)現(xiàn)直接側(cè)翼于所述重組DNA分子的核酸序列被除去或不存在。分離的多核苷酸還包括非天然存在的 核酸分子。本發(fā)明的多核苷酸還可以包含編碼免疫原性多肽的片段。本發(fā)明的多核苷酸可以 編碼全長的多肽、多肽片段和變體或融合多肽。編碼本發(fā)明的多肽的簡并核苷酸序列，以及至少約80%、或約90%、96%、98%或 99%相同于本發(fā)明的多核苷酸序列的同源核苷酸序列以及其互補物也是本發(fā)明的多核苷 酸。序列同一性百分比可以如“多肽”部分所描述的計算。簡并核苷酸序列是編碼本發(fā)明 的多肽或其片段的多核苷酸，但是由于遺傳密碼的簡并性在核酸序列上不同于野生型多核 苷酸序列。編碼生物學功能性的恰菲埃里希氏體多肽的恰菲埃里希氏體多核苷酸的互補 DNA(cDNA)分子、物種同源物和變體也是恰菲埃里希氏體多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸可以分離自例如生物樣品，如來自感染個體的血液、血清、唾液 或組織中存在的核酸序列。多核苷酸還可以在實驗室中合成，例如，利用自動合成儀。擴增 方法例如PCR可以用于從編碼多肽的基因組DNA或cDNA擴增多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸可以包含天然存在的多肽的編碼序列，或可以編碼自然中不存 在的改變的序列。如果希望，多核苷酸可以克隆到包含表達控制元件的表達載體中，所述表 達控制元件包括例如復制起點、啟動子、增強子或驅(qū)動本發(fā)明的多核苷酸在宿主細胞中表 達的其他調(diào)控元件。表達載體可以是，例如，質(zhì)粒，如PBR 322、pUC或ColEl，或是腺病毒載 體，例如，2型腺病毒載體或5型載體。任選的，可以使用其他載體，包括但不限于，Sindbis 病毒、猿猴病毒40、甲病毒載體、痘病毒載體和巨細胞病毒以及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，例如，鼠肉 瘤病毒、小鼠乳瘤病毒、Moloney鼠白血病病毒和勞氏肉瘤病毒。也可以使用微型染色體例 如MC和MC1、噬菌體、噬菌粒、酵母人工染色體、細菌人工染色體、病毒顆粒、病毒樣粒子、粘 粒(其中插入了噬菌體lambda cos位點的質(zhì)粒)和復制子(能夠在它們自主控制下在細 胞中復制的遺傳元件)。制備與表達控制序列可操作連接的多核苷酸和在寄主細胞中表達它們的方法是 本領域公知的。參見，例如，U. S.專利號4，366，246。本發(fā)明的多核苷酸當位于一個或更多 個指導該多核苷酸的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的表達控制元件鄰近或附近時是可操作連接的。本發(fā)明的多核苷酸可以用作，例如，探針或引物，例如，PCR引物，來檢測測試樣品 如生物樣品中恰菲埃里希氏體多核苷酸的存在。探針是能夠例如通過雜交與目標核酸通常 以序列特異性的方式相互作用的分子。引物是探針的子集，其可以支持酶的操作，并且可以 與目標核酸雜交從而發(fā)生酶操作。引物可以從不干擾酶操作的、本領域可獲得的核苷酸或 核苷酸衍生物或類似物的任何組合制得。探針或引物可以是編碼SEQ ID NO :1_6中所示多肽的約10、15、20、25、30、40、50、 60、70、80、90、100或更多個連續(xù)的核苷酸。核酸的雜交是本領域公知的，并且在此討論。典型地，探針可以從本領域可獲得的 核苷酸或核苷酸衍生物或類似物的任何組合來制得。這樣的探針和引物與恰菲埃里希氏體 多核苷酸序列特異性雜交的能力將允許它們在檢測給定測試樣品中互補序列的存在中是 有用的。本發(fā)明的多核苷酸探針和引物可以與測試樣品例如生物樣品，包括唾液、痰、血液、 血漿、血清、尿、糞、腦脊髓液、羊水、傷口滲出液或組織中的互補序列雜交。來自樣品的多核 苷酸可以，例如，經(jīng)歷凝膠電泳或其他大小分離技術或可以被固定化而不大小分離。多核苷酸探針或引物可以被標記。適當?shù)臉擞浳镆约皹擞浱结樅鸵锏姆椒ㄊ潜绢I域已知的，包 括，例如，通過切口平移或通過激酶摻入的放射性標記物、生物素標記物、熒光標記物、化學 發(fā)光標記物、生物發(fā)光標記物、金屬螯合標記物和酶標記物。來自樣品的多核苷酸在適合的 嚴格度的雜交條件下與探針或引物接觸。取決于應用，改變雜交的條件可以用于實現(xiàn)探針或引物對目標序列的不同程度的 選擇性。對于需要高選擇性的應用，可以使用相對嚴格的條件，例如，低鹽和/或高溫條件， 例如，由約0. 02M到約0. 15M鹽的鹽濃度、在約50°C到約70°C的溫度下所提供的。對于需 要較低選擇性的應用，可以使用較低嚴格的雜交條件。例如，約0. 14M到約0. 9M鹽的鹽條 件、在約20°C到約55°C的溫度下。從測試樣品中包含探針或引物和互補的多核苷酸的雜交 復合物的存在表明該樣品中恰菲埃里希氏體多核苷酸的存在。Si^本發(fā)明的抗體是特異性結(jié)合本發(fā)明的恰菲埃里希氏體多肽、本發(fā)明的變體多肽或 其片段的抗體分子。本發(fā)明的抗體可特異于恰菲埃里希氏體多肽，例如，對SEQ ID NO 1-6 的一個或更多個有特異性的抗體。在本發(fā)明的另一個實施方式中，抗體特異于恰菲埃里希 氏體多肽，不特異于犬埃里希氏體多肽(例如，特異于SEQ ID N0:l-6的抗體)。本領域的 技術人員可以利用在此描述的分析容易地確定抗體是否特異于恰菲埃里希氏體多肽。本 發(fā)明的抗體可以是多克隆抗體、單克隆抗體、單鏈抗體(scFv)或抗體的抗原結(jié)合片段?？?體的抗原結(jié)合片段是完整抗體的一部分，其包含完整抗體的抗原結(jié)合位點或可變區(qū)，其中 所述部分沒有完整抗體的Fc區(qū)域的恒定重鏈結(jié)構域?？乖Y(jié)合抗體片段的實例包括Fab、 Fab' ,Fab' _SH、F(ab'片段。本發(fā)明的抗體可以是任何抗體種類，包括例如，IgG, IgM, IgA, IgD和IgE0抗 體或其片段結(jié)合本發(fā)明的多肽的表位?？贵w可以利用重組DNA技術在適合的實驗動物 體內(nèi)或在體外制備。制備和表征抗體的方法是本領域公知的。參見，例如Dean，Methods Mol. Biol.80 23-37 (1998) ；Dean, Methods Mol. Biol.32 361-79 (1994) ；Baileg, Methods Mol. Biol. 32 :381_88(1994) ；Gullick, Methods Mol. Biol. 32 :389_99(1994)； Drenckhahn et al. Methods Cell. Biol. 37 7~56 (1993) ；Morrison,Ann. Rev. Immunol. 10 239-65(1992) ；Wright et al. Crit. Rev. Immunol. 12 125-68 (1992) 例如，多克隆抗體可 以通過向動物，例如人或其他靈長類、小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、山羊、豬、狗、牛、綿羊、驢子或 馬施用本發(fā)明的多肽來產(chǎn)生。來自免疫的動物的血清被收集，通過例如用硫酸銨沉淀、隨后 通過層析，例如親和層析來從血漿純化抗體。產(chǎn)生和加工多克隆抗體的技術是本領域已知 的?！疤禺愋越Y(jié)合”或“特異于”是指第一抗原，例如恰菲埃里希氏體多肽，以比其他非 特異性分子更大的親和力識別并結(jié)合本發(fā)明的抗體?！疤禺愋越Y(jié)合”或“特異于”還指第一 抗體，例如，針對SEQ IDNO 1-6產(chǎn)生的抗體，以比其他非特異性分子更大的親和力識別和 結(jié)合SEQ ID N0:l-6。非特異性分子是與第一抗原不享有共同表位的抗原。在本發(fā)明的優(yōu) 選的實施方式中，非特異性分子不來自埃里希氏體屬物種，特別是不來自恰菲埃里希氏體 或犬埃里希氏體?！鞍＠锵Ｊ象w屬物種”是指埃里希氏體屬的所有物種。例如，針對第一抗 原(例如，多肽)產(chǎn)生的抗體，與對非特異性抗原相比對第一抗原更有效率地結(jié)合，可以被 描述為特異性結(jié)合第一抗原。在一個實施方式中，當以IO7Vmol或更高的結(jié)合親和力Ka結(jié)合時，抗體或其抗原結(jié)合部分特異性地結(jié)合SEQ ID NO: 1-6的多肽或其片段。特異性結(jié)合 可以利用，例如，酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫測定(RIA)或western印跡分析，利 用本領域公知的方法來測試。本發(fā)明的抗體包括抗體和其抗原結(jié)合片段，其(a)與參考抗體競爭對SEQ ID NO 1-6或其抗原結(jié)合片段的結(jié)合；(b)結(jié)合SEQ IDNO :1_6或其抗原結(jié)合片段的、與參考抗體相 同的表位；(c)以與參考抗體基本上相同的Kd結(jié)合SEQ ID NO: 1-6或其抗原結(jié)合片段；和/ 或(d)以與參考抗體基本上相同的解離速率結(jié)合SEQ ID NO: 1-6或其片段，其中所述參考 抗體是以IO7Vmol或更高的結(jié)合親和力Ka特異性結(jié)合SEQ ID NO :1_6的多肽或其抗原結(jié) 合片段的抗體或其抗原結(jié)合片段。另外的，針對本發(fā)明的多肽上存在的表位的單克隆抗體也可以容易產(chǎn)生。例如， 來自用本發(fā)明的多肽免疫的哺乳動物例如小鼠的正常B細胞可以與例如HAT敏感的小鼠 骨髓瘤細胞融合來產(chǎn)生雜交瘤。產(chǎn)生埃里希氏體屬特異性抗體的雜交瘤可以利用RIA或 ELISA鑒定，通過在半固體瓊脂中克隆或通過有限稀釋來分離。生產(chǎn)埃里希氏體屬特異性 抗體的克隆通過另一輪篩選來分離。單克隆抗體可以利用標準技術來篩選特異性，例如， 通過將本發(fā)明的多肽結(jié)合到微量滴定板上并通過ELISA分析來測量單克隆抗體的結(jié)合。 生產(chǎn)和加工單克隆抗體的技術是本領域已知的。參見，例如Kohler & Milstein，Nature, 256 :495(1975)。單克隆抗體的特定同種型可以通過從初始的融合物選擇來直接制備，或 通過利用sib選擇技術來分離種類變化變體從分泌不同同種型的單克隆抗體的親本雜交 瘤中次級地制備。參見 St印lewski et al. P. N. A. S. U. S. A. 82 86531985 ；Spria et al, J. Immunolog. Meth. 74 :307，1984。本發(fā)明的單克隆抗體還可以是重組單克隆抗體。參見， 例如，美國專利NO. 4，474，893 ；美國專利NO. 4，816，567。本發(fā)明的抗體還可以化學地構建。 參見，例如，美國專利N0. 4，676，980。本發(fā)明的抗體可以是嵌合的(參見，例如，美國專利N0. 5，482，856)，人源化的(參 見，例如Jones et al,Nature 321:522(1986) ；Reichmann et al,Nature 332:323(1988)； Presta, Curr. Op. Struct. Biol 2 :593 (1992))、犬源化的、犬的或人類的抗體。人抗體可以 通過例如，直接immortilization、噬菌體展示、轉(zhuǎn)基因小鼠或Trimera方法來產(chǎn)生，參見， 例如 Reisener et al, Trends Biotechnol. 16 :242_246 (1998)。特異性結(jié)合恰菲埃里希氏體的抗體對于檢測樣品例如來自動物的血清、血液、血 漿、細胞、組織、尿、糞或唾液樣品中恰菲埃里希氏體抗原的存在是特別有用的。免疫測定可 以利用一種抗體或幾種抗體。免疫測定可以使用，例如，特異于一種表位的單克隆抗體、特 異于一種多肽的復數(shù)種表位的復數(shù)種單克隆抗體的組合、特異于不同多肽的復數(shù)種表位的 復數(shù)種單克隆抗體、特異于同一抗原的復數(shù)種多克隆抗體、特異于不同抗原的復數(shù)種多克 隆抗體、或單克隆抗體和多克隆抗體的組合。免疫測定方案可以基于，例如， 用例如標記 的抗體的競爭、直接反應或夾層型分析。本發(fā)明的抗體可以用本領域已知的任何類型的標 記物來標記，包括，例如，熒光的、化學發(fā)光的、放射性的、酶的、膠態(tài)金屬的、放射性同位素 的和生物發(fā)光的標記物。在本發(fā)明的一個實施方式中，本發(fā)明的抗體特異性結(jié)合恰菲埃里 希氏體抗原，不特異性結(jié)合犬埃里希氏體抗原。本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段可以結(jié)合到支持物，用于檢測恰菲埃里希氏體抗 原的存在。支持物包括，例如，玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、右旋糖酐、尼龍、淀粉酶、天然的和修飾的纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖和磁石。本發(fā)明的抗體可以進一步用于通過免疫親和柱分離恰菲埃里希氏體有機體或抗 原?？贵w可以通過例如吸附，或通過共價鍵來固定到固體支持物上，從而抗體保持它們的 免疫選擇活性。任選的，可以包括間隔區(qū)基團，從而抗體的抗原結(jié)合位點保持可以接近的。 然后，固定的抗體可以用于從樣品中結(jié)合恰菲埃里希氏體有機體或恰菲埃里希氏體抗原， 所述樣品例如生物樣品，包括唾液、血清、痰、血液、尿、糞、腦脊髓液、羊水、傷口滲出液或組 織。結(jié)合的埃里希氏體屬有機體或埃里希氏體屬抗原通過例如PH值的改變來從柱基質(zhì)上 回收。本發(fā)明的抗體還可以用于免疫定位研究來分析本發(fā)明的多肽在各種細胞事件或 生理狀況期間的存在和分布?？贵w還可以用于鑒定被動免疫中涉及的分子，和鑒定非蛋白 質(zhì)抗原的生物合成中涉及的分子。這樣的分子的鑒定在疫苗開發(fā)中是有用的。本發(fā)明的抗 體，包括，例如，單克隆抗體和單鏈抗體，可以用于監(jiān)視由恰菲埃里希氏體引起的疾病的改 善的過程。通過測量來自動物的測試樣品中特異于恰菲埃里希氏體的抗體的提高或降低， 可以確定目的在于改善病癥的特定治療方案是否是有效的?？贵w可以利用例如，直接結(jié)合 分析如RIA、ELISA或western印跡分析來檢測和/或定量。檢測的方法本發(fā)明的方法可以用于檢測測試樣品例如生物樣品、環(huán)境樣品或?qū)嶒炇覙悠分刑?異于恰菲埃里希氏體抗原的抗體或抗原結(jié)合抗體片段或恰菲埃里希氏體多核苷酸。測試樣 品可能潛在地包含埃里希氏體屬物種多核苷酸、恰菲埃里希氏體多核苷酸、犬埃里希氏體 多核苷酸、埃里希氏體屬物種多肽、恰菲埃里希氏體多肽、犬埃里希氏體多肽、特異于埃里 希氏體屬物種的抗體、特異于恰菲埃里希氏體的抗體和/或特異于犬埃里希氏體的抗體， 不相關的多核苷酸和多肽、其組合，或不包含上述。生物樣品可以包括，例如，來自哺乳動物 如馬、貓、狗或人的血清、血液、細胞、血漿、唾液、尿、糞或組織。測試樣品可以是未處理的、 沉淀的、分級的、分離的、稀釋的、濃縮的或純化的。在一個實施方式中，本發(fā)明的方法包括在容許多肽/抗體復合物，即免疫復合物 形成的條件下使本發(fā)明的一種或更多種多肽與測試樣品接觸。也就是說，本發(fā)明的多肽特 異性地結(jié)合位于樣品中的特異于恰菲埃里希氏體抗原的抗體。在本發(fā)明的一個實施方式 中，本發(fā)明的一種或更多種多肽特異性地結(jié)合特異于恰菲埃里希氏體抗原、但不特異性結(jié) 合犬埃里希氏體抗原的抗體。本領域技術人員對于檢測抗體/多肽復合物結(jié)合中使用的分 析和條件是熟悉的。檢測多肽和樣品中抗體之間的復合物的形成?？贵w/多肽復合物的形 成是恰菲埃里希氏體多肽存在于樣品中的指示。沒有多肽/抗體復合物的檢出的是恰菲埃 里希氏體多肽不存在于樣品中的指示。通過從例如懷疑具有恰菲埃里希氏體感染的人或動物獲得測試樣品，本發(fā)明的抗 體可以用于診斷恰菲埃里希氏體感染的方法。測試樣品在允許抗體-抗原復合物(即，免 疫復合物)的形成的條件下與本發(fā)明的抗體接觸。本領域技術人員了解允許和適合于抗原 /抗體復合物形成的條件?？贵w-抗原復合物的量可以通過本領域已知的方法來測定。高 于陰性對照樣品中形成的水平的水平表明恰菲埃里希氏體感染。陰性對照樣品是不包含任 何恰菲埃里希氏體和/或犬埃里希氏體多肽、或特異于恰菲埃里希氏體和/或犬埃里希氏 體的抗體的樣品。在本發(fā)明的一個實施方式中，陰性對照不包含埃里希氏體屬物種多肽或特異于埃里希氏體屬物種的抗體。在本發(fā)明的一個實施方式中，抗體特異于恰菲埃里希氏 體抗原，并且不特異于犬埃里希氏體抗原。作為選擇，本發(fā)明的多肽可以與測試樣品接觸。 陽性測試樣品中特異于恰菲埃里希氏體的抗體將在適合的條件下形成抗原_抗體復合物。 抗體-抗原復合物的量可以通過本領域已知的方法測定。在本發(fā)明的一個實施方式中，恰菲埃里希氏體感染可以在受試者中檢測。從受試 者獲得生物樣品。包含SEQ ID NO :1-6的一種或更多種純化的多肽或本發(fā)明的其他多肽在 容許多肽/抗體復合物形成的條件下與生物樣品接觸。檢測多肽/抗體復合物。多肽/抗 體復合物的檢出是哺乳動物具有恰菲埃里希氏體感染的指示。沒有多肽/抗體復合物的檢 出是哺乳動物不具有恰菲埃里希氏體感染的指示。在本發(fā)明的一個實施方式中，恰菲埃里希氏體感染可以在不遲于受試者獲得恰菲 埃里希氏體感染之后約5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16 天、17天、18天、19天、20天、21天或更久在受試者中檢出。在本發(fā)明的一個實施方式中， 恰菲埃里希氏體感染可以在不遲于受試者獲得恰菲埃里希氏體感染之后約21天、20天、19 天、18天、17天、16天、15天、14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天或更 短在受試者中檢出。在本發(fā)明的一個實施方式中，在結(jié)合到抗體的指示物試劑，例如酶綴合物催化可 檢測的反應時，檢測多肽/抗體復合物。任選的，包含信號生成化合物的指示物試劑可以在 容許多肽/抗體/指示物復合物的形成的條件下應用于多肽/抗體復合物。檢測多肽/抗 體/指示物復合物。任選的，多肽或抗體可以在多肽/抗體復合物的形成之前用指示物試 劑標記。所述方法任選地包括陽性或陰性對照。在本發(fā)明的一個實施方式中，一種或更多種本發(fā)明的抗體附著到固相或基質(zhì)上。 潛在地包含蛋白質(zhì)的測試樣品被添加到基質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含本發(fā)明的多肽。添加特異性 結(jié)合本發(fā)明的多肽的一種或更多種抗體。所述抗體可以是與固相上使用的相同的抗體，或 可以來自不同的來源或物種，并且可以連接到指示物試劑，例如酶綴合物?？梢栽诿看翁砑?之前進行洗滌步驟。添加發(fā)色團或酶底物，容許產(chǎn)生顏色。停止顏色反應，顏色可以利用例 如分光光度計來定量。在本發(fā)明的另一個實施方式中，一種或更多種本發(fā)明的抗體附著到固相或基質(zhì) 上。潛在地包含蛋白質(zhì)的測試樣品被添加到基質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含本發(fā)明的多肽。添加特異 性結(jié)合本發(fā)明的多肽的第二種抗-物種抗體。這些第二抗體來自與固相抗體不同的物種。 添加特異性結(jié)合第二抗體、不特異性結(jié)合固相抗體的第三種抗_物種抗體。第三抗體可以 包含指示物試劑，例如酶綴合物?？梢栽诿看翁砑又斑M行洗滌步驟。添加發(fā)色團或酶底 物，容許產(chǎn)生顏色。停止顏色反應，顏色可以利用例如分光光度計來定量。本發(fā)明的測定包括但不限于基于競爭的那些、直接反應或夾心型測定，包括但不 限于，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、western印跡、IFA、放射免疫測定(RIA)、血細胞凝集 (HA)、熒光偏振免疫測定(FPIA)和微量滴定板測定(任何測定在微量滴定板的一個或更多 個反應孔中進行)。本發(fā)明的分析包括可逆的流動層析結(jié)合分析，例如，SNAP 分析。參 見，例如，美國專利NO. 5，726，010。分析可以使用固相或基質(zhì)，或可以通過免疫沉淀或不利用固相的任何其他方法來 進行。當使用固相或基質(zhì)時，一種或更多種本發(fā)明的多肽直接或間接地附著于固體支持物或基質(zhì)，例如微量滴定孔、磁珠、非磁性珠子、柱、基質(zhì)、膜、由合成的或天然的纖維組成的纖 維片(例如，基于玻璃或纖維素的材料或熱塑性聚合物，例如聚乙烯、聚丙烯或聚酯)、由顆 粒材料(例如，玻璃或各種熱塑性聚合物)組成的燒造的結(jié)構、或由硝化纖維、尼龍、聚砜等 等(一般天然合成的)組成的澆鑄的薄膜。在本發(fā)明的一個實施方式中，基質(zhì)是聚乙烯的 燒制的細顆粒，一般稱為多孔聚乙烯，例如，來自Chromex Corporation (Albuquerque, NM) 的10-15微米多孔聚乙烯。所有這些基質(zhì)材料可以在適合的形狀中使用，例如，薄膜、薄片 或平板，或者它們可以包被到、或結(jié)合到或?qū)訅旱竭m當?shù)亩栊暂d體上，例如紙、玻璃、塑料膜 或織物。將肽固定到固相上的適合的方法包括離子的、疏水的、共價的相互作用，等等。在一種類型的分析形式中，一種或更多種多肽可以包被到固相或基質(zhì)上。懷疑含 有抗恰菲埃里希氏體抗體或其抗原結(jié)合片段的測試樣品在一定條件下與指示物試劑孵育 一定時間，所述指示物試劑包含綴合到特異于恰菲埃里希氏體的抗體或抗體片段的信號生 成化合物，所述時間和條件足以形成測試樣品的抗體與固相的多肽的抗原/抗體復合物、 或綴合到特異于恰菲埃里希氏體的抗體的指示物試劑化合物與固相的多肽的抗原/抗體 復合物。綴合到抗恰菲埃里希氏體抗體的指示物試劑與固相的結(jié)合方面的降低可以定量地 測量。與從例如證實的陰性恰菲埃里希氏體測試樣品產(chǎn)生的信號相比，在信號方面可測量 的降低表明測試樣品中抗恰菲埃里希氏體抗體的存在。這種類型的分析可以定量測試樣品 中抗恰菲埃里希氏體抗體的量。在另一種分析形式中，一種或更多種本發(fā)明的多肽包被在支持物或基質(zhì)上。本發(fā) 明的多肽綴合到指示物試劑并添加到測試樣品中。這種混合物施加到支持物或基質(zhì)。如果 特異于恰菲埃里希氏體的抗體存在于測試樣品中，它們將結(jié)合綴合到指示物試劑的所述一 種或更多種多肽，和結(jié)合到支持物上固定的所述一種或更多種多肽。然后可以檢測多肽/ 抗體/指示物復合物。這種類型的分析可以定量測試樣品中抗恰菲埃里希氏體抗體的量。在另一種分析形式中，一種或更多種本發(fā)明的多肽包被在支持物或基質(zhì)上。測試 樣品施加到支持物或基質(zhì)并孵育。通過用洗滌溶液洗滌固體支持物從樣品上洗去未結(jié)合的 成分。如果恰菲埃里希氏體特異性抗體存在于測試樣品中，它們將結(jié)合包被在固相上的多 肽。這種多肽/抗體復合物可以利用綴合到指示物試劑的第二物種特異性抗體來檢測。然 后可以檢測多肽/抗體/抗-物種抗體指示物復合物。這種類型的分析可以定量測試樣品 中抗恰菲埃里希氏體抗體的量。多肽/抗體復合物或多肽/抗體/指示物復合物的形成可以通過，例如，放射測量 的、比色的、熒光測量的、大小分離或沉淀方法來檢測。任選的，多肽/抗體復合物的檢測是 通過添加第二抗體，所述第二抗體偶聯(lián)到包含信號生成化合物的指示物試劑。包含信號生 成化合物(標記物)、與多肽/抗體復合物締合的指示物試劑可以利用上文描述的方法來檢 測，包括顯色劑，催化劑，例如酶綴合物、熒光化合物，例如熒光素和羅丹明，化學發(fā)光化合 物，例如dioxetanes、acridiniums、phenanthridiniums、釕和魯米諾，放射性元素，直接可 視標記物，以及輔助因子、抑制物、磁性顆粒，等等。酶綴合物的實例包括堿性磷酸酶、辣根 過氧化酶、beta-半乳糖苷酶，等等。特定標記物的選擇不是關鍵的，但是它將能夠通過自 身或與一個或更多個另外的物質(zhì)一起產(chǎn)生信號。復合物的形成是測試樣品中抗恰菲埃里希氏體抗體存在的指示。因此，本發(fā)明的 方法可以用于診斷動物中的恰菲埃里希氏體感染。
本發(fā)明的方法還可以表明測試樣品中抗-抗-恰菲埃里希氏體抗體的量。使用許 多指示物試劑，例如，酶綴合物，存在的抗體的量與產(chǎn)生的信號成比例。取決于測試樣品的 類型，它可以用適合的緩沖試劑稀釋，濃縮，或與固相接觸而沒有任何操作。例如，通常優(yōu)選 的是測試早先已經(jīng)稀釋的血清或血漿樣品、或濃縮的樣品例如尿液，來確定存在的抗體的 存在性和/或量。本發(fā)明進一步包括分析試劑盒(例如，制備物品)，用于檢測樣品中的抗_恰菲埃 里希氏體抗體或抗原結(jié)合抗體片段、或恰菲埃里希氏體多肽。試劑盒包含一種或更多種本 發(fā)明的多肽和用于測定所述多肽與樣品中的抗恰菲埃里希氏體抗體或抗體片段的結(jié)合的 工具。試劑盒或制備物品還可以包含本發(fā)明的一種或更多種抗體或抗體片段，以及用于測 定所述抗體或抗體片段與樣品中的恰菲埃里希氏體多肽結(jié)合的工具。試劑盒可以包含設 備，所述設備含有本發(fā)明的一種或更多種多肽或抗體，以及所述一種或更多種多肽或抗體 用于例如哺乳動物中恰菲埃里希氏體感染的鑒定的使用說明。所述試劑盒還可以包括包含 標簽的包裝材料，所述標簽指明所述試劑盒的一種或更多種多肽或抗體可以用于恰菲埃里 希氏體感染的鑒定。本領域普通技術人員已知的其他成分例如緩沖劑、對照物等等，可以被 包括在這樣的測試試劑盒中。本發(fā)明的多肽、抗體、分析和試劑盒，在例如患者中恰菲埃里 希氏體感染的個體案例的診斷、以及恰菲埃里希氏體爆發(fā)的流行病學研究中是有用的。本發(fā)明的多肽和分析可以與其他多肽或分析組合來檢測恰菲埃里希氏體和其 他有機體的存在。例如，本發(fā)明的多肽和分析可以與檢測犬惡絲蟲和/或伯氏疏螺旋體 (Borrelia burgdorferi)和/或犬埃里希氏體和/或Anaplasma platys和/或嗜吞噬細 胞無形體(Anaplasmaphagocytophilum)的試劑組合。本發(fā)明的多核苷酸可以用于檢測樣品中恰菲埃里希氏體多核苷酸的存在。所述 多核苷酸可以通過簡單的雜交反應用于檢測樣品中的恰菲埃里希氏體多核苷酸，還可以用 于，例如，聚合酶鏈式反應(PCR)，例如，實時PCR反應。本發(fā)明的方法和組合物還可以用于 從其他埃里希氏體屬物種例如犬埃里希氏體區(qū)分地檢測恰菲埃里希氏體的存在。PCR分析是本領域中很好地描述的，包括，例如，美國專利NO. 4，683，195 ；美國專 利NO. 4，683，202 ；美國專利NO. 4，965，188。一般地，多核苷酸引物與目標核酸的變性的鏈 退火。引物延伸產(chǎn)物通過由聚合酶的脫氧核苷三磷酸的聚合來形成。然后，PCR涉及模板 核酸變性、引物退火以及退火的引物在熱穩(wěn)定聚合酶的作用下的延伸的重復循環(huán)。所述過 程引起測試樣品中目標恰菲埃里希氏體核酸的指數(shù)式擴增，其容許檢測在樣品中以極低濃 度存在的目標多核苷酸。實時PCR分析基于信號，例如，熒光報告物信號的檢測。這種信號與反應中PCR產(chǎn) 物的量成正比地提高。實時PCR是使得可能監(jiān)視正在進行的擴增反應的進度的任何擴增 *。 #1， Quantitation ofDNA/RNA Using Real-Time PCR Detection, Perkin Elmer AppliedBiosystems (1999) ；PCR Protocols (Academic Press New York, 1989)。通過記錄 每個循環(huán)中熒光發(fā)射的量，有可能在指數(shù)期期間監(jiān)視PCR反應，在此時PCR產(chǎn)物的量的首次 顯著提高與目標模板的初始量相關。核酸目標的起始拷貝數(shù)越高，越快觀察到熒光顯著提 尚ο本發(fā)明的一個實施方式提供了檢測和/或定量測試樣品中的恰菲埃里希氏體多 核苷酸的方法。正義引物和反義引物可以在適合于聚合酶鏈式反應的條件下添加到測試樣品中。引物與恰菲埃里希氏體多核苷酸雜交，從而如果恰菲埃里希氏體多核苷酸存在于測 試樣品中，形成擴增產(chǎn)物。檢測擴增產(chǎn)物，確定恰菲埃里希氏體多核苷酸的存在和/或量。 擴增產(chǎn)物可以用在適合于聚合酶鏈式反應的條件下與恰菲埃里希氏體多核苷酸序列雜交 的多核苷酸探針來檢測。擴增產(chǎn)物可以通過測量來自探針的檢測信號、比較所述檢測信號 和來自定量標準物的第二探針檢測信號來定量。定量標準物可以與測試樣品并行地提取。 恰菲埃里希氏體引起的疾病的治療、改善或預防的方法本發(fā)明的多肽、多核苷酸和抗體可 以用于治療、改善或預防由恰菲埃里希氏體引起的疾病。例如，本發(fā)明的抗體如單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，可以施用給動物，例如人或 狗。在本發(fā)明的一個實施方式中，抗體或其抗原結(jié)合片段在包含藥學上可接受的載體的藥 物組合物中施用給動物。藥物組合物包含治療有效量的抗體或其抗原結(jié)合片段。治療有效 量是在減輕恰菲埃里希氏體感染的癥狀或降低受試者中恰菲埃里希氏體有機體的量方面 有效的量。本發(fā)明的多肽或多核苷酸可以在免疫原性組合物中存在并用于在宿主中引發(fā)免 疫反應。免疫原性組合物或免疫原能夠在動物中誘導免疫反應。本發(fā)明的免疫原性多肽或 多核苷酸組合物在敏化動物的免疫系統(tǒng)方面是特別有用的，從而作為結(jié)果，產(chǎn)生了改善或 防止恰菲埃里希氏體感染的影響的免疫反應。在動物模型中免疫反應的引發(fā)對于確定例如 最佳的劑量或施用途徑是有用的。免疫反應的引發(fā)還可以用于治療、預防或改善恰菲埃里 希氏體引起的疾病或感染。免疫反應包括體液免疫反應或細胞介導的免疫反應，或其組合。 免疫反應還可以包含，例如，通過促進防衛(wèi)素的產(chǎn)生來促進一般化的宿主響應。本發(fā)明的一個實施方式提供了免疫原，其包含本發(fā)明的多肽和與所述多肽在羧基 末端或氨基末端共價連接的一個或更多個其他區(qū)域或部分。每個區(qū)域或部分可以，例如，增 強免疫反應、方便免疫原的純化或促進多肽穩(wěn)定性。動物針對恰菲埃里希氏體的抗體滴度的產(chǎn)生在感染的保護和感染的清除方面是 重要的。在多肽或多核苷酸的遞送之后抗體滴度的檢測和/或定量可以用于鑒定在引發(fā)抗 體滴度方面特別有效的表位。對于針對恰菲埃里希氏體的強抗體反應負責的表位可以通過 引發(fā)針對不同長度的恰菲埃里希氏體多肽的抗體來鑒定。然后，由特定多肽表位引發(fā)的抗 體可以利用，例如ELISA分析來測試，以確定哪些多肽含有在產(chǎn)生強反應方面最有效的表 位。然后，含有這些表位的多肽或融合蛋白或編碼所述表位的多核苷酸可以被構建并用于 引發(fā)強抗體反應。本發(fā)明的多肽、多核苷酸或抗體可以被施用給哺乳動物，例如，小鼠、兔子、豚鼠、 獼猴、狒狒、黑猩猩、人、牛、綿羊、豬、馬、狗、貓，或施用給動物例如雞或鴨，來在體內(nèi)引發(fā)抗 體。多核苷酸的注射具有構建和修改的簡便性的實際優(yōu)點。進一步的，多核苷酸的注射引 起宿主中多肽的合成。因而，多肽被呈遞給宿主免疫系統(tǒng)，具有天然的翻譯后修飾、結(jié)構和 構象。多核苷酸可以作為“裸DNA”遞送給受試者。多核苷酸、多肽或抗體的施用可以通過本領域已知的任何方式，包括肌肉內(nèi)的、靜 脈內(nèi)的、肺內(nèi)的、肌肉內(nèi)的、皮內(nèi)的、腹膜內(nèi)的或皮下的注射，氣溶膠、鼻內(nèi)的、輸液泵、栓劑、 粘膜的、局部的和口服的，包括利用生物彈道槍(“基因槍”)的注射。多核苷酸、多肽或抗 體可以伴隨著蛋白質(zhì)載體用于口服施用。施用方法的組合也可以用于引發(fā)免疫反應?？贵w 可以以約0. 5mg到約200mg的日劑量施用。在本發(fā)明的一個實施方式中，抗體以約20到約IOOmg的日劑量施用。用于治療用途的藥學上可接受的載體和稀釋劑和獸醫(yī)可接受的載體和稀釋劑是 本領域公知的,在例如Remington ‘ s PharmaceuticalSciencesjMack Publishing Co. (Α. R. Gennaro ed. (1985))中描述了。載體本身應當不誘導對宿主有害的抗體的產(chǎn)生。這 樣的載體包括，但不限于，大的緩慢代謝的大分子，例如，蛋白質(zhì)、聚糖，如乳膠功能化的 SEPHAROSE 、瓊脂糖、纖維素、纖維素珠子等，聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸，例如，聚 谷氨酸、聚賴氨酸，等等，氨基酸共聚物、類肽、類脂(Iipitoid)和失活的無毒病毒顆?；?細菌細胞。脂質(zhì)體、水凝膠、環(huán)化糊精、可生物降解的納米膠囊和生物粘附劑也可以用作本 發(fā)明的組合物的載體。藥學上可接受的鹽也可以用于本發(fā)明的組合物，例如，礦物鹽，例如，氫氯化物、氫 溴化物、磷酸鹽或硫酸鹽，以及有機酸的鹽，例如醋酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽或苯甲酸鹽。特 別有用的蛋白質(zhì)基質(zhì)是血清白蛋白、鑰孔血藍素、免疫球蛋白分子、甲狀腺球蛋白、卵清蛋 白、破傷風類毒素和本領域技術人員公知的其他蛋白質(zhì)。本發(fā)明的組合物還可以含有液體 或賦形劑，例如水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、Ringer' s溶液、Hank' s溶液、葡萄糖、甘油、右 旋糖、malodextrin、乙醇等等，單獨或組合地，以及物質(zhì)例如潤濕劑、乳化劑、滲漲度調(diào)節(jié)試 劑、洗滌劑或PH緩沖試劑。也可以使用其他活性試劑，例如殺細菌試劑。如果希望，改善向淋巴細胞的免疫原呈遞的共-刺激分子，例如B7-1或B 7-2或 細胞因子，例如MlPl α , GM-CSF, IL-2和IL-12可以被包括在本發(fā)明的組合物中。任選地， 佐劑也可以被包括在組合物中。佐劑是可以用于非特異性增大特異性免疫應答的物質(zhì)。一 般的，本發(fā)明的佐劑和多肽在呈遞給免疫系統(tǒng)之前混合，或單獨地呈遞，但是呈遞到動物的 同一位置。佐劑可以包括，例如，油性佐劑(例如，弗氏完全和不完全佐劑)、礦物鹽(例 如，AlK(SO4)2, AlNa(SO4)2, AlNH4(SO4)、硅石、明礬、Al (OH)3 和 Ca3(PO4)2)、多核苷酸(即， 聚IC和聚AU酸)和某些自然物質(zhì)(例如，來自結(jié)核分枝桿菌(Corynebacterium parvum) 的wax D，以及在小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)、百日咳包特氏菌(Bordetella pertussis)和布魯氏菌屬(Brucella)的成員中發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)?？梢允褂玫淖魟┌ǎ?限于，MF 59-0、氫氧化鋁、N-乙?；?胞壁?；?L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr_MDP)、 N-乙酰基-nor-胞壁?；?L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(CGP 11637)，稱為nor-MDP)、N-乙 酰胞壁?；?L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1’ -2' -二棕櫚?；?sn-丙 三基-3-羥基磷酰氧基)_乙胺(CGP 19835A，稱為MTP-PE)和RIBI，其含有在2%角鯊烯 /TWEEN 80 (聚山梨酯)乳劑中的從細菌提取的三種成分，單磷?；|(zhì)A、海藻糖二 霉菌酸酯和細胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。本發(fā)明的組合物可以配制到可攝取的片劑、口腔片劑、錠劑、膠囊、酏劑、懸浮液、 糖漿、薄片、可注射制劑、嗽口水、牙粉(dentrifices)，等等。本發(fā)明的一種或更多種多肽、 多核苷酸或抗體在這樣的組合物和制品中的百分比可以是單位重量的0. 到60%。多肽、多核苷酸或抗體的施用可以在動物中引發(fā)免疫反應持續(xù)至少1周、1個月、 3個月、6個月、1年或更久。任選的，通過在初次注射后1個月、3個月、6個月、1年或更久 提供多肽、多核苷酸或抗體的一次或更多次強化注射，免疫反應可以在動物中維持。如果希 望，也可以在組合物之前、之后或與組合物一起提供共同刺激分子或佐劑。包含多肽、多核苷酸、抗體或其組合的本發(fā)明的組合物按照與所使用的特定組合物相容的方式、以對于引發(fā)免疫反應有效的量來施用，所述免疫反應由例如ELISA來檢測。 多核苷酸可以以 lng/kg、10ng/kg、100ng/kg、1000ng/kg、0. 001mg/kg、0. lmg/kg 或 0. 5mg/ kg的劑量肌肉內(nèi)地注射到哺乳動物，例如狒狒、黑猩猩、狗或人中。多肽或抗體可以以 0. 01,0. 05,0. 5,0. 75、1. 0,1. 5,2. 0,2. 5、5或10mg/kg的劑量肌肉內(nèi)地注射到哺乳動物中。多肽、多核苷酸、抗體或其組合可以施用給未受恰菲埃里希氏體感染的動物，或可 以施用給恰菲埃里希氏體感染的動物。免疫有效量或治療有效量是指以單一劑量或作為系 列的部分施用該量給個體，對于恰菲埃里希氏體感染的治療、改善或預防是有效的。在組 合物中多核苷酸、多肽或抗體的特定劑量將取決于許多因素，包括，但不限于物種、年齡、性 別、同時的藥療法、施用該組合物的哺乳動物的一般狀況以及該組合物的施用方式。本發(fā)明 的組合物的有效量可以僅利用常規(guī)的實驗來容易確定。在此任何地方弓ι用的所有的專利、專利申請和其他科學或技術著述通過將它們完 全引用來合并。在此說明性地描述的本發(fā)明可以在沒有此處所沒有特別公開的任何單種或 復數(shù)種元素、單種或復數(shù)種限制的情況下適當?shù)貙崿F(xiàn)。因而，例如，在此處的每種情況下，
“包含”、“基本上由......組成”和“由......組成”的任何術語可以用另兩個術語的任一
個替換，而保持它們的普通含義。已經(jīng)被采用的術語和表述被用作描述的術語而不是限制 的術語，在使用這樣的術語和表述時不意圖排除所顯示和描述的特征的任何等價物或其部 分，但是認識到的是，在本發(fā)明所要求的范圍內(nèi)的各種修改是可能的。因而，要理解的是，雖 然已經(jīng)通過實施方式具體地公開了本發(fā)明，在此公開的概念的任選的特征、修改和變體可 以被本領域技術人員借助，并且這樣的修改和變體被認為處于由說明書和附隨的權利要求 所定義的本發(fā)明的范圍之內(nèi)。另外，當本發(fā)明的特征或方面以馬庫什組或其他可選方式的分組來描述時，本領 域技術人員將認識到，本發(fā)明由此也按照馬庫什組或其他組的任何單獨成員或成員的子組 的方式來描述。
實施例實施例1直接ELISA分析平板和方案SEQ ID N0:5和6中所示的多肽綴合到BSA，綴合物包被在IMMULON 4平 板上。包被緩沖液是0.05M碳酸鈉、ρΗ9.6。100μ 1/孔的稀釋的多肽吸移到平板上。覆 蓋平板，在2°C -8°C孵育過夜。從平板上吸取多肽溶液，平板用HWPetChek 洗滌緩沖液 (IDEXXLaboratories, Inc.，Westbrook ME)洗滌 4 次。300 μ 1/ 孔的在 0. IM TrispH 7. 6 中的BSA添加到平板。在室溫下孵育、覆蓋平板6小時。吸出BSA，300y 1/孔的在0. IM Tris pH7. 6中的2. 5%蔗糖添加到平板。孵育平板，覆蓋，在2°C _8°C過夜。蔗糖從平板上 吸出，輕敲平板來除去過量的液體。平板在真空倉中干燥4小時。平板在2°C-8°C與干燥 劑保存在雙塑料袋中。SEQ ID NO :1和2中顯示的多肽綴合到HRP0。稀釋的多肽HRP0添加到每個反應 孔(100 μ 1/孔)，添加對照和血清樣品(純的)(50μ 1/孔)。恰菲埃里希氏體的陽性對照 與陰性對照一起使用。輕輕敲打平板，在室溫孵育ι小時。平板用HWPetChek 洗滌緩 沖液洗滌6次。100 μ 1/孔的TMB底物添加到反應孔，平板孵育10分鐘。50 μ 1/孔的停止溶液添加到反應孔。平板在A650讀取。陰性截斷值被確定為2X陰性對照O.D.值。實施例2間接ELISA分析平板和方案SEQ ID N0:4、5和6中顯示的多肽包被到Immulon l平板上。包被緩沖液是 0. 05M碳酸鈉，pH9. 6。100 μ 1/孔稀釋的肽添加到平板，平板在室溫下(RT)孵育、覆蓋過夜。 吸去多肽，平板用HWPetChek 洗滌緩沖液洗滌2次。200 μ 1/孔的0. IM Tris ρΗ7. 6中 的2 %TWEEN (聚山梨酯)20/2. 5 %蔗糖添加到反應孔，平板在室溫孵育、覆蓋2小時。 吸去阻斷溶液，輕敲平板來除去過量液體。平板在室溫下用2份(27g)干燥劑/6個平板在 聚酯薄膜(mylar)袋子中干燥過夜。平板在2°C _8°C保存。稀釋的對照和血清樣品以100 μ 1/孔吸移到反應孔中。恰菲埃里希氏體的陽性對 照與陰性對照一起使用。平板在室溫孵育30分鐘。平板用HWPetChek 洗滌緩沖液洗 滌5次。100 μ 1/孔稀釋的兔抗狗HRPO添加到反應孔中并在室溫孵育30分鐘。平板用 HWPetChek 洗滌緩沖液洗滌5次。50 μ 1/孔τμβ底物添加到平板，孵育 ο分鐘。添加 50 μ 1/孔的停止溶液。平板在Α650讀取。陰性截斷值被確定為2Χ陰性對照0. D.值。間接(α物種)和直接(Ag:Ag)分析形式的最終的最佳平板條件在表1中示出。表權利要求
一種純化的多肽，包含(a)SEQ ID NO3，其中所述多肽由少于約50個連續(xù)的天然存在的恰菲埃里希氏體氨基酸組成；(b)SEQ ID NO2，其中所述多肽由少于約50個連續(xù)的天然存在的恰菲埃里希氏體氨基酸組成；(c)SEQ ID NO1，其中所述多肽由少于約50個連續(xù)的天然存在的恰菲埃里希氏體氨基酸組成。
2.編碼權利要求1的純化的多肽的分離的多核苷酸。
3.權利要求1的純化的多肽，其中所述多肽由SEQID NO :3、SEQID NO 2或SEQ ID NO 1組成。
4.權利要求1的純化的多肽，其中所述純化的多肽連接到指示物試劑、氨基酸間隔區(qū)、 信號序列、終止轉(zhuǎn)移序列、跨膜結(jié)構域、蛋白質(zhì)純化配體、異源多肽、一種或更多種包含SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6的其他多肽，或其組合。
5.權利要求1的純化的多肽，其中所述純化的多肽包含在所述多肽的氨基末端或羧基 末端或兩個末端的一個或更多個C氨基酸殘基。
6.一種檢測測試樣品中特異性結(jié)合恰菲埃里希氏體多肽的抗體的方法，包括(a)在容許多肽/抗體復合物形成的條件下使包含SEQID NO :1、2、3、5或6的純化的 多肽與測試樣品接觸；其中所述純化的多肽由少于約50個連續(xù)的天然存在的恰菲埃里希 氏體氨基酸組成；(b)檢測所述多肽/抗體復合物；其中所述多肽/抗體復合物的檢出是特異于恰菲埃里希氏體的抗體存在于所述測試 樣品中的指示，其中沒有多肽/抗體復合物是特異于恰菲埃里希氏體的抗體不存在于所述 測試樣品中的指示。
7.權利要求6的方法，進一步包括在進行步驟(b)之前使步驟(a)的復合物與指示物 試劑接觸。
8.權利要求6的方法，其中所述純化的多肽包含SEQID NO :2或SEQ ID N0:5，其中所 述方法不檢測特異性結(jié)合犬埃里希氏體多肽的抗體。
9.權利要求6的方法，其中測定所述測試樣品中抗體的量。
10.權利要求6的方法，其中所述純化的多肽附著到基質(zhì)上。
11.權利要求6的方法，其中所述純化的多肽連接到指示物試劑、氨基酸間隔區(qū)、信號 序列、終止轉(zhuǎn)移序列、跨膜結(jié)構域、蛋白質(zhì)純化配體、異源蛋白質(zhì)、一種或更多種包含SEQ ID NO :1、2、3、4、5或6的其他多肽，或其組合。
12.—種檢測受試者中恰菲埃里希氏體感染的方法，包括(a)從所述受試者獲得生物樣品；(b)在容許多肽/抗體復合物形成的條件下使包含SEQID NO :1、2、3、5或6的純化的 多肽與生物樣品接觸；其中所述純化的多肽由少于約50個連續(xù)的天然存在的恰菲埃里希 氏體氨基酸組成；(c)檢測所述多肽/抗體復合物；其中所述多肽/抗體復合物的檢出是所述受試者具有恰菲埃里希氏體感染的指示。
13.權利要求12的方法，其中所述純化的多肽是SEQID NO :2或SEQ ID N0:5，其中所 述方法不檢測所述受試者中的犬埃里希氏體感染。
14.特異性結(jié)合由SEQID NO :1、2、3、5或6組成的多肽的抗體。
15.權利要求14的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體、多克隆抗體、抗原結(jié)合抗體片段 或單鏈抗體。
16.一種檢測樣品中的恰菲埃里希氏體多肽的方法，包括(a)在容許多肽/抗體復合物形成的條件下使特異性結(jié)合由SEQID N0:l、2、3、5或6 組成的多肽的抗體與所述樣品接觸；(b)檢測所述多肽/抗體復合物；其中所述多肽/抗體復合物的檢出是恰菲埃里希氏體多肽存在于樣品中的指示。
17.權利要求16的方法，其中所述多肽是SEQID NO 2或SEQ IDNO :5，和其中所述方 法不檢測所述樣品中的犬埃里希氏體多肽。
18.權利要求16的方法，其中所述抗體是單克隆抗體、多克隆抗體、抗原結(jié)合抗體片段 或單鏈抗體。
19.權利要求16的方法，其中所述抗體附著到基質(zhì)上。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于恰菲埃里希氏體的檢測的方法和組合物。
文檔編號C07K14/00GK101970463SQ200880117026
公開日2011年2月9日 申請日期2008年9月19日 優(yōu)先權日2007年9月21日
發(fā)明者E·R·克拉三世, J·M·索希亞, T·P·小奧康諾爾 申請人:艾德克斯實驗室公司