專利名稱：：Raf和HDAC小分子雙重抑制劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及可作為Raf和HDAC的雙重抑制劑的小分子有機(jī)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽及其制備方法，還涉及包含該抑制劑或其藥學(xué)上可接受鹽的藥用組合物，以及該抑制劑或其藥學(xué)上可接受鹽及其藥用組合物的醫(yī)療用途，尤其涉及在預(yù)防、延緩或治療Raf或HDAC單獨(dú)或兩者同時(shí)參與介導(dǎo)的疾病，特別是腫瘤的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
：Ras/Raf7MAPKs(mitogen-activatedproteinkinases)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，在將細(xì)胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及其核內(nèi)，引起細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)(如細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等)的過(guò)程中具有至關(guān)重要的作用。目前已知，所有真核細(xì)胞中均存在Raf/MEK7ERK這一轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過(guò)通路中Ras、Raf、MEK及ERK等激酶的特異性級(jí)聯(lián)磷酸化將信號(hào)由細(xì)胞外傳入細(xì)胞核內(nèi)。Raf為該通路中的一個(gè)關(guān)鍵激酶，可通過(guò)依賴或不依賴Ras的方式發(fā)揮其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)作用。作為Raf激酶的下游底物，激活的MEK磷酸化ERK，而ERK通過(guò)作用多種底物以調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。一旦該通路發(fā)生過(guò)度激活，，引起的細(xì)胞增殖的加速與細(xì)胞生存期的延長(zhǎng)可導(dǎo)致腫瘤的形成及發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，包括VEGF、PDGF-p、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-a(TGF-a)等多種生長(zhǎng)因子一旦與其同源受體結(jié)合以后，即可通過(guò)受體酪氨酸激酶自體磷酸化的方式激活RafMEK/ERK通路。此外，作為該通路的上游基因，ras基因在多種腫瘤中發(fā)生突變，可直接參與Raf/MEK/ERK通路的激活過(guò)程(SchulzeA,LehmannK,JefferiesHB,etal.Ge"eyZ)ev,2001,15:981-994;DownwardJ.胸ievC露er,2003，3:11-22)。Raf激酶的三種亞型包括Raf-l(C-Raf)、A-Raf禾BB-Raf,各亞型間具有較高的序列相似性，與細(xì)胞增殖、分化、生存、附著及血管生成的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。迄今已發(fā)現(xiàn)的Raf激酶在腫瘤中的異常激活主要涉及B-Raf與Raf-l。B-Raf基因的突變?cè)谠S多人類腫瘤中被檢測(cè)到，包括超過(guò)60%的惡性黑色素瘤和40—70X的甲狀腺乳突瘤(KimuraET,NikiforovaMN，ZhuZ，etal.Omc"2003,63:1454-1457)。B-Raf最常見的突變?yōu)?00位的纈氨酸的突變，這會(huì)導(dǎo)致加強(qiáng)B-Raf激酶活性的活性環(huán)區(qū)發(fā)生假磷酸化變異。Raf-1激酶在生物過(guò)程中除了傳遞增殖信號(hào)外，大量的證據(jù)顯示，此激酶還能調(diào)控細(xì)胞的存活及血管的生成，例如在內(nèi)皮細(xì)胞中，當(dāng)DNA破壞型藥物產(chǎn)生凋亡效應(yīng)時(shí)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子能通過(guò)Raf-1激酶?jìng)鬟f信號(hào)保護(hù)細(xì)胞。與此相似，基礎(chǔ)纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因子也能通過(guò)Raf-l激酶?jìng)鬟f信號(hào)，防止死亡受體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。SiRNA的研究進(jìn)一步證實(shí)了Raf激酶在腫瘤細(xì)胞抵御細(xì)胞凋亡中的重要作用。Raf-l的SiRNA能在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)HUVEC,MDA-MB-435及C6細(xì)胞凋亡而抑制細(xì)胞的增殖。B-Raf的SiRNA能夠阻斷ERK的活性抑制DNA的合成并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(LengQ,MixsonAJ.C匿erG匿2005,12:682-690)。腫瘤轉(zhuǎn)移亦與Raf激酶相關(guān)。目前已知50%的轉(zhuǎn)移性腫瘤存在ras基因的突變，進(jìn)而通過(guò)Raf/MEK/ERK通路發(fā)揮作用。動(dòng)物研究結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了突變r(jià)as基因的腫瘤細(xì)胞較易發(fā)生轉(zhuǎn)移，該過(guò)程伴有Raf-l的激活，而正常ras基因的腫瘤細(xì)胞則無(wú)此現(xiàn)象(WebbCP,VanAelstL,WiglerMH,etal.iVocAW"cWSdf/5L4,1998,95:8773-8778.)。針對(duì)惡性黑色素瘤和乳頭狀甲狀腺癌的研究同樣發(fā)現(xiàn)B-Raf的激活與腫瘤的高轉(zhuǎn)移性相關(guān)(VaskoV,HuS,WuG，etal.J五"fifocW朋/Meto6,2005，90:5265-5269)。除了可能參與腫瘤形成外，Raf與新生血管的生成也密切相關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，缺乏B-Raf與Raf-l基因的小鼠會(huì)在胚胎期間死于血管形成障礙(MikulaM,SchreiberM,HusakZ,etal.2001,20:1952-1962)。血管生長(zhǎng)因子如VEGF與基本纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)均可通過(guò)對(duì)于Raf-l的磷酸化來(lái)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，前者需要MEK/ERK通路的參與，而后者則為直接作用(AlaviA,HoodJD，F(xiàn)raustoR，etal.2003，301:94-96)。在藥物研發(fā)方面，靶向Raf的抑制劑己經(jīng)取得了較大成功，己有多種結(jié)構(gòu)類型的抑制劑被報(bào)道。Onyx(Emeryville,CA,USA)與Bayer(Leverkusen,Germany)合作研發(fā)了雙芳基脲類Raf抑制劑Sorafenib，于2005年12月作為腎癌的治療藥物首次上市，成為第一個(gè)臨床應(yīng)用的Raf激酶抑制劑。Sorafenib還是一個(gè)廣譜抗腫瘤藥物，其對(duì)黑色素瘤、肝癌、非小細(xì)胞肺癌等腫瘤細(xì)胞作用的研究也進(jìn)入了三期臨床階段。綜上所述，Raf激酶不但參與了腫瘤的形成及發(fā)展，且與腫瘤新生血管的生成密切相關(guān)，其抑制劑表現(xiàn)出較好的腫瘤治療效果。因此，抑制Raf激酶成為靶向治療腫瘤的有效途徑之基因轉(zhuǎn)錄的有序調(diào)控是機(jī)體細(xì)胞維持正常功能的前提，如果基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能紊亂，細(xì)胞則可能發(fā)生癌變。組蛋白乙?；?histoneacetylation,HAT)和組蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylase,HDAC)是真核細(xì)胞中控制染色質(zhì)中組蛋白尾部乙?；降膬蓚€(gè)家族，核心組蛋白氨基木端尾部包含的賴氨酸殘基，是HAT和HDAC乙酰化和去乙?；孜?，賴氨酸殘基的s-氨基的乙?；腿ヒ阴；砜刂苹虮磉_(dá)的主要分子表觀遺傳機(jī)制。HAT催化乙酰輔酶A上的乙?；D(zhuǎn)移到組蛋白N-末端賴氨酸殘基，中和正電荷，使DNA與組蛋白之間的相互作用減弱，染色體呈轉(zhuǎn)錄活性的松散狀態(tài)，有利于轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合。HDAC與HAT活性競(jìng)爭(zhēng)，催化組蛋白賴氨酸殘基的去乙?；菇M蛋白帶正電荷，與帶負(fù)電荷的DNA緊密結(jié)合，導(dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)聚集和基因轉(zhuǎn)錄抑制。HDAC和HAT的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)真核細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄和基因表達(dá)有準(zhǔn)確的調(diào)節(jié)作用，而兩者的不平衡帶來(lái)細(xì)胞增殖和分化的失調(diào)，容易引發(fā)腫瘤并對(duì)腫瘤發(fā)展起到促進(jìn)作用(GlozakMA,SetoE.O"coge恥，2007,26:5420-5432;MottetD,Castro麗oV.C7/"~Meto加脈2008,25:183-189)。HDAC通過(guò)移去乙酰基，使組蛋白去乙?；?，染色質(zhì)處于一種緊密的超螺旋結(jié)構(gòu)，基因表達(dá)受到抑制。通過(guò)抑制HDAC，某些重要基因得以轉(zhuǎn)錄，可以退出細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞分化，以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因而通過(guò)抑制HDAC活性，阻礙組蛋白的去乙?；?，可使組蛋白的高度乙酰化，使染色體處于松散狀態(tài)，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子和DNA結(jié)合，從而使被抑制的基因能夠表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的分化，提高放化療的敏感性，發(fā)揮治療腫瘤的作用。通過(guò)對(duì)進(jìn)入臨床研究階段的HDAC抑制劑與其他作用機(jī)制的抗腫瘤藥物聯(lián)合使用的研究發(fā)現(xiàn)，HDAC抑制劑能夠增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物、干擾素、放射治療以及免疫調(diào)節(jié)劑的敏感度，將表現(xiàn)遺傳調(diào)控機(jī)制的藥物與其他作用機(jī)制的抗腫瘤藥物聯(lián)合使用是腫瘤治療的新趨勢(shì)。因此，HDAC抑制劑的相關(guān)研究己經(jīng)成為抗腫瘤藥物研究的非?；钴S的一個(gè)領(lǐng)域。目前，F(xiàn)DA已經(jīng)批準(zhǔn)了首個(gè)HDAC抑制劑Zolinza(SAHA)上市，用于治療皮膚T細(xì)胞淋巴瘤。此外，還有10余種HDAC抑制劑，已經(jīng)進(jìn)入臨床研究的不同階段。HDAC的催化區(qū)由390個(gè)氨基酸殘基組成，其活性區(qū)域?yàn)橐粋€(gè)底部較寬的彎曲管狀口袋，通過(guò)電荷傳遞移去乙酰基，其中一個(gè)重要部分是口袋底部的鋅結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)該位點(diǎn)的鋅離子進(jìn)行螯合是目前HDAC抑制劑作用機(jī)制中的一個(gè)重要因素，如異羥肟酸衍生物(包括SAHA)、環(huán)肽類抑制劑、短鏈脂肪酸類、吡啶氨基甲酸鹽衍生物、苯甲酰胺衍生物及甲基酮類化合物等。這些化合物通常含有極性末端，與催化口袋的鋅離子螯合，其他部分通過(guò)活性位點(diǎn)的連接單元發(fā)揮作用，占據(jù)酶的活性區(qū)，阻止底物靠近鋅離子從而抑制了HDAC的活性。由于現(xiàn)有的抑制劑均含有可與鋅離子螯合的結(jié)構(gòu)，而HDAC具有不同的亞型且體內(nèi)的蛋白酶等也含有鋅等金屬離子，因此目前HDAC抑制劑的選擇性尚不充分。避免和鋅離子直接螯合且能區(qū)分不同HDAC亞型的新型抑制劑是目前耙向HDAC的抑制劑研究的熱點(diǎn)方向。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)手段及經(jīng)典藥物化學(xué)原理研究了Raf和HDAC與各自抑制劑作用的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成了一類脲類化合物，生物活性測(cè)試的結(jié)果表明該類化合物對(duì)Raf和HDAC均具有較好的體外抑制活性，同時(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞株也表現(xiàn)一定的抗增殖活性。因此，本發(fā)明的目的在于，提供具有Raf和HDAC的雙重抑制活性的小分子有機(jī)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。本發(fā)明的另一目的是提供上述化合物的制備方法。本發(fā)明的又一目的是提供包含上述化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的藥物組合物。本發(fā)明的還一目的在于，提供上述化合物或其藥學(xué)上可接受鹽及其藥用組合物的醫(yī)療用途，尤其是在預(yù)防、延緩或治療Raf或HDAC單獨(dú)或兩者同時(shí)參與介導(dǎo)的疾病，特別是腫瘤的藥物中的用途。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供具有通式I所示結(jié)構(gòu)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽其中，X代表取代苯基，取代基選自氫、鹵素、全鹵代、硝基、腈基或鹵代Cwo烷基,取代基優(yōu)選自氫、鹵素、三氟甲基或甲基。根據(jù)本發(fā)明，藥學(xué)上可接受的鹽包括通式I化合物與下列酸形成的酸加成鹽鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、對(duì)甲苯磺酸、萘磺酸、檸檬酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、馬來(lái)酸或苯磺酸琥珀酸、富馬酸、水楊酸、苯基乙酸、杏仁酸。上述通式的化合物優(yōu)選的是具有結(jié)構(gòu)式II或III的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>本發(fā)明還提供了一種上述化合物的制備方法:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>其中x的定義同前。本發(fā)明化合物都可以用上述或類似上述的制備方法制備得到，根據(jù)取代基的不同和取代基位置的不同選用相應(yīng)的原料即可。以上反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間根據(jù)反應(yīng)物而定，一般以TLC跟蹤檢測(cè)反應(yīng)的完成程度，反應(yīng)完畢后通常采用的后處理方法包括抽濾、濃縮反應(yīng)液除盡溶劑、重結(jié)晶、萃取、柱層析分離等。產(chǎn)物結(jié)構(gòu)由核磁共振譜圖、紅外光譜譜圖和質(zhì)譜譜圖來(lái)檢測(cè)確定。生物活性測(cè)試結(jié)果表明，本發(fā)明所提供化合物具有Raf和HDAC雙重抑制效果，同時(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞株的生長(zhǎng)有一定的抑制作用。本發(fā)明化合物可用于治療各種實(shí)質(zhì)性器官癌，其中包括黑色素瘤、肝癌、腎癌、肺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、皮膚癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、睪丸癌、骨癌、腦癌、食管癌、胃腸道癌、軟組織瘤、血癌、淋巴癌等，其中可以是由Raf或HDAC單獨(dú)或兩者共同介導(dǎo)的癌癥，也可以是不依賴于上述機(jī)制的癌癥。因此，本發(fā)明提出，本發(fā)明化合物可用于抗癌藥物的制備。部分化合物的藥理活性試驗(yàn)如下一、Raf抑制活性測(cè)試本發(fā)明化合物在體外對(duì)Raf的抑制活性。以熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluoresenceresonanceenergytransfer,FRET)測(cè)試化合物在體外對(duì)Raf激酶的抑制活性。c-raf(active)、MEKl(inactive)、ERK2(inactive)、ERK2月太底物、ERK2磷酸肽底物、DevelopmentReagentA、StopReagent等購(gòu)自Invitrogen公司；Tris、MgCb、DTT、Glycerol.BSA、TritonX-IOO、HEPES、BRIJ-35、EGTA等購(gòu)自SIGMA公司。測(cè)試時(shí)，Raf、MEKl、ERK2用激酶稀釋液(含20mMTris(pH7.5),0.05%TritonX-100,10%Glycerol,1mMDTT,0.1mg/mLBSA)稀釋至合適濃度后使用。激酶反應(yīng)總體積為10^L，反應(yīng)混合物中含0.002ngraf、10ngMEK1、100ngERK2、2jaMERK2肽底物、50mMHEPES(pH7.5)、0.01%BRIJ-35、10mMMgC2和1mMEGTA。ERK2磷酸肽底物用作100%磷酸化對(duì)照，不加ATP用作0X磷酸化對(duì)照。室溫下反應(yīng)lh后，向反應(yīng)體系中加入5pL適度稀釋的DevelopmentReagentA。室溫下繼續(xù)反應(yīng)1h，加入StopReagent中止反應(yīng)。激發(fā)波長(zhǎng)400nm，同時(shí)檢測(cè)波長(zhǎng)為445nM(香豆素?zé)晒獠ㄩL(zhǎng))和520nM(熒光素?zé)晒獠ㄩL(zhǎng))的熒光強(qiáng)度。受試化合物抑制率=1一受試化合物組的磷酸化率/磷酸化對(duì)照組的磷酸化率，其中磷酸化率=1—"emissionratio*F100%_C100%)/(C0%—C100°/o+emissionratio*(F100%—F0%))，EmissionRatio-香豆素的熒光信號(hào)強(qiáng)度/熒光素的熒光信號(hào)強(qiáng)度，C100%=磷酸化對(duì)照組的香豆素?zé)晒庑盘?hào)強(qiáng)度的平均值，C0%=0%磷酸化對(duì)照組的香豆素?zé)晒庑盘?hào)強(qiáng)度的平均值，F(xiàn)100%=磷酸化對(duì)照組的熒光素?zé)晒庑盘?hào)強(qiáng)度的平均值，F(xiàn)0%=0%磷酸化對(duì)照組的熒光素?zé)晒庑盘?hào)強(qiáng)度的平均值。結(jié)果如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>其中化合物n、ni對(duì)應(yīng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式同前。二、HDAC抑制活性測(cè)試本發(fā)明化合物在體外對(duì)HDAC的抑制活性。采用ELISA酶聯(lián)免疫測(cè)試化合物在體外對(duì)HDAC的抑制活性。EpiQuikHDACActivity/InhibitionAssayKit購(gòu)自Epigentek公司，其中還包含下述試劑，HI(10xwashbuffer)，H2(HDACassaybuffer)，H3(biotinylatedHDACsubstrate)，H4(HDACinhibitor,0.5mM)，H5(麗Cstandard,20Ug/ml)，服(captureantibody100iig/ml)，H7(detectionantibody200ug/ml)，H8(developingsolution)禾口H9(stopsolution)。細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒由碧云天生物技術(shù)研究所提供，其中包含細(xì)胞蛋白抽提試劑A和細(xì)胞蛋白抽提試劑B。PBS由下述方法配制0.2gKCL，0.2gKH2P04,8.0gNaCL，2.0gNa2HP04.12H20依次溶解在三蒸水中，待前一個(gè)完全溶解后加下一成分，最后用水補(bǔ)足到lOOOmL。用含10X小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)HELA細(xì)胞株，每隔3-4天用新鮮的含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液換液，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到全部細(xì)胞培養(yǎng)瓶80%以上時(shí)傳代。提取HELA細(xì)胞核蛋白時(shí)，首先用PBS清洗一遍細(xì)胞，以細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，并用移液器吹打下細(xì)胞，離心收集上清，留下細(xì)胞沉淀備用。每20微升細(xì)胞沉淀加入200nL的添加了苯甲基磺酰氟(PMSF)細(xì)胞蛋白抽提試劑A，(對(duì)于二百萬(wàn)個(gè)HELA細(xì)胞其體積大約為20^L。)，高速渦旋5秒后，把細(xì)胞沉淀完全懸浮并分散開，冰浴5—10分鐘，加入細(xì)胞漿蛋白抽提試劑B10微升，高速渦旋5秒鐘后，冰浴1分鐘，高速劇烈渦旋5秒后，4'C，12000-16000g離心5分鐘。對(duì)于沉淀，完全吸盡殘余的上清后，加入50的添加了PMSF的細(xì)胞核蛋白抽提試劑A,高,劇烈渦旋15-30秒，把細(xì)胞完全懸浮并分散開，然后放回冰中，每隔1-2分鐘再高速劇烈渦旋15-30秒，共30分鐘，4'C，12000-16000g，離心10分鐘。立即吸取上清至一預(yù)冷的塑料管中，即為抽提得到的細(xì)胞核蛋白，可立即使用，也可-7(TC保存。測(cè)試活性時(shí)，用三蒸水將H1稀釋10倍，調(diào)節(jié)PH到7.2-7.5。用H1將H3以1:50的比例稀釋，向96孔板的孔中加入50^L。用Hl梯度稀釋H5后在分別每個(gè)孔中加入1^LHELA細(xì)胞核蛋白提取物后，用封口膜密封所有孔后，室溫孵化45分鐘。吸出液體后用150^L的Hl洗兩遍，加入30pL的H2后37。C孵化45分鐘。吸出液體后用150pL的Hl洗三遍。用Hl將H6以1:100的比例稀釋到1嗎/mL，每孔加入H650室溫?fù)u床孵化1個(gè)小時(shí)。吸出液體后用150|iL的HI洗四遍。用HI將H7以1:100的比例稀釋到0.2嗎/mL，每孔加入50^L室溫孵化半個(gè)小時(shí)。吸出液體后用150pL的Hl洗五遍。每孔加入H8100pL，室溫孵化5分鐘。待孔中溶液呈現(xiàn)藍(lán)色，每孔加入H950fiL，使用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)試吸光度。每個(gè)化合物均以DMS0配制為0.01minol/L、0.001腦ol/L和0.0001mmol/L等三個(gè)濃度的溶液，每一濃度的下化合物重復(fù)三次測(cè)試。受試化合物的抑制率=(1-0D(inhibitorsa即le-blank)/0D(noinhibitorsample-blank))xioo%。受試化合物的IC5在Excel中以濃度和對(duì)應(yīng)抑制率，經(jīng)非線性回歸擬合而得。結(jié)果如下表所示化合物IC5"mol/L)II2.82X10"*III2.61X1(T3三、體外腫瘤細(xì)胞抑制活性測(cè)試本發(fā)明化合物在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞株的抑制活性。采用四甲基偶氮唑鹽(methylthiazolyltetrazolium,MTT)比色法測(cè)試本發(fā)明化合物對(duì)體外腫瘤細(xì)胞增殖的抑制活性，所選細(xì)胞株為人肺癌細(xì)胞A549,人低分化胃腺癌細(xì)胞BGC-823,人肝癌細(xì)胞SMMC-7721和人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞HL-60,陽(yáng)性對(duì)照藥為阿霉素和羥基喜樹堿。測(cè)試時(shí)，取處于指數(shù)生長(zhǎng)期、狀態(tài)良好的細(xì)胞一瓶，加入濃度為0.25%的胰蛋白酶消化液，消化使貼壁細(xì)胞脫落，計(jì)數(shù)24xl04個(gè)/ml，制成細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液接種于96孔板上，180pl/孔，置恒溫C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。然后換液，加入受試藥物，20^1/孔，培養(yǎng)48h。將MTT加入96孔板中，20pl/孔，培養(yǎng)箱中反應(yīng)4h。吸去上清液，加入DMSO，150|^1/孔，平板搖床上振搖10min。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在波長(zhǎng)為570nm處測(cè)定每孔的光密度(OD值)，細(xì)胞抑制率=(陰性對(duì)照組OD值._受試物組OD值)/陰性對(duì)照組OD值x100%。結(jié)果如下表所示:<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>具體實(shí)施例方式下述制備例中，熔點(diǎn)用b形熔點(diǎn)管測(cè)定，介質(zhì)為濃硫酸，溫度計(jì)未校正；IR譜用NicoletImpact410型紅外光譜儀測(cè)定，KBr壓片；'HNMR用JEOLFX90Q型傅立葉變換核磁共振儀、BRUKERACF-300型核磁共振儀和BRUKERAM-500型核磁共振儀完成(TMS內(nèi)標(biāo))；MS用Nicolet2000型傅立葉變換質(zhì)譜儀和MAT-212型質(zhì)譜儀測(cè)定。薄層色譜所用硅膠為青島海洋化工有限公司生產(chǎn)的GF254薄層色譜硅膠；柱色譜所用硅膠為青島海浪硅膠干燥劑廠生產(chǎn)，規(guī)格為160~200目。所用化學(xué)試劑均為分析純或化學(xué)純。實(shí)施例1:11<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>將5-氯-2-硝基-苯甲酸100g(0.5mol)，SOCl2200ml，7V，iV-二甲基甲酰胺(DMF)2ml依次加入反應(yīng)瓶，回流5小時(shí)，反應(yīng)液變澄清，稍冷，減壓蒸去過(guò)量SOCb，剩余液體冷卻固化，得粗品101g，收率98.3%，未經(jīng)純化直接用于下一步反應(yīng)。將化合物2粗品加入干燥二氧六環(huán)500ml溶解，05'C通入甲胺氣體，至混合物pH為堿性。室溫反應(yīng)'l小時(shí)。濃縮至約150ml，傾入冰水中，待產(chǎn)物析出后抽濾，烘干，用乙酸乙酯重結(jié)晶，得到淡黃色晶體(化合物3).87g，收率82%，MP:134136"。50ml三頸瓶中，加入對(duì)氨基酚0.96g(8.8mmo1),干燥DMF(用分子篩干燥)15ml，氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入叔丁醇鉀1.03g(9.2mmol),室溫?cái)嚢?h。再加入化合物31.5g(7.0mmo1)，無(wú)水碳酸鉀0.8g(8.0mmo1)，加熱到80'C，反應(yīng)6小時(shí)，冷卻至室溫，倒入100ml飽和食鹽水中。用乙酸乙酯100mlx3萃取，水相用乙酸乙酯提取一次，合并有機(jī)層，用無(wú)水硫酸鎂干燥。柱層析，展開體系乙酸乙酯一石油醚(V:V=1:2)，得到化合物41.25g，收率62%。MP:147148。C。在反應(yīng)瓶中加入對(duì)4-氯-3-三氟甲基-苯胺0.254g(1.3mmol)SCH2Cl24ml，氮?dú)獗Ｗo(hù)。溶解后，加入CC)I0.316g(2.0mmo1)，常溫下反應(yīng)16h后，滴加化合物40.5g(1.7mmo1)，繼續(xù)攪拌18h,有類白色沉淀析出。抽濾后，.濾餅用CH2Cl26mlx2洗滌。真空干燥，得產(chǎn)物。產(chǎn)物用THF重結(jié)晶，得到化合物50.39g，收率50%。MP:234235°C。反應(yīng)瓶中加入化合物5150mg，還原鐵粉500mg，氯化銨400mg，THF2ml，水0.5ml，緩慢升溫至75。C，TLC檢領(lǐng)U，三小時(shí)后反應(yīng)完全，加入5ml乙酸乙酯，抽濾，得濾液。分液，水相用乙酸乙酯提取三次。有機(jī)相用無(wú)水硫酸鎂干燥。抽濾，濃縮濾液得粗品133mg，柱層析分離純化得精品(化合物n)118mg，收率84%。'HNMR[DMSO-d6]數(shù)據(jù)S2.70(d，J=4.5，3H，H-17,CH3),6.97(d'J=2.7Hz,1H，13-H),7.10(d,J=2.7Hz，1H，12-H)，7.14，7.58(AA，BB，，q，J=8.9Hz,4H，H陽(yáng)5、6、7、8，芳?xì)?，7.63(s，1H,9—H，芳?xì)?，7.66(m，1H，3—H，芳?xì)?8.08(s,1H，4—H，芳?xì)?，8.12(s,1H，2-H，芳?xì)?，8.52(q，1H，NHCH3)，8.76(s，1H,脲基氫)，9.11(s，1H，脲基氫)。IR(KBr，cm")數(shù)據(jù):3394，3338，3294，3136，3078,2947，2881,2569,1706，1635，1602,1554,1487，1419,1332，1311，1274，1224,1174，1130，1033,933，883，821，682,536，511，437。MS(m/z)數(shù)據(jù)509[M+H]+。實(shí)施例2用類似于實(shí)施例1的方法制備得到本實(shí)施例的最終產(chǎn)物，即化合物III，化合物III的部分檢測(cè)數(shù)據(jù)如下'HNMR[DMS0-d6]:S2.21(s，6H，AR—CH3)，2.69(d，J=4.5，3H，N—CH3)，3.29(s，2H，NH2)，6.59(s，1H，芳?xì)?，6.72(d，J:2.7Hz，1H,芳?xì)?，6.82，7.37(AA，BB'，q,J=8.9Hz，4H,芳?xì)?，6.89(m，1H，芳?xì)?7.05(s，2H，芳?xì)?，7.40(s，1H，芳?xì)?，8.18(q,1H，NHCH3)，8.40(s，1H，脲基氫)，8.51(s，1H，脲基氫)。IR(KBr,cm")數(shù)據(jù)3469，3386，3311，2916，1641，1558，1502，1417，1294，1224,1155，935，842，635，516。MS(w/2)數(shù)據(jù)452[M+H]+。權(quán)利要求1、具有通式I結(jié)構(gòu)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽其中X代表取代苯基，取代基選自氫、鹵素、全鹵代、硝基、腈基或鹵代C1-10烷基。2、權(quán)利要求1的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中X代表氫、鹵素、三氟甲基或甲基。3、權(quán)利要求i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，為具有以下結(jié)構(gòu)式ii或ni所示結(jié)構(gòu)的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>4、權(quán)利要求l^化合物的制備方法，包括:OO<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中X的定義同權(quán)利要求l。5、一種藥物組合物，其中含有權(quán)利要求l的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。6、權(quán)利要求l的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽用于制備Raf抑制劑的用途。7、權(quán)利要求l的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽用于制備HDAC抑制劑的用途。8、權(quán)利要求1的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽用于制備預(yù)防、延緩或治療Raf或HDAC單獨(dú)或兩者同時(shí)參與介導(dǎo)的疾病的藥物的用途。9、權(quán)利要求8的用途，其中Raf或HDAC單獨(dú)或兩者同時(shí)參與介導(dǎo)的疾病是腫瘤。10、權(quán)利要求9的用途，其中腫瘤是腎癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌、胰腺癌、淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌、結(jié)腸直腸癌、腦癌或乳腺癌。全文摘要本發(fā)明提供一類具有通式I所示結(jié)構(gòu)的化合物，生物活性測(cè)試結(jié)果表明，對(duì)Raf和HDAC均有抑制活性，且對(duì)腫瘤細(xì)胞株有一定的增殖抑制作用。本發(fā)明還提供了該類化合物的制備方法，以及包含該抑制劑或其藥學(xué)上可接受鹽的藥用組合物，以及該抑制劑或其藥學(xué)上可接受鹽及其藥用組合物的醫(yī)療用途，尤其涉及在預(yù)防、延緩或治療Raf或HDAC單獨(dú)或兩者同時(shí)參與介導(dǎo)的疾病，特別是腫瘤的藥物中的用途。文檔編號(hào)C07C275/36GK101475513SQ20091002817公開日2009年7月8日申請(qǐng)日期2009年1月20日優(yōu)先權(quán)日2009年1月20日發(fā)明者帥盧,張陸勇,雍朱,宇焦,濤陸,陳亞東申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)