專利名稱：使用蛋白a親和色譜法純化抗體的方法
使用蛋白A親和色譜法純化抗體的方法貫穿本申請(qǐng)，在圓括號(hào)中用阿拉伯?dāng)?shù)字提及不同的參考文獻(xiàn)。這些出版物的公開內(nèi)容于此通過(guò)引用全部并入本申請(qǐng)中，以更完整地描述本發(fā)明所述領(lǐng)域的狀況。在說(shuō)明書最后(所附權(quán)利要求之前)可以找到這些參考文獻(xiàn)的全部文獻(xiàn)標(biāo)引。
背景技術(shù)：
在過(guò)去的10年中，關(guān)于治療性單克隆抗體(mAb)的申請(qǐng)已經(jīng)顯著增加。MAb穩(wěn)定性代表著這些蛋白的純化和配制中的當(dāng)前挑戰(zhàn)。MAb不穩(wěn)定性導(dǎo)致蛋白制劑中高水平的 mAb聚集，這可以具有幾個(gè)缺點(diǎn)，包括改變蛋白活性和潛在地導(dǎo)致在患者中的不希望的免疫應(yīng)答。蛋白A親和色譜法是用于純化抗體的有力且廣泛使用的工具。為了從蛋白A樹脂洗脫蛋白或抗體，由于單克隆抗體對(duì)樹脂的高親和力，需要酸性條件。暴露于這些酸性條件，可以導(dǎo)致蛋白聚集體的形成。以前已經(jīng)在文獻(xiàn)中描述了一些解決在蛋白A色譜法過(guò)程中聚集的策略(1，2，3，4，5，6)。此外，病毒滅活需要在洗脫后的低pH保持步驟，且該步驟也可以導(dǎo)致蛋白聚集體的形成(7，8，9)。以前，一個(gè)減少mAb制劑中的蛋白聚集的方案是使用額外的色譜法步驟。該方案在材料和處理時(shí)間方面都是昂貴的；且它也導(dǎo)致每一步的產(chǎn)物損失，這可以降低mAb產(chǎn)物
的總產(chǎn)率。另一個(gè)以前的減少mAb制劑中的蛋白聚集的方案是使用先進(jìn)的色譜法方法，諸如峰切割，以減少在親和色譜法步驟之后的蛋白聚集的量。這些方案是耗時(shí)的，且它們經(jīng)常是不成功的，需要額外的色譜法步驟來(lái)生產(chǎn)適合人用的mAb制劑。再一個(gè)以前的減少mAb制劑中的蛋白聚集的方案是使用穩(wěn)定劑，這可以具有幾個(gè)缺點(diǎn)，包括，蛋白活性的變化、其它純化步驟的困難、和潛在地在患者中的不希望的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的主題方法解決了對(duì)為了純化適合人用的單體單克隆抗體而減少單克隆抗體制劑中的蛋白聚集的更簡(jiǎn)單且更廉價(jià)的方法的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了從樣品中純化單體單克隆抗體的第一種方法，其中所述樣品包含單體單克隆抗體、宿主細(xì)胞雜質(zhì)、二聚體和更高階聚集體，所述方法包括(a)使樣品接觸蛋白A親和色譜柱；(b)使用洗脫緩沖液，從蛋白A親和色譜柱洗脫單體單克隆抗體；和(c) 收集來(lái)自步驟(b)的單體單克隆抗體的一個(gè)或多個(gè)級(jí)分，形成蛋白A產(chǎn)物庫(kù)，其中所述產(chǎn)物庫(kù)(i)包含小于5%的更高階聚集體，且(ii)具有約3. 5至約4.5的pH，由此從樣品純化單體單克隆抗體。本發(fā)明提供了從樣品中純化單體單克隆抗體的第二種方法，其中所述樣品包含單體單克隆抗體、宿主細(xì)胞雜質(zhì)、二聚體和更高階聚集體，所述方法包括(a)在約15°C至約 27°C的溫度下，使樣品接觸蛋白A親和色譜柱；(b)使用洗脫緩沖液，從蛋白A親和色譜柱洗脫單體單克隆抗體，所述洗脫緩沖液包含濃度為約0.030 M至約0.085 M的檸檬酸鹽；和 (c)收集來(lái)自步驟(b)的單體單克隆抗體的一個(gè)或多個(gè)級(jí)分，形成蛋白A產(chǎn)物庫(kù)，其中所述產(chǎn)物庫(kù)(i)包含小于5%的更高階聚集體，且(ii)具有約3. 5至約4. 0的pH，由此從樣品純化單體單克隆抗體。本發(fā)明提供了從樣品中純化單體單克隆抗體的第三種方法，其中所述樣品包含單體單克隆抗體、宿主細(xì)胞雜質(zhì)、二聚體和更高階聚集體，所述方法包括(a)在約15°C至約 27°C的溫度下，使樣品接觸蛋白A親和色譜柱；(b)使用洗脫緩沖液，從蛋白A親和色譜柱洗脫單體單克隆抗體，所述洗脫緩沖液包含濃度為約0.050 M至約0. 200 M的醋酸鹽；和 (c)收集來(lái)自步驟(b)的單體單克隆抗體的一個(gè)或多個(gè)級(jí)分，形成蛋白A產(chǎn)物庫(kù)，其中所述產(chǎn)物庫(kù)(i)包含小于5%的更高階聚集體，且(ii)具有約3. 5至約4. 5的pH，由此從樣品純化單體單克隆抗體。


圖1顯示了抗-DKK-I單克隆抗體(在圖22中顯示的SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2)在4°C、17°C和37°C在pH6. 1的PAP庫(kù)中更高階聚集體的形成速率作為時(shí)間的函數(shù)。 在該圖中，口 = pH 6. 1 在 4°C，ο = pH 6. 1 在 17°C，且 Δ = pH 6. 1 在 37°C。圖2顯示了抗-DKK-I單克隆抗體(在圖22中顯示的SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2)在4°C、17°C和37°C在pH3. 5的PAP庫(kù)中更高階聚集體的形成速率作為時(shí)間的函數(shù)。 在該圖中，口 = pH 3. 5 在 4°C，ο = pH 3. 5 在 17°C，且 Δ = pH 3. 5 在 37°C。圖3顯示了抗-DKK-I單克隆抗體在4°C、17°C和37°C在pH6. 1的PAP庫(kù)中二聚體的形成速率作為時(shí)間的函數(shù)。在該圖中，口 = pH 6. 1在4°C，ο = pH 6. 1在17°C，且Δ =pH 6. 1 在 37°C。圖4顯示了抗-DKK-I單克隆抗體在4°C、17°C和37°C在pH3. 5的PAP庫(kù)中二聚體的形成速率作為時(shí)間的函數(shù)。在該圖中，口 = pH 3. 5在4°C，且ο = pH 3. 5在17°C。圖5顯示了抗-DKK-I單克隆抗體在25°C和30°C在pH3. 5的PAP庫(kù)中更高階聚集體的形成速率作為時(shí)間的函數(shù)。在該圖中，口 = pH 3. 5在25°C，且ο = pH 3. 5在30°C。圖6顯示了抗-DKK-I單克隆抗體在25°C和30°C在pH3. 5的PAP庫(kù)中二聚體的形成速率作為時(shí)間的函數(shù)。在該圖中，口 = pH 3. 5在25°C，且ο = pH 3. 5在30°C。圖7顯示了抗-DKK-I單克隆抗體在21°C在pH4. 0,4. 5禾Π 5. 0更高階聚集體的形成速率作為時(shí)間的函數(shù)。在該圖中，□ = PH 4.0在21°C，ο = pH 4.5在21°C，且Δ = pH 5.0 在 21°C。圖8顯示了抗-DKK-I單克隆抗體在30°C在pH4. 0,4. 5和5. 0更高階聚集體的形成速率作為時(shí)間的函數(shù)。在該圖中，口 = PH 4. 0在30°C，ο = pH 4. 5在30°C，且Δ = pH 5. 0 在 30 °C ο圖9顯示了抗-DKK-I單克隆抗體在21°C在pH4. 0,4. 5和5. 0 二聚體的形成速率作為時(shí)間的函數(shù)。在該圖中，□ = pH 4. 0在21°C，ο = pH 4. 5在21°C，且Δ = pH 5. 0 在 21°C。圖10顯示了抗-DKK-I單克隆抗體在30°C在pH4. 0,4. 5和5. 0 二聚體的形成速率作為時(shí)間的函數(shù)。在該圖中，口 = pH 4. 0在30°C，ο = pH 4. 5在30°C，且Δ = pH 5. 0在 30 0C ο圖11顯示了抗-DKK-I單克隆抗體PAP在pH 3. 5在4°C、17°C、25°C和30°C相對(duì)于時(shí)間的更高階聚集體的水平。在該圖中，■ = 30°C, = 25 °C, ▲ =17°C，且χ = 4°C。圖12顯示了抗-DKK-I單克隆抗體在pH 3. 91和50mM檸檬酸鹽濃度中更高階聚集體形成作為時(shí)間和溫度的函數(shù)。在該圖中， = PH 3.91在4°〇，口 = pH 3.91在15°〇， Δ = pH 3. 91 在 20°C，且 χ = pH 3. 91 在 24°C。圖13顯示了抗-DKK-I單克隆抗體在室溫在50mM和100 mM檸檬酸鹽濃度中更高階聚集體形成作為時(shí)間的函數(shù)。在該圖中，■ = pH 3.5在25°〇，且 =pH 3.91在對(duì)24°C。圖14顯示了抗-DKK-I單克隆抗體在25°C更高階聚集體形成作為檸檬酸鹽濃度和時(shí)間的函數(shù)。在該圖中，□= 60 mM檸檬酸鹽在PH 3. 8, =75 mM檸檬酸鹽在PH 3.6， = 100 mM檸檬酸鹽在PH 3. 6, = 85 mM檸檬酸鹽在PH 3. 4，且 =40 mM 檸檬酸鹽在PH 3.4。圖15A顯示了抗-DKKl抗體在30 mM、60mM和100mM檸檬酸鹽中在pH3. 0的DSC曲線。圖15B顯示了抗-DKKl抗體在30 mM、60mM和100mM檸檬酸鹽中在pH3. 5的DSC曲線。圖15C顯示了抗-DKKl抗體在30mM、60mM和100mM檸檬酸鹽中在pH4. 0的 DSC曲線。圖16A顯示了抗-DKKl抗體在30mM、60mM和100mM檸檬酸鹽中在pH4. 5的 DSC曲線。圖16B顯示了抗-DKKl抗體在30mM、60mM和100mM檸檬酸鹽中在pH5. 0的 DSC曲線。圖16C顯示了抗-DKKl抗體在30mM、60mM和100mM檸檬酸鹽中在pH5. 5的 DSC曲線。圖16D顯示了抗-DKKl抗體在30mM、60mM和100mM檸檬酸鹽中在pH6. 0的 DSC曲線。圖17顯示了在25 °C用含有和不含50 mM精氨酸的60 mM檸檬酸鹽洗脫時(shí)
抗-DKK-I單克隆抗體的更高階聚集體的形成速率。在該圖中，O = 60 mM檸檬酸鹽+ 50 mM精氨酸，在pH 3. 5和25°C，且口 =僅60 mM檸檬酸鹽，在pH 3. 5和25°C。圖18顯示了在25 °C用含有和不含250 mM精氨酸的100 mM檸檬酸鹽洗脫時(shí)抗-DKK-I單克隆抗體的更高階聚集體的形成速率。在該圖中，0 = 100 mM檸檬酸鹽+ 250 mM精氨酸，在pH 3. 5和25°C，且口 =僅100 mM檸檬酸鹽，在pH 3. 5和25°C。圖19顯示了與磷酸鹽緩沖液相比，抗-DKK-I單克隆抗體在不同的檸檬酸鹽濃度在25°C更高階聚集體的形成速率作為時(shí)間的函數(shù)。在該圖中， = 60 mM檸檬酸鹽， ■ =75 mM檸檬酸鹽， = 40 mM檸檬酸鹽， =H3PO4，
=100 mM檸檬酸鹽，且■ =85mM檸檬酸鹽。 圖20顯示了抗-DKK-I單克隆抗體的單克隆抗體濃度對(duì)在25°C在15 mM檸檬酸鹽中的更高階聚集速率隨時(shí)間影響。在該圖中，=8 mg/mL抗-DKK-I mAb, ■ = 14 mg/mL 抗-DKK-I —，且▲ =34 mg/mL 抗-DKK-1 mAb。
圖21顯示了抗-DKK-I單克隆抗體的單克隆抗體濃度對(duì)在pH 4. 0、在15 mM檸檬酸鹽中在21 °C和在85 mM醋酸鹽中在25°C的更高階聚集速率隨時(shí)間影響。在該圖中，· =在醋酸鹽中5 mg/mL抗-DKK-1 mAb,+ =在醋酸鹽中11 mg/mL抗-DKK-1 mAb, Δ =在醋酸鹽中37 mg/mL抗-DKK-1 mAb，且=在檸檬酸鹽中7 mg/mL抗-DKK-1 mAb。圖22顯示了抗-DKK-I單克隆抗體的重鏈和輕鏈氨基酸序列(SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2)。圖23顯示了抗-ADDL # 1單克隆抗體的重鏈和輕鏈氨基酸序列(SEQ ID NO: 3和 SEQ ID NO:4)ο圖對(duì)顯示了抗-ADDL # 2單克隆抗體的重鏈和輕鏈氨基酸序列(SEQ ID N0:5和 SEQ ID NO:6)ο圖25顯示了抗-hIL_13r α-1單克隆抗體的重鏈和輕鏈氨基酸序列(SEQ ID Ν0:7 和 SEQ ID N0:8)ο圖沈顯示了來(lái)自單克隆抗體的IgG2m4 Fc區(qū)的氨基酸序列與來(lái)自IgGl、IgG2和 IgG4的Fc區(qū)的氨基酸序列的比對(duì)。
具體實(shí)施例方式
本文使用的術(shù)語(yǔ)“蛋白”或“多肽”是指由通過(guò)肽鍵共價(jià)連接到一起的氨基酸殘基組成的多肽。本文使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”、“免疫球蛋白”和“免疫球蛋白分子”可互換地使用。每個(gè)抗體具有允許它結(jié)合它的特定抗原的獨(dú)特結(jié)構(gòu)，但是所有抗體具有相同的本文所述的總體結(jié)構(gòu)。已知基礎(chǔ)抗體結(jié)構(gòu)單元包含亞基的四聚體。每個(gè)四聚體具有2個(gè)相同的多肽鏈對(duì)，每個(gè)對(duì)具有1個(gè)“輕”鏈(約25 kDa)和1個(gè)“重”鏈(約50-70 kDa)。每個(gè)鏈的氨基端部分包括約100-110個(gè)或更多個(gè)氨基酸的可變區(qū)，其主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別。每個(gè)鏈的羧基端部分定義為恒定區(qū)，其主要負(fù)責(zé)效應(yīng)子功能(10)。術(shù)語(yǔ)“Fe”片段是指含有CH2和Ch3結(jié)構(gòu)域的抗體的“片段結(jié)晶的” C-端區(qū)域。術(shù)語(yǔ)“Fab”片段是指含有VH、ChUVl和Q結(jié)構(gòu)域的抗體的“片段抗原結(jié)合”區(qū)域。本文使用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”(mAb)是指從基本上均一的抗體群體得到的抗體， 即，除了可能以微量存在的可能天然存在的突變以外，構(gòu)成該群體的單個(gè)抗體是相同的。單克隆抗體是高度特異性的，針對(duì)單個(gè)抗原位點(diǎn)。此外，不同于通常包括針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制品，每個(gè)mAb針對(duì)抗原上的單個(gè)決定簇。除了它們的特異性以外，單克隆抗體的優(yōu)勢(shì)在于，它們可以通過(guò)雜交瘤培養(yǎng)來(lái)合成，未被其它免疫球蛋白污染。術(shù)語(yǔ)“單克隆”是指從基本上均一的抗體群體得到的抗體的特征，不應(yīng)解釋為要求通過(guò)任意特定方法來(lái)生產(chǎn)抗體。例如，本文的單克隆抗體可以通過(guò)Kohler等人，(1975) Nature, 256:495首先描述的雜交瘤方法來(lái)制備，或可以通過(guò)重組DNA方法來(lái)制備(11)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“單體單克隆抗體”是指含有2個(gè)重鏈和2個(gè)輕鏈的抗體分子，即單體。本文使用的“抗-DKK-I”抗體是指具有在SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2 (參見圖 22)中所述的輕鏈和重鏈氨基酸序列的單克隆抗體。
本文使用的“抗-ADDL”抗體是指具有在SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4或SEQ ID N0:5和SEQ ID NO:6 (分別參見圖23和圖中所述的重鏈和輕鏈氨基酸序列的單克隆抗體。本文使用的“抗-hIL_13ra 1”抗體是指具有在SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8 (參見圖25)中所述的重鏈和輕鏈氨基酸序列的單克隆抗體。本文使用的“修飾的IgG2抗體”是指這樣的抗體，其具有由圖沈所示的氨基酸序列表示的單克隆抗體的“IgG2m4”Fc區(qū)。術(shù)語(yǔ)“二聚體”本文使用的是指由2個(gè)稱作單體的亞基組成的生物分子。本發(fā)明的“二聚體”是指含有2個(gè)單體單克隆抗體的分子。本文使用的術(shù)語(yǔ)“更高階聚集體”或“Η0Α”是指單體單克隆抗體的大寡聚體，通常大于300 kDa，即二聚體分子量。本文使用的術(shù)語(yǔ)“聚集體”或“聚集”是指2個(gè)或更多個(gè)單個(gè)分子的團(tuán)聚 (agglomeration)或寡聚，即蛋白聚集體或蛋白聚集。蛋白聚集體可以是可溶的或不溶的。本文使用的“雜質(zhì)”是指不同于目標(biāo)蛋白產(chǎn)物的物質(zhì)，諸如蛋白聚集體。雜質(zhì)可以是目標(biāo)蛋白或另一種蛋白的變體。本文的雜質(zhì)的具體實(shí)例包括來(lái)自生產(chǎn)目標(biāo)蛋白的宿主細(xì)胞的蛋白，諸如宿主蛋白、浸出的(leached )蛋白A、DNA、RNA等(參見，例如美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào) US 2005/0038231)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“蛋白降解”是指這樣的單體單克隆抗體或蛋白，其在一定條件下降解，形成二聚體或更高階聚集體。初步回收產(chǎn)生蛋白A色譜法的進(jìn)料流。用于描述該進(jìn)料流的一個(gè)術(shù)語(yǔ)稱作“深度過(guò)濾的離心分離液”，且如本文所使用的，是指已經(jīng)通過(guò)離心(去除細(xì)胞和碎片)和深度過(guò)濾(去除< 10 μ m的細(xì)碎片)處理過(guò)的單克隆抗體或蛋白溶液。在本發(fā)明中，深度過(guò)濾的產(chǎn)物被用作蛋白A親和色譜法實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)的進(jìn)料溶液，并用于生產(chǎn)不同的臨床批次。術(shù)語(yǔ)“蛋白A親和色譜法”是指使用蛋白A分離或純化物質(zhì)和/或顆粒，其中所述蛋白A通常固定化在固相上。蛋白A是最初在金黃色葡萄球菌(份a/^j^ococcm aureas) 中發(fā)現(xiàn)的40-60 kD細(xì)胞壁蛋白?？贵w對(duì)蛋白A樹脂的結(jié)合是高度特異性的。蛋白A以高親和力結(jié)合免疫球蛋白的Fc區(qū)。它以高親和力結(jié)合人IgGl和IgG2以及小鼠IgGh和 IgG2b。蛋白A以中等親和力結(jié)合人IgM、IgA和IgE以及小鼠IgG3和IgGl。包含CH2/CH3 區(qū)的蛋白可以可逆地被蛋白A結(jié)合或吸附。用于本文的蛋白A親和色譜法中的蛋白A親和色譜柱包括但不限于固定化在瓊脂糖固相上的蛋白A，例如MABSELECT 或MABSURE 柱 (Amersham Biosciences Inc.)；固定化在聚苯乙烯固相上的蛋白A，例如P0R0S 50A 柱 (Applied Biosystems Inc.)。當(dāng)與本發(fā)明的方法一起使用時(shí)，“樣品”包括但不限于任意身體組織、血液、血清、 血漿、腦脊髓液、淋巴細(xì)胞、滲出物或來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液。術(shù)語(yǔ)“裝載”或“負(fù)載”是指每單位體積的蛋白的量。本文使用的術(shù)語(yǔ)“接觸”是指使單克隆抗體接觸在蛋白A親和色譜柱中的蛋白A樹脂。本文使用的術(shù)語(yǔ)“洗脫緩沖液”是指包含諸如檸檬酸鈉或醋酸鈉等主要物質(zhì)(a primary species)的緩沖液，其用于從蛋白A親和柱洗脫抗體。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“檸檬酸鹽”是指從對(duì)應(yīng)的酸或鹽衍生出的存在于洗脫緩沖液中的陰離子物質(zhì)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“醋酸鹽”是指從對(duì)應(yīng)的酸或鹽衍生出的存在于洗脫緩沖液中的陰離子物質(zhì)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“級(jí)分”(“fraction”)，如在“收集一個(gè)或多個(gè)級(jí)分”中，是指分離過(guò)程的結(jié)果，在所述分離過(guò)程中，將一定量的混合物(固體、液體、溶質(zhì)或懸浮液)分成許多更小的量(“級(jí)分”)，其中組成根據(jù)梯度變化。在這里，隨著單體單克隆抗體從蛋白A親和柱洗脫，收集級(jí)分。本文使用的術(shù)語(yǔ)“再生緩沖液”是指用于清潔柱以去除結(jié)合的雜質(zhì)的緩沖液。例如，高鹽緩沖液、含有NaOH的或含有磷酸的緩沖液(13)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“柱體積”或“CV”是指在柱內(nèi)填充的樹脂的體積，包括任意空體積。例如，如果給10 mL柱填充了 2 ml樹脂，則一個(gè)CV是2 mL。本文使用的術(shù)語(yǔ)“停留時(shí)間”是指一部分產(chǎn)物與樹脂相互作用的時(shí)間的量。本文使用的術(shù)語(yǔ)“流速”是指柱體積除以停留時(shí)間。例如，在指定的5 min停留時(shí)間，裝有10 ml樹脂的柱的流速如下本文使用的術(shù)語(yǔ)“蛋白A產(chǎn)物”或“PAP”是指使用諸如檸檬酸鈉或醋酸鈉等酸從蛋白A親和色譜柱洗脫的產(chǎn)物。本文使用的術(shù)語(yǔ)“猝滅的蛋白A產(chǎn)物”或“QPAP”是指將堿加入PAP，諸如tris堿或磷酸鹽溶液，以使PAP的pH從約pH 3. 0-4. 0升高至約6. 0 - 7. 5。本文使用的術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)率”是指回收的產(chǎn)物的量除以裝載到柱上的產(chǎn)物的量，乘以 100。例如，給柱裝載含有100 g產(chǎn)物的溶液，但是從該柱在洗脫流中回收了 80 g產(chǎn)物，則
具有80%產(chǎn)率。本文使用的術(shù)語(yǔ)“示差掃描量熱法”或“DSC”是指這樣的熱分析技術(shù)，其測(cè)量升高樣品和參照物的溫度所需的熱的量的差異作為溫度的函數(shù)。對(duì)于蛋白，DSC會(huì)提供關(guān)于蛋白和它的單個(gè)結(jié)構(gòu)域的熱穩(wěn)定性和未折疊形式的蛋白的溶解度的信息。本文使用的術(shù)語(yǔ)“高壓或高效液相色譜法”或“HPLC”是指，使用高壓來(lái)分離、鑒別和定量化合物的柱色譜法形式。HPLC使用裝有在特定溫度的固定相的柱、流動(dòng)相溶液的泵、 和用于定量注射到柱上的每種化合物的檢測(cè)器。術(shù)語(yǔ)“高壓尺寸排阻色譜法”或“HPSEC”是指這樣的色譜方法，其使用高壓QO -150巴)基于它們的分子量或流體力學(xué)體積來(lái)分離顆粒。在本發(fā)明中，將該技術(shù)用于分離和定量單克隆抗體、二聚體和更高階聚集體。本文使用的術(shù)語(yǔ)“小規(guī)?！笔侵感∮?00 mL樹脂的蛋白A親和柱尺寸。本文使用的術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定劑”是指降低蛋白聚集體形成速率的試劑，諸如精氨酸、脯
氨酸或組氨酸。本文使用的術(shù)語(yǔ)“時(shí)間零點(diǎn)樣品”是指實(shí)驗(yàn)的起始時(shí)間，其表示產(chǎn)物已經(jīng)剛剛從樹脂洗脫。本發(fā)明的實(shí)施方案本發(fā)明提供了從樣品中純化單體單克隆抗體的第一種方法，其中所述樣品包含單體單克隆抗體、宿主細(xì)胞雜質(zhì)、二聚體和更高階聚集體，所述方法包括(a)使樣品接觸蛋白A 親和色譜柱；(b)使用洗脫緩沖液，從蛋白A親和色譜柱洗脫單體單克隆抗體；和(c)收集來(lái)自步驟(b)的單體單克隆抗體的一個(gè)或多個(gè)級(jí)分，形成蛋白A產(chǎn)物庫(kù)，其中所述產(chǎn)物庫(kù) (i)包含小于5%的更高階聚集體，且(ii)具有約3. 5至約4. 5的pH，由此從樣品純化單體單克隆抗體。在上述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述洗脫緩沖液是醋酸鹽或檸檬酸鹽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述洗脫緩沖液中檸檬酸鹽的濃度是約0.030 M至約0.085 M0本文使用的“約”是指士 0.015 M0在另一個(gè)實(shí)施方案中，醋酸鹽的濃度是約0. 050 M至約0. 200 M。本文使用的“約” 是指士 0. 015 M0在上述方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法在約4°C至約30 °C的溫度進(jìn)行。本文使用的“約”是指士 4°C。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法在約15°C至約27 °C的溫度進(jìn)行。本文使用的 “約”是指士 4°C。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單體單克隆抗體是IgG抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述單體單克隆抗體是IgGl或修飾的IgG2抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述IgGl抗體是抗-ADDL抗體。一個(gè)實(shí)例是抗-ADDL抗體，其重鏈和輕鏈表示為圖23中的SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4 (參見，例如PCT國(guó)際申請(qǐng)?zhí)?PCT/US2005/038125)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述修飾的IgG2抗體是IgG2m4抗體(圖沈)(參見，例如，美國(guó)系列號(hào)11/581,931)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述修飾的IgG2m4抗體是抗-DKK-I抗體。一個(gè)實(shí)例是抗-DKK-I抗體，其重鏈和輕鏈表示為圖22中的SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2 (參見，例如，美國(guó)系列號(hào)12/012,885)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述修飾的IgG2m4抗體是抗-ADDL抗體。一個(gè)實(shí)例是抗-ADDL抗體，其重鏈和輕鏈表示為圖M中的SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO:6 (參見，例如， PCT 國(guó)際申請(qǐng)?zhí)?PCT/US2006/040508)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述修飾的IgG2m4抗體是抗-hIL_13ra-l抗體。一個(gè)實(shí)例是抗-hIL-13ra-l抗體，其重鏈和輕鏈表示為圖25中的SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8 (參見，例如，美國(guó)系列號(hào)11/875,017)。在一個(gè)實(shí)施方案中，以約50 mM至約500 mM的濃度，將氨基酸加入洗脫緩沖液中。 本文使用的“約”是指士 0.015 M0在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用的氨基酸是組氨酸、脯氨酸或精氨酸。本發(fā)明提供了從樣品中純化單體單克隆抗體的第二種方法，其中所述樣品包含單體單克隆抗體、宿主細(xì)胞雜質(zhì)、二聚體和更高階聚集體，所述方法包括(a)在約15°C至約 27°C的溫度下，使樣品接觸蛋白A親和色譜柱；(b)使用洗脫緩沖液，從蛋白A親和色譜柱洗脫單體單克隆抗體，所述洗脫緩沖液包含濃度為約0.030 M至約0.085 M的檸檬酸鹽；和 (c)收集來(lái)自步驟(b)的單體單克隆抗體的一個(gè)或多個(gè)級(jí)分，形成蛋白A產(chǎn)物庫(kù)，其中所述產(chǎn)物庫(kù)(i)包含小于5%的更高階聚集體，且(ii)具有約3. 5至約4. 0的pH，由此從樣品純化單體單克隆抗體。在上述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述洗脫緩沖液是醋酸鹽或檸檬酸鹽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述洗脫緩沖液中檸檬酸鹽的濃度是約0.030 M至約0.085 M0本文使用的“約”是指士 0.015 M0在另一個(gè)實(shí)施方案中，醋酸鹽的濃度是約0. 050 M至約0. 200 M。本文使用的“約” 是指士 0. 015 M0在上述方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法在約4°C至約30 °C的溫度進(jìn)行。本文使用的“約”是指士 4°C。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法在約15°C至約27 °C的溫度進(jìn)行。本文使用的 “約”是指士 4°C。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單體單克隆抗體是IgG抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述單體單克隆抗體是IgGl或修飾的IgG2抗體。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述IgGl抗體是抗-ADDL抗體。一個(gè)實(shí)例是抗-ADDL抗體， 其重鏈和輕鏈表示為圖23中的SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4 (參見，例如PCT國(guó)際申請(qǐng)?zhí)?PCT/US2005/038125)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述修飾的IgG2抗體是IgG2m4抗體(圖沈)(參見，例如，美國(guó)系列號(hào)11/581,931)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述修飾的IgG2m4抗體是抗-DKK-I抗體。一個(gè)實(shí)例是抗-DKK-I抗體，其重鏈和輕鏈表示為圖22中的SEQ ID N0:1和SEQ ID NO: 2 (參見，例如， 美國(guó)系列號(hào)12/012,885)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述修飾的IgG2m4抗體是抗-ADDL抗體。一個(gè)實(shí)例是抗-ADDL抗體，其重鏈和輕鏈表示為圖M中的SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO:6 (參見，例如， PCT 國(guó)際申請(qǐng)?zhí)?PCT/US2006/040508)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述修飾的IgG2m4抗體是抗-hIL_13ra-l抗體。一個(gè)實(shí)例是抗-hIL-13ra-l抗體，其重鏈和輕鏈表示為圖25中的SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8 (參見，例如，美國(guó)系列號(hào)11/875,017)。在一個(gè)實(shí)施方案中，以約50 mM至約500 mM的濃度，將氨基酸加入洗脫緩沖液中。 本文使用的“約”是指士 0.015 M0在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用的氨基酸是組氨酸、脯氨酸或精氨酸。本發(fā)明提供了從樣品中純化單體單克隆抗體的第三種方法，其中所述樣品包含單體單克隆抗體、宿主細(xì)胞雜質(zhì)、二聚體和更高階聚集體，所述方法包括(a)在約15°C至約 27°C的溫度下，使樣品接觸蛋白A親和色譜柱；(b)使用洗脫緩沖液，從蛋白A親和色譜柱洗脫單體單克隆抗體，所述洗脫緩沖液包含濃度為約0.050 M至約0. 200 M的醋酸鹽；和 (c)收集來(lái)自步驟(b)的單體單克隆抗體的一個(gè)或多個(gè)級(jí)分，形成蛋白A產(chǎn)物庫(kù)，其中所述產(chǎn)物庫(kù)(i)包含小于5%的更高階聚集體，且(ii)具有約3. 5至約4. 5的pH，由此從樣品純化單體單克隆抗體。在上述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述洗脫緩沖液是醋酸鹽或檸檬酸鹽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述洗脫緩沖液中檸檬酸鹽的濃度是約0. 030 M至約0. 085M0本文使用的“約”是指士 0.015 M0在另一個(gè)實(shí)施方案中，醋酸鹽的濃度是約0.050 M至約0.200 M。本文使用的“約” 是指士 0. 015 Mo在上述方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法在約4°C至約30 °C的溫度進(jìn)行。本文使用的“約”是指士 4°C。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法在約15°C至約27 °C的溫度進(jìn)行。本文使用的 “約”是指士 4°C。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單體單克隆抗體是IgG抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述單體單克隆抗體是IgGl或修飾的IgG2抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述IgGl抗體是抗-ADDL抗體。一個(gè)實(shí)例是抗-ADDL抗體， 其重鏈和輕鏈表示為在圖23中的SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4 (參見，例如PCT國(guó)際申請(qǐng)?zhí)?PCT/US2005/038125)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述修飾的IgG2抗體是IgG2m4抗體(圖沈)(參見，例如，美國(guó)系列號(hào)11/581,931)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述修飾的IgG2m4抗體是抗-DKK-I抗體。一個(gè)實(shí)例是抗-DKK-I抗體，其重鏈和輕鏈表示為圖22中的SEQ ID N0:1和SEQ ID NO: 2 (參見，例如， 美國(guó)系列號(hào)12/012,885)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述修飾的IgG2m4抗體是抗-ADDL抗體。一個(gè)實(shí)例是抗-ADDL抗體，其重鏈和輕鏈表示為圖M中的SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO:6 (參見，例如， PCT 國(guó)際申請(qǐng)?zhí)?PCT/US2006/040508)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述修飾的IgG2m4抗體是抗-hIL_13ra-l抗體。一個(gè)實(shí)例是抗-hIL-13ra-l抗體，其重鏈和輕鏈表示為圖25中的SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8 (參見，例如，美國(guó)系列號(hào)11/875,017)。在一個(gè)實(shí)施方案中，以約50 mM至約500 mM的濃度，將氨基酸加入洗脫緩沖液中。 本文使用的“約”是指士 0.015 M0在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用的氨基酸是組氨酸、脯氨酸或精氨酸。在每個(gè)上述方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白A產(chǎn)物庫(kù)具有3. 2或更大的pH。從下面的實(shí)施例將更好地理解本發(fā)明。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)容易地理解討論的具體方法和結(jié)果僅僅是在此后的權(quán)利要求書中更完整地描述的本發(fā)明的例證。
實(shí)施例實(shí)施例1
降低溫鹿來(lái)降低在SSA親禾口代i普法洗脫,禾口_后白訓(xùn)氏dH{呆寸禾呈中的SSjg集體7k
￡
為了表征蛋白聚集的溫度和PH依賴性，針對(duì)抗-DKK-I單克隆抗體，評(píng)價(jià)了溫度和PH 對(duì)含有檸檬酸鹽(lOOmM，pH 3.5)的PAP洗脫庫(kù)的影響。相同的操作可以用于其它mAb， 諸如抗-ADDL單克隆抗體。材料和方法
小規(guī)模使用AKTA EXPLORER 100 ，進(jìn)行所有小規(guī)模實(shí)驗(yàn)。磷酸鹽、檸檬酸鹽和氫氧化鈉緩沖液購(gòu)自Hyclone (Logan, UT)。用于PAP的pH調(diào)節(jié)的Tris堿購(gòu)自Hyclone (Logan, UT)。用于蛋白A親和色譜法實(shí)驗(yàn)的Mabselect 樹脂購(gòu)自GE Healthcare。得到深度過(guò)濾的離心分離液，并用作蛋白A親和色譜法實(shí)驗(yàn)的原料。熱混合器R (Thermomixer R) (Eppendorf)和2個(gè)溫控室用于控制PAP和QPAP樣品溫度。實(shí)驗(yàn)1A:
以6. 8 mL/min (5分鐘停留時(shí)間)，用5個(gè)CV的6 mM磷酸鈉、pH 7. 2 (PBS)平衡裝有 Mabselect 樹脂(33. ；35 mL)的柱(1.7 cm χ 14. 5 cm)。在 17°C，使用 6.8 mL/min 的流速，以27 g mAb/升樹脂，裝載深度過(guò)濾的離心分離液。裝載后，用3個(gè)CV的PBS、隨后用 4個(gè)CV的6 mM磷酸鈉pH 7. 2洗滌柱。以8. 3 mL/min (4 min停留時(shí)間)，用0. IM檸檬酸鈉PH 3. 5洗脫產(chǎn)物0. 5-3. O CV。洗脫后，將PAP (9 g/L)庫(kù)在17°C在pH 3. 5保持30 分鐘。低PH保持后，將在pH 3.5的蛋白A產(chǎn)物(PAP)的一部分放置在4、17和37°C。將 PAP流的剩余部分猝滅至pH 6. 1，并放在4、17和37°C。在不同的時(shí)間間隔采取來(lái)自pH條件3. 5和6. 1的樣品Q80 μ ，使用Tris堿(1Μ，20 μ 猝滅至pH 6，并使用HPSEC分析蛋白聚集體含量。以8. 3 mL/min，用5個(gè)CV的50 mM氫氧化鈉、IM氯化鈉再生柱，并保藏在20%的乙醇的PBS溶液中。實(shí)驗(yàn)IB
該實(shí)驗(yàn)使用與在實(shí)驗(yàn)IA中所述進(jìn)行蛋白A親和色譜法相同的柱、原料和操作，例外是該步驟在25°C進(jìn)行。洗脫后，細(xì)分PAP (8 g/L, pH 3. 5)，并放在25°C和30°C。在不同的時(shí)間間隔，獲取在2個(gè)溫度的樣品Q80 PL)，使用Tris堿(1Μ，20 μ )猝滅至pH 6，并使用HPSEC分析蛋白聚集體含量。在8. 3 mL/min，用5個(gè)CV的50 mM氫氧化鈉、IM氯化鈉再生柱，并保存在20%的乙醇的PBS溶液中。分析
使用在 Agilent 1100 HPLC 系統(tǒng)(Agilent, Palo Alto, CA)上的 P0R0S 蛋白 A ID免疫親和柱，分析所有PAP或QPAP樣品的mAb單體濃度。使用在Agilent 1100 HPLC 系統(tǒng)上的Tosoh尺寸排阻柱(0.78 cm內(nèi)徑χ 30 cm長(zhǎng)度)，定量在每個(gè)樣品中的蛋白聚集體(二聚體和更高階聚集體)。使用PH探頭(士 0.1 pH單位精確度)和具有溫度補(bǔ)償?shù)牧科?二者購(gòu)自Fisher Scientific)測(cè)量溶液pH。結(jié)果和討論
使用蛋白A親和色譜法純化抗-DKK-I抗體，并保持在不同的pH (3.5，6. 1)和溫度 G°C-37°C)值，以測(cè)定pH和溫度對(duì)蛋白聚集的影響。通過(guò)HPSEC分析測(cè)得，當(dāng)在從蛋白 A親和柱洗脫產(chǎn)物后將PAP流猝滅至pH 6. 1并在37°C保持多達(dá)3. 5天時(shí)，蛋白聚集沒(méi)有發(fā)生(圖1)。在pH 6. 1和37°C，在3. 5天時(shí)，更高階聚集體水平從0. 8%增加至1. 3%，而抗體水平從98%降低至97%。在所有溫度、在pH 6. 1，二聚體保持在恒定水平(圖3)。在4°C和 17°C、在pH 6. 1，單體保持穩(wěn)定(參見，圖1和3)。在pH 3. 5，更高階聚集體(HOA)的水平隨著溫度升高而顯著增加(圖2)。另外， 隨著溫度升高至17°C，在pH 3. 6的二聚體水平增加了 0. 8% (圖4)。在37°C和pH 3. 6，單體的穩(wěn)定性快速降低(參見，圖2和4)，這促進(jìn)了顯著的蛋白聚集體沉淀。該沉淀會(huì)影響通過(guò)HPSEC定量蛋白聚集體水平的精確度，并代表該方法的限制性。當(dāng)溫度降低至4°C時(shí)，HOA 水平在30分鐘后是僅0. 7%，在8小時(shí)后是1. 5% (圖2)。因此，通過(guò)使PAP的溫度從17°C降低至4°C，使HOA水平顯著降低了 4%_7%。另一個(gè)實(shí)驗(yàn)在25°C和30°C進(jìn)行，以定量更高的溫度(> 17°C)對(duì)蛋白聚集體形成的影響。在25°C每20分鐘，使PAP (pH 3.5，9 mg/mL抗-DKK-I抗體)的更高階聚集體 (HOA)的水平增加1. 5%-3· 0%，并在30°C每20分鐘，增加4%_6% (圖5)。在25°C經(jīng)4小時(shí)， 二聚體的水平增加至7%，并在30°C經(jīng)1. 5小時(shí)增加至10% (圖6)。另外，25°C實(shí)驗(yàn)的時(shí)間零點(diǎn)樣品(產(chǎn)物洗脫和收集后)含有0.6% Η0Α。因此，當(dāng)產(chǎn)物結(jié)合或從該實(shí)驗(yàn)的柱洗脫時(shí)， HOA沒(méi)有形成。實(shí)施例2
瓶PAP_D痛條低^ ^ 盧逝膽組紐禾早Φ白她戰(zhàn)集體水平
為了表征PH對(duì)蛋白聚集的影響，針對(duì)抗-DKKl單克隆抗體，評(píng)價(jià)了 PH (3.5-5.0)對(duì) QPAP洗脫庫(kù)的影響。相同的操作可以用于其它mAb，諸如抗-ADDL單克隆抗體。材料和方法
小規(guī)模使用AKTA EXPLORER 100 (GE Healthcare)，進(jìn)行所有小規(guī)模實(shí)驗(yàn)。磷酸鹽、檸檬酸鹽和氫氧化鈉緩沖液購(gòu)自Hyclone (Logan, UT)。用于PAP的pH調(diào)節(jié)的Tris 堿購(gòu)自Hyclone (Logan, UT)。用于蛋白A親和色譜法實(shí)驗(yàn)的Mabselect 樹脂購(gòu)自GE Healthcare.使用深度過(guò)濾的離心分離液作為蛋白A親和色譜法實(shí)驗(yàn)的原料。熱混合器R (Eppendorf)和2個(gè)溫控室用于控制PAP和QPAP樣品溫度。實(shí)驗(yàn)2A
以6. 8 mL/min (5分鐘停留時(shí)間)，用5個(gè)CV的6 mM磷酸鈉pH 7. 2 (PBS)平衡裝有 Mabselect 樹月旨(33.35 mL)的柱(1.7 cm χ 14. 5 cm)。在室溫(21°C)，使用 6.8 mL/ min的流速，以25 g mAb/升樹脂，裝載深度過(guò)濾的離心分離液。裝載后，用3個(gè)CV的PBS、 隨后用4個(gè)CV的6 mM磷酸鈉pH 7. 2洗滌柱。以8. 3 mL/min (4 min停留時(shí)間)，用0. IM 檸檬酸鈉PH 3. 5洗脫產(chǎn)物0. 5-3. 0 CV。洗脫后，使用IM 1Tris堿(16 v%) JfPAP (9 g/ L)庫(kù)猝滅至pH 6。實(shí)驗(yàn)2B
該QPAP流用作pH實(shí)驗(yàn)的進(jìn)料。將檸檬酸鹽溶液G M, 50 - 100 μ )加入QPAP (20 mL)中，直到溶液pH達(dá)到5.0。在pH 5.0，獲取該溶液的樣品O mL)，并放在21°C和30°C。 重復(fù)該操作，以產(chǎn)生在PH 4. 5和4.0的溶液條件。在不同時(shí)間點(diǎn)獲取樣品(100 μυ，使用 Tris堿(0. 5-1Μ, 10-30 μ )猝滅至pH 6，并使用HPSEC分析蛋白聚集體含量。分析
使用在 Agilent 1100 HPLC 系統(tǒng)(Agilent, Palo Alto, CA)上的 P0R0S 蛋白 A ID免疫親和柱，分析所有PAP或QPAP樣品的mAb濃度。使用在Agilent 1100 HPLC系統(tǒng)上的Tosoh尺寸排阻柱(0.78 cm內(nèi)徑χ 30 cm長(zhǎng)度)，定量在每個(gè)樣品中的蛋白聚集體(即二聚體和更高階聚集體)。使用具有+/_ 0.1 pH單位精確度的pH探頭(Fisher Scientific)和具有溫度補(bǔ)償?shù)牧科?Fisher Scientific)，測(cè)量溶液pH。結(jié)果和討論
使QPAP的pH降低到pH 4.0至pH 5. 0，以測(cè)定pH對(duì)蛋白聚集的影響。所述單體在21°C 和30°C、在pH 4. 5或更高穩(wěn)定至少2. 5小時(shí)(參見，圖7和9以及8和10)。在pH 4. 0在21°C的HOA水平是在0. 9%-2. 0%范圍內(nèi)，且在30°C經(jīng)2. 5小時(shí)，是在3%_13%范圍內(nèi)(圖7 和圖8)。在pH 4.0，HOA水平隨著溫度升高而升高，這是在實(shí)施例1中在pH 3. 5發(fā)現(xiàn)的相同趨勢(shì)。二聚體水平在21°C和pH 4. 0-5.0保持恒定，但是當(dāng)在pH 4. 0溫度升高至30°C時(shí)增加(圖9和圖10)。除了溫度以外，pH也影響PAP庫(kù)中蛋白聚集體形成的動(dòng)力學(xué)速率。隨著PAP庫(kù)的 PH升高，更高階聚集體和二聚體的比例顯著減少。使用高濃度酸，可以調(diào)節(jié)在該實(shí)驗(yàn)中離子強(qiáng)度變化的影響。為了防止在蛋白A親和色譜法洗脫和隨后的低pH保持步驟過(guò)程中的蛋白聚集，可以在更高的PH進(jìn)行洗脫。實(shí)施例3
■撤_縮農(nóng)齡口 DH ■痛條低躺a A mm^immmmfsm^ dH組寺過(guò)稈中的蛋白聚集體水平
解耦洗脫緩沖液PH和濃度的影響，以表征兩個(gè)參數(shù)對(duì)PAP庫(kù)中蛋白聚集的影響。另外， 測(cè)定了從蛋白A親和色譜柱洗脫單體所需的洗脫緩沖液的最小濃度。針對(duì)抗-DKKl單克隆抗體，進(jìn)行了該評(píng)價(jià)。材料和方法
小規(guī)模使用AKTA EXPLORER 100 (GE Healthcare)，進(jìn)行所有小規(guī)模實(shí)驗(yàn)。磷酸鹽、檸檬酸鹽和氫氧化鈉緩沖液購(gòu)自Hyclone (Logan, UT)。用于PAP的pH調(diào)節(jié)的Tris 堿購(gòu)自Hyclone (Logan, UT)。用于蛋白A親和色譜法實(shí)驗(yàn)的Mabselect 樹脂購(gòu)自GE Healthcare.使用深度過(guò)濾的離心分離液作為蛋白A親和色譜法實(shí)驗(yàn)的原料。使用熱混合器R (Eppendorf)控制PAP和QPAP樣品溫度。實(shí)驗(yàn)A:
以0. 2 mL/min (5分鐘停留時(shí)間)，用5個(gè)CV的6 mM磷酸鈉pH 7. 2 (PBS)平衡裝有 Mabselect 樹脂(1. 06 mL)的柱(0.5 cm χ 5. 4 cm)。在室溫(17°C _25°C )，使用 0· 2 mL/min的流速，以25 g mAb/升樹脂，裝載深度過(guò)濾的離心分離液。裝載后，用3個(gè)CV的 PBS、隨后用4個(gè)CV的6 mM磷酸鈉pH 7. 2，以0. 2 mL/min洗滌柱。使用10% 0. IM檸檬酸鈉pH 3. 5 (10 mM檸檬酸鹽)的不連續(xù)梯度，以0. 5-1. 0 mL/min (1-2 min停留時(shí)間) 洗脫產(chǎn)物至少2. 5 CV。使用20%、30%和100%的0. IM檸檬酸鈉pH 3. 5緩沖液(分別是20 mM、30 mM和100 mM檸檬酸鹽)，重復(fù)該洗脫步驟另外3次。洗脫后，使用1 M tris堿，將所有PAP流猝滅至pH 6。在0.5-1.0 mL/min，用50 mM氫氧化鈉、1 M氯化鈉再生柱，并保存在20v%的乙醇的PBS溶液中。實(shí)驗(yàn)B:
以2. 2 mL/min (5分鐘停留時(shí)間)，用5個(gè)CV的6 mM磷酸鈉pH 7. 2 (PBS)平衡裝有 Mabselect 樹脂(10. 4 mL)的柱(1. 1 cm χ 10. 9 cm)。在室溫(17°C -20 °C )，使用 2. 1 mL/min的流速，以27 g mAb/升樹脂，裝載深度過(guò)濾的離心分離液。裝載后，用3個(gè)CV的 PBS、隨后用4個(gè)CV的6 mM磷酸鈉pH 7. 2，以2. 1 mL/min洗滌柱。使用60% 0. IM檸檬酸鈉pH 3.5 (60 mM檸檬酸鹽)或40% 0. IM檸檬酸鈉pH 3.0 (40 mM檸檬酸鹽)的不連續(xù)梯度，以2. 6 mL/min (4 min停留時(shí)間)洗脫產(chǎn)物0. 5_3 CV。洗脫后立即將PAP (11 g/ L)庫(kù)的樣品放在25°C的熱混合器中。洗脫后立即獲取時(shí)間零點(diǎn)樣品，用tris堿猝滅，并放在HPSEC上，進(jìn)行蛋白聚集體含量分析。在不同的時(shí)間間隔獲取樣品QOO μυ，立即使用Tris堿(0. 5-1M, 5-10 μ 猝滅至ρΗ 6，并使用HPSEC分析蛋白聚集體含量。在2. 4 mL/ min，用5個(gè)CV的50 mM氫氧化鈉、1 M氯化鈉再生蛋白A親和柱，并保存在20%的乙醇的 PBS溶液中。對(duì)于60%檸檬酸鹽洗脫(60 mM檸檬酸鹽)，將PAP庫(kù)分成單獨(dú)的2 mL等分試樣。將檸檬酸鹽(4M，5-10 μι)加入一個(gè)等分試樣，達(dá)到ρΗ 3. 4或3. 6。將磷酸(8 ν%, 10 μι)加入一個(gè)等分試樣，達(dá)到ρΗ 3.6。實(shí)驗(yàn)C:
在蛋白A洗脫緩沖液中，將檸檬酸鹽濃度降低至50 mM，以測(cè)定酸濃度是否對(duì)抗-DKK-I穩(wěn)定性有影響。該降低的酸濃度影響在洗脫過(guò)程中ρΗ漸變的梯度，這導(dǎo)致更高的PAP庫(kù)pH3. 9 (相對(duì)于3. 6)。使用5分鐘的停留時(shí)間，在23-25 °C，將深度過(guò)濾的離心分離液(1.7 g/L 抗-DKK-I mAb)裝載上蛋白A柱(V = 33. 35 mL,板20 N/m2,不對(duì)稱1. 33)。裝載后，用3個(gè)CV的PBS、隨后用4個(gè)CV的6 mM磷酸鈉ρΗ 7. 2，以0. 2 mL/min洗滌柱。對(duì)于洗脫，使用100 mM檸檬酸鹽ρΗ 3. 5的50%梯度，從樹脂洗脫抗-DKK-I單克隆抗體。在洗脫過(guò)程中，從0.5至3.0 CV，每0.5 CV收集級(jí)分。分析這些級(jí)分的單體濃度、ρΗ和電導(dǎo)率， 然后合并，達(dá)到7.2 g/L的終濃度。將PAP流的樣品放在不同的溫度0、15、20和23-25°C) 和ρΗ值(3.9、4.2、4.5、5.0)，并使用HPSEC在不同的時(shí)間點(diǎn)分析聚集(圖11)。當(dāng)酸濃度降低至50 mM時(shí)，ρΗ梯度輕微變化，導(dǎo)致PAP pH3. 9 (相對(duì)于100 mM檸檬酸鹽的3. 6)。但是，洗脫曲線重疊，且產(chǎn)物收集窗保持相同。50%洗脫的蛋白A產(chǎn)率是94%。使用50 mM檸檬酸鹽洗脫，在上述不同溫度的HOA曲線如圖12所示。在23-25°C，50 mM和100 mM檸檬酸鹽洗脫之間的對(duì)比表示在圖13中。分析
使用在 Agilent 1100 HPLC 系統(tǒng)(Agilent, Palo Alto, CA)上的 P0R0S 蛋白 A ID免疫親和柱(cartridge)，分析所有PAP樣品的mAb濃度。使用在Agilent 1100 HPLC 系統(tǒng)上的Tosoh尺寸排阻柱(0.78 cm內(nèi)徑χ 30 cm長(zhǎng)度)，定量在每個(gè)樣品中的蛋白聚集體(二聚體和更高階聚集體)。使用具有士 0.1 ρΗ單位精確度的ρΗ探頭(Fisher Scientific)和具有溫度補(bǔ)償?shù)牧科?Fisher Scientific)，測(cè)量溶液ρΗ。結(jié)果和討論
使用不同的檸檬酸鹽濃度，洗脫蛋白A親和柱，以測(cè)定可能從樹脂洗脫單體的檸檬酸鹽最低濃度。10 4和20 v%檸檬酸鹽濃度洗脫80%的結(jié)合在柱上的單體(未顯示)。當(dāng)檸檬酸鹽濃度增加至30 v%時(shí)，從柱洗脫僅洲的額外單體。因此，從柱洗脫> 80%單體的最小濃度是20 mM檸檬酸鹽。測(cè)試了不同的檸檬酸鹽濃度，以測(cè)定在不同的ρΗ點(diǎn)檸檬酸鹽濃度對(duì)單體穩(wěn)定性的影響。當(dāng)將檸檬酸鹽濃度降低至60福并將？!1升高至3.8時(shí)，在251的HOA水平是 0.3% (相對(duì)于4%-5%，100 mM檸檬酸鹽)(ρΗ 3.5)(圖14)。隨著檸檬酸鹽濃度降低至在 PH 3. 6的40 mM檸檬酸鹽時(shí)，HOA水平在0. 3%保持至少3小時(shí)。因此，單體穩(wěn)定性是檸檬酸鹽濃度以及PH的函數(shù)。當(dāng)加入磷酸(替代檸檬酸鹽)來(lái)PH調(diào)節(jié)洗脫庫(kù)時(shí)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品的HOA水平增加了大約0. 3%，直到2小時(shí)。因此，與在相同溶液ρΗ (3. 6)的檸檬酸鹽相比，加入磷酸會(huì)增加HOA形成速率。在PAP庫(kù)ρΗ 3. 6，測(cè)試了下述4個(gè)不同的酸濃度40 mM、75 mM和100 mM檸檬酸鹽和含有0. 1 v%磷酸的60 mM檸檬酸鹽。HOA的水平隨著檸檬酸鹽濃度增加而增加。另外，在大于75 mM的檸檬酸鹽濃度，HOA水平隨時(shí)間顯著增加。例如，在1小時(shí)時(shí)間范圍內(nèi)， 在100 mM檸檬酸鹽中的HOA速率是每20分鐘洲，相對(duì)于在相同pH3. 6在75 mM檸檬酸鹽中的每20分鐘0. 2%-0. 3%。與在相同溶液pH3. 6的檸檬酸鹽相比，向PAP庫(kù)中加入磷酸會(huì)增加HOA形成速率。當(dāng)pH保持恒定時(shí)，PAP庫(kù)中的檸檬酸鹽濃度對(duì)HOA形成有影響。從上面的圖12可以看出，使用50 mM檸檬酸鹽洗脫條件在pH 3. 9，PAP是非常穩(wěn)定的，且在(15°C經(jīng)至少12小時(shí)含有彡0.4% Η0Α。在更高的溫度，PAP中的抗-DKK-I mAb也表現(xiàn)出提高的穩(wěn)定性。例如，在20-25°C保持12小時(shí)后，PAP含有1.0%-1.4% HOA0 對(duì)于30-60分鐘的低pH保持時(shí)間，在20-250C，PAP中的HOA水平是0. 2%_0· 4%，其低于圖 13中的對(duì)比所示的批次中的3%-6% HOA水平。在50 mM檸檬酸鹽PAP中的蛋白降解的總量(Η0Α + 二聚體)是1.5%，其滿足< 5%的目標(biāo)。因此，經(jīng)證實(shí)，降低檸檬酸鹽濃度和增加 pH會(huì)使PAP的HOA水平在彡60分鐘的保持時(shí)間從3%_6%顯著降低至0. 5%。實(shí)施例4
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示差掃描量熱法是用于測(cè)量蛋白穩(wěn)定性的工具。蛋白穩(wěn)定性主要依賴于環(huán)境，所述環(huán)境具有穩(wěn)定化和去穩(wěn)定化蛋白的折疊結(jié)構(gòu)的能力。通過(guò)測(cè)量溫度漸變(ramp)過(guò)程中蛋白溶液的熱容，與溶劑參照物的熱容相對(duì)比，進(jìn)行DSC。蛋白溶液和溶劑參照物之間的示差熱容會(huì)提供代表蛋白的變性的曲線。從該曲線可以確定表觀變性溫度(melting temperature) I。蛋白向未折疊狀態(tài)的變性經(jīng)常導(dǎo)致不希望的事件，諸如聚集或化學(xué)降解(19，20，21， 22，2；3)。通過(guò)測(cè)量溫度誘導(dǎo)的蛋白解折疊，示差掃描量熱法(DSC)會(huì)提供對(duì)折疊機(jī)理的一些了解。由DSC提供的信息可用于涉及蛋白穩(wěn)定性的多種用途，諸如克隆選擇、制劑開發(fā)和蛋白表征04，25)。具有相對(duì)容易的方法來(lái)在開發(fā)過(guò)程的早期鑒別出最穩(wěn)定的藥物化合物，會(huì)通過(guò)潛在地縮短面市時(shí)間來(lái)提供巨大利益。DSC在制劑開發(fā)中也是關(guān)鍵性的。蛋白環(huán)境(諸如PH、離子強(qiáng)度和其它賦形劑)的變化可以影響蛋白的折疊結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致變性溫度的漂移。通過(guò)在制劑緩沖液中篩選不同的添加劑，DSC會(huì)提供優(yōu)化緩沖液組成的快速方式。治療蛋白的聚集具有非常嚴(yán)重的牽連，其范圍從純化過(guò)程中的困難到在體內(nèi)的免疫原性應(yīng)答。蛋白的變性和隨后的聚集對(duì)許多因素是敏感的，包括PH和溫度。因而，調(diào)節(jié)這兩個(gè)因素對(duì)于治療蛋白的穩(wěn)定性是關(guān)鍵性的。單克隆抗體具有多個(gè)結(jié)構(gòu)域，每個(gè)結(jié)構(gòu)域受到pH和離子強(qiáng)度的不同影響。使用 DSC來(lái)評(píng)價(jià)離子強(qiáng)度(30 mM、60 mM和100 mM的檸檬酸鹽濃度)和pH (3.0 to 6.0)對(duì)蛋白的熱穩(wěn)定性的影響。材料和方法
在30 mM、60 mM和100 mM檸檬酸(Sigma, St. Louis)的濃度，制備溶液。使用氫氧化鈉(Fisher Chemicals)將檸檬酸鹽溶液的pH調(diào)至3. 0、3. 5、4. 0、4. 5、5. 0、5. 5和6. 0 pH 目標(biāo)值。使用Accumet pH計(jì)(Fisher Scientific)得到pH測(cè)量結(jié)果。使用在每個(gè)pH的檸檬酸鹽緩沖液，將在制劑緩沖液中的54. 2 mg/mL的抗-DKK-1 抗體稀釋至1 mg/mL。測(cè)量最終的1 mg/mL溶液的濃度和pH。以相同的比例稀釋制劑緩沖液，用作參照緩沖液。在MicroCal VP-DSC上進(jìn)行示差掃描量熱法(DSC)。以1°C /min的速率，使溫度從25°C漸變到95°C。如下分析粗DSC曲線減去參照緩沖液，標(biāo)準(zhǔn)化濃度，并使用Origin 軟件進(jìn)行基線校正。以兩個(gè)重復(fù)運(yùn)行樣品。結(jié)果和討論
使用DSC，檢查了 pH和檸檬酸鹽濃度對(duì)抗-DKKl抗體的熱穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，變性溫度隨著PH降低而降低。結(jié)果也表明，在低pH值，檸檬酸鹽對(duì)該單克隆抗體的熱穩(wěn)定性具有更大的影響。在低于4. 5的pH值，用檸檬酸鹽緩沖液稀釋的抗-DKK-I單克隆抗體在低檸檬酸鹽濃度是更熱穩(wěn)定的(圖15 A，B, C)。在pH 3.0,100 mM檸檬酸鹽似乎已經(jīng)完全解折疊所述蛋白，且在曲線中不存在躍遷。對(duì)于30 mM和60 mM檸檬酸鹽，單個(gè)躍遷是明顯的，表明2個(gè)抗體結(jié)構(gòu)域被解折疊。數(shù)據(jù)表明，該單個(gè)躍遷表示抗體的Fab區(qū)的解折疊。隨著pH 升高至4. 0，結(jié)構(gòu)域的解折疊溫度升高，并發(fā)現(xiàn)了 3個(gè)躍遷。最低穩(wěn)定性的躍遷最可能是Ch2 結(jié)構(gòu)域的解折疊，繼之為Fab片段和Ch3結(jié)構(gòu)域。在4. 5和以上的pH值，抗-DKK-I單克隆抗體的表觀躍遷溫度獨(dú)立于檸檬酸鹽濃度(圖16 A、B、C、D)?？贵w的變性溫度隨pH升高而升高。在更高的pH值，2個(gè)結(jié)構(gòu)域同時(shí)解折疊，產(chǎn)生具有如下躍遷的曲線一個(gè)躍遷具有大焓，第二個(gè)躍遷具有較低的焓。我們從其它單克隆抗體的結(jié)果得出結(jié)論CH2結(jié)構(gòu)域和Fab在高pH值具有類似的變性溫度，其與第一個(gè)大躍遷相對(duì)應(yīng)。Ch3結(jié)構(gòu)域的解折疊具有更高的變性溫度，并與第二個(gè)躍遷相對(duì)應(yīng)。檸檬酸鹽濃度和pH會(huì)影響熱誘導(dǎo)的單克隆抗體的解折疊。隨著pH降低，抗-DKK-I 單克隆抗體的熱穩(wěn)定性降低。在低PH值，檸檬酸鹽濃度僅影響表觀躍遷溫度。更低的檸檬酸鹽濃度導(dǎo)致更高的變性溫度。實(shí)施例5
氨穩(wěn)定齊IlX寸蛋白聚集的景如向
為了從蛋白A親和樹脂洗脫蛋白或抗體，需要酸性條件。暴露于這些在低PH (3-4)的酸性條件可以導(dǎo)致蛋白聚集體的形成。已經(jīng)證實(shí)，向蛋白A洗脫緩沖液中加入穩(wěn)定劑會(huì)增加蛋白在低PH的穩(wěn)定性。選擇精氨酸作為該實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定劑，以測(cè)定精氨酸在洗脫緩沖液中的存在是否會(huì)降低更高階聚集體的水平，并由此增加mAb穩(wěn)定性。所有實(shí)驗(yàn)都在25°C進(jìn)行。對(duì)于使用含有和不含精氨酸(50 mM)的60 mM檸檬酸鹽的洗脫，與對(duì)照相比，HOA 百分比每小時(shí)僅降低0.01% (圖17)。但是，對(duì)于使用含有和不含精氨酸O50 mM)的100 mM檸檬酸鹽的洗脫，與對(duì)照相比，更高階聚集體百分比每小時(shí)降低2. 9% (圖18)。因此，精氨酸可有效地降低100 mM檸檬酸鹽溶液中更高階聚集體的水平，且可以用作在蛋白A親和色譜法和隨后的低PH保持步驟中降低聚集體水平的另一個(gè)選擇。實(shí)施例6
石開窮. 白濃ItX寸在SSA親禾口代i普法用的鹽禾口醋Il鹽洗脫中液Φ的單體穩(wěn)定件的影響
研究了檸檬酸鹽和醋酸鹽緩沖液中的蛋白濃度的影響，以測(cè)定在每個(gè)緩沖液系統(tǒng)中濃度對(duì)聚集速率的影響。另外，為了測(cè)定酸類型對(duì)聚集的影響，對(duì)比了在PH 4.0的檸檬酸鹽和醋酸鹽緩沖液。
材料和方法
小規(guī)模使用AKTA EXPLORER 100 (GE Healthcare)，進(jìn)行所有小規(guī)模實(shí)驗(yàn)。磷酸鈉緩沖液購(gòu)自Hyclone (Logan, UT)。醋酸鹽和檸檬酸鹽購(gòu)自Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)。用于 PAP 的 pH 調(diào)節(jié)的 iTris 堿購(gòu)自 Hyclone (Logan, UT)。用于蛋白 A親和色譜法實(shí)驗(yàn)的Mabselect 樹脂購(gòu)自GE Healthcare.使用猝滅的蛋白A產(chǎn)物作為這些實(shí)驗(yàn)的原料。使用熱混合器R (Eppendorf)來(lái)控制PAP和QPAP樣品溫度。使用QPAP流作為該實(shí)驗(yàn)的進(jìn)料。使用30kDa膜，以4500 rpm的離心速度，將進(jìn)料滲濾進(jìn)4-5體積的磷酸鈉緩沖液中。滲濾后，將每個(gè)溶液濃縮至起始濃度的IxJx和虹之一。將在不同濃度的樣品的一半滲濾進(jìn)至少4體積的醋酸鈉(50 mM, pH 5.0)溶液。對(duì)于取自實(shí)施例2的3個(gè)不同濃縮溶液的第一組，將檸檬酸鹽(15 mM)加入每個(gè)溶液，以達(dá)到PH 4. O。獲取每個(gè)溶液的樣品O mL)，并放在21°C (圖7)。對(duì)于濃縮溶液的第二組，加入冰醋酸，以達(dá)到PH 4.0 (總85 mM醋酸鹽)。獲取每個(gè)溶液的樣品O mL)， 并放在25°C。對(duì)于每組實(shí)驗(yàn)，在不同時(shí)間點(diǎn)獲取樣品(140 μυ，使用Tris堿(0.25 Μ-1. 0 Μ, 10-20 μι)猝滅至pH 6，并使用HPSEC分析蛋白聚集體含量。分析
使用在 Agilent 1100 HPLC 系統(tǒng)(Agilent, Palo Alto, CA)上的 P0R0S 蛋白 A ID免疫親和柱，分析樣品的單體mAb濃度。使用在Agilent 1100 HPLC系統(tǒng)上的Tosoh 尺寸排阻柱(0.78 cm內(nèi)徑χ 30 cm長(zhǎng)度)，定量在每個(gè)樣品中的蛋白聚集體(即二聚體和更高階聚集體)。使用具有+/_ 0.1 pH單位精確度的pH探頭(Fisher Scientific)和具有溫度補(bǔ)償?shù)牧科?Fisher Scientific)，測(cè)量溶液pH。結(jié)果和討論
研究了檸檬酸鹽和醋酸鹽緩沖液中的mAb濃度的影響，以測(cè)定濃度對(duì)每個(gè)緩沖液系統(tǒng)中的聚集速率的影響。隨著檸檬酸鹽(15 mM, pH 3.5)溶液中mAb濃度的增加，更高階聚集體的形成速率也增加(圖20)。例如，在1小時(shí)保持時(shí)間后，更高階聚集體的水平從在8 mg/mL mAb濃度的0. 3%增加至在34 mg/mL mAb濃度的2.6%。因此，溶液中的蛋白濃度會(huì)影響在低PH的檸檬酸鹽緩沖系統(tǒng)中的更高階聚集體的形成速率。但是，對(duì)于醋酸鹽(85 mM, PH 4.0)溶液，更高階聚集體的水平保持恒定在小于1%(對(duì)于5 mg/mL、11 mg/mL和37 mg/ mL mAb 濃度)(圖 21)。為了測(cè)定酸類型對(duì)更高階聚集體形成的影響，繪制了來(lái)自在pH 4.0在25°C的該醋酸鹽實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以及來(lái)自在PH 4. 0在21°C的檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(圖21)。在pH 4. 0， 在檸檬酸鹽緩沖系統(tǒng)中，更高階聚集體的速率開始每30分鐘增加0. 2%，而在醋酸鹽緩沖系統(tǒng)中更高階聚集體的水平保持恒定。因此，在PH 4.0，在醋酸鹽中的mAb穩(wěn)定性大于檸檬酸鹽緩沖液。結(jié)論
除了溫度和PH以外，蛋白濃度也影響PAP庫(kù)中蛋白聚集體的形成速率。隨著在pH 3.5 的檸檬酸鹽緩沖溶液中mAb濃度增加，更高階聚集體的速率顯著降低。但是，對(duì)于從5 mg/ mL至37 mg/mL的不同蛋白濃度，在pH 4. 0的醋酸鹽緩沖溶液中，更高階聚集體的水平保持小于1%。當(dāng)以5 mg/mL至11 mg/mL的蛋白濃度在pH 4. 0比較醋酸鹽和檸檬酸鹽緩沖液系統(tǒng)時(shí)，在醋酸鹽緩沖液中的mAb具有更大的穩(wěn)定性。因此，洗脫緩沖液的類型在mAb穩(wěn)定性中起作用，在PH 4.0時(shí)醋酸鹽比檸檬酸鹽緩沖液更穩(wěn)定。醋酸鹽可以用作從蛋白A親和柱洗脫mAb的替代緩沖液。實(shí)施例7
■ 0Η、·、·7中艦赫桃A 盧逝■■甫細(xì)氏DH組寺過(guò)稈中的蛋白聚集體水平的影響材料和方法
小規(guī)模使用AKTA EXPLORER 100 ，進(jìn)行所有小規(guī)模實(shí)驗(yàn)。磷酸鹽、檸檬酸鹽和氫氧化鈉緩沖液購(gòu)自Hyclone (Logan, UT)。用于PAP的pH調(diào)節(jié)的Tris堿購(gòu)自Hyclone (Logan, UT)。用于蛋白A親和色譜法實(shí)驗(yàn)的Mabselect 樹脂購(gòu)自GE Healthcare.得到深度過(guò)濾的離心分離液，并用作蛋白A親和色譜法實(shí)驗(yàn)的原料。熱混合器R (Eppendorf)和2個(gè)溫控室用于控制PAP和QPAP樣品溫度。實(shí)驗(yàn)
以2. O mL/min (5分鐘停留時(shí)間)，用5個(gè)CV的6 mM磷酸鈉、100 mM NaCL、pH 7. 2緩沖液平衡裝有Mabselect 樹脂(10 mL)的柱(1.7 cm χ 14.5 cm)。使用在表1中列出的溫度，以在表1中列出的濃度(g mAb/升樹脂)，以2. O mL/min的流速，裝載深度過(guò)濾的離心分離液。裝載后，在2 ml/min，用3個(gè)CV的6 mM磷酸鈉、100 mM NaCUpH 7. 2緩沖液洗滌柱，然后以2 ml/min，用4個(gè)CV的6 mM磷酸鈉、pH 7. 2緩沖液洗滌。以2 ml/min,以 100%不連續(xù)梯度，用3個(gè)CV的洗脫緩沖液(無(wú)水檸檬酸和檸檬酸三鈉鹽的混合物至目標(biāo) PH值)(從0.5開始，在3. 5結(jié)束)G min停留時(shí)間)，洗脫產(chǎn)物。在該實(shí)驗(yàn)中使用的洗脫緩沖液如下
60mM檸檬酸鈉，pH 3. 5
40mM檸檬酸鈉，pH 3. 2
40mM檸檬酸鈉，pH 3.8
80mM檸檬酸鈉，pH 3. 2
80mM檸檬酸鈉，pH 3.8
洗脫后，在下述時(shí)間點(diǎn)，使用HPSEC分析產(chǎn)物洗脫液樣品的蛋白聚集體含量0、15、30、 60、120 min。樣品是200微升，并加入40微升0. 25M iTris堿來(lái)猝滅樣品。以2. 0 mL/min, 用5個(gè)CV的50 mM氫氧化鈉、IM氯化鈉緩沖液再生柱，并保存在20v%的乙醇的PBS溶液中。分析
使用在Agilent 1100 HPLC 系統(tǒng)(Agilent, Palo Alto, CA)上的P0R0S 蛋白 A ID 免疫親和柱，分析所有樣品的mAb單體濃度。使用在Agilent 1100 HPLC系統(tǒng)上的Tosoh 尺寸排阻柱(0.78 cm內(nèi)徑χ 30 cm長(zhǎng)度)，定量在每個(gè)樣品中的蛋白聚集體(即二聚體和更高階聚集體)。使用PH探頭(士 0.1 pH單位精確度)和具有溫度補(bǔ)償?shù)牧科?二者購(gòu)自 Fisher Scientific)，測(cè)量溶液 pH。結(jié)果
研究了 PH、溫度、緩沖液濃度和蛋白裝載的作用，以測(cè)定它們對(duì)產(chǎn)率和蛋白聚集的影響。上述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以參見下面的表1。在IOt^PpH 3. 2，裝載或檸檬酸鹽濃度不會(huì)顯著影響產(chǎn)率或聚集水平。在10°C和PH 3. 8，裝載和/或檸檬酸鹽濃度會(huì)降低產(chǎn)率，但是聚集體保持在低水平(< 5%)。在30°C 和pH 3. 2，裝載不會(huì)顯著影響聚集，但是對(duì)于SOmM檸檬酸鹽濃度，溫度對(duì)降低產(chǎn)率和增加聚集水平具有巨大影響，但是在40mM檸檬酸鹽中幾乎沒(méi)有觀察到作用。隨著在30°C pH從 3. 2變化至3. 8，聚集體水平顯著降低，且在40至SOmM檸檬酸鹽中產(chǎn)率增加。
表1:抗-DKK-I mAb在不同的濃度、pH、蛋白裝載和溫度的聚集數(shù)據(jù)
權(quán)利要求
1.一種從樣品中純化單體單克隆抗體的方法，其中所述樣品包含所述單體單克隆抗體、宿主細(xì)胞雜質(zhì)、二聚體和更高階聚集體，所述方法包括a)使所述樣品接觸蛋白A親和色譜柱；b)使用洗脫緩沖液，從所述蛋白A親和色譜柱洗脫所述單體單克隆抗體；和c)收集來(lái)自步驟(b)的所述單體單克隆抗體的一個(gè)或多個(gè)級(jí)分，形成蛋白A產(chǎn)物庫(kù)， 其中所述產(chǎn)物庫(kù)i)包含小于5%的更高階聚集體，且ii)具有pH約3.5至約4. 5，由此從所述樣品純化所述單體單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述洗脫緩沖液是檸檬酸鹽或醋酸鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述洗脫緩沖液是檸檬酸鹽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述洗脫緩沖液中檸檬酸鹽的濃度是約0.030M至約 0. 085 M0
5.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述洗脫緩沖液是醋酸鹽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述洗脫緩沖液中醋酸鹽的濃度是約0.050 M至約 0. 200 M0
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述方法在約4°C至約30°C的溫度進(jìn)行。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述方法在約15°C至約27°C的溫度進(jìn)行。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述單體單克隆抗體是IgG抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述單體單克隆抗體是IgGl或修飾的IgG2抗體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述單體單克隆抗體是IgG2m4抗體。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述IgG2m4抗體是抗-DKKl抗體。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中將氨基酸加入步驟(b)中的所述洗脫緩沖液中至約 50 mM至約500 mM的濃度。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述氨基酸是精氨酸、脯氨酸或組氨酸。
15.一種從樣品中純化單體單克隆抗體的方法，其中所述樣品包含所述單體單克隆抗體、宿主細(xì)胞雜質(zhì)、二聚體和更高階聚集體，所述方法包括a)在約15°C至約27°C的溫度下，使樣品接觸蛋白A親和色譜柱；b)使用洗脫緩沖液，從所述蛋白A親和色譜柱洗脫所述單體單克隆抗體，所述洗脫緩沖液包含濃度為約0. 030 M至約0. 085 M的檸檬酸鹽；和c)收集來(lái)自步驟(b)的所述單體單克隆抗體的一個(gè)或多個(gè)級(jí)分，形成蛋白A產(chǎn)物庫(kù)， 其中所述產(chǎn)物庫(kù)i)包含小于5%的更高階聚集體，且ii)具有pH約3.5至約4.0，由此從所述樣品純化所述單體單克隆抗體。
16.一種從樣品中純化單體單克隆抗體的方法，其中所述樣品包含所述單體單克隆抗體、宿主細(xì)胞雜質(zhì)、二聚體和更高階聚集體，所述方法包括a)在約15°C至約27°C的溫度下，使樣品接觸蛋白A親和色譜柱；b)使用洗脫緩沖液，從所述蛋白A親和色譜柱洗脫所述單體單克隆抗體，所述洗脫緩沖液包含濃度為約0. 050 M至約0. 200 M的醋酸鹽；和c)收集來(lái)自步驟(b)的所述單體單克隆抗體的一個(gè)或多個(gè)級(jí)分，形成蛋白A產(chǎn)物庫(kù)， 其中所述產(chǎn)物庫(kù)i)包含小于5%的更高階聚集體，且ii)具有pH約3.5至約4. 5，由此從所述樣品純化所述單體單克隆抗體。
17.一種從樣品中純化單體單克隆抗體的方法，其中所述樣品包含所述單體單克隆抗體、宿主細(xì)胞雜質(zhì)、二聚體和更高階聚集體，所述方法包括a)使所述樣品接觸蛋白A親和色譜柱；b)使用洗脫緩沖液，從所述蛋白A親和色譜柱洗脫所述單體單克隆抗體；和c)收集來(lái)自步驟(b)的所述單體單克隆抗體的一個(gè)或多個(gè)級(jí)分，形成蛋白A產(chǎn)物庫(kù)， 其中所述產(chǎn)物庫(kù)i)包含小于5%的更高階聚集體，且ii)具有pH約3.2至約4. 5，由此從所述樣品純化所述單體單克隆抗體。
18.—種從樣品中純化單體單克隆抗體的方法，其中所述樣品包含單體單克隆抗體、 宿主細(xì)胞雜質(zhì)、二聚體和更高階聚集體，所述方法包括a)在約15°C至約27°C的溫度下，使樣品接觸蛋白A親和色譜柱；b)使用洗脫緩沖液，從所述蛋白A親和色譜柱洗脫所述單體單克隆抗體，所述洗脫緩沖液包含濃度為約0. 030 M至約0. 085 M的檸檬酸鹽；和c)收集來(lái)自步驟(b)的所述單體單克隆抗體的一個(gè)或多個(gè)級(jí)分，形成蛋白A產(chǎn)物庫(kù)， 其中所述產(chǎn)物庫(kù)i)包含小于5%的更高階聚集體，且ii)具有PH約3.2至約4.0，由此從所述樣品純化所述單體單克隆抗體。
19.一種從樣品中純化單體單克隆抗體的方法，其中所述樣品包含所述單體單克隆抗體、宿主細(xì)胞雜質(zhì)、二聚體和更高階聚集體，所述方法包括a)在約15°C至約27°C的溫度下，使樣品接觸蛋白A親和色譜柱；b)使用洗脫緩沖液，從所述蛋白A親和色譜柱洗脫單體單克隆抗體，所述洗脫緩沖液包含濃度為約0. 050 M至約0. 200 M的醋酸鹽；和c)收集來(lái)自步驟(b)的所述單體單克隆抗體的一個(gè)或多個(gè)級(jí)分，形成蛋白A產(chǎn)物庫(kù)， 其中所述產(chǎn)物庫(kù)i)包含小于5%的更高階聚集體，且ii)具有pH約3.2至約4. 5，由此從所述樣品純化所述單體單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了純化單體單克隆抗體的方法，所述方法包括使樣品接觸蛋白A親和色譜柱，其中所述樣品包含單體單克隆抗體、宿主細(xì)胞雜質(zhì)、二聚體和更高階聚集體；使用洗脫緩沖液，從蛋白A親和色譜柱洗脫單體單克隆抗體；和收集單體單克隆抗體的一個(gè)或多個(gè)級(jí)分，形成蛋白A產(chǎn)物庫(kù)，其中所述產(chǎn)物庫(kù)包含小于5%的更高階聚集體，且具有pH約3.2至約4.5，由此從樣品純化單體單克隆抗體。本發(fā)明也提供了純化單體單克隆抗體的方法，所述方法包括任選地在有氨基酸存在下，用醋酸鹽或檸檬酸鹽洗脫。本發(fā)明也提供了純化單體單克隆抗體的方法，所述方法包括在一定溫度范圍內(nèi)，進(jìn)行所述方法。
文檔編號(hào)C07K16/06GK102171237SQ200980139024
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2009年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月14日
發(fā)明者勞什 D., 格林-特雷克斯勒 E., 奇米洛夫斯基 R. 申請(qǐng)人:默沙東公司