專利名稱：與il-12結(jié)合的抗體及其純化方法
與IL-12結(jié)合的抗體及其純化方法與相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考
本申請(qǐng)要求于2008年10月20日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)61/196，752的利益，其在此整體引入作為參考。
背景技術(shù)：
人白細(xì)胞介素12 (IL-12)已表征為具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)和多效作用的細(xì)胞因子。IL-12在與涉及免疫和炎癥應(yīng)答的幾種疾病相關(guān)的病理學(xué)中起關(guān)鍵作用。IL-12、其生物學(xué)活性及其在疾病中的作用的綜述可以在Gately等人(1998)Ann. Rev. Immunol. 16:495-521中找到。在結(jié)構(gòu)上，IL-12是包括35 kDa亞基(p35)和40 kDa亞基(p40)的異二聚體蛋白質(zhì)，其通過二硫鍵連接在一起(被稱為“P70亞基”)。異二聚體蛋白質(zhì)主要由抗原呈遞細(xì)胞產(chǎn)生，所述抗原呈遞細(xì)胞例如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞。這些細(xì)胞類型也分泌相對(duì)于 P70亞基過量的p40亞基。p40和p35亞基在遺傳上無關(guān)，并且也未報(bào)道具有生物學(xué)活性， 盡管P40同二聚體可以充當(dāng)IL-12拮抗劑。在功能上，IL-12在調(diào)節(jié)抗原特異性T輔助細(xì)胞型(Thl)和2型(Th2)淋巴細(xì)胞之間的平衡中起重要作用。Thl和Th2細(xì)胞支配自身免疫病癥的起始和進(jìn)展，并且IL-12在 Thl淋巴細(xì)胞分化和成熟的調(diào)節(jié)中是關(guān)鍵的。由Thl細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子是炎性的，并且包括干擾素-Y (IFNy ), IL-2和淋巴毒素(LT)。Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和 IL-13，以促進(jìn)體液免疫、變態(tài)反應(yīng)和免疫抑制。與自身免疫疾病中的Thl應(yīng)答占優(yōu)勢(shì)和IFNy的促炎活性一致，IL-12可能在與許多自身免疫和炎性疾病相關(guān)的病理學(xué)中起主要作用，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、多發(fā)性硬化(MS)和Crohn氏病。具有MS的人患者已顯示IL-12表達(dá)中的增加，如由急性MS斑中的p40 mRNA水平證明的。此外，用來自MS患者的CD40L表達(dá)性T細(xì)胞先體外后體內(nèi)刺激抗原呈遞細(xì)胞導(dǎo)致與對(duì)照T細(xì)胞相比較增加的IL-12生產(chǎn)，與⑶40/⑶40L相互作用是IL-12的有效誘導(dǎo)物的
觀察一致。與健康對(duì)照相比較，在RA患者的滑液中已檢測(cè)到升高水平的IL-12 p70。在RA滑液中的細(xì)胞因子信使核糖核酸(mRNA)表達(dá)概況占優(yōu)勢(shì)地鑒定Thl細(xì)胞因子。IL-12還看起來在與Crohn氏病(CD)相關(guān)的病理學(xué)中起關(guān)鍵作用。在具有這種疾病的患者的腸粘膜中已觀察到IFNy和IL-12增加的表達(dá)。來自⑶患者的固有層的T細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌概況是占優(yōu)勢(shì)地Thl應(yīng)答的特征，包括極大升高的IFNy水平。此外，來自⑶患者的結(jié)腸組織切片顯示IL-12表達(dá)性巨噬細(xì)胞和IFNy表達(dá)性T細(xì)胞的豐度。由于人IL-12在多種人病癥中的作用，已設(shè)計(jì)治療策略以抑制或抵消IL-12活性。 具體地，已尋求與IL-12結(jié)合且中和IL-12的抗體作為抑制IL-12活性的方法。重要的是包括針對(duì)IL-12的抗體的治療方案具有高純度。本發(fā)明解決了這個(gè)需要，而無需使用A蛋白柱或等價(jià)的基于A蛋白的純化步驟。發(fā)明概述
在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及與IL-12結(jié)合的純化、分離的抗體和抗體片段，以及包括此種抗體和片段的藥物組合物。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及與人IL-12結(jié)合的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分。本發(fā)明的分離的抗IL-12抗體可以用于臨床情況以及研究和開發(fā)中。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括SEQ ID NOs. 1和2中鑒定的重和輕鏈序列的抗IL-12抗體。本發(fā)明的特定實(shí)施方案涉及從樣品基質(zhì)中純化抗IL-12抗體或其抗原結(jié)合部分， 以使其基本上不含宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(“HCPs”)的方法。在特定方面，樣品基質(zhì)(或簡(jiǎn)單地“樣品”)包括用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗IL-12抗體的細(xì)胞系。在具體方面，樣品包括用于產(chǎn)生人抗 IL-12抗體的細(xì)胞系。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，對(duì)包括推定的抗IL-12抗體或其抗原結(jié)合部分的樣品基質(zhì)實(shí)施PH調(diào)整。在特定方面，將pH調(diào)整至約3. 5。低pH尤其促進(jìn)可能污染樣品的pH 敏感病毒的減少和/或滅活。在合適的時(shí)間段后，將PH調(diào)整至約5. 0，并且對(duì)樣品實(shí)施離子交換層析，以產(chǎn)生洗脫物。在特定方面，收集離子交換洗脫物，并且進(jìn)一步實(shí)施疏水作用層析，以產(chǎn)生洗脫物。隨后可以收集疏水作用層析洗脫物用于進(jìn)一步加工或使用。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了純化IL-12抗體的方法，其包括初步回收步驟， 以尤其去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片。在上述方法的特定實(shí)施方案中，初步回收步驟包括一個(gè)或多個(gè)離心或深層過濾(cbpth filtration)步驟。例如并且非限制性地，此種離心步驟可以以約7000 χ g至約11，000 χ g執(zhí)行。此外，上述方法的特定實(shí)施方案將包括深層過濾步驟， 例如去脂(delipid)深層過濾步驟。在上述方法的特定實(shí)施方案中，離子交換步驟可以是陽離子或陰離子交換層析或兩者的組合。這個(gè)步驟可以包括多個(gè)離子交換步驟，例如陽離子交換步驟隨后為陰離子交換步驟，或反之亦然。在特定方面，離子交換步驟涉及兩步驟離子交換過程。此種兩步驟過程可以例如且不限于通過第一個(gè)陽離子交換步驟隨后為第二個(gè)陰離子交換步驟來完成。示例性陽離子交換柱是其固定相包括陰離子基團(tuán)的柱，例如CM Hyper DF 柱。這個(gè)離子交換捕獲層析步驟促進(jìn)從初步回收混合物中分離抗IL-12抗體。合適的陰離子交換柱是其固定相包括陽離子基團(tuán)的柱。此種柱的例子是Q kpharose 柱。一個(gè)或多個(gè)離子交換步驟通過減少雜質(zhì)進(jìn)一步分離抗IL-12抗體，所述雜質(zhì)如宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和DNA以及在可應(yīng)用時(shí)的親和基質(zhì)蛋白質(zhì)。這個(gè)陰離子交換程序是層析的流通(flow through)模式，其中抗IL-12 抗體不與陰離子交換樹脂(或固相)相互作用或結(jié)合。然而，許多雜質(zhì)的確與陰離子交換樹脂相互作用且結(jié)合。在特定實(shí)施方案中，在初步回收后執(zhí)行第一個(gè)和第二個(gè)離子交換步驟。在特定此種實(shí)施方案中，對(duì)離子交換樣品實(shí)施中間過濾步驟，在第一個(gè)離子交換步驟前，在2個(gè)離子交換步驟之間，或兩者。在特定方面，這個(gè)過濾步驟包括捕獲超濾/滲濾(“UF/DF”)。在其他活性中，此種過濾促進(jìn)抗IL-12抗體及其抗原結(jié)合部分的濃縮和緩沖液更換。本發(fā)明的特定實(shí)施方案提供了包括一個(gè)或多個(gè)疏水作用層析(“HIC”)步驟的方法。合適的HIC柱是其固定相包括疏水基團(tuán)的那種。此種柱的非限制性例子是Wienyl HP kpharose 柱。在特定情況下，抗IL-12抗體在分離/純化過程期間將形成聚集體。一個(gè)或多個(gè)HIC步驟的包括促進(jìn)此種聚集的減少或消除。HIC還幫助去除雜質(zhì)。在特定實(shí)施方案中，HIC步驟采用高鹽緩沖液，以促進(jìn)抗IL-12抗體(或其聚集)與疏水柱的相互作用?？?IL-12抗體隨后可以使用較低濃度的鹽進(jìn)行洗脫。
在特定實(shí)施方案中，HIC洗脫物使用病毒去除濾器進(jìn)行過濾，例如但不限于 Ultipor DV50 濾器(Pall Corporation,East Hills，N. Y.)?？商娲鸀V器例如 Viresolve 濾器(Millipore，Billerica, Mass. ) ；Zeta Plus VR 濾器(CUN0 ；Meriden, Conn.)；和 Planova 濾器(Asahi Kasei Pharma，Planova Division,Buffalo Grove，111.)，也可以在此種實(shí)施方案中使用。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括分離的抗IL-12抗體或其抗原結(jié)合部分和可接受載體的一種或多種藥物組合物。在一個(gè)方面，組合物進(jìn)一步包括除抗IL-12抗體外的一種或多種抗體或其抗原結(jié)合部分。在另一個(gè)方面，組合物進(jìn)一步包括一種或多種藥物試劑。附圖簡(jiǎn)述


圖1.圖1公開了抗IL-12抗體(ABT-847)的非限制性例子的重和輕鏈可變區(qū)序列。發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及與IL-12結(jié)合的抗體。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及與人IL-12結(jié)合的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分。本發(fā)明的分離的抗IL-12抗體可以用于臨床情況以及研究和開發(fā)中。本發(fā)明還涉及用于純化抗IL-12抗體或其抗原結(jié)合部分的方法?？梢栽诒景l(fā)明的背景中純化的合適抗IL-12抗體公開于美國(guó)專利號(hào)6，914，128 (其在此整體引入作為參考)中， 包括但不限于在那個(gè)專利中鑒定為J695的抗IL-12抗體，并且其隨后已鑒定為ABT-874。 ABT-874的重和輕鏈可變區(qū)的序列在圖1以及SEQ ID NOs. 1和2中顯示。本發(fā)明還涉及包括本文描述的抗IL-12抗體或其抗原結(jié)合部分的藥物組合物。為了清楚起見且非限制性地，這個(gè)詳述分成下述亞部分
1.定義；
2.抗體生成；
3.抗體生產(chǎn)；
4.抗體純化；
5.測(cè)定樣品純度的方法；
6.進(jìn)一步修飾；
7.藥物組合物；和
8.抗體用途。1.定義
為了本發(fā)明可以更容易理解，首先定義了特定術(shù)語。術(shù)語“抗體”包括免疫球蛋白分子，其包含通過二硫鍵互連的4條多肽鏈一一 2條重(H)鏈和2條輕(L)鏈。每條重鏈包括重鏈可變區(qū)(本文縮寫為HCVR或VH)和重鏈恒定區(qū)(CH)。重鏈恒定區(qū)包括3個(gè)結(jié)構(gòu)域一一 CH1、CH2和CH3。每條輕鏈包括輕鏈可變區(qū)(本文縮寫為L(zhǎng)CVR或VL)和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包括一個(gè)結(jié)構(gòu)域一一 CL。VH和VL區(qū)可以進(jìn)一步再分成稱為互補(bǔ)性決定區(qū)(CDRs)的高變區(qū)，由稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的更保守區(qū)域點(diǎn)綴。 每個(gè)VH和VL由3個(gè)⑶Rs和4個(gè)FRs組成，從氨基末端到羧基末端以下述次序排列FR1、 CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”(或“抗體部分”)包括抗體的片段，其保留與抗原(例如，hIL-12)特異性結(jié)合的能力。已顯示抗體的抗原結(jié)合功能可以通過全長(zhǎng)抗體的片段執(zhí)
8行。在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”內(nèi)包含的結(jié)合片段例子包括(i) Fab片段，包括VL、VH、 CL和CHl結(jié)構(gòu)域的單價(jià)片段；(ii)F(ab' )2片段，包括在鉸鏈區(qū)通過二硫鍵連接的2個(gè)Fab 片段的二價(jià)片段；(iii )包括VH和CHl結(jié)構(gòu)域的Fd片段；(iv)包括抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域的Fv片段，(ν)包括VH結(jié)構(gòu)域的dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341:544 546, 其完整教導(dǎo)引入本文作為參考);和(vi)分離的互補(bǔ)性決定區(qū)(⑶R)。此外，盡管Fv片段的 2個(gè)結(jié)構(gòu)域VL和VH由分開的基因編碼，但它們可以使用重組法通過合成接頭進(jìn)行連接，所述合成接頭使得它們能夠制備為單條蛋白質(zhì)鏈，其中VL和VH區(qū)配對(duì)以形成單價(jià)分子(稱為單鏈 Fv (scFv);參見例如，Bird 等人(1988)Science 242 423-426 ；和 Huston 等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 855879-5883，其完整教導(dǎo)引入本文作為參考)。此種單鏈抗體也意欲包含在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”內(nèi)。還包含其他形式的單鏈抗體，例如雙抗體。 雙抗體是二價(jià)、雙特異性抗體，其中VH和VL結(jié)構(gòu)域在單條多肽鏈上表達(dá)，但使用太短而不允許相同鏈上的2個(gè)結(jié)構(gòu)域之間配對(duì)的接頭，從而迫使結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，并且產(chǎn)生2個(gè)抗原結(jié)合部位(參見例如，Holliger，P.，等人(1993)ftx)C. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 ;Poljak，R. J.，等人(1994)Mructure 2:1121-1123，其完整教導(dǎo)引入本文作為參考)。再進(jìn)一步地，抗體或其抗原結(jié)合部分可以是通過抗體或抗體部分與一種或多種其他蛋白質(zhì)或肽的共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合形成的較大免疫粘附分子的部分。此種免疫粘附分子的例子包括使用鏈霉抗生物素蛋白核心區(qū)，以制備四聚scFv分子(Kipriyanov， S. Μ.，等人(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101，其完整教導(dǎo)引入本文作為參考)，以及使用半胱氨酸殘基、標(biāo)記肽和C末端多組氨酸標(biāo)簽，以制備二價(jià)和生物素化的 scFv分子(Kipriyanov，S. Μ.，等人(1994)Mol. Immunol. 31 1047-1058，其完整教導(dǎo)引入本文作為參考)?？贵w部分例如Fab和F (ab’)2片段可以使用常規(guī)技術(shù)由完整抗體制備， 例如完整抗體分別地木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。此外，抗體、抗體部分和免疫粘附分子可以使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)獲得，如本文描述的。在一個(gè)方面，抗原結(jié)合部分是完整結(jié)構(gòu)域或完整結(jié)構(gòu)域?qū)?。如本文使用的，短語“人白細(xì)胞介素12”(本文縮寫為hIL-12或IL-12)包括主要由巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞分泌的人細(xì)胞因子。該術(shù)語包括包含35 kD亞基(p35)和40 kD 亞基(P40)的異二聚體蛋白質(zhì)，其通過二硫鍵連接在一起。異二聚體蛋白質(zhì)被稱為“p70 亞基”。人IL-12的結(jié)構(gòu)在例如下述中進(jìn)一步描述Kobayashi，等人(1989) J. Exp Med. 170:827-845 ;Seder，等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90 10188-10192 ;Ling，等人(1995) J. Exp Med. 154:116-127 ;Podlaski，等人(1992) Arch. Biochem. Biophys. 四4:230-237，其完整教導(dǎo)引入本文作為參考。編碼IL-12的核酸可作為GenBank登記號(hào) NM_000882獲得，并且多肽序列可作為GenBank登記號(hào)NP_000873. 2獲得。術(shù)語人IL-12意欲包括重組人IL-12 (rh IL-12)，這可以通過標(biāo)準(zhǔn)重組表達(dá)方法進(jìn)行制備。術(shù)語“Kabat編號(hào)”、“ Kabat定義”和“Kabat標(biāo)記”在本文中可互換使用。本領(lǐng)域公認(rèn)的這些術(shù)語指編號(hào)氨基酸殘基的系統(tǒng)，所述氨基酸殘基比抗體或其抗原結(jié)合部分的重和輕鏈可變區(qū)中的其他氨基酸殘基更可變(即高變XKabat等人(1971 )Arm. NY Acad, Sci. 190:382-391 禾口 Kabat，Ε· A.，等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,U. S. Department of Health and Human Services,NIH公開號(hào)91-3242, 其完整教導(dǎo)引入本文作為參考)。對(duì)于重鏈可變區(qū)，高變區(qū)范圍為關(guān)于CDRl的氨基酸位置31 - 35、關(guān)于⑶R2的氨基酸位置50 - 65、和關(guān)于⑶R3的氨基酸位置95 - 102。對(duì)于輕鏈可變區(qū)，高變區(qū)范圍為關(guān)于⑶Rl的氨基酸位置M - 34、關(guān)于⑶R2的氨基酸位置50 -56、和關(guān)于⑶R3的氨基酸位置89 - 97。術(shù)語“人抗體”包括具有與人種系免疫球蛋白序列對(duì)應(yīng)的可變和恒定區(qū)的抗體，如 ^ Kabat ^AffiiiW Kabat, ^A (1991 )Sequences of proteins of Immunological Interest,第 5 版，U. S. Department of Health and Human Services, NIH
發(fā)明者佩里利帕爾默 B., 黃 Q., K. ?？寺?R. 申請(qǐng)人:雅培制藥有限公司