專利名稱：延長的dicer酶底物和特異性抑制基因表達的方法
延長的DICER酶底物和特異性抑制基因表達的方法相關申請的交叉引用與本發(fā)明相關的參照申請，涉及到的并按照美國法典第35篇第119條要求了其優(yōu)先權的申請，具體如下美國臨時專利申請No. 61/138，946，申請日12月18，2008 ；美國臨時專利申請No. 61/166，227，申請日為April 2,2009 ；美國臨時專利申請No. 61/173，505， 申請日為April 28,2009 ；美國臨時專利申請No. 61/173，514，申請日為April 28， 2009 ；美國臨時專利申請No. 61/173，521，申請日為April 28,2009 ；美國臨時專利申請 No. 61/173，525，申請日為April 28,2009 ；美國臨時專利申請No. 61/173，532，申請日為 April 28,2009 ；美國臨時專利申請No. 61/173，538，申請日為April 28,2009 ；美國臨時專利申請No. 61/173，544，申請日為April 28，2009 ；美國臨時專利申請No. 61/173，549，申請日為April 28,2009 ；美國臨時專利申請No. 61/173，554，申請日為April 28,2009 ；美國臨時專利申請No. 61/173，556，申請日為April 28,2009 ；美國臨時專利申請No. 61/173，558， 申請日為April 28，2009 ;and美國臨時專利申請No. 61/173,563，申請日為April 28， 2009。本文件參考的上述申請給予的教導是整體一致的。
背景技術：
雙鏈RNA (dsRNA)是一種長度為25_35核苷酸鏈，在哺乳類動物里是一種高效的目的基因表達抑制劑(Rossi等人美國專利2005/0244858和2005/0277610)。這種長度的雙鏈RNA分子被認為是通過RNA干擾(RNAi)途徑被Dicer酶剪切處理，因此，這樣的分子在學術上被命名為"Dicer酶的底物siRNA" (DsiRNA)。某種經(jīng)修飾的DsiRNA結(jié)構的分子在Rossi等人公布號No. 2007/0265220的美國專利中有描述。鑒于25-35個核苷酸長度的dsRNA片段對特異性序列的目的基因沉默的功效已經(jīng)完全被證實，因此，迫切需要設計更多的這種核苷酸片段，包括在體內(nèi)體外都具有高效作用的DsiRNA分子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是基于(至少部分基于)一個令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，通過正義鏈的3’末端或末端附近/反義鏈的5’末端或末端附近，或者正義鏈5’末端或末端附近/反義鏈3’末端或末端的脫氧核糖核苷酸的堿基配對，含有脫氧核苷酸配對的27-39個堿基序列的雙鏈核苷酸片段是高效的RNA干擾劑。實際上，本發(fā)明證實了，通過Dicer酶的剪切，從活性siRNA 中分離的Dicer酶的底物siRNA (DsiRNAs)區(qū)域內(nèi)的核糖核苷酸的堿基配對，從而形成了一種高效抑制劑。DsiRNA區(qū)域內(nèi)的1個或更多的脫氧核糖核苷酸堿基對對這樣的DsiRNA能給予一些有利優(yōu)勢，包括例如提高效率(包括提高效能，和/或者延長作用時間)，或者展示出一個可識別的區(qū)域給DNA結(jié)合分子，或者其他的與DNA:DNA雙鏈區(qū)相關的特性。事實上，相對于相應的RNA DNA雙鏈或者RNA RNA雙鏈延長的Ds iRNA，這種 DNAiDNA雙鏈延長的DsiRNA被證實具有增強的效用，特別是包括有改良的效力。本發(fā)明的優(yōu)點中，令人驚訝的發(fā)現(xiàn)是，與相應長度的不含雙鏈DNA延長區(qū)域的dsRNA片段相比，DNA延長的DsiRNA片段不會隨著雙鏈長度的增加而降低活性，這就使得可以提供更多的結(jié)合空間以產(chǎn)生具有RNA抑制活性的DsiRNA，例如，附加的功能集團連接到 DsiRNAs上，包括/制定穩(wěn)定的修飾(如，PS-NA基團)或者其他的修飾，可以進一步增加實用功能和/或加強的性能，如藥物代謝動力學，藥效學或者生物分配性能。這種雙鏈DNA延長區(qū)域，不象是由已有的dsDNA退火產(chǎn)生的，而更象是來源于由特定的、局部的脫氧核糖核苷酸殘基(可以是在第一寡核苷酸鏈的設計好的Dicer剪切處的3'末端和相應的第二寡核苷酸鏈的Dicer剪切處的5’末端，或者在第一寡核苷酸鏈 Dicer剪切處的5’端和相應的第二寡核苷酸鏈的Dicer剪切處的3’端)指導Dicer酶剪切而產(chǎn)生的和/或更普遍地制備到的更好的剪切產(chǎn)物和/或全部的剪切產(chǎn)物。因此，某些方面，本發(fā)明可設計一種RNA抑制劑，相比以前已報道的RNA抑制劑，其具有更高的效能，更長的長度(通過更精確的指導Dicer酶的剪切位點)。產(chǎn)生的含dsRNA 產(chǎn)物，可提供更高效的傳遞，代謝動力學，藥效性的和生理分配性能，同樣，一些更好的如下性能也可以成功設計例如，或者與有活性的藥物分子和/或載體結(jié)合，或者與其他活性核酸分子結(jié)合，或者與檢測分子結(jié)合，從而獲得穩(wěn)定的修飾等等。一方面，本發(fā)明提供了一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5，末端和3，末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第一寡核苷酸鏈具有27-49 個核苷酸殘基，起始于第一寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸。第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的堿基配對形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的5’末端和第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端(blunt end)或1_4個核苷酸組成的3，懸垂(overhang)結(jié)構。第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端，第一寡核苷酸鏈的第24至3’末端的核苷酸殘基中的至少一個是脫氧核糖核苷酸，并與第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸形成堿基對；沿著第二寡核苷酸鏈至少有19個核糖核苷酸殘基序列與靶標RNA充分互補，這樣雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞后可抑制目的基因的表達。另一方面，本發(fā)明提供一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第一寡核苷酸鏈具有27-53 個核苷酸殘基，起始于第一寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的堿基配對形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的5’末端和第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成1-4個核苷酸組成的 3’懸垂結(jié)構，在第一寡核苷酸鏈的第24位至3’末端中至少有一個殘基是脫氧核糖核苷酸， 且與第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對；沿著第二寡核苷酸鏈至少有19個核糖核苷酸序列與靶標RNA充分互補，這樣雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞后可抑制目的基因的表達。另一方面，本發(fā)明提供一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，起始于第一寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的堿基配對形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的5’末端和第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端，第一寡核苷酸鏈的3’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基與第二寡核苷酸鏈的5’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基形成一個或兩個錯配的堿基對，在第一寡核苷酸鏈的第24 位至3’末端中至少有一個殘基是脫氧核糖核苷酸，且與第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對；沿著第二寡核苷酸鏈至少有19個核糖核苷酸序列與靶標RNA充分互補，這樣雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞后可抑制目的基因的表達。另一方面，本發(fā)明提供一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第一寡核苷酸鏈具有27-49 個核苷酸殘基，起始于第一寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸，第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，其與第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的5’末端和第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端，第一寡核苷酸鏈起始于5’末端的第一個核苷酸((第1)，第一寡核苷酸鏈的5’末端第1至第9個核苷酸殘基中含有一個堿基與第二寡核苷酸鏈形成錯配；第一寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中的至少一個是脫氧核糖核苷酸，并與第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對；沿著第二寡核苷酸鏈至少有19個核糖核苷酸序列與靶標RNA充分互補，這樣雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞后可抑制目的基因的表達。另一方面，本發(fā)明提供一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第一寡核苷酸鏈具有27-53 個核苷酸殘基，起始于第一寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的5’末端和第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端，第一寡核苷酸鏈的5’末端第1至第9個核苷酸殘基中的一個堿基與第二寡核苷酸鏈形成錯配；第一寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中的至少一個是脫氧核糖核苷酸，并與第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對；沿著第二寡核苷酸鏈至少有19個核糖核苷酸序列與靶標RNA充分互補，這樣雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞后可抑制目的基因的表達。另一方面，本發(fā)明提供一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，起始于第一寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的5’末端和第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端，第一寡核苷酸鏈的3’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基與第二寡核苷酸鏈的5’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基形成一個或兩個錯配的堿基對；第一寡核苷酸鏈的5’末端第1至第 9個核苷酸殘基中一個堿基與第二寡核苷酸鏈形成錯配；第一寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中的至少一個是脫氧核糖核苷酸，并與第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。一個實施例中，第一寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中有2個或2 個以上，4個或4個以上，6個或6個以上，8個或8個以上，10個或10個以上，12個或12個以上，14個或14個以上，16個或16個以上，和20個或20個以上的核苷酸殘基是脫氧核糖核苷酸，并與第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對，并且，任選地，上述第一寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸與第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對是連續(xù)的。在一個實施例中，第一寡核苷酸鏈的第24至第27位核酸殘基為脫氧核糖核苷酸， 其中有2個或者更多核苷酸殘基與第二寡核苷酸鏈的堿基配對。在另一個實施例中，第一寡核苷酸鏈的第24位和第25位核酸殘基都是脫氧核糖核苷酸，并與第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對。在另一個實施例中，第一寡核苷酸鏈的第24位至第27位核酸殘基是脫氧核糖核苷酸，并與第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對。在另一個實施例中，第一寡核苷酸鏈具有29-49個核苷酸殘基，第一寡核苷酸鏈的第24位至第27位核酸殘基都是脫氧核糖核苷酸，并與第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對。在另一個實施例中，第一寡核苷酸鏈具有31-49個核苷酸殘基，任意地，第一寡核苷酸鏈的第24位至第29位核酸殘基都是脫氧核糖核苷酸，并與第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對。在另一個實施例中，第一寡核苷酸鏈具有33-49個核苷酸殘基，第一寡核苷酸鏈的第24位至第31位核酸殘基都是脫氧核糖核苷酸，并與第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對。在另一個實施例中，第一寡核苷酸鏈具有35-49個核苷酸殘基，第一寡核苷酸鏈的第24位至第33位核酸殘基都是脫氧核糖核苷酸，并與第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對。在另一個實施例中，第一寡核苷酸鏈具有37-49個核苷酸殘基，任意地，第一寡核苷酸鏈的第24位至第35位核酸殘基都是脫氧核糖核苷酸，并與第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對。在一個實施例中，第一寡核苷酸鏈具有39-49個核苷酸殘基，第一寡核苷酸鏈的第24位至第37位核酸殘基都是脫氧核糖核苷酸，并與第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對。在另一個實施例中，與第一寡核苷酸鏈相配對的第二寡核苷酸鏈中的脫氧核糖核苷酸與靶標RNA不互補。在某個實施例中，第二寡核苷酸鏈的3’端含一個1-4個堿基的懸垂。在另一個相應的實施例中，第二寡核苷酸鏈3’懸垂的核苷酸中一個核苷酸被修飾，任選地，修飾這個核苷酸的是 2，-氧-甲基(2' -0-methyl)，2，-甲氧基乙氧基(2' -methoxyethoxy), 2'-M 代，2，-烯丙基(2' -allyl)，2，-氧-[2-(甲氨基)_2_ 氧代乙基](2‘ -0-[2-(methylami no)-2-oxoethyl])，4，_ 硫代，4，-甲基-氧-2，-橋聯(lián)(4' -CH2-0-2‘ -bridge)，2，-LNA， 2，-氨基和 2，-0-(氮-甲基氨基甲酸酯))(2' -amino or2' -0-(N-methlycarbamate)) 或者上述組合。在另一個實施例中，第一寡核苷酸鏈的第24到3’末端的核苷酸殘基中至少有一個核苷酸被修飾，其中，任選地，核苷酸的修飾基團是2’ -氧-甲基，2’ -甲氧基乙氧基， 2，_氟代，2，-烯丙基，2，-氧-[2-(甲氨基)-2_氧代乙基]，4，-硫代，4，-甲基-氧-2，-橋聯(lián)，2’ -LNA，2’ -氨基和2’ -0-(氮-氨基甲酸酯)。在一個實施例中，所述第一寡核苷酸鏈的3’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基是脫氧核糖核苷酸，第二寡核苷酸鏈的5’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基是核糖核苷酸。在另一個實施例中，第二寡核苷酸鏈起始于與第一寡核苷酸鏈的5’末端核苷酸殘基互補配對的核苷酸(第1*位)，并所有從第20*位至5’末端的核苷酸殘基未被修飾；任選地，起始于第一寡核苷酸3’末端的第一個核苷酸(第1*位)，第1*位、第2* 位和/或第3*位是被脫氧核糖核苷酸。在一個實施例中，第一寡核苷酸鏈的3’末端第1*位是脫氧核糖核苷酸。任選地， 第一寡核苷酸鏈的3’末端第1*位和第2*位是脫氧核糖核苷酸。在另一個實施例中，第二寡核苷酸鏈或第一寡核苷酸鏈中的一個核苷酸被經(jīng)修飾的核苷酸取代，該被修飾的核苷酸指導Dicer酶剪切的定位。在另一個實施例中，從第二寡核苷酸鏈3'端第一個核苷酸(第1*位)起始，第二寡核苷酸鏈3’末端的第1*位、第2*位和第3*位是被修飾的核苷酸。任選地，第一寡核苷酸鏈具有至少60 %，70 %，80 %，90 %，95 %或100 %與第二寡核苷酸鏈互補的核苷酸序列。在某個實施例中，第一寡核苷酸鏈的3’末端的核苷酸殘基通過核苷酸序列連接于第二寡核苷酸鏈的5’末端核苷酸殘基。任選地，連接于所述第一寡核苷酸鏈的3’末端核苷酸殘基和第二寡核苷酸鏈的5’末端核苷酸殘基的所述核苷酸序列包含有四核苷酸環(huán) (tetraloop)或發(fā)夾(hairpin)結(jié)構。在一個實施例中，第一寡核苷酸鏈和第二寡核苷酸鏈通過化學連接劑鏈接，且任選地，第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端通過化學試劑連接。在一個實施例中，與第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷配對的第一寡核苷酸鏈的第 24位至3’末端的核苷酸殘基中的至少一個是未被修飾的脫氧核糖核苷酸，在一個相應的實施例中，第一寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中的至少一個是脫氧核糖核苷酸，并與第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸堿基配對，且配對的所述第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸是未被修飾的脫氧核糖核苷酸。在一個實施例中，第二寡核苷酸鏈起始于與第一寡核苷酸鏈5’末端互補配對的核苷酸殘基，包括有由交替的被修飾和未被修飾的核苷酸殘基。在另一個實施例中，DsiRNA的第3至第9位存在一個或更多的錯配。實在另一個實施例中，DsiRNA的第1至7位存在一個或更多的錯配，在另一個實施例中，DsiRNA的第3 至第7位存在一個或更多的錯配，任選的，第6位存在錯配。在另一個實施例中，從第一寡核苷酸鏈的5’端第一個核苷酸(第1)起始，第1位至第9位存在2個或者更多的與第二寡核酸鏈的錯配，任選地，第2位和第6位是錯配的。另一方面，本發(fā)明提供一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第一寡核苷酸鏈具有27-49 個核苷酸殘基，起始于第一寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的5’末端和第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸的3’懸垂結(jié)構；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端，于與第一寡核苷酸鏈5'末端互補的第二寡核苷酸鏈的第一位核苷酸殘基(1*) 開始，從第二寡核苷酸鏈5'方向第1位至第9位核苷酸殘基有一個核苷酸與靶標RNA形成錯配；在第一寡核苷酸鏈的第24位至3’末端中至少有一個殘基是脫氧核糖核苷酸，且與第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸配對；沿著第二寡核苷酸鏈至少有19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，這樣雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞后可降低目的基因的表達。另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’ 末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第一寡核苷酸鏈具有 27-53個核苷酸殘基，起始于第一寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第 23個核苷酸是核糖核苷酸。第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的5’末端和所述第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成一個1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；于與第一寡核苷酸鏈5’端互補的第二寡核苷酸鏈的第一位核苷酸殘基(1*)開始，從第二寡核苷酸鏈5方向第一位至第9位核苷酸殘基有一個核苷酸與靶標RNA形成錯配，在第一寡核苷酸鏈的第24位至3’末端中至少有一個殘基是脫氧核糖核苷酸，且與第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸配對；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’ 末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第一寡核苷酸鏈具有 27-49個核苷酸殘基，起始于第一寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第 23個核苷酸是核糖核苷酸；第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的5’末端和所述第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的 3’懸垂結(jié)構；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成一個1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；于與第一寡核苷酸鏈5’端匹配的第二寡核苷酸鏈的第一位核苷酸殘基(1*)開始，從第二寡核苷酸鏈5’方向第1位至第9位核苷酸殘基有一個核苷酸與靶標RNA形成錯配，在第一寡核苷酸鏈的第24位至3’末端至少有一個殘基是脫氧核苷酸，且與第二寡核苷酸鏈的脫氧核苷酸配對；沿著第二寡核苷酸鏈至少有19個核糖核苷酸序列與靶標RNA充分互補，這樣雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞后可降低目的基因的表達。在一個實施例中，第二寡核苷酸鏈的3’懸垂結(jié)構的一個堿基與靶標RNA錯配。另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’ 末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第二寡核苷酸鏈具有 27-53個核苷酸殘基，起始于第二寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第二寡核苷酸鏈的第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基， 并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，且與第二寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的堿基配對形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端；在第二寡核苷酸鏈的3’末端第24位后至少有一個殘基是脫氧核苷酸，且與第一寡核苷酸鏈的脫氧核苷酸配對；沿著第二寡核苷酸鏈至少有19個核苷酸序列與靶標RNA充分互補，這樣雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞后可降低目的基因的表達。另一個方面，本發(fā)明提供了一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’ 末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第二寡核苷酸鏈具有 27-53個核苷酸殘基，起始于第二寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第二寡核苷酸鏈的第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；第一寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基， 并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第二寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的堿基配對形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；在第二寡核苷酸鏈的第24位到3’末端中至少有一個殘基是脫氧核苷酸，且與第一寡核苷酸鏈的脫氧核苷酸配對；沿著第二寡核苷酸鏈至少有19個核糖核酸與靶標RNA充分互補，這樣雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞后可降低目的基因的表達。另一方面，另一方面，本發(fā)明提供了一種雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和 3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，起始于第二寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸。第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第二寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的堿基配對形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端；第一寡核苷酸鏈的3’ 末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基與第二寡核苷酸鏈的5’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基形成一個或兩個錯配的堿基對。在第二寡核苷酸鏈的第24位至3’末端中至少有一個殘基是脫氧核糖核苷酸，且與第一寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸配對；沿著第二寡核苷酸鏈至少有19個核糖核酸與靶標RNA充分互補，這樣雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞后可降低目的基因的表達。 另一方面，本發(fā)明提供了一種雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5，末端和3，末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，起始于第二寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸，第11至第21位核苷酸中包含一個與第一寡核苷酸鏈形成堿基錯配的核苷酸；第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第二寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端，在第二寡核苷酸鏈的3’末端第24位后至少有一個殘基是脫氧核苷酸，且與第一寡核苷酸鏈的脫氧核苷酸配對；沿著第二寡核苷酸鏈至少有19個核糖核酸與靶標RNA充分互補，這樣雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞后可降低目的基因的表達。另一方面，本發(fā)明提供了一種雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第二寡核苷酸鏈具有27-53 個核苷酸殘基，起始于第二寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸，第11至第21位核苷酸中包含一個與第一寡核苷酸鏈錯配的核苷酸。 第一寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第二寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的堿基配對形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構，在第二寡核苷酸鏈的第24位至3’末端中至少有一個殘基是脫氧核糖核苷酸，且與第一寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸配對；沿著第二寡核苷酸鏈至少有19個核糖核酸與靶標RNA充分互補，這樣雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞后可降低目的基因的表達。另一個方面，本發(fā)明提供了一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’ 末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第二寡核苷酸鏈具有 27-53個核苷酸殘基，起始于第二寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第 23個核苷酸是核糖核苷酸；第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，并具有21個連續(xù)的核糖核苷酸，與第二寡核苷酸鏈的第3至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端，第一寡核苷酸鏈的3’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基與第二寡核苷酸鏈的5’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基形成一個或兩個錯配的堿基對；在第二寡核苷酸鏈的第24位至3’末端中至少有一個殘基是脫氧核苷酸，且與第一寡核苷酸鏈的脫氧核苷酸配對；沿著第二寡核苷酸鏈至少有19個核糖核酸與靶標RNA充分互補，這樣雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞后可降低目的基因的表達。在一個實施例中，第二寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中有4個或 4個以上，6個或6個以上，8個或8個以上，10個或10個以上，12個或12個以上，14個或 14個以上，16個或16個以上，或者20個或20個以上的核苷酸殘基是脫氧核糖核苷酸，并與第一寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對，另一個實施例中，第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸與第一寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對是連續(xù)的；有選擇地，在另一個實施中第二寡核苷酸鏈的第24至第27 位核苷酸殘基為脫氧核糖核苷酸，其中有2個或者更多連續(xù)的核苷酸殘基與第一寡核苷酸鏈的堿基配對。在一個實施中，DsiRNA第二寡核苷酸鏈的第24位和第25位都為脫氧核糖核苷酸， 并與第一寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對。任選地，第二寡核苷酸鏈的第24位至第27位核酸殘基是脫氧核糖核苷酸，并與第一寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對。在一個實施中，第二寡核苷酸鏈具有29-53個核苷酸殘基，任選地，第二寡核苷酸鏈的第24位至第27位核酸殘基都是脫氧核糖核苷酸，并與第一寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對。在另一個實施中，第二寡核苷酸鏈具有31-53個核苷酸殘基，任選地，第二寡核苷酸鏈的第24位至第29位核酸殘基都是脫氧核糖核苷酸，并與第一寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對。在另一個實施中，第二寡核苷酸鏈具有33-53個核苷酸殘基，任選地，第二寡核苷酸鏈的第24位至第31位核酸殘基都是脫氧核糖核苷酸，并與第一寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對。在某個實施例中，DsiRNA的第二寡核苷酸鏈有35-53個核苷酸殘基， 任選地，第二寡核苷酸鏈的第24位至第33位核酸殘基都是脫氧核糖核苷酸，并與第一寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對。在另一個實施中，第二寡核苷酸鏈具有37-53個核苷酸殘基，第二寡核苷酸鏈的第24位至第35位核酸殘基都是脫氧核糖核苷酸，并與第一寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配。在另一個實施中，DsiRNA的第二寡核苷酸鏈具有39_53個核苷酸殘基，第二寡核苷酸鏈的第24位至第37位核酸殘基都是脫氧核糖核苷酸，并與第一寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對。在一個實施中，第二寡核苷酸鏈的第24位到3’末端的核苷酸殘基中有1-25個脫氧核糖核苷酸，且每個脫氧核糖核苷酸與第一寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對。在另一個實施中，第二寡核苷酸鏈起始于與第一寡核苷酸鏈3’末端互補配對的第一位(1*)核苷酸殘基，與其配對的堿基是第一寡核苷酸鏈的5’ Dicer剪切處的3’緊接位置處(immediately3' of the most 5')，第二寡核苷酸鏈的第20位處至5，末端中的所有核苷酸殘基包括有未經(jīng)修飾的。在另一個實施中，起始于DsiRNA的第二寡核苷酸鏈的所有3 ‘的Dicer剪切處的 5'緊接(immediately5' of the most 3' Dicer)位置處的核苷酸(Α位)，朝第二寡核苷酸鏈5’方向的A位，B位，和C位殘基是經(jīng)修飾的核苷酸。另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’ 末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第二寡核苷酸鏈具有 27-53個核苷酸殘基，起始于第二寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第 23個核苷酸是核糖核苷酸；第一寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的堿基配對形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的5’末端和第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’ 懸垂結(jié)構；第二寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中的至少一個是脫氧核糖核苷酸，并與第一寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對；第二寡核苷酸鏈的第11位至第 21位含有一個核苷酸與靶標RNA形成錯配，且沿著第二寡核苷酸鏈有至少19個核糖核酸與靶標RNA充分互補，這樣雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞后可降低目的基因的表達。一個實施例中，第13位至第21位核苷酸殘基存在一個或多個堿基錯配，選擇性地，第14位核苷酸殘基產(chǎn)生堿基錯配。—個實施例中，從第二寡核苷酸鏈5'端第一個核苷酸起始，第二寡核苷酸鏈的第 11位至第21位存在兩個或者更多的核苷酸殘基與第一寡核苷酸鏈的核苷酸殘基錯配，選擇性地，第二寡核苷酸鏈第14位和第18位核苷酸殘基與第一寡核苷酸鏈的核苷酸殘基錯配。
另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第一寡核苷酸鏈具有27-49 個核苷酸殘基，起始于第一寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，且與第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的堿基配對形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的5’末端和第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端；第一寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中的至少一個是被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)， 并與第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’ 末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第一寡核苷酸鏈具有 28-53個核苷酸殘基，起始于第一寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第 23個核苷酸是核糖核苷酸；第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的堿基配對形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的5’末端和第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’ 懸垂結(jié)構；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；第一寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中的至少一個是被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)，并與第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’ 末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第一寡核苷酸鏈具有 27-49個核苷酸殘基，起始于第一寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第 23個核苷酸是核糖核苷酸。第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的堿基配對形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的5’末端和第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’ 懸垂結(jié)構；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端；第一寡核苷酸鏈的3’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基與所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基形成一個或兩個錯配的堿基對；第一寡核苷酸鏈的第 24位至3’末端的核苷酸殘基中的至少一個是被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)，并與第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’ 末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第一寡核苷酸鏈具有 27-49個核苷酸殘基，起始于第一寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第 23個核苷酸是核糖核苷酸；第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈 ’第一寡核苷酸鏈的5’末端和第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’ 懸垂結(jié)構；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端；從第一寡核苷酸鏈的5’末端開始，第1至第9位核苷酸殘基含有一個核苷酸與第二寡核苷酸鏈形成錯配；第一寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中的至少一個是被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)，并與第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’ 末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第一寡核苷酸鏈具有 27-49個核苷酸殘基，起始于第一寡核苷酸鏈5，末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23 個核苷酸是核糖核苷酸。第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的5’末端和第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端；起始于與第一寡核苷酸鏈5’端匹配的第二寡核苷酸鏈的第一位核苷酸殘基(1*)開始，朝第二寡核苷酸鏈5方向第一位(1*)至第9位(9*)核苷酸殘基有一個核苷酸與靶標RNA形成錯配；第一寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中的至少一個是被硫代磷酸基修飾的核苷酸 (PS-NA)，并與第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。另一方面，本發(fā)明提供了一種雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，起始于第一寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的5’末端和第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構； 第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端；從第一寡核苷酸鏈的5’末端開始，第1至第9位核苷酸殘基含有一個核苷酸與第二寡核苷酸鏈形成錯配；第二寡核苷酸鏈至少有一個與第一寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基堿基配對的核苷酸是被硫代磷酸基修飾的脫氧核糖核苷酸(PS-NA)；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19 個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。另一方面，本發(fā)明提供了一種雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，起始于第一寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸。第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的5’末端和第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構； 第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端；于與第一寡核苷酸鏈5’端互補的第二寡核苷酸鏈的第一位核苷酸殘基(1*)開始，朝向第二寡核苷酸鏈5'方向的第一位(1*)至第9位(9*)核苷酸殘基有一個核苷酸與靶標RNA形成錯配；第二寡核苷酸鏈至少有一個與第一寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的脫氧核糖核苷酸堿基配對的核苷酸是被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。另一方面，本發(fā)明提供了一種雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，起始于第一寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸。第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的5’末端和第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構； 第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端；從第一寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1至第9位核苷酸殘基含有一個核苷酸與第二寡核苷酸鏈形成錯配；第一寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中的至少一個是脫氧核糖核苷酸，且與第二寡核苷酸鏈的的被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)堿基配對；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。另一方面，本發(fā)明提供了一種雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，起始于第一寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸。第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的5’末端和第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構； 第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端；于與第一寡核苷酸鏈5’端互補的第二寡核苷酸鏈的第一位核苷酸殘基(1*)開始，朝第二寡核苷酸鏈5方向第一位(1*)至第9位(9*)核苷酸殘基有一個核苷酸與靶標RNA形成錯配；第一寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中的至少一個是脫氧核糖核苷酸，且與第二寡核苷酸鏈的的被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)，堿基配對；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19 個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。另一方面，本發(fā)明提供了一種雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第一寡核苷酸鏈具有28-53個核苷酸殘基，起始于第一寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的5’末端和第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構； 第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；從第一寡核苷酸鏈的5’末端開始，第1至第9位核苷酸殘基含有一個核苷酸與第二寡核苷酸鏈形成錯配；第一寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中的至少一個是被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)，并與第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對； 所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。另一方面，本發(fā)明提供了一種雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第一寡核苷酸鏈具有28-53 個核苷酸殘基，起始于第一寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的5’末端和第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成1-4個核苷酸的3’懸垂結(jié)構；起始于與第一寡核苷酸鏈5’端互補的第二寡核苷酸鏈的第一位核苷酸殘基(1*)開始，朝向第二寡核苷酸鏈5方向的第一位(1*)至第9位(9*)核苷酸殘基中有一個核苷酸與靶標RNA形成錯配；第一寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中的至少一個是被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)，并與第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對； 所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。另一方面，本發(fā)明提供了一種雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第一寡核苷酸鏈具有28-53個核苷酸殘基，起始于第一寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的5’末端和第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構； 第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成1-4個核苷酸的3’懸垂結(jié)構； 從第一寡核苷酸鏈的5’末端第一個核苷酸(第1)開始，第1至第9位核苷酸殘基含有一個核苷酸與第二寡核苷酸鏈形成錯配；第二寡核苷酸鏈至少有一個與第一寡核苷酸鏈的第 24位至3’末端的核苷酸殘基堿基配對的核苷酸是被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。另一方面，本發(fā)明提供了一種雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第一寡核苷酸鏈具有28-53 個核苷酸殘基，起始于第一寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸。第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的5’末端和第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成1-4個核苷酸的3’懸垂結(jié)構；起始于與第一寡核苷酸鏈5’端互補的第二寡核苷酸鏈的第一位核苷酸殘基(第1*) 開始，朝向第二寡核苷酸鏈5方向第一位(1*)至第9位(9*)核苷酸殘基有一個核苷酸與靶標RNA形成錯配。第一寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中的至少一個是被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)，并與第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對；沿著第二寡核苷酸鏈至少有19個核糖核苷殘基與靶標RNA充分互補，這樣雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞后可降低目的基因的表達。 另一方面，本發(fā)明提供了一種雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第一寡核苷酸鏈具有28-53個核苷酸殘基，起始于第一寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸。第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的5’末端和第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構； 第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成1-4個核苷酸的3’懸垂結(jié)構； 從第一寡核苷酸鏈的5’末端開始，第1至第9位核苷酸殘基含有一個核苷酸與第二寡核苷酸鏈形成錯配；第一寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的脫氧核糖核苷酸中至少有一個可以和第二寡核苷酸鏈被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)堿基配對；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。 另一方面，本發(fā)明提供了一種雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5，末端和3，末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第一寡核苷酸鏈具有28-53個核苷酸殘基，起始于第一寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的5’末端和第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構； 第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成1-4個核苷酸的3’懸垂結(jié)構； 于與第一寡核苷酸鏈5’端匹配的第二寡核苷酸鏈的第一位核苷酸殘基(1*)開始，朝向第二寡核苷酸鏈5’方向第一位(1*)至第9位(9*)核苷酸殘基有一個核苷酸與靶標RNA形成錯配；第一寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的脫氧核糖核苷酸中至少有一個可以和第二寡核苷酸鏈被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)堿基配對；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少 19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。 另一方面，本發(fā)明提供了一種雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第一寡核苷酸鏈具有27-49 個核苷酸殘基，起始于第一寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸。第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的5’末端和第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端并且第一寡核苷酸鏈的3’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基與所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基形成一個或兩個錯配的堿基對；從第一寡核苷酸鏈的 5’末端開始，第1至第9位核苷酸殘基含有一個核苷酸與第二寡核苷酸鏈形成錯配；第一寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中的至少一個是被硫代磷酸基修飾的核苷酸 (PS-NA)，并與第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。另一方面，本發(fā)明提供了一種雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，起始于第一寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸。第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的5’末端和第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端并且第一寡核苷酸鏈的3’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基與所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基形成一個或兩個錯配的堿基對；起始于與第一寡核苷酸鏈 5’端匹配的第二寡核苷酸鏈的第一位核苷酸殘基(1*)開始，朝第二寡核苷酸鏈5’方向第一位(1*)至第9位(9*)核苷酸殘基有一個核苷酸與靶標RNA形成錯配；第一寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中的至少一個是被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)，并與第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。另一方面，本發(fā)明提供了一種雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，起始于第一寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的5’末端和第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構； 第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端并且第一寡核苷酸鏈的3’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基與所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基形成一個或兩個錯配的堿基對；從第一寡核苷酸鏈的5’末端開始，第1至第9位核苷酸殘基含有一個核苷酸與第二寡核苷酸鏈形成錯配；第二寡核苷酸鏈至少有一個與第一寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的脫氧核糖核苷酸堿基配對的核苷酸是被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。另一方面，本發(fā)明提供了一種雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第一寡核苷酸鏈具有27-49 個核苷酸殘基，起始于第一寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸。第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的5’末端和第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端并且第一寡核苷酸鏈的3’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基與所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基形成一個或兩個錯配的堿基對；于與第一寡核苷酸鏈5’端匹配的第二寡核苷酸鏈的第一位核苷酸殘基(1*)開始，朝第二寡核苷酸鏈5’方向第一位(1*)至第9位(9*)核苷酸殘基有一個核苷酸與靶標RNA形成錯配；第二寡核苷酸鏈至少有一個與第一寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的脫氧核糖核苷酸堿基配對的的核苷酸是被硫代磷酸基修飾的核苷酸的(PS-NA)；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。另一方面，本發(fā)明提供了一種雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第一寡核苷酸鏈具有27-49 個核苷酸殘基，起始于第一寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸。第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，且與第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的5’末端和第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端并且第一寡核苷酸鏈的3’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基與所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基形成一個或兩個錯配的堿基對；從第一寡核苷酸鏈的 5’末端開始，第1至第9位核苷酸殘基含有一個核苷酸與第二寡核苷酸鏈形成錯配；第一寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中至少有一個可以和第二寡核苷酸鏈被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)堿基配對；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。另一方面，本發(fā)明提供了一種雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第一寡核苷酸鏈具有27-49 個核苷酸殘基，起始于第一寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的5’末端和第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端并且第一寡核苷酸鏈的3’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基與所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基形成一個或兩個錯配的堿基對；于與第一寡核苷酸鏈 5’端匹配的第二寡核苷酸鏈的第一位核苷酸殘基(1*)開始，朝第二寡核苷酸鏈5’方向第一位(1*)至第9位(9*)核苷酸殘基有一個核苷酸與靶標RNA形成錯配；第一寡核苷酸鏈的第24位至3’末端中至少有一個是脫氧核糖核苷酸，并可以和第二寡核苷酸鏈被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)堿基配對；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。一個實施例中，第一寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中有2個或者更多是硫代磷酸基修飾的核苷酸殘基(PS-NA)，且與第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸堿基配對。另一個實施例中，第一寡核苷酸鏈的硫代磷酸基修飾的核苷酸殘基(PS-NA)與第二寡核苷酸鏈的PS-NA脫氧核糖核苷酸堿基配對。另一方面，本發(fā)明提供了一種雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，起始于第二寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸。第一寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第二寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的堿基配對形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端；第二寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中至少有一個核苷酸殘基是被硫代磷酸基修飾的脫氧核糖核苷酸(PS-NA)； 所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。 另一方面，本發(fā)明提供了一種雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5，末端和3，末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，起始于第二寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸。第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第二寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的堿基配對形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端；第二寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中至少有一個脫氧核糖核苷酸，并與第一寡核苷酸鏈的被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)堿基配對；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。另一方面，本發(fā)明提供了一種雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，起始于第二寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸。第一寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第二寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；第二寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中至少有一個核苷酸殘基是被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。另一方面，本發(fā)明提供了一種雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，起始于第二寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸。第一寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第二寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；第二寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中至少一個是脫氧核糖核苷酸，并可與第一寡核苷酸鏈被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)形成堿基配對；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19 個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。另一方面，本發(fā)明提供了一種雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，起始于第二寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸。第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第二寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的堿基配對形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端；第一寡核苷酸鏈的3’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基與所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基形成一個或兩個錯配的堿基對；第二寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中至少有一個核苷酸是硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。另一方面，本發(fā)明提供了一種雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，起始于第二寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸。第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第二寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的堿基配對形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端；第一寡核苷酸鏈的3’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基與所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基形成一個或兩個錯配的堿基對。第二寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中至少有一個核苷酸是脫氧核糖核苷酸，且能與第一寡核苷酸鏈的PS-NA堿基配對；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。另一方面，本發(fā)明提供了一種雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，起始于第二寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸，其中第11位至第21位與第一寡核苷酸鏈形成堿基錯配；第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第二寡核苷酸鏈的第1至第 23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’ 末端形成鈍性末端。第二寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中至少有一個核苷酸是硫代磷酸基修飾的脫氧核糖核苷酸(PS-NA)；沿著第二寡核苷酸鏈至少有19個核糖核苷酸基與靶標RNA充分互補，這樣雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞后可降低目的基因的表達。另一方面，本發(fā)明提供了一種雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，起始于第二寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸。第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第二寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的堿基配對形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端；第一寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中至少有一個核苷酸是硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)；沿著第二寡核苷酸鏈至少有19個核糖核苷酸殘基與靶標RNA充分互補，且第二寡核苷酸鏈的第11位-第 21位的核苷酸與靶標RNA存在一個堿基錯配，這樣雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞后可降低目的基因的表達。另一方面，本發(fā)明提供了一種雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，起始于第二寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸，第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第二寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端；第二寡核苷酸鏈第24位至3’末端的核苷酸殘基中至少有一個核苷酸堿基可以和第一寡核苷酸鏈的被硫代磷酸基修飾的核苷酸的(PS-NA)堿基互補；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。另一方面，本發(fā)明提供了一種雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，起始于第二寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸。第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第二寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的堿基配對形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端。第二寡核苷酸鏈第24位至3’末端的核苷酸殘基中至少一個是脫氧核糖核苷酸，且和第一寡核苷酸鏈的被硫代磷酸基修飾的核苷酸的(PS-NA)堿基互補；沿著第二寡核苷酸鏈至少有19個核糖核苷酸殘基與靶標RNA 充分互補，且第二寡核苷酸鏈的第11位-第21位的核苷酸與靶標RNA存在一個堿基錯配， 這樣雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞后可降低目的基因的表達。另一方面，本發(fā)明提供了一種雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5，末端和3，末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，起始于第二寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸，其中第11位至第21位與第一寡核苷酸鏈形成堿基錯配。第一寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第二寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的 5’末端形成核苷酸的3'懸垂；第二寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中至少有一個核苷酸是硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。另一方面，本發(fā)明提供了一種雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第二寡核苷酸鏈具有27-53 個核苷酸殘基，起始于第二寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸。第一寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第二寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成1-4個核苷酸的3’懸垂結(jié)構，第二寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中至少有一個核苷酸是硫代磷酸基修飾的核苷酸 (PS-NA)；沿著第二寡核苷酸鏈至少有19個核糖核苷酸殘基與靶標RNA充分互補，且第二寡核苷酸鏈的第11位-第21位的核苷酸與靶標RNA存在一個堿基錯配，這樣雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞后可降低目的基因的表達。另一方面，本發(fā)明提供了一種雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5，末端和3，末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，起始于第二寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸，其中第11位至第21位與第一寡核苷酸鏈形成堿基錯配；第一寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第二寡核苷酸鏈的第1至第 23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’ 末端形成1-4個核苷酸的3’懸垂結(jié)構，第二寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中至少有一個核苷酸是脫氧核糖核苷酸，該脫氧核糖核苷酸與第一寡核苷酸鏈的硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)堿基配對；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標 RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’ 末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第二寡核苷酸鏈具有 27-53個核苷酸殘基，起始于第二寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第 23個核苷酸是核糖核苷酸。第一寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與第二寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成1-4個核苷酸的3’懸垂結(jié)構，第二寡核苷酸鏈第24位至3’末端的核苷酸殘基中至少有一個是可以和第一寡核苷酸鏈的被硫代磷酸基修飾的核苷酸的(PS-NA)堿基配對的脫氧核糖核苷酸堿基；沿著第二寡核苷酸鏈至少有19個核糖核苷酸殘基與靶標RNA充分互補，且第二寡核苷酸鏈的第11位-第21位的核苷酸與靶標RNA存在一個堿基錯配，這樣雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞后可降低目的基因的表達。另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’ 末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第二寡核苷酸鏈具有 27-53個核苷酸殘基，起始于第二寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第 23個核苷酸是核糖核苷酸，其中第11位至第21位與第一寡核苷酸鏈形成堿基錯配。第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，并具有21個連續(xù)的核糖核苷酸，與第二寡核苷酸鏈的第3至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端，第一寡核苷酸鏈的3’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基與所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基形成一個或兩個錯配的堿基對；第二寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中至少有一個是硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)；沿著第二寡核苷酸鏈至少有19個核糖核苷酸殘基與靶標 RNA充分互補，這樣在導入到哺乳動物細胞后可針對目標RNA進行目的基因的抑制表達。另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’ 末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第二寡核苷酸鏈具有 27-53個核苷酸殘基，起始于第二寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第 23個核苷酸是核糖核苷酸；第一寡核苷酸鏈有27-49個核苷酸殘基，并具有21個連續(xù)的核糖核苷酸，與第二寡核苷酸鏈的第3至第23個核糖核苷酸的堿基配對形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端，第一寡核苷酸鏈的3’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基與所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基形成一個或兩個錯配的堿基對；第二寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中至少有一個是硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)；沿著第二寡核苷酸鏈至少有 19個核糖核苷酸殘基與靶標RNA充分互補，且第二寡核苷酸鏈的第11位至第21位的核苷酸中與靶標RNA存在一個堿基錯配，這樣在導入到哺乳動物細胞后可針對目標RNA進行目的基因的抑制表達。另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’ 末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第二寡核苷酸鏈具有 27-53個核苷酸殘基，起始于第二寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第 23個核苷酸是核糖核苷酸，其中第11位至第21位與第一寡核苷酸鏈形成堿基錯配。第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，并具有21個連續(xù)的核糖核苷酸，與第二寡核苷酸鏈的第3至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端，第一寡核苷酸鏈的3’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基與所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基形成一個或兩個錯配的堿基對；第二寡核苷酸鏈第24位至3’末端的核苷酸殘基中至少有一個是可以和第一寡核苷酸鏈的被硫代磷酸基修飾的核苷酸的(PS-NA)堿基互補的脫氧核糖核苷酸堿基；沿著第二寡核苷酸鏈至少有19個核糖核苷酸殘基與靶標RNA充分互補，這樣在導入到哺乳動物細胞后可針對目標RNA進行目的基因的抑制表達。另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，其包括具有5’末端和3’ 末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，第二寡核苷酸鏈具有 27-53個核苷酸殘基，起始于第二寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第 23個核苷酸是核糖核苷酸；第一寡核苷酸鏈有27-49個核苷酸殘基，并具有21個連續(xù)的核糖核苷酸，與第二寡核苷酸鏈的第3至第23個核糖核苷酸的堿基配對形成雙鏈；第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端，第一寡核苷酸鏈的3’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基與所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基形成一個或兩個錯配的堿基對；第二寡核苷酸鏈第24位至3’末端的核苷酸殘基中至少有一個是可以和第一寡核苷酸鏈的被硫代磷酸基修飾的核苷酸的(PS-NA) 堿基互補的脫氧核糖核苷酸堿基；沿著第二寡核苷酸鏈至少有19個核糖核苷酸殘基與靶標RNA充分互補，且第二寡核苷酸鏈的第11位-第21位的核苷酸與靶標RNA存在一個堿基錯配，這樣在導入到哺乳動物細胞后可針對目標RNA進行目的基因的抑制表達。在一個實施例中，所述第二寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中有2 個或者更多是硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)，任選地，第二寡核苷酸鏈上的PS-NA與第一寡核苷酸鏈上的PS-NA堿基配對。在另一個實施例中，所述雙鏈核酸含有總共兩個或者更多，三個或者更多，四個或者更多，五個或者更多，六個或者更多，七個或者更多，八個或者更多，九個或者更多，十個或者更多，十一個或者更多，十二個或者更多，十三個或者更多，十四個或者更多，或者十五個或者更多的PS-NA殘基。任選地，雙鏈核酸的每條單鏈或者兩條鏈一起含有兩個或者更多，三個或者更多，四個或者更多，五個或者更多，六個或者更多，七個或者更多，八個或者更多，九個或者更多，十個或者更多，十一個或者更多，十二個或者更多，十三個或者更多， 十四個或者更多，或者十五個或者更多的PS-NA殘基或者其他修飾的殘基。進一步的，所述雙鏈核酸含有總共16個或者更多，17個或者更多，18個或者更多，19個或者更多，20個或者更多，21個或者更多，22個或者更多，23個或者更多，24個或者更多，25個或者更多，26 個或者更多，27個或者更多，28個或者更多，29個或者更多，或者30個或者更多的PS-NA或者其他修飾的殘基。另一個實施例中，所述雙鏈核酸是在哺乳動物內(nèi)部被Dicer酶剪切。另一個實施例中，所述雙鏈核酸(dsNA)是在哺乳動物內(nèi)部被Dicer酶剪切，并產(chǎn)生一長度為19-23個核苷酸可抑制目的基因表達的雙鏈核酸。在另實施例中，分離的dsNA 具有磷酸化、硫代磷酸化或者磷酸三脂的磷酸骨架修飾。另一個實施例中，所述雙鏈核酸在哺乳動物體外實驗中可減少目的基因表達量的至少10%，至少50%，或者至少80-90%。任意地，在哺乳動物實驗中，或者在哺乳動物的細胞實驗中，或者在哺乳動物的組織實驗中，雙鏈核酸可減少目的基因的表達量達至少5%， 至少10%，至少20%，至少25%，至少30%，至少35%，至少40%，至少45%，至少50%，至少55%，至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，或者至少95%或者更多。在一個實施例中，在哺乳動物或者在哺乳動物的細胞或者在哺乳動物的組織實驗中，單一劑量處理還是多劑量處理，這種水平的抑制作用的持續(xù)時間可以是6個小時，12個小時，24個小時，2天，3天，4天，5天，6天，7天，8天，9天，10天，11天，12天，12天，14天
或者更長。在一個實施例中，與相應的不含有脫氧核糖核苷酸脫氧核糖核苷酸堿基配對的 dsRNA相比，所述dsNA在導入到哺乳動物細胞后能降低目的基因的表達。在另一個實施例中，當轉(zhuǎn)染到所述細胞中可降低目的基因的表達量達至少70% 時，所述dsNA的濃度選自以下InM或者更少，200pM或者更少，IOOpM或者更少，50pM或者更少，20pM或者更少，IOpM或者更少，5pM或者更少，和IpM或者更少另一個實施例中，所述dsNA的至少50%的核糖核甘酸殘基是未被修飾的核糖核甘酸。在一個實施例中，所述第二寡核苷酸鏈的至少50%核糖核甘酸殘基是未被修飾的核糖核甘酸。任選地，所述dsNA的至少50%的脫氧核糖核苷酸殘基是未被修飾的脫氧核糖核苷酸。在一個實施例中，所述第一寡核苷酸鏈有至少80 %，90 %，95 %，或者100 %核苷酸序列與所述第二寡核苷酸鏈互補。在一個實施例中，所述目的RNA是KRAS?！矫?，本發(fā)明提供一種與相應的dsRNA相比，可以在細胞中更有效降低目的基因表達的方法，該方法通過將本發(fā)明上述的分離的雙鏈核酸(dsNA)與細胞接觸。另一方面，本發(fā)明提供一種比相應的dsRNA更能有效抑制動物體內(nèi)目的基因表達的方法，該方法通過將本發(fā)明所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)處理動物。在一個實施例中，相比于合適的對照物DsiRNA，所述dsNA具有增強的藥效代謝動力學，增強的藥效學，降低了毒性，或增強了細胞內(nèi)攝取量等優(yōu)點。另一個方面，本發(fā)明提供了一種可以降低細胞中目的基因的表達的藥物組合物， 該藥物組合物包括有本發(fā)明上述的雙鏈核酸(dsNA)和藥學上可接受的載體，相比于相應的dsRNA，雙鏈核酸(dsNA)可以更高效的降低細胞中目的基因的表達。另一個方面，本發(fā)明提供了一種通過化學合成或者酶催化合成上述雙鏈核酸(dsNA)的方法。另一方面，本專利提供一種包含上述的雙鏈核酸和它的使用說明的試劑盒。另一方面，本發(fā)明提供一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，如圖30-43C任一所描述。


圖IA Dicer底物RNA抑制劑處理(DsiRNA)過程示意圖。大矩形表示Dicer酶， 其含所指示的PAZ(PiWi/Arg0naute/ZWille)結(jié)構域標。PAZ結(jié)構域與2個堿基的懸垂結(jié)構和引導鏈(反義鏈)的3’末端的3’ -OH結(jié)合，雙鏈RNA的每條鏈被RNA聚合酶III (黑色三角形)剪切開。過渡鏈(正義鏈)3’末端的2個堿基形成了一個含2個堿基的RNA/DNA 的雙鏈鈍性末端，這就降低或者消減了 PAZ的結(jié)合活性。典型的DsiRNA的剪切產(chǎn)生了一條 19個堿基的雙鏈，其每條單鏈含含2個堿基的懸垂末端。圖IB描述了在所述DsiRNA上增加4個堿基的長度沒有明顯抑制Dicer酶的剪切作用。插入到反義HPRT DsiRNA(黑色條紋和箭頭)中堿基不與HPRT目的序列互補。圖2A是顯示所述DsiRNA的強有力的效果的柱狀圖，DsiRNA含有脫氧核糖核苷酸堿基對，在雙鏈區(qū)域存在一個正義鏈3'方向和反義鏈5'方向Dicer酶剪切位點(向右延長的的DsiRNA)。終濃度20nM的DsiRNA雙鏈被導入到HeLa細胞，24小時后測量HPRT的表達水平。 每個轉(zhuǎn)染實驗設2個重復，每個重復3個樣品，以用于通過定量PCR檢測HPRT的表達。誤差線為標準誤差。雙鏈1的目的基因為HPRT，25/27個堿基結(jié)構，具懸垂RNA/兩個-DNA替換的粘性末端(overhanging RN A/blunt two-DNA substitution)結(jié)構，具體描述見 Rose, NAR 2005。由于插入的堿基與HPRT目標區(qū)域不互補，所有其他的雙鏈長度都比雙鏈1要長。 插入的堿基序列從2個堿基(雙鏈2)到8個堿基(雙鏈6，7和8)不等。圖2B顯示的是圖2A中數(shù)據(jù)對應的核酸雙鏈的數(shù)目，序列和化學修飾形式。大寫字母為為修飾的RNA，黑體下劃線為2' _0_甲基修飾的RNA，小寫字母為 DNA,黑體小寫字母為硫代磷酸化修飾的DNA(PS-DNA)。每條雙鏈和其全部結(jié)構的一般說明見右邊。圖3A和3B描述的是低劑量的DNA延長的DsiRNA比相應的RNA延長的DsiRNA更有效。一種優(yōu)選的27/29個堿基的DsiRNA雙鏈，其目的基因是HPRT，與一修飾的雙鏈相比， 在濃度分別為10nM，1. OnM和IOOpM時，在HeLa細胞中敲除HPRT的mRNA的效率評估。雙鏈核酸的濃度是實施例中所描述的轉(zhuǎn)染混合物和培養(yǎng)基中寡居核苷酸的最終濃度。柱(1，2，3)代表的是不同的雙鏈核酸，“C"柱是指為未被雙鏈核酸處理過的細胞中的HPRT表達。圖3B描述的是圖3A中所述雙鏈的序列和化學修飾形式。大寫字母為未修飾的 RNA,黑體、下劃線為2’ -0-甲基RNA，小寫字母為DNA。DsiRNAl是已報道的有效的25/27個堿基的DsiRNA雙鏈的延長物(HPRT-1，Rose 等，NAR2005, Collingwood等，2008，見圖2A)，在其每條鏈中都插入了兩個堿基，這樣寡核苷酸鏈的長度增加到27/29 (黑色粗體表示插入的堿基對)。雙鏈核酸2的序列與雙鏈核酸1 一致，但插入了 2個堿基對(黑色粗體)，包括新加入的2個核苷酸和passenger鏈(正義鏈)及引導鏈(反義鏈)全部為合成的DNA序列。因此，與前人報道的在過客鏈(正義鏈)3’末端含2個堿基的DNA(Rose et al,2005) 相反，雙鏈核酸2在引導鏈5，末端含有4bp DNA(堿基對)。雙鏈核酸3(錯配(MM)對照)來源于優(yōu)選的HPRT-I雙鏈，但是含有合成的錯配堿基，如箭頭所示。為了控制不對目的基因產(chǎn)生化學影響(見下圖5)，雙鏈核酸3的末端的堿基組成和化學修飾和堿基序列和懸垂或者鈍性末端結(jié)構都與優(yōu)選的HPRT-I雙鏈結(jié)構一致。圖4A-4D顯示經(jīng)過加長2-8個堿基對的脫氧核糖核苷酸的修飾的DsiRNA比相應的加長核糖核苷酸的DsiRNA更有效的減少HPRT靶標mRNA表達水平。圖4A表示的是InM 修飾的DsiRNA處理后HPRT目的基因mRNA水平。圖4B表示的是IOOnM改良的DsiRNA處理后HPRT目的基因mRNA水平.圖4C表示的是IOpM修飾的的DsiRNA處理后HPRT目的基因 mRNA水平。圖4D表示的是圖4A-4C終核酸雙鏈的序列和化學修飾形式。插入的序列(核酸雙鏈下黑色曲線)與HPRT mRNA目的區(qū)域不互補。大寫字母為未修飾的RNA，黑色下劃線為2' -0-甲基RNA，小寫字母為DNA。U為未處理的細胞。圖5A顯示HPRT靶標mRNA被一系列終濃度為IOOpM長度增加的經(jīng)修飾的雙鏈核酸處理后所抑制的結(jié)果。圖5B顯示的是圖5A中所述雙鏈核酸的數(shù)目，序列和化學修飾形式。雙鏈核酸1是優(yōu)化的25/27個堿基對的含化學修飾的DsiRNA，在引導鏈(反義鏈)3’末端含2個堿基的懸垂結(jié)構，在過客鏈(正義鏈)3’末端具有2個DNA的替代和鈍性末端(Collingwood 等，2008)。與HPRT mRNA堿基不互補的2個堿基導入到RNA (雙鏈2到5)或DNA雙鏈(雙鏈 6到9)中，使得雙鏈核酸的總殘基數(shù)從27/29增加到33/35個堿基。大寫字母為未修飾的 RNA,黑色下劃線為2' -0-甲基RNA，小寫字母為DNA，U為未處理的細胞。圖6顯示的是Dicer酶介導的25/27堿基對的DsiRAN片段的結(jié)構和處理過程(上圖)，下圖顯示的是存在一個G:U錯配堿基對的dsRNA雙鏈序列典型的向左延長的DsiRNA 片段。大寫字母為RNA殘基；小寫字母為DNA殘基。圖7顯示的是一系列DNA延長后的雙鏈的結(jié)構，包括交替向左或向右延長5個堿基的DNA序列。每種所述延長的DsiRNA片段都引入了堿基錯配，并從第二寡核苷酸鏈3’ 方向第一位堿基，也即Dicer剪切后第二寡核苷酸鏈5’末端的RNA殘基開始編號。圖8顯示的是圖7中所述向左或向右延長的核酸片段抑制作用的第一輪實驗結(jié)果。為了比較向左和向右延長的核酸片段的抑制效果，分別在第14位，第16位以及第14 和18位同時引入堿基錯配，驚訝的發(fā)現(xiàn)向左延長的核酸片段比向右延長的抑制效果更好。 (每種所述雙鏈核酸導入HeLa細胞的終濃度為lOOPm，24小時后測量KRAS靶標mRNA的百分比含量)圖9顯示的是圖7所述核酸片段抑制作用的第二輪實驗結(jié)果，4組實驗里三組結(jié)果顯示向左延長的雙鏈核酸片段再生對靶標mRNA有抑制作用片段的能力比向右延長雙鏈核酸片段再生能力更強?！癘pt" 25/27堿基對為對照組無延長的25/27堿基對的DsiRNA實驗結(jié)果。圖10顯示的是為了沉默HPRT的靶標mRNA而設計的一序列DsiRNA的結(jié)構，及這些DsiRNA在細胞培養(yǎng)中的抑制功效。大寫字母表示核糖核苷酸；小寫字母表示脫氧核糖核苷酸；粗體小寫字母表示硫代磷酸化修飾的核苷酸(PS-NAs)；粗體加下劃線的大寫字母表示2' -0-甲基-修飾的核糖核苷酸；雙鏈DP 1065P/DP 1067G中的粗體大寫字母表示錯配的堿基(與正義鏈相關)，位于所述DsiRNA反義鏈的“種子”區(qū)域序列內(nèi)。圖11顯示的是硫代磷酸化修飾的“向右”延長的DsiRNAs，具有對靶標基因HPRTl 的抑制活性，并且顯示過客鏈上延長的殘基比引導鏈上的延長的殘基更耐受硫代磷酸化修飾，且保留抑制靶標基因的能力。圖中顯示所有的延長的DsiRNAs的體外Dicer剪切試驗 (左邊柱狀圖為未處理；右邊柱狀圖為Dicer酶處理結(jié)果)。大寫字母表示核糖核苷酸；小寫字母表示脫氧核糖核苷酸；粗體小寫表示硫代磷酸化修飾的核苷酸。圖12描述的是靶向位于KRAS轉(zhuǎn)錄本的“KRAS-200"位點的“向右延長”的所述 DsiRNAs和對照DsiRNAs結(jié)構圖。大寫字母為核糖核苷酸，小寫字母為脫氧核糖核苷酸。圖13為圖12中所述DsiRNA在體外實驗中KRAS抑制效果。圖14顯示的是靶向位于KRAS轉(zhuǎn)錄本的“KRAS-909"位點的“向右延長”的所述 DsiRNAs和對照DsiRNAs結(jié)構圖。大寫字母為核糖核苷酸，小寫字母為脫氧核糖核苷酸。圖15為圖14中所述DsiRNA在體外實驗中KRAS抑制效果。圖16描述的是靶向位于KRAS轉(zhuǎn)錄本的“KRAS-249 "位點的“向右延長”的 DsiRNAs和對照DsiRNAs結(jié)構圖，所述DsiRNAs含堿基修飾。大寫字母為核糖核苷酸，小寫字母為脫氧核糖核苷酸，黑體小寫字母為硫代磷酸化修飾的脫氧核糖核苷酸，大寫下劃線字母為2' -0-甲基-修飾的核糖核苷酸。圖17描述的是靶向位于KRAS轉(zhuǎn)錄本的“KRAS-516丨‘位點的“向右延長”的的 DsiRNAs和對照DsiRNAs結(jié)構圖，所述DsiRNAs含堿基修飾。大寫字母為核糖核苷酸，小寫字母為脫氧核糖核苷酸，黑體小寫字母為硫代磷酸化修飾的脫氧核糖核苷酸，大寫下劃線字母為2' -0-甲基-修飾的核糖核苷酸。圖18描述的是靶向位于KRAS轉(zhuǎn)錄本的“KRAS-909 "位點的“向右延長”的 DsiRNAs和對照DsiRNAs結(jié)構圖，所述DsiRNAs含堿基修飾。大寫字母為核糖核苷酸，小寫字母為脫氧核糖核苷酸，黑體小寫字母為硫代磷酸化修飾的脫氧核糖核苷酸，大寫下劃線字母為2' -0-甲基-修飾的核糖核苷酸。圖19為圖16-18中所述“向右延長”的DsiRNA在體外實驗中抑制KRAS作用結(jié)果。 濃度為0. InM上述DsiRNA轉(zhuǎn)染HeLa細胞24小時后進行post-RNAiMAX 實驗。大寫字母為核糖核苷酸，小寫字母為脫氧核糖核苷酸，黑體小寫字母為硫代磷酸化修飾的脫氧核糖核苷酸圖20描述的是堿基錯配對25/27個堿基對的DsiRNA靶向〃 KRAS-249 ‘‘位點的影響。閉合箭頭表示設計的Dicer酶剪切位點，開放箭頭表示的是設計的相對應于過客鏈 DsiRNA序列的目的鏈序列內(nèi)Ago2剪切位點。大寫字母為核糖核苷酸，小寫字母為脫氧核糖核苷酸，粗體大寫字母為引導鏈(且在適當?shù)那闆r下，互補的過客鏈上)錯配堿基的靶標位點。這樣的錯配堿基的靶標位點是通過在DsiRNA設計時，引導鏈和過客鏈之間的單個“討厭的”的殘基獲得的。DP1301P/DP1302G雙鏈下平行框表示的是該雙鏈的"種子區(qū)域"(所有所述DsiRNA結(jié)構的種子區(qū)域都位于同一直線柱位置內(nèi))。圖21表示的是圖20中所述DsiRNA在體外實驗中抑制KRAS作用結(jié)果。濃度為 0. InM上述DsiRNA轉(zhuǎn)染HeLa細胞24小時后進行post-RNAiMAX 。圖22表示濃度為10mg/kg靶向"KRAS-249"位點的DsiRNA(" K249")在單次注射肝臟組織實驗中抑制KRAS作用結(jié)果，包括25/27堿基對的未修飾的DsiRNA(〃 K249")， 25/27堿基對2' -0-甲基修飾的DsiRNA(“ KRAS-249M")和DNA延長的2' -0-甲基修飾DsiRNA(" K249DNA"，如圖16所示的"K249D" ； “ 5% GIu"為5%的葡萄糖對照)。圖23 表示濃度為 10mg/kg 靴向“KRAS-249 “位點的 DsiRNA ( “ K249 “) 在單次注射腎臟組織實驗中抑制KRAS作用結(jié)果，包括靶25/27堿基對的未修飾的 DsiRNA (“ K249" )，25/27 堿基對 2' -0-甲基修飾的 DsiRNA (“ KRAS-249M")和 DNA 延長的 2' -0-甲基修飾 DsiRNA(“ K249DNA"，如圖 16 所示的"K249D" ； “ 5% GIu"為 5%的葡萄糖對照)。圖23 表示濃度為 10mg/kg 靴向“KRAS-249 “位點的 DsiRNA ( “ K249 “) 在單次注射脾臟組織實驗中抑制KRAS作用結(jié)果，包括靶25/27堿基對的未修飾的 DsiRNAC K249“ )，25/27 堿基對 2' -0-甲基修飾的 DsiRNA(〃 KRAS-249M")和 DNA 延長的 2' -0-甲基修飾 DsiRNA(“ K249DNA"，如圖 16 所示的"K249D" ； “ 5% GIu"為 5%的葡萄糖對照)。圖23表示濃度為10mg/kg靶向〃 KRAS-249"位點的DsiRNA(" K249")在單次注射淋巴結(jié)實驗中抑制KRAS作用結(jié)果，包括靶25/27堿基對的未修飾的DsiRNA(〃 K249")， 25/27堿基對2' -0-甲基修飾的DsiRNA(“ KRAS-249M")和DNA延長的2' -0-甲基修飾DsiRNA(" K249DNA"，如圖16所示的"K249D" ； “ 5% GIu"為5%的葡萄糖對照)。圖26顯示的是靶向“KRAS-249 “位點的2 ‘ _0_甲基修飾 DsiRNAC KRAS-249M")和延長的 2' -0-甲基修飾 DsiRNA(“ K249D〃，如圖 16 所示) 多次注射肝臟組織實驗中抑制KRAS作用結(jié)果(每次注射濃度為2mg/kg，每三天注射一次， 總共注射4次)。圖27顯示的是靶向‘‘KRAS-249 ‘‘位點的2 ‘ _0_甲基修飾 DsiRNAC KRAS-249M")和延長的 2' -0-甲基修飾 DsiRNA(“ K249D〃，如圖 16 所示) 多次注射肺臟組織實驗中體外抑制KRAS作用結(jié)果(每次注射濃度為2mg/kg，每三天注射一次，總共注射4次)。圖28顯示的是靶向‘‘KRAS-249 ‘‘位點的2 ‘ _0_甲基修飾 DsiRNAC KRAS-249M")和延長的 2' -0-甲基修飾 DsiRNA(“ K249D〃，如圖 16 所示) 多次注射脾臟組織實驗中抑制KRAS作用結(jié)果(每次注射濃度為2mg/kg，每三天注射一次， 總共注射4次)。圖29顯示的是靶向‘‘KRAS-249 ‘‘位點的2 ‘ _0_甲基修飾 DsiRNAC KRAS-249M")和延長的 2' -0-甲基修飾 DsiRNA(“ K249D〃，如圖 16 所示) 多次注射腎臟組織實驗中抑制KRAS作用結(jié)果(每次注射濃度為2mg/kg，每三天注射一次， 總共注射4次)。圖30顯示的是典型的“向右延長”的DsiRNA片段的結(jié)構，所述DsiRNA第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端。大寫字母表示核糖核苷酸；小寫字母表示脫氧核糖核苷酸；空三角表示第一寡核苷酸鏈對應于靶標RNA內(nèi)Ago2剪切位點；實三角表示的是設計的Dicer酶剪切位點；[#]表示的是延長4-16個或者更多堿基對且含至少一個DNA:DNA堿基對的雙鏈核酸片段。(可選的，[#]表示延長4-16個或者更多堿基對且且含至少4個脫氧核糖核苷的雙鏈核酸片段，該脫氧核糖核苷可以不是DNA:DNA 堿基配對)。核苷點排序如圖所示。圖31顯示的是典型的“向右延長”的DsiRNA片段的結(jié)構，所述DsiRNA第一寡核苷酸鏈的3’末端，相對應于第二寡核苷酸鏈的5’末端含有一個懸垂結(jié)構。大寫字母表示核糖核苷酸；小寫字母表示脫氧核糖核苷酸；空三角表示第一寡核苷酸鏈對應于靶標RNA內(nèi) Ago2剪切位點；實三角表示的是設計的Dicer酶剪切位點；[#]表示的是延長4_16個或者更多堿基對且含至少一個DNA:DNA堿基對的雙鏈核酸片段。(可選的，[#]表示延長4-16 個或者更多堿基對且且含至少4個脫氧核糖核苷的雙鏈核酸片段，該脫氧核糖核苷可以不是DNA:DNA堿基配對)。核苷位點排序如圖所示。圖32顯示的是典型的“向右延長”的DsiRNA片段的結(jié)構，所述DsiRNA第一寡核苷酸鏈的3’末端和相對于第二寡核苷酸鏈的5’末端處含有一個fray結(jié)構。大寫字母表示核糖核苷酸；小寫字母表示脫氧核糖核苷酸；空三角表示第一寡核苷酸鏈對應于靶標RNA內(nèi) Ago2剪切位點；實三角表示的是設計的Dicer酶剪切位點；[#]表示的是延長4_16個或者更多堿基對且含至少一個DNA:DNA堿基對的雙鏈核酸片段。(可選的，[#]表示延長4-16 個或者更多堿基對且且含至少4個脫氧核糖核苷的雙鏈核酸片段，該脫氧核糖核苷可以不是DNA:DNA堿基配對)。核苷位點排序如圖所示。圖33顯示的是典型的“向右延長”的DsiRNA片段的結(jié)構，所述DsiRNA第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端，在反義鏈上含一個錯配的核苷酸殘基，該錯配在Dicer剪切之后仍然保留。大寫字母表示核糖核苷酸；小寫字母表示脫氧核糖核苷酸；空三角表示第一寡核苷酸鏈對應于靶標RNA內(nèi)Ago2剪切位點；實三角表示的是設計的Dicer酶剪切位點；[#]表示的是延長4-16個或者更多堿基對且含至少一個 DNA:DNA堿基對的雙鏈核酸片段。(可選的，[#]表示延長4-16個或者更多堿基對且且含至少4個脫氧核糖核苷的雙鏈核酸片段，該脫氧核糖核苷可以不是DNA:DNA堿基配對)。種子區(qū)域和錯配堿基的位置以及核苷位點排序都如圖所示。在底部的反義鏈下面標下劃線的核酸殘基表示的是與所述DsiRNA正義鏈堿基配對，但與靶標RNA形成錯配的核苷酸。圖34顯示的是典型的“向右延長”的DsiRNA片段的結(jié)構，所述DsiRNA第一寡核苷酸鏈的3’末端即對應于第二寡核苷酸鏈的5’末端處形成一個懸垂結(jié)構，在反義鏈上含一個錯配的核苷酸殘基，該錯配在Dicer剪切之后仍然保留。大寫字母表示核糖核苷酸；小寫字母表示脫氧核糖核苷酸；空三角表示第一寡核苷酸鏈對應于靶標RNA內(nèi)Ago2剪切位點； 實三角表示的是設計的Dicer酶剪切位點；[#]表示的是延長4-16個或者更多堿基對且含至少一個DNA:DNA堿基對的雙鏈核酸片段。(可選的，[#]表示延長4-16個或者更多堿基對且且含至少4個脫氧核糖核苷的雙鏈核酸片段，該脫氧核糖核苷可以不是DNA:DNA堿基配對)。種子區(qū)域和錯配堿基的位置以及核苷位點排序都如圖所示。在底部的反義鏈下面標下劃線的核酸殘基表示的是與所述DsiRNA正義鏈堿基配對，但與靶標RNA形成錯配的核苷酸。圖35顯示的是典型的“向右延長”的DsiRNA片段的結(jié)構，所述DsiRNA第一寡核苷酸鏈的3’末端即對應于第二寡核苷酸鏈的5’末端形成fray，在反義鏈上含一個錯配的核苷酸殘基，該錯配在Dicer剪切之后仍然保留。大寫字母表示核糖核苷酸；小寫字母表示脫氧核糖核苷酸；空三角表示第一寡核苷酸鏈對應于靶標RNA內(nèi)Ago2剪切位點；實三角表示的是設計的Dicer酶剪切位點；[#]表示的是延長4-16個或者更多堿基對且含至少一個DNA:DNA堿基對的雙鏈核酸片段。(可選的，[#]表示延長4-16個或者更多堿基對且且含至少4個脫氧核糖核苷的雙鏈核酸片段，該脫氧核糖核苷可以不是DNA: DNA堿基配對)。 種子區(qū)域和錯配堿基的位置以及核苷位點排序都如圖所示。在底部的反義鏈下面標下劃線的核酸殘基表示的是與所述DsiRNA正義鏈配對的堿基，但與靶標RNA形成錯配的核苷酸。圖36顯示的是典型的“向左延長”的DsiRNA片段的結(jié)構，所述DsiRNA第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端。大寫字母表示核糖核苷酸；小寫字母表示脫氧核糖核苷酸；空三角表示第一寡核苷酸鏈對應于靶標RNA內(nèi)Ago2剪切位點； 實三角表示的是設計的Dicer酶剪切位點；[#]表示的是延長4-16個或者更多堿基對且含至少一個DNA:DNA堿基對的雙鏈核酸片段。(可選的，[#]表示延長4-16個或者更多堿基對且且含至少4個脫氧核糖核苷酸的雙鏈核酸片段，該脫氧核糖核苷酸可以不是DNA:DNA 堿基配對)。核苷酸位置排序如圖所示。圖37顯示的是典型的“向左延長”的DsiRNA片段的結(jié)構，所述DsiRNA第一寡核苷酸鏈的3’末端，對應于第二寡核苷酸鏈的5’末端，含有一個3'懸垂結(jié)構。大寫字母表示核糖核苷酸；小寫字母表示脫氧核糖核苷酸；空三角表示第一寡核苷酸鏈對應于靶標RNA 內(nèi)Ago2剪切位點；實三角表示的是設計的Dicer酶剪切位點；[#]表示的是延長4_16個或者更多堿基對且含至少一個DNA:DNA堿基對的雙鏈核酸片段。(在一替代的實施例中，[#] 表示延長4-16個或者更多堿基對且且含至少4個脫氧核糖核苷酸的雙鏈核酸片段，該脫氧核糖核苷可以不是DNA:DNA堿基配對)。核苷酸位點排序如圖所示。圖38顯示的是典型的“向左延長”的DsiRNA片段的結(jié)構，所述DsiRNA第一寡核苷酸鏈的3’末端和對應于第二寡核苷酸鏈的5’末端處含有一個fray結(jié)構。大寫字母表示核糖核苷酸；小寫字母表示脫氧核糖核苷酸；空三角表示第一寡核苷酸鏈(此處為正義鏈)對應于靶標RNA內(nèi)Ago2剪切位點；實三角表示的是設計的Dicer酶剪切位點；[#]表示的是4-16個或者更多堿基對且含至少一個DNA:DNA堿基對的雙鏈核酸片段。(在一替代的實施例中，[#]表示4-16個或者更多堿基對且且含至少4個脫氧核糖核苷酸的雙鏈核酸片段，該脫氧核糖核苷可以不是DNA:DNA堿基配對)。核苷位點排序如圖所示。圖39顯示的是典型的“向左延長”的DsiRNA片段的結(jié)構，所述DsiRNA第一寡核苷酸鏈的3’末端和第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端，在反義鏈上含一個錯配的核苷酸殘基，該錯配在Dicer剪切之后仍然保留。大寫字母表示核糖核苷酸；小寫字母表示脫氧核糖核苷酸；空三角表示第一寡核苷酸鏈對應于靶標RNA內(nèi)Ago2剪切位點；實三角表示的是設計的Dicer酶剪切位點；[#]表示的是延長4-16個或者更多堿基對且含至少一個 DNAiDNA堿基對的雙鏈核酸片段。(另一個實施例中，[#]表示延長4_16個或者更多堿基對且且含至少4個脫氧核糖核苷的雙鏈核酸片段，該脫氧核糖核苷可以不是DNA:DNA堿基配對)。種子區(qū)域和錯配堿基的位置以及核苷位點排序都如圖所示。在反義鏈下面標下劃線的核酸殘基表示的是與所述DsiRNA正義鏈堿基配對，但與靶標RNA形成錯配的核苷酸。圖40顯示的是典型的“向左延長”的DsiRNA片段的結(jié)構，所述DsiRNA第一寡核苷酸鏈的3’末端相對應于第二寡核苷酸鏈的5’末端處形成一個3'懸垂結(jié)構，在反義鏈上含一個錯配的核苷酸殘基，該錯配在Dicer剪切之后仍然保留。大寫字母表示核糖核苷酸； 小寫字母表示脫氧核糖核苷酸；空三角表示第一寡核苷酸鏈對應于靶標RNA內(nèi)Ago2剪切位點；實三角表示的是設計的Dicer酶剪切位點；[#]表示的是延長4-16個或者更多堿基對且含至少一個DNA:DNA堿基對的雙鏈核酸片段。(可選的，[#]表示延長4-16個或者更多堿基對且且含至少4個脫氧核糖核苷的雙鏈核酸片段，該脫氧核糖核苷可以不是DNA:DNA 堿基配對)。種子區(qū)域和錯配堿基的位置以及核苷位點排序都如圖所示。在反義鏈下面標下劃線的核酸殘基表示的是與所述DsiRNA正義鏈堿基配對，但與靶標RNA形成錯配的核苷酸。種子區(qū)域和錯配堿基的位置以及核苷位點排序都如圖所示。在圖中間的反義鏈下面標下劃線的核酸殘基表示的是與所述DsiRNA正義鏈配對的堿基，但與靶標RNA形成錯配的核苷酸。圖41顯示的是典型的“向左延長”的DsiRNA片段的結(jié)構，所述DsiRNA第一寡核苷酸鏈的3’末端和對應于第二寡核苷酸鏈的5’末端形成fray，在反義鏈上含一個錯配的核苷酸殘基，該錯配在Dicer剪切之后仍然保留。大寫字母表示核糖核苷酸；小寫字母表示脫氧核糖核苷酸；空三角表示第一寡核苷酸鏈對應于靶標RNA內(nèi)Ago2剪切位點；實三角表示的是設計的Dicer酶剪切位點；[#]表示的是延長4-16個或者更多堿基對且含至少一個 DNA:DNA堿基對的雙鏈核酸片段。(在一個實施例中，[#]表示延長4-16個或者更多堿基對且且含至少4個脫氧核糖核苷的雙鏈核酸片段，該脫氧核糖核苷可以不是DNA:DNA堿基配對)。種子區(qū)域和錯配堿基的位置以及核苷位點排序都如圖所示。在反義鏈下面標下劃線的核酸殘基表示的是與所述DsiRNA正義鏈堿基配對，但與靶標RNA形成錯配的核苷酸。種子區(qū)域和錯配堿基的位置以及核苷位點排序都如圖所示。在圖底部的反義鏈下面標下劃線的核酸殘基表示的是與所述DsiRNA正義鏈配對的堿基，但與靶標RNA形成錯配的核苷酸。圖42A-42C表示的是典型的“向右延長”的DsiRNA結(jié)構。大寫字母表示核糖核苷酸；小寫字母表示脫氧核糖核苷酸；空三角表示上面一條寡核苷酸鏈(此處為正義鏈)對應于靶標RNA內(nèi)Ago2剪切位點；實三角表示的是設計的Dicer酶剪切位點。核苷酸位點排序如圖所示。圖43A-43C表示的是典型的“向左延長”的DsiRNA結(jié)構。大寫字母表示核糖核苷酸；小寫字母表示脫氧核糖核苷酸；空三角表示上面一條寡核苷酸鏈(此處為正義鏈)對應于靶標RNA內(nèi)Ago2剪切位點；實三角表示的是設計的Dicer酶剪切位點。核苷酸位點排序如圖所示。詳細描述本發(fā)明提供一種用于抑制細胞中目的基因的表達的組合物和方法，包括用有效劑量的分離的雙鏈核酸(dsNAs)接觸細胞，從而降低細胞中目的基因的表達。本發(fā)明所述的 dsNAs被設計為具有脫氧核糖核苷酸的結(jié)構(在大多數(shù)的實施例中，這種設計包括至少一個脫氧核糖核苷酸_脫氧核糖核苷酸的堿基對)，設計的脫氧核糖核苷酸可以指導Dicer 酶在雙鏈核酸(dsNAs)的分子內(nèi)部剪切。本發(fā)明所述的dsNAs分子的脫氧核糖核苷酸位于dsNAs的區(qū)域內(nèi)部，并能通過Dicer酶剪切從而分離產(chǎn)生一種有活性的、不再含有脫氧核糖核苷酸結(jié)構(例如的脫氧核糖核苷酸-脫氧核糖核苷酸的堿基對)siRNA。令人驚奇的是,在此也證實了，相比于RNA DNA-or RNA RNA延長的DsiRNAs而言，這種DNA DNA延長的Dicer底物siRNAs (DsiRNAs)是更有效的RNA抑制劑。在許多實例中，驚人地發(fā)現(xiàn)具有位于在dsRNA DsiRNA(第二寡核苷酸鏈與靶標 RNA序列足夠長的區(qū)域互補，以至于可以有效的充當RNA干擾片段(反義靶標RNA)的引導鏈序列)的第一寡核苷酸鏈的5'末端和相應的第二寡核苷酸鏈3’末端的DNA:DNA延長片段的DsiRNA構成了高效的抑制劑。驚人地發(fā)現(xiàn)，與相應長度的不含雙鏈DNA延長片段dsRNA片段相比，所述的DNA延長的DsiRNA不會隨著雙鏈長度的增加而降低活性，這就使得可以提供更多的結(jié)合空間以產(chǎn)生更多的DsiRNA和/或者更多的功能基團，包括或者制定穩(wěn)定的修飾(如，PS-NA修飾) 或者其他的更廣泛的功能修飾，和/或提高比如藥物代謝動力學，藥效學或者生物分配性能。延長的含dsNA的DsiRNA保留Dicer酶處理后的siRNA片段的新的能力，在同一水平上比相同長度的dsRNA雙鏈更強，這種優(yōu)勢在本發(fā)明實驗結(jié)果中得到強調(diào)，這表明一條所有的核苷酸完全硫代磷酸化(PS)修飾的DNA:DNA雙鏈完全失去抑制活性(見圖2A和 2B中雙鏈#8)。術語除非特別注明，所有涉及的技術和科學術語的都是本發(fā)明所屬技術領域的技術人員能通常理解的。下面的文獻提供了本發(fā)明大量術語的常規(guī)定義除非特別注明，本發(fā)明所用的以下術語具有如下描述的含義。本專利所用到的“核酸”(“nucleic acid")指的是脫氧核苷酸，核糖核苷酸，或者修飾的核苷酸，以及單鏈或者雙鏈形式的聚合物。該詞包括核酸，含已知的核酸同型物， 或者修飾的核酸殘基或鍵骨架，是合成的、自然產(chǎn)生的和非自然產(chǎn)生的具有核酸相似的特性相關物質(zhì)，以及代謝形式類似于核苷酸的物質(zhì)。這些核酸類似物包括例如，沒有限制的， 硫代磷酸鹽(phosphorothioates)，氨基磷酸酯(phosphoramidates)，甲基磷酸酯，手性甲基磷酸酯(chiral-methyl phosphonates)，2-0甲基核糖核苷酸和多肽核酸(PNAs)。本發(fā)明所用到的核苷酸(“nucleotide")用來指本領域自然堿基(常規(guī))，和眾所周知的修飾了的堿基的核苷酸。這樣的堿基通常位于核苷酸糖基的第1'位。核苷酸通常包含了一個堿基，戊糖和磷酸基團。所述核苷酸可以在戊糖，磷酸基團和/或者堿基上不被修飾或被修飾，(也用來指可替換的核甘酸類似物，修飾的核苷酸，非天然的核苷酸，非標準的核昔酸以及其他；參見如 Usman 禾口 McSwiggen, supra ；Eckstein,等.,International PCT Publication No. WO 92/07065 ；Usman φ, International PCT Publication No. WO 93/15187 ；UhIman & Peyman，supra，中所述，所有的本發(fā)明所涉及的文獻)在Limbach 等人(Nucleic Acids Res. 22 :2183，1994)文獻中公開的幾個修飾的核苷酸堿基的例子。一些堿基修飾的-非限制性的例子_可以引進到核酸分子，包括次黃嘌呤，嘌呤，吡啶-4-1 (pyridin-4-one)，吡啶-2-1,苯基(phenyl)，假尿嘧啶(pseudouracil)，2， 4，6_ 三甲氧基苯(2，4，6-trimethoxy benzene)，3-甲基尿嘧啶(3-methyl uracil),二氫尿嘧啶核苷(dihydrouridine)，萘基(naphthyl)，氨基苯胼(aminophenyl)，5-烷基胞啶(例如5-甲基胞苷，5-methylCytidine)，5-烷基尿苷(例如胸腺嘧啶核糖核苷)， 5-halouridine (例如5-溴尿核苷)或者6_azapyrimidines或6-烷基嘧啶(例如.6-甲基尿嘧啶核苷)，丙炔(propyne)以及其它(Burgin，et al. ,Biochemistry 35 14090,1996 ； Uhlman & Peyman，supra)?！靶揎椀膲A基”(〃 modified bases")在這方面意指核苷酸堿基，除了 1'位的或者其它等同物的腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶。本發(fā)明所用到的“雙鏈核酸”(‘‘double-strandednucleic acid ‘‘)或者"dsNA"是指包含有2條寡核苷酸鏈形成的雙鏈分子。一個dsNA可能包括核糖核苷酸， 脫氧核糖核苷酸，修飾的核苷酸，以及他們的組合。本發(fā)明所述雙鏈NSs是RNA干擾通過中的蛋白或蛋白復合物的底物，例如切割酶 (Dicer酶)和RNA誘導沉默復合體(RISC).圖IA顯示的是本發(fā)明中一種dsNA的典型結(jié)構，并且該典型結(jié)構在一個區(qū)域內(nèi)含有一個RNA雙鏈，能夠作為Dicer酶的底物siRNA (DsiRNA)，和一個DNA雙鏈在所述DsiRNA/ DNA片段第一寡核苷酸鏈Dicer酶剪切處3’含有至少一個脫氧核苷酸，該脫氧核糖核苷酸與所述DsiRNA/DNA的第二寡核苷酸鏈的Dicer酶剪切處5’的同源的脫氧核糖核苷酸形成堿基配對。在一個替代的實施例中，本發(fā)明提供的所述雙鏈典型結(jié)構在區(qū)域內(nèi)含有一個RNA 雙鏈，可以作為Dicer酶的底物siRNA (DsiRNA)，和一個DNA雙鏈在所述DsiRNA/DNA片段第一寡核苷酸鏈Dicer酶剪切處5’含有至少一個脫氧核糖核苷酸，該脫氧核苷酸與所述 DsiRNA/DNA的第二寡核苷酸鏈的Dicer酶剪切處3’的同源的脫氧核糖核苷酸形成堿基配對(如圖6所示“向左延長”的DsiRNA片段)。在一個實施例中，本發(fā)明所述DsiRNAs在設計的Dicer剪切處毗鄰的第一個位置起始為脫氧核糖核苷酸殘基。例如，圖12中的第二條，第四條和第六條DsiRNAs中第22位和3’位置(如23， 24，25，等)的脫氧核糖核苷酸(第1位起始于第一寡核苷酸鏈5’末端殘基)。相應的，脫氧核糖核苷酸還可以位于第二寡核苷酸鏈，其起始于與第一寡核苷酸鏈的第20位互補的核苷酸，還可以位于第二寡核苷酸鏈上并朝這個核苷酸的5'方向。這樣，所述高效的DsiRNAs僅含有19個互補的核糖核苷酸，在第一寡核苷酸鏈，第二寡核苷酸鏈，和/或者2條鏈中引進脫氧核糖核苷酸之前。上文中所述的關于在毗鄰設計的Dicer酶剪切處含有脫氧核糖核苷的DsiRNAs 中，明確闡述了 “向右延長”的DsiRNAs在Dicer酶剪切起始處含有脫氧核糖核苷，所述的 “向左延長”的DsiRNAs同樣在相應的位置可以含有脫氧核糖核苷酸。(例如，脫氧核糖核苷酸可以位于“向左延長”的DsiRNAs內(nèi)計劃的Dicer酶剪切起始處-如“向左延長”的 DsiRNAs正義鏈5’端Dicer酶剪切起始處，和/或者“向左延長”的DsiRNAs反義鏈3’端 Dicer酶剪切起始處)。本發(fā)明所用的“雙鏈”("duplex")指的是兩條單獨的核苷酸鏈相互作用形成的雙螺旋結(jié)構。與本發(fā)明相關的，一條雙鏈須含有第一條寡核苷酸鏈和第二條寡核苷酸鏈，即正義鏈和反義鏈，或者目標鏈和反義鏈。雙鏈都是典型的由兩條單獨的寡核苷酸鏈通過堿基間成對的氫鍵作用反向平行形成的堿基對。雙鏈中的堿基配對通常為Watson-Crick堿基對，如在DNA和RNA中鳥嘌呤(G)與胞嘧啶(C)配對(也就是與鳥嘌呤脫氧核糖核苷酸同源的核苷酸為胞嘧啶脫氧核糖核苷酸，反之亦然)，腺嘌呤(A)在DNA中與胸腺嘧啶(T)形成堿基對，在RNA中與尿嘧啶(U)形成堿基配對。堿基對形成的條件包括生理學或者生物學相關條件(例如細胞內(nèi):pH 7. 2，140mM鉀+ ；細胞外pH 7. 4，145mM Na+)。進一步的，雙鏈的結(jié)構在堿基對和毗鄰的堿基間的堆垛作用下是穩(wěn)定的。雙鏈是兩條核苷酸互補形成的， 包括大體上互補或者充分互補(如下所述)。互補的，或者互補性指的是雙鏈中的核苷酸可以與另一個核苷酸通過傳統(tǒng)的 Watson-Crick或者Hoogsteen堿基配對相互形成氫鍵。根據(jù)現(xiàn)已公開的關于核酸分子的相關報道，核酸分子與其互補的的鏈結(jié)合所需要的自由能足以維持相關功能行使的需要，例如，RNA的活性。檢測核酸分子結(jié)合的自由能的方法在本領域是眾所周知的(見 Terner 等 CSH Symp. Quant. Biol. LII，pp. 123-133，1987 ； Frier 等 Proc. Nat. Acad. Sci. USA83 :9373_9377，1986 ；Turner 等 J. Am. Chem. Soc. 109 3783-3785，1987).互補百分率指的是核酸分子中連續(xù)的核苷酸殘基與另一條核酸分子序列能形成氫鍵(如Watson-Crick堿基配對)的百分比(如核苷酸總數(shù)為10的第一寡核苷酸鏈序列含有5，6，7，8，9或者10個核苷與核苷酸總數(shù)為10第二寡核苷酸鏈形成堿基配對，其互補百分比相應地分別為 50%,60%, 70%,80%,90%, and 100%。為了定義互補百分率是一個至少一定的百分比，一個核酸分子中連續(xù)的核酸殘基可以與另一條核酸分子形成氫鍵(如Watson-Crick base堿基配對)須通過計算和四舍五入至一個最接近的整數(shù)(如一條總數(shù)為23個核苷酸分子的第一寡核苷酸鏈與第二條寡核苷酸鏈有12，13，14，15，16，或者17個核苷酸形成堿基配對，計算得到的值分別為52%， 57%,61%,65%,70%, and 74 %，相應的，其互補百分比分別為至少50%，50%，60%， 60%, 70%, and 70% )。本發(fā)明中，充分互補(“substantially complementary")指的是可以在生物學條件下2條鏈之間能夠雜交的互補率。充分互補的百分比可以是60%，70%，80 %，90 %， 95%，或者100%互補。此外，通過檢測核酸序列確定兩條鏈之間在生物學條件下是否能雜交的技術在本領域是已經(jīng)熟知的。本發(fā)明所述的第一和第二寡核苷酸鏈(反義和正義寡核苷酸)不要求充分互補。在一個實施例中，反義鏈RNA序列存在一個或者多個堿基錯配，或者堿基類似物修飾的核苷酸。在一個典型的實施例中，這種堿基錯配發(fā)生于反義鏈RNA序列的3’區(qū)域(如與靶標RNA序列互補的反義鏈RNA序列其5’定位于靶標RNA內(nèi)家族蛋白2 (Ago2)切割位點，如圖6所示的堿基錯配區(qū)域)一方面，目標RNA序列雜交時，反義鏈的RNA序列包含有2個錯配或者修飾的核苷酸的堿基類似物是反義鏈3’定位于靶標RNA的Ago2剪切位點。堿基錯配的使用或者降低熱力學穩(wěn)定性(特別在SiRNA正義鏈3’末端殘基位置或附近位置/反義鏈5’末端殘基位置或附近)可能有利于或者傾向于使反義鏈進入RISC復合物(Schwarz等，2003 ；Khvorova等，2003)，推測其通過影響siRNA進入RISC時發(fā)生退火時的速率。因此，末端堿基是包括在精心設計的有活性的siRNA雙鏈21個堿基中的(Ui-Tei等，2004 ；Reynolds 等，2004)。 一個實施例中，堿基錯配(或者堿基類似物的核苷酸修飾)可設計位于一親緣的 DsiRNA (隨意的向左或向右延長的DsiRNA片段)在Dicer酶剪切下產(chǎn)生的siRNA的正義鏈的3’端或附近。在這個實施例中，這個小的末端的錯配堿基序列將既不與反義鏈堿基配對 (形成3’端懸垂)，也不會從最終產(chǎn)生的21個堿基的siRNA鏈上完全切下。在這樣實施例中，最初始結(jié)構中(未被Dicer酶加工)的錯配在最終的RISC復合物中的RNA中是不存在的。已有研究發(fā)現(xiàn)，在Dicer底物正義鏈3'末端的堿基錯配或者不穩(wěn)定可以改進人工合成的雙鏈在RNA干擾過程中的功效，推測是因為可以促進Dicer酶的剪切作用(Collingwood 等，2008)。 一個實施例中，一個或更多堿基錯配位于本發(fā)明所述DsiRNA (任意地向左或向右延長的DsiRNA)反義鏈區(qū)域，該區(qū)域能和靶標mRNA雜交，在靶標mRNA的該區(qū)域內(nèi)設計的有 Ago2剪切位點處5’ (例如圖7中DsiRNA中的錯配堿基位置)。隨意的，兩個或者更多的堿基錯配位于向左或向右延長的DsiRNA相應的反義鏈 3’區(qū)域內(nèi)，該區(qū)域能和靶標RNA雜交，靶標mRNA的該區(qū)域內(nèi)設計的有Ago2剪切位點處5’ 位置(為靶標RNA剪切發(fā)生處)。本發(fā)明所述的DsiRNA內(nèi)的這樣的錯配能使DsiRNA發(fā)揮抑制功能，類似于自然產(chǎn)生的miRNAs，并且不但能隨意指導自然產(chǎn)生的miRNAs的目的RNAs (例如目的轉(zhuǎn)錄本的 3' UTR區(qū)域，而且能指導以RNA為背景序列的已知的非自然產(chǎn)生的對抗性的miRNA，例如， 本發(fā)明所述的DsiRNA具有的錯配堿基設計未類似于miRNAs和/或行使miRNAs的功能，所述miRNAs能和基因/轉(zhuǎn)錄本內(nèi)的目的重復序列雜交，該基因/轉(zhuǎn)錄本可能不是自然產(chǎn)生的 miRNAs的目標物，(例如Notch蛋白內(nèi)的重復序列能作為目標物，在核酸水平，Notch內(nèi)的單個的重復能彼此區(qū)分(例如，被退化)，但是，其是通過一個miRNA機制允許錯配以及允許更多的雜交抑制效果而不是通過一個相應的，正確的配對siRNA，而成為有效的目標物)。在一個實施例中，本發(fā)明所述的雙鏈核酸分子包含一個小RNA(miRNA)或行使小 RNA的功能。“ microRNA"或〃 miRNA"指的是一個小的雙鏈RNA，通過mRNA剪切，轉(zhuǎn)運阻遏/ 抑制或者異源沉默可以調(diào)節(jié)靶標mRNA的表達(參照Ambros，2004，Nature, 431, 350-355 ； Bartel,2004, Cell, 116, 281-297 ；Cullen,2004, Virus Research.，102，3-9 ;He 等，2004， Nat. Rev. Genet.，5，522-531 ；and Ying 等，2004，Gene, 342，25-28)。一個實施例中，本發(fā)明所述microRNA局部互補(也即不超過100%互補率)于 miRNA分子正義鏈(如第一寡核苷酸鏈)，或者正義鏈區(qū)域和反義鏈(如第二寡核苷酸鏈) 或者反義鏈區(qū)域之間，或者miRNA反義鏈或反義鏈區(qū)域和相應的靶標核酸分子(如靶標 mRNA)之間。例如，所述雙鏈核酸分子結(jié)構中，局部互補可以包括不同的堿基錯配或者堿基不互補的核苷酸(如1，2，3，4，5或者更多堿基錯配或者堿基不互補的核苷酸，如核苷酸突起 (bulges)，這樣導致正義鏈或者正義鏈區(qū)域和反義鏈或者反義鏈區(qū)域之間或者miRNA反義鏈或反義鏈區(qū)域和相應的靶標核酸分子形成突起，loop環(huán)，或者懸垂結(jié)構。單股的核酸分子超過一個堿基數(shù)的堿基配對即為“雜交”。雜交是在生理學或者生物學相關條件下測定的(如細胞內(nèi):pH 7. 2，140mM鉀+ ；細胞外:pH 7. 4，145mM鈉+)。
雜交的條件通常包括一價陽離子、可接受的生物學緩沖液，可有可沒有的二價陽離子、復合陰離子，如葡萄糖酸鉀中的葡萄糖鹽離子，不帶電荷的如蔗糖，和惰性聚合物以降低樣品中水的活性，如PEG.所述條件包括堿基對形成所需條件。雜交測量的溫度即二條單鏈核苷酸形成的雙鏈解鏈溫度即熔點，Tm.所述的雜交條件也包括堿基配對形成的條件。各種嚴格的條件用來測定雜交。 (參照 Wahl，G. M. and S. L. Berger (1987)Methods Enzymo 1. 152 399 ；Kimmel，A. R. (1987) Methods Enzymo1. 152 507)嚴格的雜交溫度通常包括為至少30°C左右，優(yōu)選至少37°C左右，最優(yōu)選為至少 42°C左右。雜交溫度可以如下估算至少50個堿基對長度雙鏈雜交溫度比解鏈溫度(Tm) 要低5-10°C。解鏈溫度計算公式為長度為少于18個堿基對的雙鏈TmCC ) = 2 (#的A+T 堿基數(shù))+4(#的6+(堿基數(shù)).長度介于18和49個堿基之間的堿基對的混合物，Tm(°C ) = 81. 5+16. 6 (log 10[Na+])+0.41(% G+C)-(600/N)，此處N表示堿基數(shù)目[Na+]表示雜交緩沖液鈉離子的濃度([Na+]為0. 165M IxSSC中的鈉離子。如表1為雜交緩沖液各成分濃度。表1
終濃度生產(chǎn)商貨號序列號貯存濃度配5 OmL所需的量NaClIOOmMSigmaS-515041K89345MImLKCl80mMSigmaP-954170K000274.550.298gMgC128mMSigmaM-1028120K8933IMOAmLsurose2%FishBP220-212907105342.3isTris-HCl16mMFishBP1757-50012419IM0.8mLNaH2P04ImMSigmaS-319352H-029515120.00.006gEDTA0.02mMSigmaE-7889110K892710.5M2uLH20SigmaW-450251K2359補足50mLpH=7.0 20°CHCl調(diào)pH值至7.0本領域的技術人員可熟練應對雜交條件有用的變化，具有熟練雜交的技術， 這些雜交技術在本領域有詳細介紹，如Benton和Davis (Science 196 180，1977)； Grunstein 禾口 Hogness(Proc. Natl. Acad. Sci. ,USA 72 3961,1975) ；Ausubel 等.(Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York,2001) ；Berger 禾口 Kimmel(Antisense to Molecular Cloning Techniques,1987, Academic Press, New York) ；and Sambrook等，MoIecuIar Cloning :A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.文中的“寡核苷酸鏈”指的是單鏈的核酸分子。一個寡核苷酸鏈可包含核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，修飾的核苷酸(如2’修飾的核苷酸，人工合成的堿基類似物，等)或者三者混合物。所述修飾的寡聚核苷酸鏈相比天然形式的更優(yōu)越，因為其特性，如提高細胞的吸收量和增加其在核酸酶存在條件下的穩(wěn)定性。本發(fā)明所述dsNAs部分為嵌合dsNAs。所述“嵌合dsNAs”或者“嵌合體”是指含有2個或者更多化學特性的區(qū)域，每個區(qū)域含有至少一個核苷酸。首先，這些所述dsNAs通常含有至少一個區(qū)域，該區(qū)域是主要由核糖核苷酸組成(可選的，含有修飾的核糖核苷酸)的Dicer酶的底物siRNA(" DsiRNA")分子。所述DsiRNA區(qū)域與第二區(qū)域是共價結(jié)合的，第二區(qū)域含有堿基配對的脫氧核糖核苷酸(dsDNA區(qū)域)，具有一個或者更多的有利特性(如提高效率，如增長效能，和/或者持續(xù)的DsiRNA活性，行使識別區(qū)域的功能或者鎖定嵌合的dsNA至特殊區(qū)域，如當導入到培養(yǎng)的細胞或者組織時，作為延長的區(qū)域增進附著到功能基團、裝備、檢測/檢測部分上，作為一個延長的區(qū)域以供更多的需要的修飾和/或者提高所述修飾的空間，等)。所述第二區(qū)域含有的脫氧核糖核苷酸堿基配對可以包括修飾的或人工的核苷酸和/或者修飾的或人工合成的脫氧核糖核苷酸。本文中所述"核糖核苷酸"包括天然的和人工合成的，未修飾的或者修飾的核糖核苷酸。所作修飾可以是糖基上的修飾，可以是堿基和/或者寡聚核苷酸的核糖核苷酸鏈上的修飾。本文中所述的，特別地，單詞"核糖核苷酸"不包括脫氧核糖核苷酸，其再核糖的2’位含一個單價質(zhì)子基團。本文中所述"脫氧核糖核苷酸"包括天然的和人工合成的，未修飾的或者修飾的脫氧核糖核苷酸。所作修飾可以是配基糖上的修飾，可以是堿基和 /或者寡聚核苷酸的脫氧核糖核苷酸鏈上的修飾。本發(fā)明所涉及的，單詞"脫氧核糖核苷酸〃可包括一個修飾的核糖核苷酸，這樣阻止了 Dicer酶剪切dsNA，如2' -0-甲基核糖核苷酸，硫代磷酸修飾的核糖核苷酸，等，這些核苷酸阻止了 Dicer酶在此位點的剪切。本文中所述〃 PS-NA"指的是硫代磷酸化修飾(phosphorothioate-modified)的核苷酸殘基。所述"PS-NA"包括硫代磷酸化核糖核苷酸(“PS-RNAs")和硫代磷酸化脫氧核糖核苷酸(“PS-DNAs")。在一個實施例中，所述嵌合的DsiRNA/DNA包括一個至少長度為23個核苷酸的雙鏈區(qū)域，其中50%核苷酸為未修飾的核糖核苷酸?！拔葱揎椀暮颂呛塑账帷敝傅氖窃诤颂堑?2’位置存在一個羥基(-0H)。在一個實施例中，所述的嵌合DsiRNA/DNA存在至少一個區(qū)域，定位有設計的 Dicer酶在第一寡核苷酸鏈的剪切位點的3’端和Dicer酶在第二寡核苷酸鏈的剪切位點的 5’端，含有至少2個堿基對的核苷酸，在該區(qū)域所有核苷酸中至少有50%的核苷酸為未修飾的脫氧核糖核苷酸?！拔葱揎椀拿撗鹾颂呛塑账帷敝傅氖呛颂呛塑账嵩诤颂堑?'位置為單個離子。本發(fā)明所涉及的“反義鏈”指的是一條序列與靶標RNA的序列互補的單鏈核苷酸分子。當所述反義鏈在堿基類似物上含有修飾的核苷酸時，其序列不需要完全與靶標RNA 充分互補，但至少可以與靶標RNA雜交。本發(fā)明所涉及的“正義鏈”指的是一條序列與反義鏈序列互補的單鏈核苷酸序列。當所述反義鏈在堿基類似物上含有修飾的核苷酸時，正義鏈序列不需要完全與反義鏈互補，但至少可以和反義鏈形成雙鏈。本發(fā)明所涉及的，“引導鏈"指的是dsRNA或含dsRNA的分子的一條單鏈核酸分子，其序列與靶標RNA充分互補以至于可以導致RNA干擾。所述dsRNA或含dsRNA的分子經(jīng) Dicer酶剪切后，引導鏈產(chǎn)生的片段與靶標RNA結(jié)合而成為RISC復合物的一個組成成分，且促進剪切作用。在這里指的是RISC剪切靶標RNA。本發(fā)明所涉及的所述引導鏈(guide strand)不需要是連續(xù)的核苷酸單鏈，可以間斷，在Dicer酶剪切部位較好。一條引導鏈是一條反義鏈。
本發(fā)明所涉及的“靶標RNA”指的是被反義鏈引導支配的RNA，例如定向剪切或者空間堵塞(steric blockage)。例如，靶標RNA可以是病毒RNA，mRNA，前體mRNA，或者非編碼RNA。優(yōu)選的目標是mRNA，mRNA編碼疾病相關蛋白，如ApoB，Bcl2，Hif-lalpha，Survivin 或者 p21 ras, Ha. ras, K_ras 或者 N-ras.本發(fā)明所涉及的過客鏈指的是dsRNA或含dsRNA的分子的一條單鏈核酸分子，其序列與引導鏈互補。所述過客鏈不需要是連續(xù)的核苷酸單鏈，可以間斷，在Dicer酶剪切部位較好。一條過客鏈是一條正義鏈。本發(fā)明所涉及的"Dicer"指的是RNA聚合酶III家族的內(nèi)切核糖核酸酶，可以剪切dsRNA或含dsRNA的分子，如雙鏈RNA，(dsRNA)或者小RNA前體(miRNA)，并產(chǎn)生大約 19-25個核苷酸長度3’端2個堿基懸垂的核酸雙鏈片段。至于本發(fā)明所述dsNAs，所述dsRNA形成的雙鏈可以被Dicer酶識別且至少一條鏈是Dicer酶的底物。Dicer酶催化是RNA干擾的第一個步驟，導致了靶標RNA的降解。人類 Dicer酶的蛋白序列已在NCBI數(shù)據(jù)庫公布，其登陸號是NP_085124，見參考文獻。Dicer 酶“剪切率”定義如下(參照 Collingwood 等·，Oligonucleotides 18 187-200(2008))在 Dicer 酶剪切體系中IOOpmolRNA雙鏈與 20 μ L 的 20mM Tris pH 8.0， 200mM NaCl,2. 5mM MgC12 溶液在 96 孔細胞培養(yǎng)板上(EdgeBiosystems，Gaithersburg, ffl))，37°C共孵育18-24小時，加入或不加入IU重組人Dicer酶(Stratagene，La Jolla, CA)，通過液相色譜-質(zhì)譜分析儀(ESI-LCMS)測定雙鏈RNAs在Oligo HTCS system系統(tǒng)中 Dicer 酶處理前后的量(Novatia, Princeton, NJ ；Hail et al. ,2004) ,Oligo HTCS system 系統(tǒng)包括 ThermoFinnigan TSQ7000, Xcalibur data system，ProMass 數(shù)據(jù)處理軟件和 Paradigm MS4 HPLC(Michrom BioResources, Auburn, CA). ￠1 !^, Dicer MmW^-可以達到至少 5%，10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，95%，甚至 100%。 (即25-35bp dsRNA,優(yōu)選是^_30bp的dsRNA，任意的兩端延長，可以剪切成短的dsRNA. (如 19-23bp dsRNA，優(yōu)選是 21_23bpdsRNA)。本發(fā)明所涉及的“Dicer酶剪切位點“指的是Dicer酶在dsRNA (如本發(fā)明所述的 dsNA上的dsRNA區(qū)域)上的剪切位置。Dicer酶含有2個RNA聚合酶III結(jié)構域，可以剪切dsRNA的正義鏈和反義鏈。RNA聚合酶III結(jié)構域與PAZ結(jié)構域之間的平均距離決定了產(chǎn)生的短的雙鏈核酸片段的長度，并且，這個距離可以改變(Macrae I，等.(2006).‘‘雙鏈RNA經(jīng)Dicer酶處理的結(jié)構基礎〃 .Science 311 (5758) :195-8.)。如圖IA所示，Dicer酶要剪切本發(fā)明所述雙鏈核酸，該雙鏈核酸的反義鏈位于第 21位和第22位核苷酸之間2個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構，從反義鏈3’末端被移除，相應的，在正義鏈5’相應位置移除第21位和第22位核苷酸之間含有的2個核苷酸。與圖IA 描述的不同，所述設計的和/或者普通的Dicer酶在所述dsNA上的剪切位點與本領域所報道的方法相似，如Macrae等描述。而圖IA所示Dicer酶剪切產(chǎn)生的片段為21個核苷酸的 siRNA，這里重點突出的是Dicer酶剪切產(chǎn)生的片段長度為19-23個核苷酸。事實上，本發(fā)明重點闡述的一方面是，所述dsNA含有的雙鏈DNA區(qū)域引導了 Dicer酶對非優(yōu)選的19堿基的siRNA的剪切。本發(fā)明所涉及的“懸垂”指的是不配對的核苷酸，在一個dsNA雙鏈的5’末端或者3’末端上下游有2個或者4個未配對的末端。在一個實施例中，懸垂在正義鏈或者反義鏈的3’端或者5’端。本發(fā)明所涉及“靶標”(或目的基因)指的是任何需要調(diào)整表達或者活性的核酸序列。在特殊的實施例中，靶標指的是雙鏈RNA的一條單鏈核苷酸序列是RISC復合體的反義鏈。靶標RNA與反義鏈的雜交導致了 RISC復合體的啟動，隨即，RNA，如mRNA編碼的表達和蛋白降低了。本發(fā)明所涉及〃 RNA加工〃指的是在siRNA，mi RNA,或者RNA酶H途徑(如 Drosha,Dicer,Argonaute2或者其他RISC內(nèi)源性核酸酶和foiaseH)下的加工，已有非常詳細的描述(見"RNA加工"部分)。這個詞明確地區(qū)別于RNA的5'帽的轉(zhuǎn)錄后加工，以及區(qū)別于通過非RISC或非RNase H加工導致的RNA衰退。這樣的RNA衰退有幾種模式發(fā)生， 例如脫腺苷化(去除3' poly(A)尾巴)，和/或通過幾個內(nèi)部的或者外部的核酸酶(例如.RNase III，RNase P, RNase Tl，RNase A(1，2，3，4/5)，寡核苷酸酶等.)，降解部分或者全部的RNA體。本發(fā)明所涉及“參照”指的是標準或者對照。明顯的，適當?shù)膮⒄帐?，本領域的技術人員為了確定一個元素的影響，只改變一個元素。本發(fā)明所涉及的“修飾的核苷酸”指的是核苷酸的核苷，核苷堿基，核糖環(huán)或者磷酸基團有一個或者更多的修飾。例如，修飾的核苷酸包括單磷酸腺苷，單磷酸鳥苷，單磷酸尿嘧啶和單磷酸胞嘧啶的核糖核苷酸，和單磷酸脫氧腺苷，單磷酸脫氧鳥苷，單磷酸脫氧胸腺嘧啶和單磷酸胞嘧啶的脫氧核糖核苷酸。所述修飾包括天然發(fā)生的由酶作用產(chǎn)生的核苷酸修飾，例如甲基轉(zhuǎn)移酶。修飾的核苷酸也包括人工合成的或者非天然發(fā)生的核苷修飾。人工合成或者非天然發(fā)生的修飾包括2’修飾，如2’ -甲氧基乙氧基議-methoxyethoxy)， 2，-氟代，2，-烯丙基，2，-氧-[2-(甲氨基)-2-氧代乙基](2' -0-[2-(methylamino)-2-OXOethyl])，4’ -硫代，4’ -甲基-氧 _2’ -橋聯(lián)，2’ -LNA，2’ -氨基和 2’ _0-(Ν_ 氨基甲酸酯)、2’ -O-(N-methylcarbamate)或者包含堿基類似物。目前關于報道的2’修飾的核苷酸，“氨基"指的是2’-氨基或者2’-ο-氨基，可以是修飾的或未修飾的。這些修飾可參考文獻，如 Eckstein 等.，U. S. Pat. No. 5，672，695 和 Matulic-Adamic 等.，美國專利號 6，248, 878。術語“體外”為其在本領域有公認的意義，例如需要純化的反應體系或提取物，如細胞提取物?！绑w內(nèi)”在本領域也有公認的意義，如需要活的細胞，如需要無限增殖化細胞， 原始細胞，細胞株，和/或者組織內(nèi)細胞。至于本發(fā)明公開的核酸分子，核酸修飾可能存在于所述dsNA的一條鏈上。本發(fā)明涉及的“交替位置”(〃 alternating positions")指的是在所述dsNA的一條長度確定的鏈上每隔一個核苷酸是修飾的核苷酸或者在每兩個修飾的核苷酸之間有一個未修飾的核苷酸(如未修飾的核糖核苷酸)(如5' -MNMNMN-3‘ ；3' -MNMNMN-5‘； 其中M為修飾的核苷酸，N為未修飾的核苷酸)。根據(jù)所述編號習慣，核酸修飾起始于無論是在5’或者3’端第一位核苷酸(在一個實施例中，第1位核苷酸指派為所述DsiRNA被Dicer酶剪切后產(chǎn)生的鏈的末端殘基；這樣，第1位核苷酸不會一直是所述雙鏈核酸處理前的3’末端或者5’末端殘基)。交替的修飾模式可能貫穿于一條鏈的全長序列，但在某一個實施例中，含有至少4,6,8,10，12，14核苷酸的核酸鏈相應地包括至少2，3，4，5，6，或者7個修飾的核苷酸。本發(fā)明所涉及的“交替的配對位(”alternating pairs of positions")指的是所述dsNA的長度確定的一條鏈中2個連續(xù)的修飾的核苷酸間隔于2個連續(xù)的非修飾的核苷酸(如5' -MMNNMMNNMMNN-S' ；3' -MMNNMMNNMMNN-5‘；其中M為修飾的核苷酸，N為未修飾的核苷酸)。根據(jù)所述編號習慣，核酸修飾起始于無論是在5’或者3’端第1位核苷酸。交替的修飾模式可能貫穿于一條鏈的全長序列，但更適宜的是，含有至少8，12， 16,20,24,28個核苷酸的核酸鏈相應地包括至少4，6，8，10，12或者14個修飾的核苷酸.需要強調(diào)的是，上述修飾模式是典型的，是可仿效的，而不是用于限制本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明所涉及的“堿基類似物”(base analog)指的是修飾的核苷酸的糖基第1位上存在雜環(huán)基，該修飾的核苷酸可以組成一條核酸雙鏈(或者在核苷酸糖基同等位置存在修飾，可以組成一條核酸雙鏈)。本發(fā)明所述dsNA，堿基類似物通?？梢允青堰蕢A基也可以是嘧啶堿基，而不是普通的鳥嘌呤堿基(G)，胞嘧啶⑴)，腺嘌呤(A)，胸腺嘧啶(T)，和尿嘧啶(U)。堿基類似物在 dsRNAs中可以和其他堿基形成雙鏈。堿基類似物用于這些發(fā)明的化合物和方法，例如本發(fā)明引用的Bermer的專利號為5，432，272和6，001，983的美國專利，Manoharan的專利公布號為20080213891美國專利。非限制的堿基包括次黃嘌呤(I)，黃嘌呤(X)，3 β-D-呋核亞硝脲-(2，6-二氨基嘧啶)(k)，3- β -D-呋核亞硝脲-(1-甲基-吡啶[4，3-d]嘧啶-5，7 (4H, 6H)-丙二酮)(ρ)， 異胞嘧啶(iso-C)，異鳥嘌呤(iso-G)，l-β -D-呋核亞硝脲-(5-硝基吲哚)，l-β -D-呋核亞硝脲-(3-硝基吡咯)，5_嗅尿嘧唆，2-氨基嘌呤，4-硫代-脫氧胸(腺嘧啶核)苷， 7-(2-噻吩基)-咪唑W，5-b]吡啶(Ds)和吡咯-2-甲醛(Pa)，2-氨基-6-(2-噻吩基)嘌呤 (s)，2-吡啶酮(Y)，氟甲苯，4-氟-6-甲基苯并咪唑，4-甲基苯并咪唑，3-甲基異喹諾酮基， 5-甲基異喹諾酮基，和3-甲基-7-丙炔基異喹諾酮基，7-氮雜吲哚基，6-甲基-7-雜氮吲哚基，imidizopyridinyl, 9-甲基-imidizopyridinyl，pyrrolopyrizinyl，異喹諾酮基，7_ 丙炔基異喹諾酮基，丙炔基-7-雜氮吲哚基，2,4,5-三甲基苯基，4-甲基吲哚基，4，6- 二甲基吲哚基，苯基，萘次甲基，蒽基，phenanthracenyl，芘基，二苯乙烯基，tetracenyl，，稠五苯基，和結(jié)構的延長物。(Schweitzer et al.，J. Org. Chem.，59 :7238-7242 (1994) ；Berger 等，Nucleic Acids Research, 28 (15) :2911-2914(2000) ；Moran 等，J. Am. Chem. Soc，119 2056-2057 (1997) ；Morales 等，J. Am. Chem. Soc, 121 :2323-2324 (1999) ；Guckian 等，J. Am. Chem. Soc, 118 :8182-8183(1996) ；Morales 等，J. Am. Chem. Soc，122 (6) :1001-1007(2000)； McMinn J. Am. Chem. Soc, 121 :11585-11586(1999) ；Guckian J. Org. Chem. ,63 9652-9656(1998) ；Moran 等，Proc. Natl. Acad. Sci.，94 10506-10511 (1997) ；Das 等， J. Chem. Soc, Perkin Trans.，1 197-206 (2002) ；Shibata 等，J. Chem. Soc, Perkin Trans.， 1 :1605-1611 (2001) ；Wu 等，J. Am. Chem. Soc，122 (32) :7621-7632(2000) ；0 ‘ Neill 等，J. Org. Chem.，67 :5869-5875(2002) ；Chaudhuri et al. , J. Am. Chem. Soc, 117 10434-10442 (1995) ；and U. S. Pat. No. 6，218，108.) ·
堿基類似物也可能是通用堿基。本發(fā)明所涉及的“通用堿基”(“universal base")指的是位于修飾的核苷酸的核糖基團的Γ位或者是核苷酸的核糖基團替代物的同等位置的雜環(huán)部分，這樣，在形成核酸雙鏈時，可以在不改變雙螺旋的結(jié)構(例如磷酸骨架結(jié)構)時，能位于至少一種堿基的的對面。并且，所述通用堿基不會破壞單鏈核苷酸與靶標核酸形成雙鏈的能力。單鏈核苷酸與靶標核酸形成雙鏈的能力在本領域可進行試驗測定(如UV吸收，圓二色譜，凝膠遷移實驗，單鏈核酸酶活性靈敏度試驗等)。并且，對雙鏈的形成條件進行了測定，根據(jù)雙鏈的穩(wěn)定性以及構造雙鏈的形成條件是可以改變的，如溫度，即解鏈溫度(Tm)跟雙鏈核酸的穩(wěn)定性相關。與與靶標核酸充分互補的對照單鏈核苷酸相比，含有通用堿基的核苷酸單鏈與靶標核苷酸形成雙鏈后Tm值要低于充分互補的核苷酸。然而，如果通用堿基被一個可以形成錯配的堿基替代，那么含有這個通用堿基的單鏈核苷酸與靶標核苷酸形成雙鏈后其Tm值要比含有錯配的對照核苷酸的Tm值要高。一些通用堿基可以在堿基對形成所需的條件下和通用堿基以及所有的鳥嘌呤 (G)，胞嘧啶(C)，腺嘌呤(A)，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)形成堿基配對。一個通用堿基指的是不僅僅與單一的堿基形成堿基配對的堿基。在一個雙鏈中，通用堿基可以和互補鏈中的對應的G，C，Α，Τ，以及U中任何一個不形成氫鍵，形成1個氫鍵或者形成多于一個氫鍵。通用堿基最好不與互補鏈中對應的堿基相互作用。在一個雙鏈中，通用堿基的配對不會改變磷酸骨架的雙螺旋結(jié)構。通用堿基可以和同一條核苷酸鏈中毗鄰的堿基通過堿基堿基堆積而相互作用。這種堿基堆積作用穩(wěn)定了核苷酸雙鏈結(jié)構，特別是在通用堿基與互補鏈中的對應的堿基不形成氫鍵作用是尤甚。非限制的例子，通用結(jié)合的核苷酸包括次黃苷(mosme)，l-β -D-呋核亞硝脲-5-硝基吲哚(1-β-D-ribofuranosyl-5-nitroindole)，和 / 或 l-β-D-ribofuranosyl-3-硝基吲哚((美國專利申請公布號.200702M362 to Quay et al. ；Van Aerschot 等，An acyclic 5-nitroindazole nucleoside analogue as ambiguous nucleoside. Nucleic Acids Res. 1995 Nov 11 ；23(21) :4363-70 ；Loakes 等，3-Nitropyrrole and 5-nitroindole as universal bases in primers for DNA sequencing and PCR. Nucleic Acids Res. 1995 Jul 11 ；23(13) :2361-6 ；Loakes禾口Brown, 5-Nitroindole as an universal base analogue. Nucleic Acids Res. 1994 Octll ； 22(20) :4039-43)本發(fā)明所涉及的環(huán)("loop環(huán)")指的是一條單鏈核苷酸形成的結(jié)構，是堿基互補區(qū)域外的特殊的單鏈核苷酸，不在所形成的雙鏈區(qū)域或Watson-Crick堿基配對區(qū)域內(nèi)。 一個Loop環(huán)是個任何長度的單鏈核苷酸區(qū)域，單鏈核苷酸loop環(huán)結(jié)構的實例包括有發(fā)卡結(jié)構，桿環(huán)結(jié)構，或者延長環(huán)結(jié)構。本發(fā)明所涉及的“延長環(huán)”指的是一條單鏈核苷酸上的環(huán)，附加于1，2，3，4，5，6，或者多至20個堿基對的雙鏈上或者雙鏈核酸側(cè)翼的loop環(huán)結(jié)構。
在一個延長環(huán)結(jié)構中，5’位置的loop環(huán)上的核苷酸與3’位置loop環(huán)上的的核苷酸形成雙鏈結(jié)構。一個延長環(huán)可以形成發(fā)卡或者桿環(huán)結(jié)構。本發(fā)明所涉及的dsRNA的“四核苷酸環(huán)”(“tetraloop “)指的是單鏈核苷酸區(qū)域四個核苷酸組成的穩(wěn)定的二級結(jié)構，這種穩(wěn)定性是由毗鄰的Watson-Crick鏈上的核苷酸提供的。不被理論所限制，一個四核苷酸環(huán)可以通過堿基堆積作用穩(wěn)定毗鄰的 Watson-Crick堿基對的結(jié)構。并且，四核苷酸環(huán)(‘‘tetraloop”)中的四個堿基之間的作用力可以是但不限制于無Watson-Crick作用的堿基配對作用，堿基堆積作用，氫鍵以及接觸相互作用。(Cheon 等，Nature 1990 Augl6 ；346 (6285) :680-2 ；Heus and Pardi, Science 1991 Jul 12; 253(5016) :191-4).四核苷酸環(huán)導致毗鄰的雙鏈的Tm值要比含簡單的4個核苷酸形成的普通環(huán)的雙鏈要高。例如，在IOmM NaHPO4溶液中，四核苷酸環(huán)在至少含有2個堿基的雙鏈上形成發(fā)卡結(jié)構的退火溫度至少達到55°C。四核苷酸環(huán)可以含有核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，修飾的核苷酸以及三者的組合。例如，RNA四核苷酸環(huán)包括UNCG家族四核苷酸環(huán)(如UUCG)， GNRA四核苷酸環(huán)家族(如GAAA)，和CUUG四核苷酸環(huán)。(Woese等，Proc Natl Acad Sci USA. 1990 Nov ；87 (21) :8467-71 ； Antao 等，Nucleic Acids Res. 1991Nov 11 ；19(21) 5901-5). DNA四核苷酸環(huán)包括d (GNNA)家族四核苷酸環(huán)，d (CNNG)家族四核苷酸環(huán)，d (TNCG) 家族四核苷酸環(huán)(如 d(TTCG)。(Nakano 等.Biochemistry，41 08) ,14281-14292，2002.； SHINJI 等· Nippon Kagakkai Koen Yokoshu VOL. 78th ；NO. 2 ；PAGE. 731 (2000).)本發(fā)明所涉及的“增加”或“提高”指的是相比于對照組，顯著提高至少5%的實驗結(jié)果。相比于對照組，這種提高可以是5%，10%，25%，30%，50%，75%，甚至是100%。提高Dicer酶剪切指的是，在體外體內(nèi)實驗中，相比于同等量的對照組Dicer酶處理dsERNA或含dsRNA的分子，實驗組Dicer酶處理一定量的dsRNA或者含dsRNA的分子產(chǎn)生更多的Dicer酶加工后的產(chǎn)物，Dicer酶剪切的速度更快，或者Dicer酶在dsERNA分子內(nèi)部的剪切位置定位的更特殊，更優(yōu)選的位置，或者產(chǎn)生的剪切產(chǎn)物有更卓越的產(chǎn)量。在一個實施例中，增強或者提高的Dicer酶剪切能力剪切dsNA分子的能力高于對照組dsNA的普遍能力。本發(fā)明所涉及的降低指的是相比于對照組，顯著降低至少5%的實驗結(jié)果。相比于對照組，這種降低可以是5%，10%，25%，30%，50%，75%，甚至是100%?！敖档捅磉_量”指的是在體外體內(nèi)實驗中，在不存在核酸分子(如dsRNA分子或者含dsRNA的分子)時，基因的表達，或者RNA分子的水平，或者編碼一個或多個蛋白或蛋白亞基的RNA分子水平，或者一個目標基因編碼的一個或者更多蛋白或蛋白亞基的水平或活性降低了。在一個實例中，抑制，下調(diào)或者dsNA分子量的減少低于在無活性或削弱的核酸分子存在時觀察到的水平。在另一個實例中，抑制，下調(diào)或者dsNA分子量的減少低于在含雜亂序列或者含錯配的的dsNA分子存在時的水平。在另一個實例中，抑制，下調(diào)或者本發(fā)明公開的基因表達的下降在所述核酸分子存在時比不存在時更顯著。本發(fā)明所涉及的，“細胞”包括原核細胞(如細菌)和真核細胞(如哺乳動物或者植物)。細胞可以是體細胞或者微生物細胞株來源的，可以是全能細胞也可以是多能細胞， 也可以是劃分的細胞或未劃分的細胞。細胞也可以來源于接合子，或者胚胎細胞，或者干細胞，或者完全分化的細胞。因此，“細胞”保留了通常的生物學意義并且可以是任何一種生物體如鳥類，植物，或者動物，包括例如人類，牛，羊，猿，猴子，豬，夠，或者貓。在某些方面，“細胞”特別指的指哺乳動物細胞，如人類細胞，含有一個或多個dsNA分子。特別的，細胞含有可導致靶標核苷酸的RNA干擾的dsRNAs或者含dsRNA分子含有RNA干擾途徑蛋白質(zhì)或者蛋白復合物例如Dicer酶或者RISC。本發(fā)明所涉及的，動物("animal")指的是多細胞的，真核有機體，包括哺乳動物，特別是人類。該專利提供導入到一個物種(如動物，人類)，包括哺乳動物，特別是人類所需所述核苷酸的量所需的量的計算公式。這種處理對于導入的物體是適宜的，特別是人類，遭受，可能患病或者易感疾病或者癥狀的人?！八帉W可接受的載體”，指的是一種合成物或者制劑，可以有效的分配所述核苷酸分子到適合其發(fā)揮作用的物理位置。本發(fā)明在了大多實施例中涉及了含有雙鏈RNA (dsRNA) 和含DNA延長區(qū)域的合成物，dsDNA雙鏈這類物質(zhì)及其制備方法，所述雙鏈可以降低真核細胞中目標基因的表達。所述dsRNA的一個標準是含有一個核苷酸序列的區(qū)域，核苷酸的長度為15-22個，該核苷酸序列可以摧毀目的基因轉(zhuǎn)錄的RNA。所述dsDNA雙鏈區(qū)域不必和靶標RNA互補，因此，不會加強靶標RNA與可以指揮摧毀靶標RNA的核苷酸序列的雜交。本發(fā)明所述的雙鏈NAs具有以化學方法連接的鏈，或則具有延長的環(huán)(loop)的鏈，可選的，環(huán)包含四核苷酸環(huán)(tetraloop)，可連接第一鏈和第二鏈。在一些實施例中，所述包含四聚環(huán)的延長的環(huán)是在正義鏈的3'末端，反義鏈的5'末端，或者在兩個上述末端。在一個實施例中，所述dsNA含有一個雙鏈RNA區(qū)域，該區(qū)域程度為含有18_30個核苷酸(如，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，四和 30 個堿基)。本專利所述DsiRNA/dsDNA相比于缺少所述dsDNA區(qū)域的DsiRNAs具有增強的如下功能在體外的效率(如藥性和藥效持久性)，在體內(nèi)的效率(如藥效，藥效持久性，藥代動力學，藥效學，細胞攝取量，降低的毒性)。在一個實施例中，本發(fā)明所述dsDNA可另外任選地提供一個分子(或者片段)，如適體(aptamer)或者片段，一個結(jié)合位點(如"decoy" 結(jié)合位點)，通過非選擇性序列或特異性序列形式讓天然的或者外源性的基團結(jié)合到 dsDNA上(如本發(fā)明所述延長dsDNA區(qū)域可以設計含有一個或者多個轉(zhuǎn)錄因子識別序列和 /或者所述延長dsDNA區(qū)域能提供一個可以被探針或者標記等識別的特異性序列)。本發(fā)明所涉及的“藥物代謝動力學”指的是體內(nèi)藥物吸收，分配，代謝和排泄的過程。在某個實施例中，增強所述DsiRNA/dsDNA的藥物動力學相當于適當?shù)目刂艱siRNA以增強個體內(nèi)DsiRNA/dsDNA的吸收和/或者分配，和/或者延緩代謝和/或者排泄。本發(fā)明所涉及的，“藥效學"指的是藥物在一個活體組織內(nèi)的功能或者影響。在一個實施例中，增強所述DsiRNA/dsDNA藥效學相當于適當?shù)目刂艱siRNA以提高(如更高的或者更持久的)個體內(nèi)DsiRNA/dsDNA的功能或者影響，相當于適當?shù)目刂艱siRNA.本發(fā)明所涉及的“穩(wěn)定性"指的是在一個確定的環(huán)境內(nèi)，所述藥劑持續(xù)作用的一種狀態(tài)。在一個實施例中，相比于對照DsiRNAs，所述DsiRNA/dsDNA嵌合的藥劑表現(xiàn)出增強的穩(wěn)定性。這種增強的穩(wěn)定性可以通過這類介質(zhì)-降解酶(如核酸酶)或者其它的介質(zhì)的增強的阻抗而達到。DsiRNA的設計與合成有報道指出，長度為25-30個核苷酸(DsiRNAs)的dsRNA比長度為19-23個siRNA的具有出乎意料的抑制RNA的功效，體現(xiàn)在效價和持久性上。為了不受dsRNA處理機制基本理論約束，我們認為較長的dsRNA類在細胞質(zhì)中做為Dicer酶的底物起作用。除了將本發(fā)明所述dsNA剪切為短的片段，我們認為Dicer酶促進了從被剪切的dsNA脫離下來的單鏈產(chǎn)物進入RISC復合體，從而導致了細胞質(zhì)中RNA或者來源于目的基因的RNA的毀滅。前人的研究((Rossi 等.，U. S. Patent Application No. 2007/0265220)表明 Dicer 酶剪切 dsRNA種類的能力與dsRNA(特別是DsiRNA)的功效及活性的持久性相關。本發(fā)明至少一部分，提供了設計的RNA抑制劑，其可以指導Dicer酶的剪切位點，這樣，優(yōu)選的Dicer酶剪切產(chǎn)物產(chǎn)生了。DsiRNA加工的模型在圖IA中有描述。簡單地講，Dicer酶結(jié)合到DsiRNA上，導致了 DsiRNA在一個位置的剪切，該處有19-23個堿基從Dicer酶PAZ結(jié)構域處分離出來， 與DsiRNA的反義鏈3’端懸垂序列相關。這樣的Dicer酶剪切作用導致了預先位于過客鏈 (正義鏈)3’端和引導鏈(反義鏈)的5’端的核苷酸的切除(圖IA中DsiRNA的切除產(chǎn)生了一個在每個末端含2個堿基的懸垂的19個堿基對的雙鏈)。如圖IA中所示，Dicer酶的剪切產(chǎn)生了一個21-23個核苷酸引導鏈(反義鏈)，該鏈作為RISC的一個組成部分具有指導特異性序列抑制靶標mRNA的能力。所述DsiRNA第一和第二寡核苷酸鏈不需要充分互補。事實上，在一個實施例中， 正義鏈的3’末端還有一個或多個堿基錯配。一方面，2個左右的堿基錯配都處于正義鏈的3’末端。另一個實施例中，所述 DsiRNA是雙鏈RNA分子，含2個RNA寡聚核苷酸。所述雙鏈分子的每條鏈含有相同數(shù)目的 27-35個核苷酸長度，當退火時兩條鏈形成鈍性末端，且在正義鏈的3’末端和反義鏈的5’ 末端還有2個錯配的堿基。堿基錯配的使用或者降低其熱力學穩(wěn)定性(特別正義鏈的3’末端和反義鏈的5’ 末端位置)被指出推動了反義鏈進入RISC復合體(ktiwarz等，2003 ；Khvorova等.,2003), 推測是因為影響了 siRNA進入RISC時限制了 siRNA展開的步驟。因此，末端堿基的組成包括設計挑選21個堿基的有活性的siRNA雙鏈(Ui-Tei 等，2004 ；Reynolds 等，2004) ·在此實例中，Dicer酶在dsRNA區(qū)域剪切后，含有堿基錯配的小的末端序列，或在反義鏈留下不配對(成為3’懸垂部分)，或者被完整的從21個堿基對的siRNA上切下。 因此，這種特殊形式的“錯配”，在最終RISC中的RNA中是不存在的。在Dicer酶底物正義鏈3’端的堿基錯配或者不穩(wěn)定片段可以提高合成雙鏈核酸在RNA干擾作用中的作用，推測是促進了 Dicer酶的加工作用，這項關于25-30個堿基的dsRNAs (本文中指的是DsiRNAs) 的設計和使用的研究的報道在過去是驚人的(Rossi等.，U. S. Patent Application Nos.2005/0277610,2005/0244858 and 2007/0265220). 同樣驚人的發(fā)現(xiàn)是，在過客鏈(正義鏈)和引導鏈(反義鏈)上都含有堿基配對的脫氧核糖核苷酸的DsiRNAs，在相應的過客鏈或引導鏈的3’端設計Dicer酶的剪切位點， 具有至少與RNA-RNA雙鏈同樣的作用，我們稱為延長的DsiRNA。這種DsiRNA也可以含有錯配，這種錯配可以是反義鏈與相應的(實際上兩者可以雜交)正義鏈之間的錯配，也可以是反義鏈與靶標RNA之間的錯配。典型的錯配或者搖擺堿基對有G:A，C:A，C:U，G:G，A:A， C:C，U:U，I:A，I:U和I:C。such agents (DsiRNA)的堿基配對的力量可以通過修飾核苷酸而降低，如鳥嘌呤或者腺嘌呤核苷酸的2-氨基，或者2，6-diamin0修飾。典型的DsiRNA復合物的結(jié)構一方面，本發(fā)明提供用于RNA干擾(RNAi)的一種復合物，該復合物在雙鏈核苷酸 (dsNA)區(qū)域含有一個或多個脫氧核糖核苷酸堿基對，這個區(qū)域設計的有Dicer酶在正義鏈的3’剪切位點和相應的反義鏈的5’剪切位點。本發(fā)明提供的復合物包括一個dsNA先驅(qū)分子，也即所述dsNA在體內(nèi)可以產(chǎn)生有活性的小干擾核酸分子(siRNA)。所述dsNA經(jīng)過 Dicer加工后產(chǎn)生的活性siRNA成為RISC的一部分。在某個實施例中，本發(fā)明所述DsiRNA可以具有下列任何一種典型結(jié)構。在一個實施例中，所述DsiRNA的結(jié)構組成如下5 ‘ -xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxi “ DNDD-3 ‘3' -yxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxn“dnxx-s‘此處的X" = RNA, “ Y"是任選的有0_10 RNA單體(任選的，在一個實施例中， 是2 ‘ -0-甲基修飾RNA單體)構成的懸垂，在一個實施例中，“Y"是任選的有1-4個RNA 單體(任選的，是T' -0-甲基修飾RNA單體)構成的懸垂，“D〃 = DNA, “ N" = 1-50 或者更多，但優(yōu)選1-15，更優(yōu)選1-8?！?N*〃 = 0-15或者更多，但優(yōu)選0，1，2，‘ 3，4，5或 6。在一個實施例中，上面一條鏈為正義鏈，下面一條鏈為反義鏈。或者可選的，下面一條鏈為正義鏈，上面的鏈為反義鏈。在一個相關實施例中，所述DsiRNA的結(jié)構組成如下5' -XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXI "DNDD-3 ‘3' -yxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxn“dndd-s‘其中，X" = RNA, “ Y"是任選的有0_10個RNA單體(任選的，在一個實施例中， 是2' -0-甲基修飾RNA單體)構成的懸垂，在一個實施例中，“Y〃是任選的有1-4個 RNA單體(任選的，是T' -0-甲基修飾RNA單體)構成的懸垂，“D〃 =DNA, “ N"表示 1-50，或者更多，但是，優(yōu)選1-15，更優(yōu)選1-8.. “ N*"為0-15或者更多，但是，優(yōu)選為0，1， 2，' 3，4，5或者6。在一個實施例中，上面一條鏈為正義鏈，下面一條鏈為反義鏈。或者可選的，下面一條鏈為正義鏈，上面的鏈為反義鏈。在另一個實施例中，所述DsiRNA結(jié)構組成如下5' -XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN “ DNDD-3 ‘3 ‘ -YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXn*DnZZ-5 ‘其中“X"為RNA，“ X"為2’ _0_甲基RNA?！?Y〃為表示的是一個任意的0-10 個RNA單體的懸垂結(jié)構，任意的，該懸垂結(jié)構含2’ -0-甲基修飾RNA單體-在某個實施例中，“Y”表示的是含1-4個RNA單體的懸垂結(jié)構，任意的，該單體為2’ -0-甲基RNA單體。“D〃 = DNA, “ Z"為DNA或者RNA，“ N"表示1-50，或者更多，但是，優(yōu)選1-15，更優(yōu)選1-8?！?N*〃為0-15或者更多，但是，優(yōu)選為0，1，2，‘ 3，4，5或者6。在一個實施例中，上面一條鏈為正義鏈，下面一條鏈為反義鏈。或者可選的，下面一條鏈為正義鏈，上面的鏈為反義鏈。上面一條鏈含有交替的2’ -0甲基RNA單體，而不是下面的鏈。在另一個實施例中，所述DsiRNA結(jié)構組成如下5' -XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN “ DNDD-3 ‘3' -yxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxn“dnzz-s‘
其中“X"為RNA，“ X"為2’_0_甲基RNA. “ Y"為表示的是一個任意的0-10 個RNA單體的懸垂結(jié)構，任意的，該懸垂結(jié)構含2’ -0-甲基修飾RNA單體，在某個實施例中，“Y”表示的是含1-4個RNA單體的懸垂結(jié)構，任意的，該單體為2’ -0-甲基修飾RNA單體?！癉〃 = DNA, “ Z"為DNA或者RNA，“ N"表示1-50，或者更多，但是，任意的，1-15 或者1-8?！?N* 〃為0-15或者更多，但是，任意地，為0，1，2，‘ 3，4，5或者6.在一個實施例中，上面一條鏈為正義鏈，下面一條鏈為反義鏈?；蛘呖蛇x的，下面一條鏈為正義鏈，上面的鏈為反義鏈。上面一條鏈含有交替的2’ -0甲基RNA單體，而不是下面的鏈。在另一個實施例中，所述DsiRNA結(jié)構組成如下5' -XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN* [X1 /D1 ] NDD_3 ‘3' -Yxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxn*[X2/D2]nzz-5‘其中〃 X"為RNA，“Y”表示的是一個任意的0-10個RNA單體的懸垂結(jié)構，任意的， 該懸垂結(jié)構含2’ -0-甲基修飾RNA單體，在某個實施例中，“Y”表示的是含1-4個RNA單體的懸垂結(jié)構，任意的，該單體為T-O-甲基修飾的RNA單體?！癉〃 = DNA, “ N"表示1_50， 或者更多，but，任意的，1-15或者1-8。其中上面一條鏈中DIn至少有一個可以和下面的鏈中的0 形成堿基配對。任意是，DIn和D1N+I和相應的0 和D2N+I形成堿基配對；DIn，DIn+1 and 01_和相應的D2N，D2N+I and 形成堿基配對，等等。“N"表示1_50，或者更多，但是，任意的，為1-15或者1-8。“ N*〃為0-15或者更多，但是，任意地，為0，1，2，‘ 3,4,5 或者6.在一個實施例中，上面一條鏈為正義鏈，下面一條鏈為反義鏈?；蛘呖蛇x的，下面一條鏈為正義鏈，上面的鏈為反義鏈。上面一條鏈含有交替的2’ -0甲基RNA單體，而不是下面的鏈。在上述任何一種結(jié)構中，可選地正義鏈或者反義鏈的5’端含有一個磷酸基團。在另一個實例中，所述DNA:DNA延長的DsiRNA，含有相等長度的兩條鏈，其含1_3 個錯配的殘基可以確定Dicer酶的剪切方向。(特別的，在DsiRNA兩條寡核苷酸鏈退火時， 第一寡核苷酸鏈從3’端第一位編號，第1，2，3位核苷酸有一個或者多個與第二寡核苷酸鏈 5’端相應殘基形成堿基錯配)。一個典型的含有2個末端錯配堿基的DNA:DNA延長DsiRNA 結(jié)構如下&M-35' -XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXn*Dnm 3'-xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxwiw其中，“X"為RNA，“ M"位核酸殘基，可以是RNA，DNA，或者非天然的或人工修飾的核酸，在兩條鏈退火時與互補鏈中相對應的位置上的殘基堿基不互補?！癉"為 DNA, “ N"表示1-50，或者更多，但是，優(yōu)選的為1-15或者1-8?！?N*〃為0_15或者更多， 但是，優(yōu)選為0，1，2，’ 3，4，5或者6。下面一條鏈(第二條鏈)中任何一個核苷酸殘基， 任意的，起始于3’端可以是2’ -0-甲基修飾RNA單體-交替的含有2’ -0-甲基修飾RNA 單體，這樣與上面的鏈形成不均勻互補，也可以出現(xiàn)在上面所示的具有“鈍性末端/fray”的 DsiRNA中。在一個實施例中，上面一條鏈(第一鏈)為正義鏈，下面一條鏈(第二鏈)為反義鏈?；蛘呖蛇x的，下面一條鏈為正義鏈，上面的鏈為反義鏈。上述給出的結(jié)構中的修飾過的DNA:DNA延長的DsiRNA具有不對稱/懸垂，其也能組成這樣的“鈍性末端/fray”。在一個實施例中，一個長度延長的DsiRNA，含有脫氧核糖核苷酸以確定Dicer酶的剪切方向，但不需要在dsNA結(jié)構中形成堿基互補的脫氧核糖核苷酸。
這樣的DsiRNA結(jié)構模型如下5 ‘ -XXXXXXXXXXXXXXXXXXXDDXX-3‘ 3 ‘ -YXXXXXXXXXXXXXXXXXDDXXXX-5‘其中其中“X"為RNA，“Y”表示的是一個任意的0-10個RNA單體的懸垂結(jié)構，任意的，該懸垂結(jié)構含2’-0_甲基修飾RNA單體，在某個實施例中，“Y”表示的是含1-4個RNA 單體的懸垂結(jié)構，任意的，該單體為T-O-甲基修飾的RNA單體。“D"為DNA。。在一個實施例中，上面一條鏈為正義鏈，下面一條鏈為反義鏈?；蛘?，下面一條鏈為正義鏈，上面的鏈為反義鏈。上述結(jié)構模型強迫Dicer酶剪切一最少為21個堿基對的雙鏈，作為其加工后初始形式。在上述結(jié)構中的任何一個下面一條鏈為反義鏈的實例中，反義鏈5’端最后一個和倒數(shù)第二個殘基上的脫氧核糖核苷酸很可能會降低目標的影響(已有報道指出反義鏈 5’端至少倒數(shù)第二個位置為修飾的2’ -0-甲基修飾RNA的殘基，降低了目標的影響。參照 US2007/0223427)在一個實施例中，DsiRNA含有5 ‘ -DnXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXWY-3‘3' -DNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN"-S‘其中，其中〃 X"為 RNA，“Y，，表示的是一個任意的0-10個RNA單體的懸垂結(jié)構，任意的，該懸垂結(jié)構含2’ -0-甲基修飾RNA單體， 在某個實施例中，“Y”表示的是含1-4個RNA單體的懸垂結(jié)構，任意的，該單體為T-O-甲基修飾的RNA單體?！癉〃 = DNA, “ N〃表示1_50，或者更多，但是，優(yōu)選為1_15或者 1-8?！?N*〃為0-15或者更多，但是，任意地，為0，1，2，' 3，4，5或者6。在一個實施例中， 上面一條鏈為正義鏈，下面一條鏈為反義鏈。或者可選的，下面一條鏈為正義鏈，上面的鏈為反義鏈。在一個相關實例中，DsiRNA含有5' -DnXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXI"DD-3‘3' -DnXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXn“XX-S ‘其中〃 X"為 RNA，任意的，含一個 2，-0_甲基RNA，‘‘ D〃 = DNA, ‘‘ N〃表示1-50，或者更多，但是，任選的，為1-15或者 1-8?！?N*〃為0-15或者更多，但是，任選地，為0，1，2，' 3，4，5或者6。在一個實施例中， 上面一條鏈為正義鏈，下面一條鏈為反義鏈?；蛘呖蛇x的，下面一條鏈為正義鏈，上面的鏈為反義鏈。在另一個相關實施例中，所述DsiRNA含有如下結(jié)構5 ‘ -DnXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXWDD-3 ‘ 3 ‘-DnXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXwZZ-5 ‘，其中〃 X 〃 為 RNA，任意的，含一個 2’-0_甲基RNA," D"為DNA，" N"表示1-50，或者更多，但是任選為1-15或者1-8?！?N*" 為0-15或者更多，但是，任選為0，1，2，‘ 3，4，5或者6?！癦”為DNA或RNA.在一個實施例中，上面一條鏈為正義鏈，下面一條鏈為反義鏈?；蛘?，底下一條鏈為正義鏈，上面的鏈為反義鏈，上面一條鏈含有交替的2’ -0甲基RNA單體，而不是下面的鏈。在另一個這樣的實施例中，所述DsiRNA含有如下結(jié)構5' -DnZZXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXn " DD-B ‘3' -DnXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXn"ZZ-S‘，其中〃 X"為 RNA，“X，為 2，_0_ 甲基修飾RNA單體。“D"為DNA，“Z”為DNA或RNA.，“ N"表示1_50，或者更多，但是任選為1-15或者1-8. . 〃 N*〃為0-15或者更多，但是，任意地，為0，1，2，‘ 3，4，5或者6。在一個實施例中，上面一條鏈為正義鏈，下面一條鏈為反義鏈?；蛘撸紫乱粭l鏈為正義鏈，上面的鏈為反義鏈，上面一條鏈含有交替的2’ -0甲基RNA單體，而不是下面的鏈。在另一個這樣的實施例中，所述DsiRNA含有如下結(jié)構5' -DnZzxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx1 "y-3‘ 3'-DnXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXw-5 ‘其中“X"為RNA, “X，為2，_0_甲基修飾RNA單體?！癉〃為DNA, “Z，，為DNA或 RNA.，‘‘ N"表示1-50，或者更多，但是任選為1-15或者1-8. . ‘‘ N*"為0_15或者更多， 任選為0，1，2，‘ 3，4，5或者6?！癥”表示的是一個任意的0-10個RNA單體的懸垂結(jié)構， 任意的，該懸垂結(jié)構含2’ -0-甲基修飾RNA單體，在某個實施例中，“Y”表示的是含1-4個 RNA單體的懸垂結(jié)構，任意的，該單體為2’ -0-甲基修飾的RNA單體。在一個實施例中，上面一條鏈為正義鏈，下面一條鏈為反義鏈?；蛘撸紫乱粭l鏈為正義鏈，上面的鏈為反義鏈， 上面一條鏈含有交替的2’ -0甲基RNA單體，而不是下面的鏈。在另一個實施例中，所述DsiRNA結(jié)構組成如下5' -[Xl/Dl] NXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD-3 ‘3' -[X2/D2]NXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX"ZZ-5 ‘，其中〃 X"為 RNA，“X，為 2，-0-甲基修飾RNA單體?！癉〃為DNA，“Z”為DNA或RNA.，“ N"表示1-50，或者更多， 任選為1-15或者1-8.其中上面一條鏈中DIn至少有一個可以和下面的鏈中的形成堿基配對。任意是，DIn和D1n+i和相應的D2n和D2n+i形成堿基配對；DIn, DIn+1 and DlN+2和相應的D2n，D2n+i and 形成堿基配對，等等?！癗*"為0_15或者更多，任選為為0，1， 2，‘ 3，4，5或者6.在一個實施例中，上面一條鏈為正義鏈，下面一條鏈為反義鏈。或者可選的，下面一條鏈為正義鏈，上面的鏈為反義鏈。上面一條鏈含有交替的2’ -0甲基RNA單體，而不是下面的鏈。在一個相關實施例中，所述DsiRNA含有如下結(jié)構5' - [X1 /D1 ] NXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXNJ-3 ‘3' - [X2/D2] NXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*-5 ‘其中〃 X"為RNA，“Y”表示的是一個任意的0-10個RNA單體的懸垂結(jié)構，任意的， 該懸垂結(jié)構含2’ -0-甲基修飾RNA單體，在某個實施例中，“Y”表示的是含1-4個RNA單體的懸垂結(jié)構，任意的，該單體為T-O-甲基修飾的RNA單體?！癉〃為DNA，" N"表示1_50， 或者更多，而任選為1-15或者1-8。其中上面一條鏈中DIn至少有一個可以和下面的鏈中的 D2n形成堿基配對。任意是，DIn和D1n+i和相應的0 和D2n+i形成堿基配對；DIN，DIN+1 and
和相應的D2n，D2n+i and 形成堿基配對，等等?！甆"表示1_50，或者更多，而任選為1-15或者1-8。‘‘ N*〃為0-15或者更多，而任選為0，1，2，‘ 3，4，5或者6.在一個實施例中，上面一條鏈為正義鏈，下面一條鏈為反義鏈?；蛘呖蛇x的，下面一條鏈為正義鏈， 上面的鏈為反義鏈。上面一條鏈含有交替的2’-0甲基RNA單體，而不是下面的鏈。在上述任何一種結(jié)構中，可選地正義鏈或者反義鏈的的5’端含有一個磷酸基團。在另一個實例中，所述DNA:DNA延長的DsiRNA，含有相等長度的兩條鏈，含1_3個錯配的殘基可以確定Dicer酶的剪切方向。(特別的，在DsiRNA兩條寡核苷酸鏈退火時， 第一寡核苷酸鏈從3’端第一位編號，第1，2，3位核苷酸有一個或者多個與第二寡核苷酸鏈 5’端相應殘基形成堿基錯配)。
一個典型的含有2個末端錯配堿基的DNA:DNA延長DsiRNA結(jié)構如下5' -DnXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXnMMJ-3' 3'
-DnXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXn"其中，“X"為RNA，“ M"為核酸殘基，可以是RNA，DNA，或者非天然的或人工修飾的核酸，在兩條鏈退火時與互補鏈中相對應的位置上的殘基堿基不互補?！癉"為 DNA, “ N"表示1-50，或者更多，而任選1-15或者1-8?！?N*〃為0_15或者更多，但是，任選地，為0，1，2，‘ 3，4，5或者6。下面一條鏈(第二條鏈)中任何一個核苷酸殘基，任意的， 起始于3’端可以是2’-0_甲基修飾RNA單體-交替的含有2’-0_甲基修飾RNA單體，這樣與上面的鏈形成不均勻互補，其也可以用于以上所示的具有“鈍性末端/fray”’ DsiRNA中。 在一個實施例中，上面一條鏈(第一鏈)為正義鏈，下面一條鏈(第二鏈)為反義鏈。或者可選的，下面一條鏈為正義鏈，上面的鏈為反義鏈。上述給出的結(jié)構中的修飾過的DNA:DNA 延長的、具有不對稱/懸垂DsiRNA，其也能組成這樣的“鈍性末端/fray”。在一個實施例中，一個長度延長的DsiRNA，含有脫氧核糖核苷酸以確定Dicer酶的剪切定位，但不需要在dsNA結(jié)構中形成堿基互補的脫氧核糖核苷酸。這樣的典型結(jié)構如下5 ‘ -XXDDXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXn+Y-3 ‘ 3 ‘ -DDXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN+-S ‘ 或5 ‘ -XDXDXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXn+Y-3 ‘3 ‘ -DXDXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX\*-5 ‘其中，丨‘X"為RNA，“Y”表示的是一個任意的0-10個RNA單體的懸垂結(jié)構，任意的，該懸垂結(jié)構含2’ -0-甲基修飾RNA單體，在某個實施例中，“Y”表示的是含1-4個RNA 單體的懸垂結(jié)構，任選地，該單體為T-O-甲基修飾的RNA單體?！癉〃為DNA，“ N〃表示 1-50，或者更多，而任選為1-15或者1-8?！?N*〃為0-15或者更多，但是，任意地，為0，1， 2,' 3，4，5或者6。在一個實施例中，上面一條鏈為正義鏈，下面一條鏈為反義鏈?；蛘呖蛇x的，下面一條鏈為正義鏈，上面的鏈為反義鏈。上述結(jié)構模型強迫Dicer酶剪切一最少為 21個堿基對的雙鏈，作為其加工后初始形式。在上述任何一個下面一條鏈為反義鏈的實例中，反義鏈5’端最后一個和倒數(shù)第二個殘基上的脫氧核糖核苷酸可能會降低目標的影響(已有報道指出反義鏈5’端至少倒數(shù)第二個位置為修飾的2’ -0-甲基修飾RNA的殘基，降低了目標的影響。參照 US2007/0223427)上述延長的DsiRNAs，可以采用許多種修飾形式(如延長的DsiRNA序列上RNA的 2’ -0-甲基修飾)。DsiRNAs第二寡核苷酸鏈上的優(yōu)選的修飾模式如下所示，-特別注明的是，下列無延長的DsiRNAs的修飾，本領域的技術人員應該認識到，此處所示修飾模式也很容易應用到其他任何延長的DsiRNA結(jié)構上。在一個實施例中，所述DsiRNA含如下結(jié)構5' -pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3‘ 3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5‘其中，‘‘X"為RNA，‘‘ ρ〃為一個磷酸基團，“Y”表示的是一個含1_4個RNA單體的懸垂結(jié)構，任選地，該RNA單體可以是2' -0-甲基修飾的RNA單體，"D"為DNA。在一個實施例中，上面一條鏈為正義鏈，下面一條鏈為反義鏈?；蛘呖蛇x的，下面一條鏈為正義鏈，上面的鏈為反義鏈。在另一個實施例中，所述DsiRNA含如下結(jié)構5' -pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3‘ 3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-S‘其中，“X"為 RNA，“ p〃 為一個磷酸基團，‘‘X"為2' -O-甲基RNA?！癥”表示的是一個含1-4個RNA單體的懸垂結(jié)構，任選地， 該RNA單體可以是2' -0-甲基修飾的RNA單體，帶下劃線的為2' -0-甲基修飾的RNA單體，“D"為DNA。上面一條鏈為正義鏈，下面一條鏈為反義鏈。在又一個實施例中，所述DsiRNA含如下結(jié)構5' -pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3‘ 3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-S‘其中，‘‘X"為RNA，“ p〃為一個磷酸基團，“X"為2' _0_甲基RNA?！癥”表示的是一個含1-4個RNA單體的懸垂結(jié)構，任選地，該RNA單體可以是2' -0-甲基修飾的 RNA單體，帶下劃線的為2' -0-甲基修飾的RNA單體，“D〃為DNA。上面一條鏈為正義鏈，下面一條鏈為反義鏈。進一步實施例中，所述DsiRNA含如下結(jié)構5' -pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3‘ 3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5‘其中，“X"為RNA，“ ρ〃為一個磷酸基團，“X"為2' _0_甲基RNA?！癥”表示的是一個含1-4個RNA單體的懸垂結(jié)構，任選地，該RNA單體可以是2' -0-甲基修飾的 RNA單體，帶下劃線的為2' -0-甲基修飾的RNA單體，“D〃為DNA。上面一條鏈為正義鏈，下面一條鏈為反義鏈。
在一個實施例中，所述DsiRNA 含如下結(jié)構5 ‘ -pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3' 3' -XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5'其中，“X"為 RNA，“ ρ 〃 為一個磷酸基團，“X"為2' -0-甲基RNA，“ D"為DNA。上面一條鏈為正義鏈，下面一條鏈為反義鏈。在又一個實施例中，所述DsiRNA含如下結(jié)構5'-pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD -3' 3' -YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5‘其中，‘‘X"為RNA，“ ρ〃為一個磷酸基團，“X"為2' _0_甲基RNA?！癥”表示的是一個含1-4個RNA單體的懸垂結(jié)構，任選地，該RNA單體可以是2' -0-甲基修飾的 RNA單體，帶下劃線的為2' -0-甲基修飾的RNA單體，“D〃為DNA。上面一條鏈為正義鏈，下面一條鏈為反義鏈。在一個實施例中，所述DsiRNA含如下結(jié)構5' -pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3‘ 3'-
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5‘其中，“X"為RNA，“ p〃為一個磷酸基團，“X"為2' _0_甲基RNA。“ D" 為DNA。上面一條鏈為正義鏈，下面一條鏈為反義鏈。在另一個實施例中，所述DsiRNA含如下結(jié)構5'-pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD _3' 3' -Yxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxp-S‘
其中，“X"為RNA，“ p〃為一個磷酸基團，“X"為2' _0_甲基RNA?！癥”表示的是一個含1-4個RNA單體的懸垂結(jié)構，任選地，該RNA單體可以是2' -0-甲基修飾的 RNA單體，帶下劃線的為2' -0-甲基修飾的RNA單體，“D〃為DNA。上面一條鏈為正義鏈，下面一條鏈為反義鏈。在一個實施例中，所述DsiRNA 含如下結(jié)構5 ‘ -pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3' 3' -XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5'其中，“X"為 RNA，“ ρ 〃 為一個磷酸基團，“X"為2' -0-甲基RNA。“ D"為DNA。上面一條鏈為正義鏈，下面一條鏈為反義鏈。進-
-步實施例中，所述DsiRNA含如下結(jié)構其中，“X"為 RNA，“ ρ〃 為-5' -pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3‘ 3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5‘
-個磷酸基團，‘‘X"為2' -0-甲基RNA。“Y”表
示的是一個含1-4個RNA單體的懸垂結(jié)構，任選地，該RNA單體可以是2' -0-甲基修飾的 RNA單體，帶下劃線的為2' -0-甲基修飾的RNA單體，“D〃為DNA。上面一條鏈為正義鏈，下面一條鏈為反義鏈。在一個實施例中，所述DsiRNA 含如下結(jié)構5' -pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3' 3' -XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5'，其中，“X"為 RNA，“ ρ〃 為一個磷酸基團，“X"為2' -0-甲基RNA?！?D"為DNA。上面一條鏈為正義鏈，下面一條鏈為反義鏈。在一個實施例中，所述DsiRNA含如下結(jié)構5' -pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3‘ 3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5 ‘其中，“X"為 RNA，“ ρ〃 為一個磷酸基團，‘‘X"為2' -O-甲基RNA。“Y”表示的是一個含1-4個RNA單體的懸垂結(jié)構，任選地， 該RNA單體可以是2' -0-甲基修飾的RNA單體，帶下劃線的為2' -0-甲基修飾的RNA單體，“D"為DNA。上面一條鏈為正義鏈，下面一條鏈為反義鏈。在一個實施例中，所述DsiRNA 含如下結(jié)構5' -pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3' 3' -XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5'，其中，“X"為 RNA，“ ρ〃 為一個磷酸基團，“X"為2' -0-甲基RNA。“ D"為DNA。上面一條鏈為正義鏈，下面一條鏈為反義鏈。在另一個實施例中，所述DsiRNA含如下結(jié)構5' -pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3‘ 3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5 ‘其中，“X"為 RNA，“ p〃 為一個磷酸基團，‘‘X"為2' -O-甲基RNA?！癥”表示的是一個含1-4個RNA單體的懸垂結(jié)構，任選地， 該RNA單體可以是2' -0-甲基修飾的RNA單體，帶下劃線的為2' -0-甲基修飾的RNA單體，“D"為DNA。上面一條鏈為正義鏈，下面一條鏈為反義鏈。在一個實施例中，所述DsiRNA 含如下結(jié)構5 ‘ -pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3' 3' -XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5'，其中，“X"為 RNA，“ ρ〃 為一個磷酸基團，“X"為2' -0-甲基RNA?！?D"為DNA。上面一條鏈為正義鏈，下面一條鏈為反義鏈。
在另一個實施例中，所述DsiRNA含如下結(jié)構5' -pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3‘ 3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5 ‘其中，“X"為 RNA，“ ρ〃 為一個磷酸基團，‘‘X"為2' -O-甲基RNA?！癥”表示的是一個含1-4個RNA單體的懸垂結(jié)構，任選地， 該RNA單體可以是2' -0-甲基修飾的RNA單體，帶下劃線的為2' -0-甲基修飾的RNA單體，“D"為DNA。上面一條鏈為正義鏈，下面一條鏈為反義鏈。在一個實施例中，所述DsiRNA 含如下結(jié)構5 ‘ -pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3' 3' -XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5'，其中，“X"為 RNA，“ ρ〃 為一個磷酸基團，“X"為2' -0-甲基RNA?！?D"為DNA。上面一條鏈為正義鏈，下面一條鏈為反義鏈。在另一個實施例中，所述DsiRNA含如下結(jié)構5' -pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3‘ 3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5 ‘其中，“X"為 RNA，“ ρ 〃 為一個磷酸基團，‘‘X"為2' -O-甲基RNA?！癥”表示的是一個含1-4個RNA單體的懸垂結(jié)構，任選地， 該RNA單體可以是2' -0-甲基修飾的RNA單體，帶下劃線的為2' -0-甲基修飾的RNA單體，“D"為DNA。上面一條鏈為正義鏈，下面一條鏈為反義鏈。在一個實施例中，所述DsiRNA 含如下結(jié)構5 ‘ -pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3' 3' -XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5'，其中，“X"為 RNA，“ ρ〃 為一個磷酸基團，“X"為2' -0-甲基RNA?！?D"為DNA。上面一條鏈為正義鏈，下面一條鏈為反義鏈。在進一步實施例中，所述DsiRNA含如下結(jié)構5 ‘ -pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3‘3' -YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5‘其中，“X"為 RNA，“ p〃 為一個磷酸基團，‘‘X"為2' -O-甲基RNA?！癥”表示的是一個含1-4個RNA單體的懸垂結(jié)構，任選地，該RNA單體可以是2' -0-甲基修飾的RNA單體，帶下劃線的為2' -0-甲基修飾的RNA 單體，“D"為DNA。上面一條鏈為正義鏈，下面一條鏈為反義鏈。在一個實施例中，所述DsiRNA 含如下結(jié)構5 ‘ -pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3' 3' -XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5'，其中，“X"為 RNA，“ ρ〃 為一個磷酸基團，“X"為2' -0-甲基RNA?！?D"為DNA。上面一條鏈為正義鏈，下面一條鏈為反義鏈。在另一個實例中，所述DsiRNA，含有相等長度的兩條鏈，含1_3個錯配的殘基可以確定Dicer酶的剪切方向。X特別的，在DsiRNA兩條寡核苷酸鏈退火時，第一寡核苷酸鏈從3’端第一位編號，第1，2，3位核苷酸有一個或者多個與第二寡核苷酸鏈5’端相應殘基形成堿基錯配)。一個典型的含有2個末端錯配堿基的27mer DsiRNA結(jié)構如下"M-3‘ 5 ‘ -pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX · Mr3' -XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXM% p-5‘其中，‘‘X"為RNA，‘‘ p〃為磷酸基團，‘‘M"為核酸殘基(RNA，DNA，或者非天然的或人工修飾的核酸)，在兩條鏈退火時與互補鏈中相對應的位置上的"M"殘基不互補(氫連接)。任何一個這樣DsiRNA的殘基能任選是2 ‘ -0-甲基RNA單體-2 ‘ -0-甲基 RNA單體的交替的位置，2' -0-甲基RNA單體起始于上式的下面一條鏈(第二鏈)的3' 端的殘基，其也能用于上述〃 blunt/fray" DsiRNA中。在一個實施例中，上面一條鏈(第一鏈)為正義鏈，下面一條鏈(第二鏈)為反義鏈。或者可選的，下面一條鏈為正義鏈，上面的鏈為反義鏈。本發(fā)明所涉及的，“DsiRNAmm〃指的是含有一個“錯配耐受區(qū)域”的DisRNA，該區(qū)域在反義鏈和正義鏈之間含有一個，兩個，三個或者4個錯配的堿基對，該堿基錯配位于 (因此不包括)DsiRNA任一端的末端的兩個堿基對之間。堿基錯配定位于“錯配耐受區(qū)域”內(nèi)，這個名字的來源與靶向目標基因而設計的 Ago2酶切位點相關。錯配耐受區(qū)域定位于靶標片段Ago2剪切位點上游。文中所述“上游” 可以理解為DsiRNAmm雙鏈5’大部分區(qū)域，其中5’指的是DsiRNA雙鏈的正義鏈起始位點。也就是說，錯配耐受區(qū)域位于正義鏈(passenger)上游相當于靶標核酸所設計的 Ago2剪切位點處(見圖14)?？蛇x的，如果是所述DsiRNAmm反義鏈(引導鏈)，錯配耐受區(qū)域也可指與靶標核酸上所設計的Ago2剪切位點互補的堿基下游區(qū)域，也即所述DsiRNAmm 反義鏈3’端大部分區(qū)域(反義鏈第一位核苷酸為反義鏈5’末端核苷酸，見圖20)。在一個實施例中，如圖33所示，錯配耐受區(qū)域位于從所述雙鏈核酸正義鏈5’端起始第3-9個堿基(含)之間。因此，本發(fā)明所述DsiRNAmm含有一個錯配堿基位于向右延長的DsiRNA正義鏈的第3，4，5，6，7，8，或者第9位核苷酸位點上(其中第一位為正義鏈的5’ 末端核苷酸，第9位核苷酸恰為正義鏈5’上所設計的與正義鏈相關的靶標RNA序列上Ago2 剪切位點處，在一個實施例中，DsiRNA正義鏈的第3，4，5，6，7，8，或者第9位核苷酸任何一個位點上含有一個錯配的堿基，與其想對應的反義鏈上錯配的堿基不僅與正義鏈上的對應位點堿基錯配，且與靶標RNA序列上相對應的位點處形成堿基錯配(也即在DsiRNAmm上，反義鏈序列和正義鏈序列的互補性被破壞，同樣的，反義鏈序列和靶標RNA序列的互補性也被破壞)。在一個可替代的實施例中，DsiRNAmm反義鏈上核苷酸與正義鏈上的核苷酸堿基形成錯配，但不與相關的靶標RNA上的相應位點上的核苷酸堿基形成錯配(也即在DsiRNAmm 上，反義鏈序列和正義鏈序列的互補性被破壞，而反義鏈序列和靶標RNA序列的互補性仍然保持)。如上所述在錯配耐受區(qū)域含有一個單獨的錯配堿基的DsiRNAmm(如在DsiRNAmm 正義鏈上第3，4，5，6，7，8或者第9位上任何一個位點上含有一個錯配的堿基)，進一步的可以含有1，2，或者甚至3個另外的錯配堿基。在一個優(yōu)選的實施例中，所述1，2，或者甚至3 個另外的錯配堿基可以發(fā)生在DsiRNAmm正義鏈的第3，4，5，6，7，8或者第9位點上(及在反義鏈相對應的殘基上)。在還有一個附加的錯配堿基的DsiRNAmm上，這2個錯配的堿基可以發(fā)生在，如正義鏈第4和第6位核苷酸上(及在反義鏈相應位置的核苷酸上發(fā)生堿基錯配)。所述含有2個錯配堿基的DsiRNAmm，錯配可以是連續(xù)的(如，在正義鏈核苷酸序列上連續(xù)的位點上)。另外，正義鏈上與反義鏈上堿基錯配的核苷酸也可以被與反義鏈上堿基互補的核苷酸間斷(如在DsiRNAmm正義鏈上第3位或第6位上含有與反義鏈上堿基錯配的核苷酸，而不是第4位和第5位，這樣正義鏈上第3位和第6位與反義鏈錯配的核苷酸殘基被2個互補核苷酸間隔)例如，正義鏈上2個與反義鏈上相對應位置錯配的殘基(位于錯配耐受區(qū)域)之間可以有1，2，3，4，或者5個堿基互補的核苷酸。所述含有3個錯配堿基的DsiRNAmm，錯配可以是連續(xù)的(如，在正義鏈核苷酸序列上連續(xù)的3個位點上)。另外，正義鏈上與反義鏈上堿基錯配的核苷酸也可以被與反義鏈上堿基互補的核苷酸間斷(如在DsiRNAmm正義鏈上第3位、第4位第8位上含有與反義鏈上堿基錯配的核苷酸，而不是第5位第6位和第7位，這樣正義鏈上第3位和第4位與反義鏈錯配的核苷酸殘基是毗鄰的，第4位和第8位與反義鏈錯配的核苷酸殘基被3個互補核苷酸間隔)。例如，正義鏈上3個與反義鏈上相對應位置錯配的殘基(位于正義鏈的錯配耐受區(qū)域)的任何2個錯配的堿基之間可以有0，1，2，3或者4個堿基互補的核苷酸。所述含有4個錯配堿基的DsiRNAmm，錯配可以是連續(xù)的(如，在正義鏈核苷酸序列上連續(xù)的4個位點上)。另外，正義鏈上與反義鏈上堿基錯配的核苷酸也可以被與反義鏈上堿基互補的核苷酸間斷(如在DsiRNAmm正義鏈上第3位、第5位，第7位和第8位上含有與反義鏈上堿基錯配的核苷酸，而不是第4位第6位和第7位，這樣正義鏈上第7位和第8位與反義鏈錯配的核苷酸殘基是毗鄰的，第3位和第5位與反義鏈錯配的核苷酸殘基被1個互補核苷酸間隔，第5位和第7位與反義鏈錯配的核苷酸殘基也被1個互補核苷酸間隔)。例如，正義鏈上4個與反義鏈上相對應位置錯配的殘基(位于錯配耐受區(qū)域)中任何2個錯配的堿基之間可以有0，1，2，3或者4個堿基互補的核苷酸。在另一個實施例中，如圖39中所示，本發(fā)明所述DsiRNAmm在向左延長的DsiRNA 反義鏈錯配耐受區(qū)域第13，14，15，16，17，18. 19. 20或者第21位(以反義鏈5’端第一個核苷酸為第1位，且反義鏈上第13位為與其充分互補的靶標RNA序列上設計的Ago23’端剪切位點)任何位點上含有一個錯配的堿基。在這樣的實施例中，DsiRNA反義鏈錯配耐受區(qū)域第13，14，15，16，17，18. 19. 20或者第21位核苷酸含有與正義鏈錯配的堿基，該錯配的堿基不僅與DsiRNAmm的正義鏈形成形成錯配，且與靶標RNA形成錯配(也即在DsiRNAmm上， 反義鏈序列和正義鏈序列的互補性被破壞，而反義鏈序列和靶標RNA序列的互補性也同樣被破壞)。如上所述在錯配耐受區(qū)域含有一個單獨的錯配堿基的DsiRNAmm(如在DsiRNAmm 反義鏈上第13，14，15，16，17，18. 19. 20或者第21位上任何一個位點上含有一個錯配的堿基)，進一步的可以含有1，2，或者甚至3個另外的錯配堿基。在一個優(yōu)先的實施例中，所述1，2，或者甚至3個另外的錯配堿基可以發(fā)生在DsiRNAmm反義鏈的第13，14，15，16，17， 18. 19. 20或者第21位點上(及在反義鏈相對應的殘基上)。在還有一個附加的錯配堿基的DsiRNAmm上，這2個錯配的堿基可以如發(fā)生在，如反義鏈第14和第18位核苷酸上(及在反義鏈相應位置的核苷酸上發(fā)生堿基錯配)。所述含有2個錯配堿基的DsiRNAmm，錯配可以是連續(xù)的(如，在反義鏈核苷酸序列上連續(xù)的位點上)。例如，反義鏈上2個與正義鏈上相對應位置錯配的殘基(位于錯配耐受區(qū)域)之間可以有0，1，2，3，4，5，6或者7個堿基互補的核苷酸。另外，反義鏈上與正義鏈上堿基錯配的核苷酸也可以被與正義鏈上堿基互補的核苷酸間斷(如在DsiRNAmm具有在第13位或第16位上錯配的核苷酸，而不是第14位和第15位，這樣反義鏈上第13位和第16位核苷酸被與正義鏈相應堿基配對的2個核苷酸間隔)。例如，反義鏈上2個與正義鏈上相對應位置錯配的殘基(位于正義鏈的錯配耐受區(qū)域內(nèi))之間可以有0，1，2，3，4，5，6 或者7個堿基互補的核苷酸。所述含有3個錯配堿基的DsiRNAmm，錯配可以是連續(xù)的(如， 在反義鏈核苷酸序列上連續(xù)的3個位點上)。另外，反義鏈上與正義鏈上堿基錯配的核苷酸也可以被與正義鏈上堿基互補的核苷酸間斷(如在DsiRNAmm反義鏈上第13位、第14位第18位上含有與正義鏈上堿基錯配的核苷酸，而不是第15位第16位和第17位，這樣反義鏈上第13位和第14位與正義鏈錯配的核苷酸殘基是毗鄰的，第14位和第18位核苷酸被 3個與正義鏈相應的堿基配對的核苷酸間隔)。例如，反義鏈上3個與正義鏈上相對應位置錯配的殘基(位于反義鏈的錯配耐受區(qū)域)任何2個錯配的堿基之間可以有0，1，2，3，4，5 或者6個堿基互補的核苷酸。所述含有4個錯配堿基的DsiRNAmm，錯配可以是連續(xù)的(如，在反義鏈核苷酸序列上連續(xù)的4個位點上)。另外，反義鏈上與正義鏈上堿基錯配的核苷酸也可以被與正義鏈上堿基互補的核苷酸間斷(如在DsiRNAmm反義鏈上第13位、第15位，第17位和第18位上含有與正義鏈上堿基錯配的核苷酸，而不是第14位和第16位，這樣反義鏈上第17位和第 18位與正義鏈錯配的核苷酸殘基彼此是毗鄰的，第13位和第15位被1個與正義鏈相應堿基配對的核苷酸間隔，同樣地，第15位和第17位被1個與正義鏈相應堿基配對的核苷酸間隔)。例如，反義鏈上4個與正義鏈上相對應位置錯配的殘基(位于反義鏈的錯配耐受區(qū)域內(nèi))任何2個錯配的堿基之間可以有0，1，2，3，4或，5個堿基互補的核苷酸。進一步的實施例中，如圖40中所示，本發(fā)明所述DsiRNAmm在向左延長的DsiRNA 反義鏈錯配耐受區(qū)域第11，12，13，14，15，16，17，18或者第19位(以反義鏈5’端第一個核苷酸為第1位，且反義鏈上第11位為與其充分互補的靶標RNA序列上設計的Ago2的緊鄰3’(下游)端剪切位點)中任何位點上含有一個錯配的堿基。在一個實施例中，相對于DsiRNAmm的正義鏈，DsiRNA反義鏈錯配耐受區(qū)域第11，12，13，14，15，16，17，18或者第 19位核苷酸含有與正義鏈錯配的堿基，該錯配的堿基不僅與DsiRNAmm的正義鏈形成形成錯配，且與DsiRNAmm靶標RNA形成錯配(也即在DsiRNAmm上，反義鏈序列和正義鏈序列的互補性被破壞，而反義鏈序列和靶標RNA序列的互補性也同樣被破壞)。在一個實施例中，所述DsiRNAmm反義鏈的錯配的核苷酸中，一個核苷酸不僅與DsiRNAmm正義鏈的相應的堿基形成錯配，然而這個反義鏈的錯配核苷酸還能與相應的靶標RNA堿基配對(也即在 DsiRNAmm內(nèi)，反義鏈序列和正義鏈序列的互補性被這個核苷酸破壞，而DsiRNAmm的反義鏈序列和靶標RNA序列的互補性得以保持)。如上所述在錯配耐受區(qū)域含有一個單獨的錯配堿基的DsiRNAmm(如在DsiRNAmm 反義鏈上第11，12，13，14，15，16，17，18或者第19位上任何一個位點上含有一個錯配的堿基)，進一步的可以含有1，2，或者甚至3個另外的錯配堿基對。在一個優(yōu)選的實施例中，所述1，2，或者甚至3個另外的錯配堿基可以發(fā)生在DsiRNAmm反義鏈的第11，12，13，14，15， 16，17，18和/或者第19位點上(和正義鏈相對應的殘基上)。在一個實施例中，在含有一個附加的錯配堿基的DsiRNAmm上，這2個錯配的堿基可以發(fā)生在，如反義鏈第14和第18 位核苷酸上(和正義鏈相應位置的核苷酸上也發(fā)生堿基錯配)。所述含有2個錯配堿基的DsiRNAmm，錯配可以是連續(xù)的(如，在反義鏈核苷酸序列上連續(xù)的位點上)。另外，與正義鏈上堿基錯配的反義鏈的核苷酸也可以被與正義鏈上堿基互補的核苷酸間斷(如在DsiRNAmm反義鏈上第12位或第15位上含有與正義鏈上堿基錯配的核苷酸，而不是第13位和第14位，這樣反義鏈上第12位和第15位被2個與正義鏈相應堿基配對的核苷酸間隔)。例如，反義鏈上2個與正義鏈上相對應位置錯配的殘基(位于正義鏈的錯配耐受區(qū)域)之間可以有0，1，2，3，4，5，6或者7個堿基互補的核苷酸。所述含有3個錯配堿基的DsiRNAmm，錯配可以是連續(xù)的(如，在反義鏈核苷酸序列上連續(xù)的3個位點上)。另外，與正義鏈上堿基錯配的反義鏈核苷酸也可以被與正義鏈上堿基互補的核苷酸間斷(如在DsiRNAmm反義鏈上第13位、第14位和第18位上含有與正義鏈上堿基錯配的核苷酸，而不是第15位第16位和第17位，這樣反義鏈上第13位和第 14位與正義鏈錯配的核苷酸殘基是彼此毗鄰的，第14位和第18位核苷酸被3個與正義鏈相應堿基配對的核苷酸間隔)。例如，反義鏈上3個與正義鏈上相對應位置錯配的殘基(位于反義鏈錯配耐受區(qū)域)任何2個錯配的堿基之間可以有0，1，2，3，4，5或者6個堿基互補的核苷酸。所述含有4個錯配堿基的DsiRNAmm，錯配可以是連續(xù)的(如，在反義鏈核苷酸序列上連續(xù)的4個位點上)。另外，與正義鏈上堿基錯配的反義鏈核苷酸也可以被于正義鏈上相應堿基互補的核苷酸間斷(如在DsiRNAmm反義鏈上第13位、第15位，第17位和第18位上含有與正義鏈上堿基錯配的核苷酸，而不是第14位和第16位，這樣反義鏈上第17位和第18位與正義鏈錯配的核苷酸殘基是毗鄰的，第13位和第15位核苷酸被1個與正義鏈相應堿基配對的核苷酸間隔，同樣地，第15位和第17位核苷酸被1個與正義鏈相應堿基配對的核苷酸間隔)。例如，反義鏈上4個與正義鏈上相對應位置錯配的殘基(位于反義鏈錯配耐受區(qū)域)任何2個錯配的堿基之間可以有0，1，2，3，4或者5個堿基互補的核苷酸。進一步的實施例中，如圖41中所示，本發(fā)明所述DsiRNAmm在向左延長的DsiRNA 反義鏈錯配耐受區(qū)域第15，16，17，18，19，20，21，22或者第23位(以反義鏈5’端第一個核苷酸為第1位，且反義鏈上第15位為與其完全互補的靶標RNA序列上設計的Ago23’(下游) 端剪切位點)任何位點上含有一個錯配的堿基。在一個實施例中，相對于DsiRNAmm的正義鏈，DsiRNA反義鏈錯配耐受區(qū)域第15，16，17，18，19，20，21，22或者第23位核苷酸含有與正義鏈錯配的堿基，該錯配的堿基不僅與DsiRNAmm的正義鏈形成形成錯配，且與DsiRNAmm 靶標RNA形成錯配(也即在DsiRNAmm上，反義鏈序列和正義鏈序列的互補性被破壞，而反義鏈序列和靶標RNA序列的互補性也同樣被破壞)。在一個實施例中，所述DsiRNAmm反義鏈的錯配的核苷酸中，一個核苷酸不僅與DsiRNAmm正義鏈的相應的堿基形成錯配，然而這個反義鏈的錯配核苷酸還能與相應的靶標RNA堿基配對(也即在DsiRNAmm內(nèi)，反義鏈序列和正義鏈序列的互補性被這個核苷酸破壞，而DsiRNAmm的反義鏈序列和靶標RNA序列的互補性得以保持)。如上所述在錯配耐受區(qū)域含有一個單獨的錯配堿基的DsiRNAmm(如在DsiRNAmm 反義鏈上第15，16，17，18，19，20，21，22或者第23位上任何一個位點上含有一個錯配的堿基)，進一步的可以含有1，2，或者甚至3個另外的錯配堿基對。在一個優(yōu)選的實施例中，所述1，2，或者甚至3個另外的錯配堿基可以發(fā)生在DsiRNAmm反義鏈的第15，16，17，18，19， 20，21，22和/或者第23位點上(和正義鏈相對應的殘基上)。在一個實施例中，含有一個附加的錯配堿基的DsiRNAmm上，這2個錯配的堿基可以發(fā)生在，如反義鏈第16和第20位核苷酸上(和正義鏈相應位置的核苷酸上發(fā)生堿基錯配)。所述含有2個錯配堿基的DsiRNAmm，錯配可以是連續(xù)的(如，在反義鏈核苷酸序列上連續(xù)的位點上)。另外，與正義鏈上堿基錯配的反義鏈核苷酸也可以被與正義鏈上堿基互補的核苷酸間斷(如在DsiRNAmm反義鏈上第16位或第20位上含有與正義鏈上堿基錯配的核苷酸，而不是第17位，第18位和第19位，這樣反義鏈上第16位和第20位核苷酸被 3個與正義鏈相應堿基配對的核苷酸間隔)。例如，反義鏈上2個與正義鏈上相對應位置錯配的殘基(位于錯配耐受區(qū)域)之間可以有0，1，2，3，4，5，6或者7個堿基互補的核苷酸。所述含有3個錯配堿基的DsiRNAmm，錯配可以是連續(xù)的(如，在反義鏈核苷酸序列上連續(xù)的3個位點上)。另外，反義鏈上與正義鏈上堿基錯配的核苷酸也可以被與正義鏈上堿基互補的核苷酸間斷(如在DsiRNAmm反義鏈上第16位、第17位和第21位上含有與正義鏈上堿基錯配的核苷酸，而不是第18位第19位和第20位，這樣反義鏈上第16位和第 17位與正義鏈錯配的核苷酸殘基是毗鄰的，第17位和第21位核苷酸被3個與正義鏈相應堿基配對的核苷酸間隔)。例如，反義鏈上3個與正義鏈上相對應位置錯配的殘基(位于錯配耐受區(qū)域)任何2個錯配的堿基之間可以有0，1，2，3，4，5或者6個堿基互補的核苷酸。所述含有4個錯配堿基的DsiRNAmm，錯配可以是連續(xù)的(如，在反義鏈核苷酸序列上連續(xù)的4個位點上)。另外，與正義鏈上堿基錯配的反義鏈核苷酸也可以被與正義鏈上堿基互補的核苷酸間斷(如在DsiRNAmm反義鏈上第17位、第19位，第21位和第22位上含有與正義鏈上堿基錯配的核苷酸，而不是第18位和第20位，這樣反義鏈上第21位和第22 位與正義鏈錯配的核苷酸殘基是毗鄰的，第17位和第19位核苷酸被1個與正義鏈相應堿基配對的核苷酸間隔，同樣地，第19位和第21位核苷酸被1個與正義鏈相應堿基配對的核苷酸間隔)。例如，反義鏈上4個與反義鏈上相對應位置錯配的殘基(位于錯配耐受區(qū)域)任何2個錯配的堿基之間可以有0，1，2，3，4或者5個堿基互補的核苷酸。為了表述清楚，以上所述DsiRNAmm中堿基錯配的核苷酸殘基的位點是按所述 DsiRNAmm正義鏈或者反義鏈5’端開始編號。圖20，21，22中不同的向左延長的DsiRNAmm 為例，位于反義鏈的錯配耐受區(qū)域(錯配區(qū)域)的堿基位置標號能根據(jù)反義鏈5'端附近的設計的Ago2酶切位點的改變而改變。因此，無論是反義鏈還是正義鏈上的錯配堿基的優(yōu)選位點是可以盡可能在所設計的Ago2剪切位點附近。相應的，在一個優(yōu)選實施例中，一個DsiRNAmm中正義鏈上的錯配的核苷酸的位置正好是正義鏈上所設計的對應的靶標RNA序列的Ago2剪切位點的5’ (上游) 附近。另一個優(yōu)選實施例中，一個DsiRNAmm中正義鏈上的錯配的核苷酸位于正義鏈上所設計的Ago2剪切位點5'(上游)2個核苷酸處，正義鏈上所設計的Ago2剪切位點5’(上游)3個核苷酸處，正義鏈上所設計的Ago2剪切位點5 ’(上游)4個核苷酸處，正義鏈上所設計的Ago2剪切位點5’(上游)5個核苷酸處，正義鏈上所設計的Ago2剪切位點5’端(上游)6個核苷酸處，正義鏈上所設計的Ago2剪切位點5’(上游)7個核苷酸處，正義鏈上所設計的Ago2剪切位點5’端(上游)8個核苷酸處，或者正義鏈上所設計的Ago2剪切位點 5’端(上游)9個核苷酸處，典型的含一個錯配堿基的25/27mer的DsiRNAs(DsiRNAmm)包括如下所示結(jié)構 (這種含錯配的結(jié)構也可能包含在其他典型的DsiRNA結(jié)構中)。5 ‘ -PXX1 “ XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3 ‘
3'-XXXXNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-S
5'-pXXXMXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3‘
3'-XXXXXr ·0 ΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧρ
5'-PXXXX1 "XXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-S ‘
3'-XXXXXXNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-S
5'-PXXXXX1 "XXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-XXXXXXXNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-S
5'-pXXXXXXMXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-XXXXXXXXNXXXXXXXXXXXXXXXXXXP-S
5'-PXXXXXXXnXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-XXXXXXXXXMXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5
5'-PXXXXXXXX1 "XXXXXXXXXXXXXXDD-3'
3'-XXXXXXXXXXNXXXXXXXXXXXXXXXXP-S
其中，“X"為 RNA，“ D"為 DNA，“
P^為磷酸基團，“M"為雙鏈退火時與互補鏈上對應的"M"為核苷酸殘基不互補核苷酸殘基(RNA，DNA，或者非天然的或修飾過的核苷酸)。任選地，上述任何一個殘基可為2' -0-甲基RNA單體-或者起始于底下一條鏈(第二寡核苷酸鏈)3’端殘基的定位的2' -0-甲基RNA單體，如上所述，可以用于上述 DsiRNAmm。如上所述錯配的DsiRNAmm結(jié)構，上面一條鏈為正義鏈，下面的鏈為反義鏈。
在一個實施例中，本發(fā)明所述DsiRNA含有的錯配可以是與靶標RNA序列形成的錯配，而不是所述DsiRNA的兩條寡核苷酸鏈之間形成錯配-這樣，所述DsiRNA的第一寡核苷酸鏈與第二寡核苷酸鏈之間具有完美的互補性，而保持與靶標RNA之間的錯配(這樣，在一些實施例中，在促進高效和/或者效力和/或者持久性具有優(yōu)勢)。在一個實施例中，在反義鏈和靶標RNA之間形成堿基錯配，錯配堿基位于反義鏈上，該錯配堿基對應的是所設計的Ago2剪切位點的正義鏈5’端。例如，朝向于反義鏈3'的、位于反義鏈內(nèi)的殘基互補與目的序列的所設計的Ago2剪切位點這種區(qū)域如圖33所示的“錯配區(qū)域”，與設計的種子區(qū)域(“seed region”)完全不同)。
典型的含有一個與靶標序列錯配堿基的25/27mer DsiRNAs含有如下優(yōu)選結(jié)構。 靶標 RNA 序列5 ‘ -. . XAXXXXXXXXXXXXXXXXXXX. . . -3' DsiRNAmm 正義鏈序列5 ‘ -pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3 ‘ DsiRNAmm 反義鏈序列3 ‘ -XEXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5 ‘
靶標RNA序列5'-DsiRNAmm 正義鏈5' DsiRNAmm 反義鏈3' 靶標RNA序列5'-DsiRNAmm 正義鏈5' DsiRNAmm 反義鏈3' 靶標RNA序列5'-DsiRNAmm 正義鏈5' DsiRNAmm 反義鏈3'
.Axxxxxxxxxxxxxxxxxxxx. . . -3‘ -pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3‘ -EXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5' .XAXXXXXXXXXXXXXXXXXXX. . . -3' -pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3‘ -XEXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5‘ ..AXXXXXXXXXXXXXXXXXX. . . -3' -pBXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3‘ -XXEXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5'
靶標RNA序列5'- · XAXXXXXXXXXXXXXXXXX. . . -3'
DsiRNAmm正義鏈5'-pXBXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3
DsiRNAmm反義鏈3'-XXXEXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp--5'
靶標RNA序列5'- · XXAXXXXXXXXXXXXXXXX. . . -3'
DsiRNAmm正義鏈5'-pXXBXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3
DsiRNAmm反義鏈3'-XXXXEXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp--5'
靶標RNA序列5'- · XXXAXXXXXXXXXXXXXXX. . . -3'
DsiRNAmm正義鏈5'-pXXXBXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3
DsiRNAmm反義鏈3'-XXXXXEXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp--5'
靶標RNA序列5'- · XXXXAXXXXXXXXXXXXXX. . . -3'
DsiRNAmm反義鏈5'-pXXXXBXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3
DsiRNAmm正義鏈3'-XXXXXXEXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp--5'
靶標RNA序列5'- ·XXXXXAXXXXXXXXXXXXX. . . -3'
DsiRNAmm正義鏈:51--pXXXXXBXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3'
DsiRNAmm反義鏈3'-XXXXXXXEXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp--5'
靶標RNA序列5'- ·XXXXXXAXXXXXXXXXXXX. . . -3'
DsiRNAmm正義鏈5'-pXXXXXXBXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3
DsiRNAmm反義鏈3'-XXXXXXXXEXXXXXXXXXXXXXXXXXXp--5'
靶標RNA序列5'- · XXXXXXXAXXXXXXXXXXX. . . -3'
DsiRNAmm正義鏈5'-pXXXXXXXBXXXXXXXXXXXXXXXDD-3
DsiRNAmm反義鏈3'-XXXXXXXXXEXXXXXXXXXXXXXXXXXp--5'
靶標RNA序列5'- ·XXXXXXXXAXXXXXXXXXX. . . -3'
DsiRNAmm正義鏈5'-pXXXXXXXXBXXXXXXXXXXXXXXDD-3
DsiRNAmm反義鏈3'-XXXXXXXXXXEXXXXXXXXXXXXXXXXp--5'
其中，‘‘X"為RNA，“D〃為DNA，" p〃為一個磷酸基團，
“E"為當退火時
與互補的鏈(目標鏈)中RNA殘基“A”不配對的核苷酸殘基(RNA，DNA或者非天然的或許修飾的核苷酸)，任意的，也不與相應位點的"B"殘基(”B"殘基也為RNA，DNA，或者非天然或修飾的核苷酸殘基)堿基配對。上述任何一個殘基可以是2’ -0-甲基RNA單體，如起始于DsiRNA底下一條鏈3’末端殘基交替的2’ -0甲基RNA單體，如上所述，或者其他2’ -0 甲基核苷酸和/或者其他修飾核苷酸也可以用在下一條鏈上。除了以上所述的典型結(jié)構，所述DsiRNA還可以含有附加的1，2，或者3個殘基與靶標RNA序列錯配。這種錯配可以是連續(xù)的，也可以被形成互補的堿基對間隔。如果被互補的堿基所間隔，錯配的殘基與另一個錯配的參加之間可以有0，1，2，3，4，5，6，7，或者甚至8 個堿基互補的核苷酸.如上述DsiRNAmnuDsiRNA的反義鏈中與靶標RNA形成堿基錯配的核苷酸(可以與正義鏈相對應的位置形成或不形成錯配)優(yōu)選的位置為與DsiRNA中所設計的Ago2剪切位點互補的反義鏈3’(下游)區(qū)域內(nèi)(如圖39所示，反義鏈中標記為“錯配區(qū)域”的區(qū)域是優(yōu)選的形成堿基錯配的區(qū)域，且正好是反義鏈中13-21位處)。因此，在一個優(yōu)選的實施例中，DsiRNAmm的反義鏈上與靶標RNA序列形成錯配的核苷酸正好位于根據(jù)靶標RNA序列所設計的Ago2剪切位點、反義鏈的3’(下游)附近。在另一個優(yōu)選實施例中，DsiRNAmm的反義鏈上與靶標RNA序列形成錯配的核苷酸位于反義鏈上相應的所設計的Ago2剪切位點的3’(下游)2個核苷酸處，或相應的所設計的Ago2剪切位點的3’(下游)3個核苷酸處，或相應的所設計的Ago2剪切位點的3’(下游)4個核苷酸處，或相應的所設計的Ago2剪切位點的3’ (下游)5個核苷酸處，或相應的所設計的Ago2剪切位點的3’ (下游)6個核苷酸處，或相應的所設計的Ago2剪切位點的 3’(下游)7個核苷酸處，或相應的所設計的Ago2剪切位點的3’(下游)8個核苷酸處，或相應的所設計的Ago2剪切位點的3’ (下游)9個核苷酸處。所述DsiRNAmm反義鏈上含有2個堿基錯配(與靶標RNA序列形成的堿基錯配) 可以是連續(xù)的(如，在反義鏈核苷酸序列上連續(xù)的位點上)。另外，反義鏈上與靶標RNA序列上的堿基錯配的核苷酸也可以被反義鏈與靶標RNA序列上堿基互補的核苷酸間斷(如在 DsiRNAmm反義鏈上第13位或第16位上含有與靶標RNA序列上堿基錯配的核苷酸，如圖39 所示，而不是第14位和第15位，這樣反義鏈上第13位和第16位與靶標RNA序列錯配的核苷酸殘基被2個與靶標RNA堿基互補的核苷酸間隔)。例如，反義鏈上2個與靶標RNA序列上相對應位置形成錯配的殘基(位于反義鏈錯配耐受區(qū)域)之間可以有0，1，2，3，4或者5 個堿基互補(與靶標RNA序列)的核苷酸。所述DsiRNAmm反義鏈上含有3個堿基錯配(與靶標RNA序列形成的堿基錯配) 可以是連續(xù)的(如，在反義鏈核苷酸序列上連續(xù)的位點上)。另外，反義鏈上與靶標RNA序列上的堿基錯配的核苷酸也可以被反義鏈與靶標RNA序列上堿基互補的核苷酸間斷(如在 DsiRNAmm反義鏈上第13位，第14位或第18位上含有與靶標RNA序列上堿基錯配的核苷酸，而不是第15位，第16位和第17位，這樣反義鏈上第13位和第14位形成的堿基錯配是毗鄰的，第14位和第18位與靶標RNA序列錯配的核苷酸殘基被3個與靶標RNA堿基互補的核苷酸間隔)。例如，反義鏈上3個與靶標RNA序列上相對應位置形成錯配的殘基(位于反義鏈錯配耐受區(qū)域)任何2個之間可以有0，1，2，3，4或者5個堿基互補的核苷酸。所述DsiRNAmm反義鏈上含有4個堿基錯配(與靶標RNA序列形成的堿基錯配) 可以是連續(xù)的(如，在反義鏈核苷酸序列上連續(xù)的位點上)。另外，反義鏈上與靶標RNA序列上的堿基錯配的核苷酸也可以被反義鏈與靶標RNA序列上堿基互補的核苷酸間斷(如在 DsiRNAmm反義鏈上第13位，第15位，第17位或第18位上含有與靶標RNA序列上堿基錯配的核苷酸，而不是第14位和第16位，這樣反義鏈上第17位和第18位形成的堿基錯配是毗鄰的，反義鏈上第13位和第15位與靶標RNA序列錯配的核苷酸殘基被1個與靶標RNA堿基互補的核苷酸間隔，同樣的，反義鏈上第15位和第17位與靶標RNA序列錯配的核苷酸殘基被1個與靶標RNA堿基互補的核苷酸間隔)。例如，反義鏈上4個與靶標RNA序列上相對應位置形成錯配的殘基(位于反義鏈錯配耐受區(qū)域)任何2個之間可以有0，1，2或者3個堿基互補的核苷酸。上述DsiRNAmm和其他DsiRNA的結(jié)構描述，是為了舉例說明DsiRNAmm和DsiRNA 的某些結(jié)構。上述DsiRNAmm和DsiRNA結(jié)構設計，可用來生產(chǎn)諸如DNA延長的(“DNA”把手)DsiRNA形式的DsiRNAmm(包括如圖14-16和20-22所示含錯配的DsiRNAmm)。如上所述，DsiRNAs也可以設計為僅在所述DsiRNA的反義鏈和靶標序列之間含單個堿基錯配(或者2，3，或者4個錯配)，而任選地，正義鏈與反義鏈序列之間保持完好的互補性。
本發(fā)明進一步闡釋了所述DsiRNA在其雙鏈和/或者與靶標RNA結(jié)合片段中可含有插入/缺失(in/del)結(jié)構。相應的，在本發(fā)明所述DsiRNAs中可不同位置設計含有in/ del結(jié)構，如與靶標RNA序列相比的反義鏈序列，和/或者與正義鏈相比的反義鏈序列，且在比錯配和/或者形成錯配的堿基對位點更優(yōu)選的位置替代所插入/缺失的核苷酸。在某個實施例中，上述任一結(jié)構中的〃 D"殘基包括至少一個PS-DNA或者 PS-RNA0任選地，上述任一結(jié)構中的〃 D"殘基包括至少一個修飾的核苷酸可以抑制Dicer 酶剪切。上述描述的“DNA延長” DsiRNA可以分為“向左延長”或“向右延長”的DsiRNA， DsiRNA的某一條寡核苷酸鏈同時含有“向左”和“向右”延長的DNA序列(如圍繞一個核心的dsRNA結(jié)構的兩個側(cè)翼的dsDNA)這樣的結(jié)構也可以產(chǎn)生并以類似于“向左延長”或“向右延長”的方式應用。進一步的，在一些實施例中，本發(fā)明的DsiRNA含有一個連接基團或者結(jié)構域?qū)?DNAiDNA-延長的DsiRNA的正義鏈和反義鏈連接。任選地，這種連接結(jié)構域連接正義鏈的 3'端和反義鏈的5'端。該連接基團可以是化學(無核苷酸)連接，例如多聚2羥基甲烷， 寡甘醇(oligoethylene glycol)，或者其他的公認的連接基團。或者，該連接基團可以是核苷酸連接，任意的，包含一個延長的loop結(jié)構和/或者四核苷酸環(huán)結(jié)構。在一個實施例中，所述DsiRNA含有一個不對稱的結(jié)構，即正義鏈含有27個堿基長度，反義鏈含有四個核苷酸，其中形成2個堿基的3’端懸垂結(jié)構(并且，因此，所述DsiRNA 在正義鏈3’端或在反義鏈5’端形成形成鈍性末端)，在正義鏈的第M位和25位為脫氧核糖核苷酸(從正義鏈5’端第一個核苷酸開始標號)且每個堿基都與反義鏈上的脫氧核糖核苷酸堿基配對。進一步的實施例中，所述DsiRNA含有一個不對稱的結(jié)構，其在正義鏈的 3’端還有2個脫氧核糖核苷酸。在另一個實施例中，所述DsiRNA還有一個不對稱的結(jié)構，其中正義鏈還有30個核苷酸，反義鏈還有28個核苷酸，在正義鏈的3’端還有2個核苷酸的3’懸垂結(jié)構。反義鏈的 3’端和正義鏈的5’端形成鈍性末端，從正義鏈的5’端開始第1-5個核苷酸為脫氧核糖核苷酸，并與反義鏈3’端的同源脫氧核苷酸在雜交時可形成互補。任選地，在反義鏈與正義鏈退火時或與靶標RNA退火時，從反義鏈的5’端第一位核苷酸開始第11-21位核苷酸(在某些實施例中，第13位-第21位)含有一個或多個核苷酸與正義鏈相對應的核苷酸形成錯誤的堿基配對，或者與靶標RNA序列相對應的位置形成錯配的堿基配對。任選地，正義鏈 5’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基與反義鏈3’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基含有一個或多個硫代磷酸化修飾(任選地，反義鏈上的這2個核苷酸為脫氧核糖核苷酸，正義鏈上的這2個核苷酸為脫氧核糖核苷酸，或者組成正義鏈5’末端和反義鏈3’ 末端這4個脫氧核糖核苷酸含有硫代磷酸基)。DsiRNAs 的修飾一個抑制雙鏈RNA(" dsRNAs ”)分子效果的主要因素是核酸酶對所述 dsRNAs (如siRNAs和DsiRNAs)的降解。3’外切酶是血清中重要的核酸酶，且反義DNA多聚核苷酸的3’修飾對于阻止降解是非常重要的(Eder等，1991)。一個RNA酶T家族的核酸酶最近被發(fā)現(xiàn)并命名為ERI-I，其具有3’ -5’外切酶活性，參與了 siRNAs的調(diào)控和降解(Kennedy等，2004 ;Hong等，2005).該基因在小鼠中也存在，為Hiexl (NM 02067)和人類中為THEXl (匪153332)。該核酸酶也參與siRNAs 3，懸垂結(jié)構的降解，但不降解雙鏈 RNA (Yang 等，2006).XRNl (匪019001)是位于細胞質(zhì)處理小體的5' -3'核酸外切酶，參與miRNA靶向的mRNA降解(Retiwinkel et al.，2005)，且也可能負責完成起始于內(nèi)部siRNA引起的降解。XRN2(匪012255)是個獨特的5' -3'核酸外切酶，參與核糖體RNA的加工。盡管目前沒有報道這兩者參與siRNA和miRNA的降解和加工，但他們可以降解RNAs，所以也可能是重要的考慮因素。RNA酶A是哺乳動物中重要的降解RNA的核苷酸酶。它對于ssRNA特別重要，在3’ 末端進行嘧啶堿基的剪切。RNA酶A對SiRNA的降解產(chǎn)物可以在血清中孵育后通過質(zhì)譜鑒定(Turner等，2007). SiRNAs的3’懸垂結(jié)構增加了 siRNA對RNA酶的易感性。血清中RNA 酶A的消耗降低了 siRNAs的降解，這種降解顯示出一定的序列優(yōu)選性，且在序列末端還有多聚A或U序列的更甚(Haupenthal等，2006).這可能意外著降低雙鏈核酸的穩(wěn)定性序列的可能性存在可能，并且提供轉(zhuǎn)錄單鏈的轉(zhuǎn)錄本而被RNA酶降解。RNA酶A抑制劑可以加入到血清中以提高siRNA的壽命和持久性(Haupenthal等，2007).在21個堿基對的雙鏈核酸，硫代磷酸化或者boranophosphate修飾直接穩(wěn)定核苷酸之間的磷酸化連接。Boranophosphate修飾的RNAs具有高的核苷酸酶耐性，有力的沉默抑制劑，且相對無毒。Boranophosphate修飾的RNAs不能使用標準的化學合成方法制造的， 而是通過體外轉(zhuǎn)錄而成(IVT) (Hall等，2004 ；Hall等，2006).硫代磷酸化修飾(PQ可以隨時在一個RNA雙鏈的任何需要的位置產(chǎn)生，可使用標準的化學方法合成，雖然在一個RNA雙鏈上能夠進行這樣的修飾，但其保留RNA沉默的活性是有限的。如圖2所示，雙鏈8含有串聯(lián)的多個PS-修飾的脫氧核糖核苷酸殘基與另一個同源的串聯(lián)的多個PS修飾的脫氧核糖核苷酸配對，將失去RNA沉默活性，而僅剩下的沒有修飾的脫氧核糖核苷酸具有該活性。由于雙鏈RNA中的PS基團需要更多的空間，為了保留RNA的一直活性，以上所述延長的DsiRNAs能夠提供一種方式，比其他沒有延長的單鏈DsiRNA上含有更多的PS修飾。然而，需要強調(diào)的是，PS修飾顯示出一定的劑量相關的毒性，因此，多數(shù)研究者建議siRNAs中采用PS的限制，歷史上保護3'端不被核酸酶降解是最重要的(Harborth等， 2003 ；Chiu 和 Rana，2003 ；Braasch 等，2003 ；Amarzguioui 等.，2003).更多的 PS 修飾就可以具有強大的RNAi活性，但是糖類修飾(如2' -0-甲基RNA)更優(yōu)越(Choimg等，2006). 在核糖的2’位置可以被多種基團替換，這樣通常能增加雙鏈的穩(wěn)定性(Tm)，且能提高雙鏈對核酸酶的耐受性。2’ -0甲基修飾的RNA是再哺乳動物細胞中核糖體RNA和轉(zhuǎn)運RNA中發(fā)現(xiàn)的天然的修飾。siRNA核酸雙鏈中的精確定位的的2’ -0-甲基修飾對于核酸雙鏈保持藥性非常重要，并且完全替代為2' -0-甲基RNA的RNA使siRNA失活。如采用交替的 2’ -0-甲基修飾堿基的RNA與未修飾的RNA具有同等效力，且在血清中相當穩(wěn)定(Choimg 等，2006 ；Czaudema 等，2003)。2'-氟O ‘ -F)的修飾對于dsRNA(如siRNA和DsiRNA)的功能也是可行的； 該修飾普遍應用于嘧啶堿基上，可與2' -0-甲基修飾同時使用。2' -F嘌呤是可用的，也可以用。在體外，雙鏈核酸的大量的這種修飾可以強有力的觸發(fā)RNAUAllerson等，2005 ； Prakash等，2005 ；Kraynack和Baker，2006)并能在體內(nèi)使用時提高性能和延長作用時間(Morrissey 等·，2005a ；Morrissey 等·，2005b).。Allerson 曾報導過平末端的 19 堿基對的含有交替的2'-F)的修飾和2' -0-甲基修飾雙鏈核酸具有高效性能，對核酸
酶穩(wěn)定。該設計中，與Czauderna采用的模式一樣，2' _0_甲基修飾殘基交替出現(xiàn)，間隔的 RNA殘基則為2' -F修飾。Morrissey在體內(nèi)采用了一種高效的，耐核酸酶的siRNA。除了 2' -O-甲基修飾和2' -F修飾，所述雙鏈，包括DNA和RNA，反向殘基(inverted abasic residues)，和3’末端PS核苷酸之間連接。盡管這些改良的修飾具有很多優(yōu)點，但是這種雙鏈核酸的修飾還是需要限制，這樣可以提高在體內(nèi)的性能，既簡單，制造成本更低。 Soutschek等Q004)在體內(nèi)采用一種雙鏈，含有2個2' -O-甲基修飾殘RNA堿基和有限的3'-末端PS核苷酸之間的連接。鎖定核苷酸(LNAs)是一種不同的2’位修飾，可以用來穩(wěn)定dsRNA (如siRNA和 DsiRNA).保持藥效的LNA采用比2' -O-甲基修飾和2' -F修飾更受限制，所以有限使用修飾更好(Braasch 等.，2003 ；GrunweIler e 等，2003 ；Elmen 等，2005).盡管使用受限，但是LNA修飾的使用可以提高dsRNA在體內(nèi)的性能，并且可能改變或改善靶標效果(Mook等， 2007).合成的核苷酸導入到細胞或者活的動物體內(nèi)會被當做“外來物”而引起免疫反應。 免疫刺激構成了主要脫靶效應，這樣能顯著改變實驗結(jié)果甚至導致細胞死亡。先天免疫系統(tǒng)包括受體分子的集合，該受體分子與介導反應的DNA和RNA直接相關，這些受體分子有些定位于細胞質(zhì)，有些定位于內(nèi)質(zhì)體(Marques和Williams，2005 fchlee等，2006)。不管是體內(nèi)還是體外，無論是通過陽離子脂質(zhì)還是脂質(zhì)體將siRNA輸送到細胞質(zhì)還是內(nèi)質(zhì)體，都最大程度的面臨激發(fā)1型(IFN)干擾反應的風險(Morrissey等，200 ； Sioud 和 Sorensen，2003 ；Sioud, 2005 ；Ma 等，2005) ·。RNAs在細胞體內(nèi)轉(zhuǎn)錄具較少的免疫原性(RcAbins等.，2006)，人工合成的RNAs 當通過脂質(zhì)-為基礎的方法導入到細胞具免疫原性，當通過機械方法導入到細胞時能逃脫免疫刺激(Heidel等，2004).但是脂質(zhì)為基的導入方法方便，高效，使用廣泛。一些普遍性的策略，以防止免疫反應是必要的，特別是在體內(nèi)的應用，所有類型的細胞都有，產(chǎn)生免疫反應的風險也就最高。雖然某些序列比其他序列顯然具有更高的免疫原性，但一般的先天免疫系統(tǒng)的受體只區(qū)分某些堿基修飾的存在或不存在，這些堿基修飾在哺乳動物的RNAs存在比在原核細胞中的RNAs更廣泛。如，假尿苷，N6-甲基-腺嘌呤和2 ‘ -0-甲基修飾的堿基，被識別為“自身的修飾”并且合成的RNA中含有這些殘基可以幫助逃避免疫識別(Kariko等，200 .序列大規(guī)模的2’修飾像未修飾的RNA—樣，當靜脈注射小鼠時會引起劇烈的免疫刺激(Morrissey 等，2005b).然而，大規(guī)模的修飾并不需要逃避免疫檢測和在一個siRNA的雙鏈的單鏈中僅僅兩個2' -0-甲基替代修飾，足以在體外和體內(nèi)都可以阻止1型干擾反應；修飾的U和G 堿基活性最大(Judge等，2006).作為附加的效益，選擇性的采用2' -0-甲基修飾的堿基可以減少脫靶反應(Jackson等.，2006)。因此，使用2' _0_甲基修飾的堿基被認為是可以在體內(nèi)廣泛使用以消除免疫反應的方法，并且能提高核苷酸的穩(wěn)定性，降低可能的脫敏效應。盡管免疫刺激可以引起細胞死亡，對于用來監(jiān)視IFN誘導反應，評估一個細胞的活力不是一個適當?shù)姆椒āFN反應發(fā)生時可以不引起細胞死亡，細胞死亡可以是在不引起 IFN反應時而靶標基因的敲除而產(chǎn)生(如，如果靶標基因?qū)毎钚允潜仨毜?。相關的細胞因子可以直接在培養(yǎng)基中測定，各種常規(guī)檢測都有商品化的試劑盒存在。而一系列的不同免疫因子都可以檢測，在轉(zhuǎn)化以后4和M小時檢測IFN-a，TNF_a和 IL-6的水平，就足以滿足檢測目的的需要。由于陽離子脂質(zhì)在無任何核苷酸存在時即可引起細胞中免疫反應，所以設置一個“轉(zhuǎn)染試劑對照”是非常重要的。對所有細胞培養(yǎng)工作都需設置INF誘導途徑的對照，只要堿基修飾不妨礙所述DsiRNA作為Dicer的底物，本發(fā)明所述DsiRNA就可以含有堿基修飾。事實上，本發(fā)明驚人的發(fā)現(xiàn)，是堿基配對的脫氧核糖核苷酸可以連接到前人所述DsiRNA分子上，可以增強RNA干擾效應和持久性，這種延長的DsiRNA分子延長區(qū)域不干擾Dicer酶的加工(如，Dicer酶切割正義鏈的3’端或反義鏈的5’端)。在一個實施例中，一個或多個殘基修飾可以增強Dicer酶加工所述DsiRNA。在第二個實施例中，一個或多個殘基修飾可以導致更多的RNAi產(chǎn)生。在第三個實施例中，一個或多個堿基修飾可以增強 RNA干擾效應。在第四個實施例中，一個或多個堿基修飾可以可以導致每條DsiRNA分子更有效力地進入到細胞。堿基修飾可以發(fā)生在3’末端，5’末端區(qū)域，或者同時在3’末端和 5’末端區(qū)域，或在某些情況下，在序列中的不同位置。根據(jù)上面提到的限制措施，任何堿基修飾的數(shù)目和組合都可以應用到所述DsiRNA。在應用多個堿基修飾時，可以是一樣的修飾也可以是不一樣的修飾。修飾可以發(fā)生在堿基上，糖基上，或者磷酸骨架上，或者他們的綜合使用。5’末端可以磷酸化。所涉及的磷酸骨架修飾的例子，包括膦酸鹽的修飾，包括甲基磷酸，硫代磷酸，以及磷酸三酯修飾，例如alkylphosphotriesters及相似修飾。所涉及的糖基修飾的例子， 包括2'-烷基嘧啶，如2' -0-甲基，2'-氟，氨基，以及脫氧修飾及類似修飾(參見 Amarzguioui等，2003)。所涉及的堿基修飾，例如可以采用的修飾包括abasic sugars, 2-0-烷基嘧啶(2-0-alkyl modified pyrimidines)，4-硫脲嘧啶 0-thiouracil)，5-嗅尿嘧啶(5-bromouracil)，5_ 碘尿嘧啶和 5-(3-胺基)-尿嘧啶(5-(3-aminoallyl)-uracil) 修飾及類似修飾。核苷酸鎖定，或者說LNA’ S，也可以采用。許多其他已知修飾只要符合上述標準都可以采用。核苷酸修飾的例子在專利U. S. Pat. Nos. 5, 684, 143, 5, 858, 988and6, 291, 438 and in U. S. published patent application No. 2004/0203145 中游詳盡敘述。其他修飾可見文獻 Herdewi jn (2000)，Eckstein (2000)， Rusckowski 等· (2000)，Stein 等· (2001) ；Vorobjev 等· (2001).一個或多個核苷酸修飾可以應用到任何一條鏈中。所述DsiRNA中的修飾替代能很大地影響所述DsiRNA的性質(zhì)，包括賦以更強的藥效和穩(wěn)定性，降低毒性，增強Dicer 酶加工，減少免疫反應。在一個實施例中，反義鏈或者正義鏈或者2條鏈含有一個或多個 2’ -0-甲基修飾的核苷酸。在另一個實施例中，反義鏈含有2’ -0-甲基修飾的核苷酸。在另一個實施例中，反義鏈3’懸垂結(jié)構中含有2’-0_甲基修飾的核苷酸。該反義鏈還可以包括另外的2’ -0-甲基修飾的核苷酸。在本發(fā)明的某些實施例中，所述DsiRNA有一個或多個特性，可以增強Dicer酶對其的加工。在這個實施例中，所述DsiRNA具有足夠的長度，這樣經(jīng)過Dicer酶的加工，產(chǎn)生一個有活性的siRNA。所述DsiRNA必須具有下列特性的至少一條(1)所述DsiRNA是不對稱的，如，在反義鏈上含有3’懸垂結(jié)構；(2)所述DsiRNA的正義鏈還有修飾的3’末端以指導Dicer酶結(jié)合定位和加工雙鏈RNA區(qū)域以產(chǎn)生有活性的siRNA。在某個實施例中，正義鏈上某段區(qū)域里含一個或多個堿基配對的脫氧核糖核苷酸，該區(qū)域是設計的Dicer酶剪切處的3’處，且其在反義鏈上相對應的區(qū)域為Dicer酶在反義鏈上的5’剪切處，該區(qū)域還可以兼具適當?shù)闹笇icer酶剪切起始的作用。在某個實施例中，雙鏈DNA的長度(或者含有DNA:DNA堿基配對的區(qū)域的長度) 為1-50個堿基對，任選地，2-30個堿基對，優(yōu)選2-20個堿基對，更優(yōu)選2_15個堿基對。因此，一個本發(fā)明所述的DNA:DNA延長的DsiRNA含有的dsDNA區(qū)域長度可以是1，2，3，4，5， 6,7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32， 33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50 或者更多(如 51，52，53，54， 55，56，57，58，59，60或者更多)個堿基對。在某些實施例中，所述dsNA最長的鏈含有四-43個核苷酸。在一個實施例中，所述 DsiRNA是不對稱的，這樣正義鏈3’末端和反義鏈的5’末端形成鈍性末端，反義鏈的3’末端和正義鏈的5’末端形成懸垂結(jié)構。在某個實施例中，所述反義鏈3’懸垂結(jié)構含有1-10 個核苷酸，任選地為1-4個核苷酸，例如2個核苷酸。正義鏈和反義鏈都有一個5’磷酸。在某個實施例中，所述DsiRNA正義鏈含有堿基配對的脫氧核苷酸殘基的總長度為沈-39個核苷酸或者更多(如，正義鏈含有一個長度為26，27，28，四，30，31，32，33，34，35，36，37，38， 39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50 或者更多(如 51，52，53，54，55，56，57，58，59，60ο 或者更多)核苷酸)。在某個實施例中，正義鏈的長度為沈-39個核苷酸，任選地，為27-35個核苷酸，或者任選的，為27-33個核苷酸的長度。在相關實施例中，反義鏈的長度為27-43個或者更多的核苷酸(如，正義鏈的長度為 26，27，28，四，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41， 42，43，44，45，46，47，48，49，50 或者更多(如 51，52，53，54，55，56，57，58，59，60 或者更多) 核苷酸。在某個這樣的實施例中，反義鏈的的長度為27-43個核苷酸，或者27-39個核苷酸， 或者27-35個核苷酸，或者觀-37個核苷酸，或者，任選的，29-35個核苷酸。在某個實施例中，正義鏈上某段區(qū)域里含一個或多個堿基配對的脫氧核糖核苷酸，該區(qū)域是設計的Dicer酶剪切處的3’處，且其在正義鏈上相對于的區(qū)域為Dicer酶在反義鏈上的5’剪切處，該區(qū)域還可以兼具指導Dicer酶剪切的作用。本發(fā)明所述典型的雙鏈核酸正義鏈上的脫氧核糖核苷酸位于第M位或者再往3’方向位置處，第一個核苷酸的計算是從正義鏈上5’端起始的，且在正義鏈上第M位或再往3’方向位置處的脫氧核糖核苷酸與反義鏈上同源的脫氧核糖核苷酸堿基配對，在一些實施例中，通過含有脫氧核糖核苷酸殘基的方式，如在正義鏈的第20位上，雙鏈核酸指導Dicer酶產(chǎn)生一個短的，如19或 20個堿基的產(chǎn)物。這個第20位的脫氧核糖核苷酸與反義鏈上相應位置的脫氧核糖核苷酸堿基配對，這樣指導Dicer酶介導的19個堿基對的切除，如大多數(shù)Dicer酶產(chǎn)物一樣(需要強調(diào)的是，在這樣的實施例中，反義鏈3’附近也可以含有1個或者2個脫氧核糖核苷酸與正義鏈上第20位的脫氧核糖核苷酸堿基配對，以進一步指導Dicer酶剪切反義鏈)。在這樣的實施例中，DNA雙鏈區(qū)域(含有修飾的核苷酸以阻遏Dicer酶活性)通常含有多于1個或者2個堿基對(如3-5個堿基對或者更多)，以指導Dicer酶剪切產(chǎn)生一個通常沒有長度偏好性的的Dicer酶剪切產(chǎn)物。設置一個指導Dicer酶剪切產(chǎn)生20個堿基對的siRNA的平行組，其中正義鏈上第一個脫氧核糖核苷酸的位置發(fā)生在第21位(從正義鏈5’端第一位開始標號)。在某個實施例中，所述DsiRNA的正義鏈在3’端作了適當?shù)男揎椧岳贒icer酶加工，也即所述DsiRNA通過正義鏈的修飾進行了了指導Dicer酶結(jié)合和加工的設計。合適的修飾包括核苷酸的修飾，如脫氧核糖核苷酸，雙脫氧核糖核苷酸，無環(huán)鳥苷核苷酸， 及類似修飾。還有空間阻礙分子修飾，如熒光分子修飾及類似修飾。無環(huán)鳥苷核苷酸 (Acyclonucleotides)對2_羥基乙氧基基團的取代經(jīng)常存在于dNMPs中的T-乙氧基甲基 H (T-deoxyribofuranosyl sugar)中。其他的核苷酸修飾包括3'-脫氧腺苷(蟲草菌素)，3'-疊氮基-3'-脫氧腺苷(AZT)，2'，3'-雙脫氧肌苷(ddDJ1;'-雙脫氧-3'-硫胞嘧啶核苷(3TC)，2'， 3'-雙脫氧-2S3'-雙脫氧胸肝(d4T)和單磷酸化的核苷酸如3'-疊氮基-3'-脫氧腺苷(AZT)J1J'-雙脫氧-3'-胞嘧啶(3TC)和3'-雙脫氧-2^3'-雙脫氧胸肝 (d4T)和的3'-疊氮-3'-脫氧胸苷(AZT)單磷酸核苷酸、2'，3'-雙脫氧_3'-硫胞嘧啶核苷(3TC)和2'，3'-雙脫氧-2'，3'-雙脫氧胸肝(d4T)。在一個實施例中，脫氧核糖核苷酸作為修飾基團使用。當使用核苷酸修飾時，正義鏈的3’端的核糖核苷酸被1-3 個核苷酸修飾，或者2個核苷酸修飾替代。當使用空間位阻分子修飾時，其更容易結(jié)合到反義鏈的3’端的核糖核苷酸。因此，寡核苷酸鏈的長度沒有因為核苷修飾發(fā)生改變。在另一個實施例中，本發(fā)明在所述DsiRNA上取代2個DNA堿基以指導Dicer酶對反義鏈加工的起始。在進一步的實施例中，正義鏈3’末端2個末端DNA堿基被RNA堿基替代，這樣在正義鏈的3’末端和反義鏈的5’末端形成一個鈍性末端，而在反義鏈的3’末端形成一個2個RNA核苷酸的懸垂結(jié)構。含有DNA的鈍性末端和含有RNA堿基的懸垂結(jié)構是不對稱的結(jié)構。在某個實施例中，正義鏈3’末端的修飾的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基和與反義鏈的5’末端相對應的修飾過的核苷酸(如脫氧核糖核苷酸)堿基配對(任選地，所述DsiRNA反義鏈5’末端最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基與正義鏈3’末端或反義鏈的5’末端形成鈍性末端)。本發(fā)明所述DsiRNA的正義鏈和反義鏈在生物學條件下可以退火，如在細胞的細胞質(zhì)中的條件。另外，序列上的某個區(qū)域，特別是所述DsiRNA反義鏈上序列，長度至少為19 個核苷酸，位于反義鏈3’末端毗鄰的21個核苷酸區(qū)域內(nèi)，與目標基因的RNA序列充分互補以至可以退火和或者降低靶標RNA的水平。所述DsiRNA無論在正義鏈還是反義鏈上可能含有一個或多個脫氧核糖核苷酸堿基對，位于設計的正義鏈上Dicer酶的3’剪切處或反義鏈上5’剪切處。在某個實施例中，正義鏈上第對-27位(從正義鏈的5’端開始編號)上有1，2， 3或者4個全部都是脫氧核糖核苷酸，每個核苷酸都與反義鏈上對應的脫氧核苷酸堿基配對。在某個實施例中，反義鏈上5’端的脫氧核糖核苷酸(如設計的反義鏈上Dicer酶的5’ 剪切區(qū)域)不與所述DsiRNA定向的靶標RNA互補。在相關實施例中，所述DsiRNA的反義鏈位于Dicer酶剪切5’處的全部區(qū)域不需要與所述DsiRNA定向的靶標RNA充分互補。在某個實施例中，反義鏈上的脫氧核糖核苷酸或者反義鏈上位于Dicer酶在所述DsiRNA上5’剪切處的全序列不需要與靶標RNA充分互補以增強DsiRNA反義鏈與靶標RNA在可以退火的條件下的退火(如一個沒有DNA-延長片段的反義鏈的“核心”序列可以和有DNA延長片段的反義鏈“核心”序列一樣和靶標RNA退火。所述DsiRNA可能具有如下附加特性中的一個或者多個(a)反義鏈在典型的21 堿基序列上還有一個向左或向右偏移，(b)DsiRNA含有的鏈可能不完全互補，也即鏈與鏈之間存在堿基錯配(c)堿基修飾如核苷酸鎖定可能出現(xiàn)在正義鏈的5’末端?！暗湫偷摹?1mer siRNA的設計采用傳統(tǒng)技術。在一種技術中，多個位點通過平行試驗或者含有針對同一目標的幾種不同的siRNA雙鏈的集中池進行檢測，以期找到有效的siRNACJi等.，2003)。其他的技術通過設計規(guī)則或者計算方法以提高得到有效的RNA干擾效應分子的可能性(khwarz 等，2003 ；Khvorova 等·，2003 ；Ui-Tei 等，2004 ；Reynolds 等·，2004 ；Krol 等，2004 ；Yuan 等，2004 ;Boese 等，2005)。高通量的 siRNA 的篩選也發(fā)展起來了(U. S. published patent application No. 2005/0042641A1).潛在的靶標位點也可以通過二級結(jié)構預測進行分析 (Heale等，200 。然后，21個堿基對的序列用來設計在這21個堿基對的5’端向右移位 3-9個附加核苷酸。這些附加的核苷酸可以組成任何的序列。在一個實施例中，附加的核糖核苷酸是基于目標基因設計的。甚至在該實施例中，目標序列與反義siRNA的序列不需要完全互補。本發(fā)明所述DsiRNA的第一寡核苷酸鏈與第二寡核苷酸鏈不需要完全互補。它們的互補性只需要在生物條件下可以退火并形成Dicer酶的底物，繼而產(chǎn)生與靶標序列充分互補的siRNA。核苷酸鎖定，或者說LNA’ s，對本領域的技術人員是熟知的(Elman等，2005 ； Kurreck 等，2002 ；Crinelli 等，2002 ；Braasch 和 Corey, 2001 ；Bondensgaard 等，2000 ； Wahlestedt等，2000).在一個實施例中，一個LNA可以用在正義鏈5’端。在另一個實施例中，LNA可以用在反義鏈含有3’端懸垂結(jié)構的雙鏈核酸的正義鏈的5’端。在一個實施例中，本發(fā)明所述DsiRNA具不對稱結(jié)構，其正義鏈含有27個堿基與反義鏈配對，而反義鏈含有四個堿基，這樣形成一個2個堿基的3’懸垂結(jié)構。任選地，該結(jié)構在正義鏈的3’端區(qū)域(特別地，該區(qū)域是設計的Dicer酶剪切的3’位點)含有1_4個脫氧核糖核苷酸，其中至少一個與反義鏈5’末端區(qū)域(特別地，該區(qū)域是設計的Dicer酶剪切的5’位點)的同源脫氧核糖核苷酸堿基配對。在一個實施例中，正義鏈含有觀個堿基與反義鏈堿基配對，反義鏈含有30個堿基，并形成一個2個堿基的3’懸垂結(jié)構。任選地，該結(jié)構在正義鏈的3’端區(qū)域(特別地， 該區(qū)域是設計的Dicer酶剪切的3’位點)含有1_5個脫氧核糖核苷酸，其中至少一個與反義鏈5’末端區(qū)域(特別地，該區(qū)域是設計的Dicer酶剪切的5’位點)的同源脫氧核糖核苷酸堿基配對。在另一個實施例中，正義鏈含有四個堿基與反義鏈堿基配對，反義鏈含有31個堿基，并形成一個2個堿基的3’懸垂結(jié)構。任選地，該結(jié)構在正義鏈的3’端區(qū)域(特別地， 該區(qū)域是設計的Dicer酶剪切的3’位點)含有1_6個脫氧核糖核苷酸，其中至少一個與反義鏈5’末端區(qū)域(特別地，該區(qū)域是設計的Dicer酶剪切的5’位點)的同源脫氧核糖核苷酸堿基配對。在進一步實施例中，正義鏈含有30個堿基與反義鏈堿基配對，反義鏈含有32個堿基，并形成一個2個堿基的3’懸垂結(jié)構。任選地，該結(jié)構在正義鏈的3’端區(qū)域(特別地， 該區(qū)域是設計的Dicer酶剪切的3’位點)含有1_7個脫氧核糖核苷酸，其中至少一個與反義鏈5’末端區(qū)域(特別地，該區(qū)域是設計的Dicer酶剪切的5’位點)的同源脫氧核糖核苷酸堿基配對。在另一個實施例中，正義鏈含有31個堿基與反義鏈堿基配對，反義鏈含有33個堿基，并形成一個2個堿基的3’懸垂結(jié)構。任選地，該結(jié)構在正義鏈的3’端區(qū)域(特別地， 該區(qū)域是設計的Dicer酶剪切的3’位點)含有1_8個脫氧核糖核苷酸，其中至少一個與反義鏈5’末端區(qū)域(特別地，該區(qū)域是設計的Dicer酶剪切的5’位點)的同源脫氧核糖核苷酸堿基配對。在另一個實施例中，正義鏈含有32個堿基與反義鏈堿基配對，反義鏈含有34個堿基，并形成一個2個堿基的3’懸垂結(jié)構。任選地，該結(jié)構在正義鏈的3’端區(qū)域(特別地， 該區(qū)域是設計的Dicer酶剪切的3’位點)含有1_9個脫氧核糖核苷酸，其中至少一個與反義鏈5’末端區(qū)域(特別地，該區(qū)域是設計的Dicer酶剪切的5’位點)的同源脫氧核糖核苷酸堿基配對。在某個進一步實施例中，正義鏈含有33個堿基與反義鏈堿基配對，反義鏈含有35 個堿基，并形成一個2個堿基的3’懸垂結(jié)構。任選地，該結(jié)構在正義鏈的3’端區(qū)域(特別地，該區(qū)域是設計的Dicer酶剪切的3’位點)含有1_10個脫氧核糖核苷酸，其中至少一個與反義鏈5’末端區(qū)域(特別地，該區(qū)域是設計的Dicer酶剪切的5’位點)的同源脫氧核糖核苷酸堿基配對。在其他實施例中，所有的DsiRNA都具有不對稱的結(jié)構，且在正義鏈3’端含有2個脫氧核糖核苷酸而不是核糖核苷酸。任選地，這2個脫氧核糖核苷酸與反義鏈上同源的脫氧核糖核苷酸堿基配對。某些DsiRNA的2條分開的寡核苷酸鏈可以通過第3個結(jié)構連接起來。該結(jié)構不會阻遏Dicer酶對DsiRNA的活性，也不會妨礙對破壞目的基因的轉(zhuǎn)錄RNA的指導。在一個實施例中，所述的第三結(jié)構可以是一個化學連接基團。本領域存在許多為人熟知的合適的化學基團可以使用?；蛘?，所述第三結(jié)構可以是一個寡核苷酸鏈，通過產(chǎn)生一個發(fā)夾結(jié)構將兩條寡核苷酸鏈連接起來，當退火時形成dsNA結(jié)構。該發(fā)卡結(jié)構不會阻遏Dicer酶對DsiRNA 的活性，也不會妨礙對破壞目的基因的指導。在某個實施例中，所述DsiRNA具有一些特性可以增強其在Dicer酶作用下的加工。根據(jù)這個實施例，所述DsiRNA具有足夠的長度，這樣在Dicer酶的加工下可以產(chǎn)生 siRNA，并且，還要具有如下特性(1)所述DsiRNA結(jié)構是不對稱的，在正義鏈的3’端具有懸垂結(jié)構(2)所述DsiRNA反義鏈的3’端含修飾結(jié)構，以指導Dicer酶定向結(jié)合dsNA，并且加工產(chǎn)生有活性的siRNA。根據(jù)這些實施例，所述DsiRNA最長的鏈含有25-43個核苷酸。在某個實施例中，正義鏈含有25-39個核苷酸，反義鏈含有沈-43個核苷酸并導致產(chǎn)生的dsNA 在正義鏈3’末端上含有懸垂結(jié)構。該懸垂結(jié)構含1-4個核苷酸，例如含2個核苷酸。反義鏈和正義鏈可能都含有5’磷酸基團。在某個實施例中，所述DsiRNA正義鏈3’末端經(jīng)過了適當?shù)男揎椧岳贒icer酶的加工，如，所述DsiRNA經(jīng)過了 Dicer酶的定向結(jié)合與加工的設計。適當?shù)男揎棸ê塑账嵝揎?，如脫氧核糖核苷酸，雙脫氧核糖核苷酸，無環(huán)鳥苷核苷酸，及類似修飾。還有空間阻礙分子修飾，如熒光分子修飾及類似修飾。無環(huán)鳥苷核苷酸(Acyclonucleotides)對2-羥基乙氧基 (2-hydroxyethoxymethyl)基團的取代經(jīng)常存在于dNMPs中的2'-乙氧基甲基糖 (2 ‘ -deoxyribofuranosyl sugar)中。其他的核苷酸修飾包括3'-脫氧腺苷(3' -deoxyadenosine，蟲草菌素)， 3'-疊氮基-3'-脫氧腺苷(3 ‘ -azido-3 ‘ -deoxythymidine, AZT), 2 ‘，3'-雙脫氧肌苷0'，3' -dideoxyinosine, ddl),21,3 ‘-雙脫氧 _3 ‘-胞嘧啶 0'， 3' -dideoxy-3 ‘ -thiacytidine, 3TC), 2 ‘，3'-雙脫氧-2^3'-雙脫氧胸肝 Qt, 3 ‘ -didehydro-2 ‘ ,3 ‘ -dideoxythymidine, d4T)和 3 ‘-疊氮基 _3 ‘-脫氧腺苷(3 ‘ -azido-3 ‘ -deoxythymidine, AZT) ,21, 3 ‘-雙脫氧 _3 ‘-胞嘧啶 O ‘， 3 ‘ -dideoxy-3 ‘ -thiacytidine，3TC)和 3 ‘-雙脫氧-2^3'-雙脫氧胸肝 O'， S-didehydro^' ,3' -dideoxythymidine d4T)的單磷酸化的核苷酸。在一個實施例中，脫氧核糖核苷酸的作用是修飾。當使用核苷酸修飾時，正義鏈的 3’端的核糖核苷酸被1-3個核苷酸修飾，或者2個核苷酸修飾替代。。當使用空間位阻分子修飾時，反義鏈的3’端的核糖核苷酸被結(jié)合空間位阻分子。因此，寡核苷酸鏈的長度沒有因為核苷修飾發(fā)生改變。在另一個實施例中，本發(fā)明仔細闡述了 在所述dsNA中2個DNA 堿基取代以指導Dicer酶加工的定位。在進一步的實施例中，正義鏈3’末端2個末端RNA 堿基被DNA堿基替代，這樣在反義鏈的5’末端和正義鏈的3’末端形成一個鈍性末端，而在反義鏈的3’末端形成一個2個RNA核苷酸的懸垂結(jié)構。含有DNA的鈍性末端和含有RNA 堿基的懸垂結(jié)構是不對稱的結(jié)構。在某個實施例中，所述DsiRNA反義鏈3’末端經(jīng)過了適當?shù)男揎椧岳贒icer酶的加工，如，所述DsiRNA設計成可指導Dicer酶結(jié)合與加工的定向。適當?shù)男揎棸ê塑账嵝揎棧缑撗鹾颂呛塑账?，雙脫氧核糖核苷酸，無環(huán)鳥苷核苷酸，及類似修飾。還有空間阻礙分子修飾，如熒光分子修飾及類似修飾。無環(huán)鳥苷核苷酸對2-羥基乙氧基基團的取代經(jīng)常存在于dNMPs中的T-乙氧基甲基糖中。其他的核苷酸修飾包括3'-脫氧腺苷(蟲草菌素)，3'-疊氮基-3'-脫氧腺苷(AZT)，2' ,3'-雙脫氧肌苷(ddl) ,2^3'-雙脫氧-3'-胞嘧啶(3TC)，2' ,3'-雙脫氧-2^3'-雙脫氧胸肝(d4T)和單磷酸化的核苷酸如3'-疊氮基-3'-脫氧腺苷 (AZT)，21，3 ‘-雙脫氧-3 ‘-胞嘧啶(3TC)和3 ‘-雙脫氧-21，3 ‘-雙脫氧胸肝(d4T)。在一個實施例中，脫氧核糖核苷酸被用作修飾(modifiers)。當使用核苷修飾時， 反義鏈的3’端的核糖核苷酸被這樣的1-3個核苷酸修飾，或者2個核苷酸修飾替代。當使用空間位阻分子修飾時，反義鏈的3’端的核糖核苷酸被結(jié)合空間位阻分子。因此，寡核苷酸鏈的長度沒有因為核苷酸修飾而發(fā)生改變。在另一個實施例中，本發(fā)明仔細闡述了 在所述dsNA中2個DNA堿基取代以指導Dicer酶加工的定位。在進一步的實施例中，正義鏈3， 末端2個末端RNA堿基被DNA堿基替代，這樣在反義鏈的5’末端和正義鏈的3’末端形成一個鈍性末端，而在反義鏈的3’末端形成一個2個RNA核苷酸的懸垂結(jié)構。含有DNA的鈍性末端和含有RNA堿基的懸垂結(jié)構是不對稱的結(jié)構。本發(fā)明所述DsiRNA的正義鏈和反義鏈在生物學條件下可以退火，如在細胞的細胞質(zhì)中的條件。另外，序列上的某個區(qū)域，特別是所述DsiRNA反義鏈上序列， 鄰反義鏈的3’端，長度至少為19個核苷酸，與靶標RNA核苷酸序列充分互補以至指導RNA干擾。此外，所述DsiRNA的結(jié)構可以被優(yōu)化，以確保Dicer酶切割產(chǎn)生的寡核苷酸段可以成為最有效地抑制基因的表達的寡核苷酸部分。例如，在本發(fā)明的一個實施例中，合成的所述DsiRNA結(jié)構中包含一個27-35-bp的寡核苷酸段，而這個寡核苷酸段的序列中有 21-22-bp的序列(用于抑制基因表達)是位于反義鏈的3'末端。剩下的位于反義鏈5' 末端的序列將會被Dicer酶切割掉并被拋棄，被切割的部分可以是同源的(即基于目標基因而合成的序列)或非同源的，可以用作增加延長核酸鏈。由于本發(fā)明驚奇地發(fā)現(xiàn)，這樣的延長是通過配對的DNA殘基(雙鏈DNA:DNA延長)進行的，所以這種延長的DsiRNA相對于雙鏈的RNA:RNA延長的DsiRNA來說提高了效率或效力持續(xù)的能力。US 2007/(^65220 公開了一種 27mer 的 DsiRNAs，與 21mer siRNA組合物相比，即使在沒有化學修飾的條件下，它在血清中的穩(wěn)定性也有所提高。對DsiRNAs的修飾。例如包括反義鏈中2' -0-甲基修飾的RNA方式在US 2007/0265220和本項發(fā)明中都有具體的描述，當偶聯(lián)上一個5'磷酸，可以提高DsiRNA的穩(wěn)定性。添加5'磷酸到所有合成的RNA雙鏈也許是經(jīng)濟的并且可通過生理學的方法來比較核酸酶的穩(wěn)定性。本發(fā)明對DsiRNA的化學修飾方式是為了提高它的功效而設計的。因此，這樣的修飾在設計時須考慮到不會降低 DsiRNA的功效；不會干擾Dicer酶對DsiRNA的加工；提高DsiRNA在體液中的穩(wěn)定性(降低核酸酶的敏感性)；阻止或逃避先天性免疫系統(tǒng)的識別。這樣的修飾還要避免有毒性和增加成本或影響DsiRNA的產(chǎn)量。RNA 加工 siRNAsiRNA介導的RNA干擾過程是由細胞中存在的長的、dsRNA分子所引發(fā)的。RNAi 的起始步驟是這些dsRNA分子被Dicer酶切割成21_23nt的小的干擾RNA雙鏈(siRNAs)， Dicer酶是一個包含兩個RNase III類似結(jié)構的保守的酶家族(Bernstein等.2001 ； Elbashir等.2001)。siRNAs的特征就是，有一個19_21bp的雙鏈區(qū)域和在每條鏈的3 ‘端有2個核苷酸的3'懸垂。在RNA干擾的效應階段，siRNAs會包含在一個多聚體的蛋白復合物中，叫做RNA 誘導的沉默復合體(RISC)，該復合體作為一個導向來選擇完全互補mRNA底物并把它降解。降解的起始是通過在與siRNA互補配對的mRNA區(qū)域的內(nèi)部剪切而引發(fā)的，更準確地說，剪切是發(fā)生在指導siRNA 5'端的10號核苷酸所對應的mRNA上(Elbashir等.2001， Genes & Dev. 15 188-200 ;Nykanen 等.2001 Celll07 :309-321 ;Martinez 等.2002Cell 110 :563-574)。負責切割的核酸內(nèi)切酶命名為 Argonaute2 (Ago2 ；Liu 等.Science, 305 1437-41)。小分子干擾RNA人體中主要的miRNAs (70 % )，或其他哺乳動物的大部分的miRNAs，是通過外顯子和/或內(nèi)含子區(qū)域轉(zhuǎn)錄而來，大約30%是位于基因間(Rodriguez等.，Genome Res. 2004, 74(IOA)，1902-1910)。在人類和動物中，miRNAs通常是由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄(Farh 等· Science 2005，370 (5755)，1817-1821)。在某些情況下也有 RNA 聚合酶 III 轉(zhuǎn)錄(Borchert 等.Nat. Struct. MoI. Biol. 2006，13(12)，1097-1101)。一些病毒編碼的 miRNAs 由 RNA 聚合酶 III 轉(zhuǎn)錄(Pfeffer 等· Nat. Methods 2005，2 (4)，269-276 ；Andersson 等· J. Virol. 2005,79(15) ,9556-9565)，有些是位于病毒基因的開放閱讀框內(nèi)(Pfeffer等.Nat. Methods 2005,2(4),269-276 ；Samols 等·J.Virol. 2005，79(14)，9301-9305)。 miRNA的轉(zhuǎn)錄會導致大量單順反子、雙順反子或多順反子前體轉(zhuǎn)錄本(pri-miRNAs)的生成，一個pri-miRNAs的長度可以從200nt到幾1Λ，并且都含有5' 7-甲基鳥苷(m7)帽和3' poly (A)尾。典型地，成熟的miRNA序列位于pri_miRNAs的不完整的頸-環(huán)結(jié)構中 (Cullen, MoI.Cell 2004，16 (6)，861-865)。miRNA成熟的第一步是在細胞核中，通過RNase III Drosha_DGCR8核微小處理復合體來切割pri-miRNAs，從而釋放一個大約70nt的發(fā)夾結(jié)構，其中包含有前體分子叫做pre-miRNAs，在5'末端有單磷酸化，在3'有2nt的懸垂結(jié)構，這個2nt的懸垂結(jié)構帶有羧基(Cai 等· RNA 2004，10 (12)，1957-1966 ；Lee 等· Nature 2003，425 (6956)， 415-419 ；Kim Nat. Rev. Mo I. Cell. Biol. 2005，6 (5)，376-385)。接著 pre-mi RNAs 通過命名為Exportin-5的轉(zhuǎn)運蛋白從細胞核轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中(Yi等.Genes. Dev. 2003,77(24), 3011-3016，Bohnsack 等.RNA 2004,10(2), 185-191), Exportin-5 與它的結(jié)合了 GTP 的 Ran輔因子共同識別并結(jié)合3'端突出的2nt和鄰近的pre-miRNA所特有的莖上(Basyuk 等· Nucl. Acids Res. 2003,31 (22),6593-6597,Zamore MoI. Cell. 2001,8(6)，1158-1160)。 在細胞質(zhì)中，GTP水解導致pre-miRNA的釋放，然后被一種細胞核酸內(nèi)切酶III Dicer酶加工(Bohnsack等.)。Dicer酶最早是在RNA干擾(RNAi)的siRNAs的產(chǎn)生過程中被認識的。Dicer酶配合它的輔因子TRBP (轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域結(jié)合蛋白；Chendrimata等.Nature2005， 436(1051)，740-744)和PACT (干擾素誘導的雙鏈RNA依賴性蛋白激酶激活劑；Lee等.EMBO J. 2006，25 (3)，522-532)，這些酶結(jié)合到位于pre-miRNA發(fā)夾結(jié)構的3 ‘端突出的2_nt上并去除末端的環(huán)狀結(jié)構，產(chǎn)生了一個大約21nt的雙鏈miRNA中間物，它具有5'單磷酸、 3'懸垂結(jié)構的2nt和3'羥基。miRNA中間物的指導鏈的5'從能量角度看不穩(wěn)定，因此會被選擇性地包含在RISC中(RNA誘導的沉默復合體)，同時“passenger”鏈會被釋放并降解(Maniataki etal. Genes. Dev. 2005，19 (24)，2979—2990 ；Hammond 等· Nature 2000， 404(6115)，四3-四6)。目前為止，RISC的組成仍然沒有完全確定。但是，一種關鍵的組分是一個 Argonaute (Ago)蛋白家族的成員(Maniataki 等；Meister 等.MoI. Cell. 2004，15 O)， 185-197)。成熟的miRNA會指導RISC結(jié)合到互補mRNA上，如果目標mRNA能與結(jié)合了 RISC 的miRNA完全互補配對，則會導致mRNA切割和降解(Zeng等· Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003，100 (17)，9779-9784 ；Hutvagner 等· Science 2002，297 (5589)，2056-2060)。但是，哺乳動物細胞中最常見的情況是，miRNAs和目標mRNAs并不是完全互補配對，會使mRNA的翻譯受到抑制，導致相應蛋白表達量的降低(Yekta等.Science 2004，304 (5670)，594-596 ； Olsen等· Dev. Biol. 1999，216 (2)，671-680)。miRNA的5 ‘區(qū)域，尤其是與目標序列互補配對的第2-7位、第8位核苷酸序列(從5'末端的第一位開始編號)，稱為種子區(qū)，對于miRNA 鎖定目標非常重要，并且種子區(qū)域的配對也被廣泛地用于計算機預測miRNA作用的目標序列(Lewis 等· Cell 2005，120(1)，15-20 ；Brennecke 等· PLoS Biol. 2005，3 (3)，e85) miRNA 對miRNA-mRNA雙鏈的調(diào)節(jié)主要是通過mRNA的3 ‘ UTRs的多個互補配對位點，但也有很多例外的情況。miRNAs也可能與mRNA的5' UTR和/或編碼區(qū)結(jié)合，也會導致相似的結(jié)果。RNase HRNase H是核糖核酸酶，它會切割DNA/RNA雙鏈中RNA的3' _0_P鍵，產(chǎn)生以 3'-羥基和5'-磷酸為末端的產(chǎn)物。RNase H是非特異性的核糖核酸酶，在與酶結(jié)合的二價金屬離子的輔助下通過水解的機制催化切割RNA。RNase H家族的成員幾乎從真細菌和原核生物到真核生物的所有生物體內(nèi)都能找到。在DNA復制過程中，RNase H被認為可以切割引發(fā)合成網(wǎng)崎片段的RNA引物；然而，RNase H酶可能更加廣泛地用于清除任何足夠長的DNA: RNA雜交鏈(例如，具有代表性的是在哺乳動物中具有4個或更長堿基對的DNA: RNA 雜交鏈)。MicroRNA 和類似 MicroRNA 的治療法MicroRNAs (miRNAs)具有與模板轉(zhuǎn)錄本的3' UTR結(jié)合的特性，從而通過一種與傳統(tǒng)RNA干擾相關但又明顯不同的機制抑制模板轉(zhuǎn)錄本所編碼的蛋白的表達。特別地， miRNAs被認為是通過抑制目標轉(zhuǎn)錄本的翻譯而發(fā)揮作用，而不是降低目標轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性。機體自然產(chǎn)生的典型的miRNAs的長度大約為22nt。人們認為它們是來源于更大被稱為小的暫時RNAs(stRNAs)的前體，長度大約為70nt。像siRNAs這種干擾物，具有更多的特異性，例如miRNAs，可以與3' UTR結(jié)合(或目的轉(zhuǎn)錄本的其他位置，例如，Notch和/或Notch家族的轉(zhuǎn)錄本的重復單元)，并抑制翻譯，siRNA/模板(miRNA/模板)雙鏈可能擁有大量的不配對序列，特別是在雙鏈的核心區(qū)可能有錯配。事實上，有證據(jù)表明有些錯配可能是合適的或者是必需的，機體自然產(chǎn)生的stRNAs同miRNAs —樣經(jīng)常表現(xiàn)出這種錯配，在體外也會抑制基因的翻譯(kng等.， Molecular Cell，9 :1-20)。例如，當與目標轉(zhuǎn)錄本雜交時，這種miRNAs經(jīng)常包含兩個完全互補的區(qū)域，而這兩個區(qū)域又被一個錯配的區(qū)域所隔開。這樣的雜交復合體通常包含由堿基對組成的兩個完全互補的區(qū)域(雙鏈部分)至少有一個錯配的堿基對，這個錯配的堿基對可能是 G:A，G:U, G:G, A:A, A: C，U:U, U:C, C:C, G:-，A-, U-, C:-等等。這些錯配的核苷酸，尤其如果是一前一后(例如，兩個、三個或四個錯配的核苷酸區(qū)域)存在時，可以形成一個凸起，因此，存在于凸起兩側(cè)的雙鏈部分就會被分開。各種結(jié)構都有可能形成。例如，miRNA可能包含多個不均一(錯配)的區(qū)域。就目標序列和miRNA兩者所包含的不配對的核苷酸而言，這個不均一(錯配)的區(qū)域不需要是對稱的。例如，那種只有一條鏈包含不配對的核苷酸的結(jié)構已經(jīng)有報道Geng等，F(xiàn)igure 33)。在miRNA中，一個典型的完全配對的延長區(qū)域通常至少有5個核苷酸的長度，也有6個、7個或更長核苷酸序列。 然而不配對的區(qū)域可能有1、2、3或4個核苷酸的長度。一般地，任何一個特別的siRNA都可以通過兩種途徑來抑制基因的表達(i) “典型的”siRNA途徑，這種作用方式會降低目標轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性，并且這種作用方式更偏好于siRNA與目標物完全配對，也可以通過備選途徑(ii)(通常是動物細胞中miRNA途徑)，這種方式可以抑制目標轉(zhuǎn)錄本的翻譯。通常，一個特定的SiRNA鎖定目標轉(zhuǎn)錄本是通過機制(i)，而最終將會通過機制 (ii)區(qū)別目標轉(zhuǎn)錄本，盡管一個單一的轉(zhuǎn)錄本有可能包含有一些區(qū)域，這些區(qū)域既可以作為典型途徑的目標，也可以作為備選途徑的目標。(注意這里所述“典型的”和“備選的”只是為了方便，并反應了早期在動物中發(fā)現(xiàn)了這種機制，但并不能反應這兩種機制的重要性、 效能或者其他的特征)。設計siRNA的一個通常目的是通過機制(i)對具有極好的特異性鎖定單一的目標轉(zhuǎn)錄本，并最大限度地降低脫靶效應及有可能通過機制(ii)引起的效應。 然而，本發(fā)明的目標之一就是提供含有錯配序列的RNA干擾物，既可以最好地降低機體自然產(chǎn)生的miRNAs的活性，也設計出目前還沒有相應miRNA的目標RNAs的miRNAs，這種具有抑制和/或者治療功效的含有錯配序列的DsiRNA (例如，DsiRNAmm)功效，確實有可能被這些錯配序列所增強。miRNA含有錯配的核苷酸(實際上就是細胞中存在的自然利用機制(ii)的情況) 的情況暗示了利用miRNAs的作用方式具有一些優(yōu)點和/或擴展了 “經(jīng)典的”利用完全配對的siRNAs的作用機制(i)。因為miRNAs是機體自然產(chǎn)生的分子，所以這有可能在運用 miRNAs進行治療時具有明顯的優(yōu)勢。每年會有幾億元的項目用于研究miRNAs在進化上的 “微調(diào)”功能。因此，序列特異性的“脫靶”效應對于自然產(chǎn)生的miRNAs來說不應該是一個問題，對于本項發(fā)明的DsiRNAs (例如，DsiRNAmm)，通過人工模擬的miRNAs并用于抑制基因表達也不存在問題。除此之外，miRNAs已經(jīng)發(fā)展到用于調(diào)節(jié)基因簇的表達，即用于上調(diào)，也用于下調(diào)(在某些例子中，一個細胞的一個特定的miRNAs可通過作用多個目標RNAs而同時執(zhí)行這2種功能)，這樣使得細胞復雜的功能可以被精確地調(diào)控。這種替換機體自然產(chǎn)生的miRNAs方法就是引入人工合成的miRNAs或miRNA模擬物到病變的組織，以恢復細胞的增值、細胞凋亡、細胞周期，和其他由于了一個或更多個miRNAs下調(diào)而受到影響的細胞的功能。在某些例子中，重新激活miRNA調(diào)節(jié)途徑后產(chǎn)生了巨大的治療反應(例如，在一項關于心臟肥大的研究中，通過腺病毒介導的過表達一種miRNAmiR-133后，可以保護動物由興奮劑而導致的心臟肥大，然而，相應地，當利用antagomirs減少野生型小鼠體內(nèi)的 miR-133 后，就會導致心臟肥厚(Care 等.Nat. Med. 13 :613-618))。到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人體基因組可以編碼超過600多種miRNAs，這些miRNAs 表達和加工是細胞核和細胞質(zhì)中一系列的蛋白質(zhì)的作用。miRNAs在脊椎動物中是高度保守的，并且其數(shù)量占到哺乳動物全部基因的2%。因為每個miRNA似乎都調(diào)節(jié)多個基因的表達，例如，2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或甚至數(shù)十個到幾百個不同的基因， miRNAs可以通過作為“控制開關”而發(fā)揮作用，有效地調(diào)節(jié)和協(xié)調(diào)多種細胞途徑和生理過程。通過協(xié)調(diào)多基因的表達，miRNAs在胚胎發(fā)育、免疫、炎癥反應及細胞生長和增值過程中發(fā)揮了關鍵作用。對miRNAs的表達和功能的研究發(fā)現(xiàn)，某些特定的miRNAs表達量的改變對于人體各種疾病的發(fā)生非常重要。越來越多的數(shù)據(jù)表明，將特定的miRNAs導入到病變的細胞或組織后，會出現(xiàn)良好的療效(Pappas 等.，Expert Opin Ther Targets. 12 :115-27)。miRNAs 療法也許最有可能應用于癌癥的治療，因為某些miRNAs具有腫瘤抑制劑的特性。以miRNAs 為基礎的治療原理，例如對于癌癥，在一定程度上有以下幾個發(fā)現(xiàn)作為證據(jù)(1)與正常的組織相比，病變組織中的miRNAs經(jīng)常會表現(xiàn)出錯誤調(diào)節(jié)和錯誤的表達水平。很多研究表明，在癌變的組織中miRNAs水平相對于正常的組織而言都會發(fā)生改變。通常是由于基因突變從而導致了特定miRNAs表達水平的升高或降低。對于某些擁有獨特的miRNA表達特性的疾病，可以用miRNA為診斷和預兆的標志，這些miRNAs可以作為本發(fā)明的DsiRNA (例如， DsiRNAmm)的目標。(2)這些錯誤調(diào)節(jié)的miRNAs對于癌癥的發(fā)展是通過作為原癌基因或腫瘤抑制劑而發(fā)揮作用的。原癌基因是一類當過表達或有不適當?shù)幕钚詴r導致了癌癥的發(fā)生的基因。 腫瘤抑制劑是對于防止細胞癌變所必需的；腫瘤抑制劑的下調(diào)或失活是導致癌變的一個通常的原因。這兩種類型的基因都有不同偏好的靶向藥物，根據(jù)對特定癌癥的分子，可以特異性地發(fā)揮作用理，例如miR-155、miR-17-92就是原癌miRNAs ；而let_7則是一個抑制腫瘤的 miRNA。
(3)動物臨床預實驗研究發(fā)現(xiàn)，利用miRNA可以達到治療效果，是因為miRNA阻止或降低了腫瘤的生長。有文獻報道，恢復miRNA的功能可以在體外或動物模型中阻止或降低腫瘤的生長。一個研究得很透徹例子是，在乳腺癌和肺癌模型中的let-7的抗腫瘤活性， 而本發(fā)明所述DsiRNAs (例如，DsiRNAmms)就是通過模擬let_7可以用來鎖定這種癌癥而設計的，并且還可以利用DsiRNA的設計參數(shù)來生產(chǎn)新的DsiRNA(例如，DsiRNAmm)，以直接地針對那些靶標RNAs，因為對于靶標RNAs來說，目前與它們對應的機體自然產(chǎn)生的miRNA 是未知的(例如，在凹口或其他轉(zhuǎn)錄本中的重復序列)，以篩選具有治療效果的組分，例如那些在動物臨床預實驗模型中可以降低腫瘤負擔的物質(zhì)。(4) 一個miRNA控制著多個細胞途徑，因此可能有優(yōu)越的治療活性。根據(jù)它們的生物活性，miRNAs可以作為基因組的“控制開關”而發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)多個基產(chǎn)物協(xié)調(diào)多個信號途徑。miRNAs調(diào)節(jié)的基因包括編碼常見的原癌基因和腫瘤抑制劑的基因，它們當中很多是作為制藥工業(yè)的藥物靶向目標。因此，與siRNAs和其他組分相，miRNA具有更優(yōu)越的活性， 因為它可以控制多種疾病和/或癌癥相關的基因。有證據(jù)表明，miRNAs的錯誤調(diào)節(jié)通常出現(xiàn)在腫瘤發(fā)生的早期，用miRNA治療來取代缺失的miRNAs，可能是最合適的治療方法。^miRNAs是機體自然產(chǎn)生的分子，因此不太可能會導致非特異性的副作用。幾百萬年以來的進化，形成了 miRNAs的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡，它使miRNAs與目標信使RNA可以很好地相互作用。因此，在適當?shù)那闆r下應用時，沒有任何序列特異性的“脫靶”效應的miRNAs和 miRNA(例如，DsiRNAs被設計用來模擬機體自然產(chǎn)生的miRNAs)的衍生是不存在的。siRNAs和miRNAs的物理特征是相似的。因此，有效輸送siRNAs (例如，本發(fā)明中的DsiRNAs)的技術與有效輸送合成的miRNAs (例如，本發(fā)明中的某些DsiRNAmms)是一樣的。DsiRNA分子的連接和輸送在某些實施例中，本發(fā)明涉及一種治療某種疾病或有可能發(fā)展為疾病和機體紊亂的方法。在這些實施例中，DsiRNA可以作為一種新的治療物來控制疾病或機體紊亂。這種方法包括給予本發(fā)明的藥物組合物到病人體內(nèi)(例如，人)，這樣靶標RNA的表達水平和/ 或活性會被降低。靶標RNA編碼的多肽的表達，水平和/或活性降低。在治療疾病或機體紊亂過程中，DsiRNA可以被引入到表現(xiàn)出某些疾病或機體紊亂或與某些疾病或機體紊亂有聯(lián)系的細胞或組織中。例如，DsiRNA實際上與目標RNA序列完全或部分是相同的，可以被引入到發(fā)生病變、與疾病相關或被感染的細胞中，可以在體內(nèi)也可以在體外。同樣，DsiRNA實際上與目標RNA完全或部分是相同的，可以被引入到已經(jīng)有某種疾病或機體紊亂的個體或有發(fā)展為某種疾病或機體紊亂的個體中。利用本發(fā)明的DsiRNA來治療時，可使用包括多種DsiRNA序列的DsiRNA劑型。例如，兩個或更多，三個或更多，四個或更多，五個或更多等等，所描述的這些DsiRNA分子能結(jié)合形成一種劑型，例如以一個或更多的RNA(S)的多個不同的區(qū)域為目的。本發(fā)明構建的 DsiRNA的兩條寡核苷酸鏈可以獨立地針對一個RNA的多個區(qū)域。使用可以針對目標核苷酸的多個區(qū)域的多功能DsiRNA分子期望可以有效地抑制RNA的水平和表達。例如，本發(fā)明的一個多功能DsiRNA可以既針對核酸分子的保守區(qū)也可以針對核酸分子的可變區(qū)，因此，就可以下調(diào)或抑制，例如病毒的不同突變株，或由單個目的基因編碼的不同剪接突變體。本發(fā)明所述DsiRNA可以以共價鍵結(jié)合(例如，在它的正義鏈或反義鏈的5 ‘或3'端)或非共價鍵結(jié)合其他組分(例如，像肽這樣的非核苷酸組分)，一個有機的組分 (例如，染料、膽固醇或者其類似物)。與沒有修飾過的DsiRNA相比，通過這種方式修飾后的DsiRNA衍生物可以提高它在細胞中的攝取量，增加細胞的靶向活性，并且有利于這種 DsiRNA衍生物在細胞中的追蹤，或在細胞中的穩(wěn)定性。RNAi的體外試驗評估DsiRNA的活性一個體外實驗可以用來說明RNAi在非細胞體系中可以有選擇性地被用來評估DsiRNA的結(jié)構。例如，該試驗包含的系統(tǒng)已有描述(Tuschl等.，1999，Genes and Development, 13, 3191-3197 and Zamore 等，2000，Cell，101，25-33)，調(diào)整使用 DsiRNA 來靶向目標RNA。一個從果蠅合胞胚層中的提取物被用來在體外重組RNAi的活性。目標RNA 通過質(zhì)粒用T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生或通過化學合成。DsiRNA的正義鏈和反義鏈(例如每條鏈20uM)在緩沖液(比如IOOmM乙酸鈉，30mM HEPES-KOH, pH 7. 4，2mM醋酸鎂)中 90°C共孵育1分鐘，接著在37°C共孵育1小時后退火。退火可以在TBE緩沖液中，瓊脂糖電泳后通過溴化乙錠來染色檢測。用源于Oregon R的0小時到2小時的胚胎來來制備果蠅的溶解產(chǎn)物，果蠅從酵母糖蜜瓊脂上收集起來，去掉絨毛并裂解。細胞裂解物通過離心機分離獲得上清。試驗的反應復合物包括50%細胞裂解物[vol/vol]，RNA(終濃度10_50pM)，10%的含有DsiRNA(終濃度IOnM)的裂解緩沖液[vol/vol]。反應體系中還包括IOmM的磷酸肌酸，10ug/ml的磷酸肌酸激酶，IOOurn GTP，IOOuM UTP，1 OOuMCTP，500uM ATP,5mM DTT，0. 1U/uL 阻抑蛋白 (Promega)，每種氨基酸IOOuM,乙酸鉀的最終濃度調(diào)節(jié)為100mM。反應體系在冰上添加完成，在25°C共孵育10分鐘，加入RNA，然后在25°C共孵育60分鐘。用4倍體積的裂解緩沖液(!Iomega)終止反應。目標RNA的切割情況利用RT-PCR和其他的方法來分析，設置一沒有加DsiRNA的反應組為對照。交替地，用于分析的內(nèi)部標記的目標RNA通過在[α _32P]CTP存在的條件下體外轉(zhuǎn)錄獲得。經(jīng)過G50交聯(lián)葡聚糖柱旋轉(zhuǎn)色譜純化后，產(chǎn)物被用作目標RNA。隨意地，目標RNA 的5' -32P標記使用T4多核苷酸激酶來完成的。試驗是用前面已經(jīng)描述過的方法來做， 目標RNA和RNAi產(chǎn)生的特異性的RNA切割產(chǎn)物可以利用膠的放射自顯影來得到。切割的百分比用PHOSPHOR IMAGER (射線自顯跡法)來確定，通過代表完整的RNA對照或沒有 DsiRNA的反應的對照RNA和通過該實驗中產(chǎn)生的切割產(chǎn)物的條帶來進行定量分析。核酸的引入方法，載體，宿主細胞本發(fā)明的DsiRNA可以直接導入到受體細胞(例如，細胞內(nèi)的)；或?qū)氲郊毎獾膬?nèi)陷處，間隙，機體的循環(huán)系統(tǒng)，或口服導入，或?qū)⒓毎蛴袡C體放在含有核酸的溶液里以共孵育的方法導入。血管或血管外的循環(huán)系統(tǒng)，血液或淋巴系統(tǒng)以及腦脊液都是導入核酸的可能的位點。本發(fā)明所述DsiRNA可以用本領域公認的核酸輸送方法來導入，包括注射含有該核酸的溶液，或?qū)⒑怂岚奈⒘Ｓ秒姄舻姆椒▽?，將細胞或有機體放在含有該核酸的溶液里共孵育。其他導入核酸到細胞中的方法也可以使用，例如，液體介導的載體轉(zhuǎn)運，化學介導的轉(zhuǎn)運，以及陽離子脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)運，如磷酸鈣法，以及類似方法。所述核酸還可以同具有以下功能的組分一起導入增加細胞對核酸的攝取量，或可以增加對目標RNA的抑制性。
細胞中含有的RNA可能來自于生殖細胞系或體細胞，全能干細胞或多能干細胞， 分開的或沒有分開的，軟組織細胞或上皮細胞，永生的細胞或轉(zhuǎn)移的細胞，諸如此類。細胞可能是一種干細胞或分化的細胞，分化細胞的類型包括脂肪細胞，纖維細胞，肌細胞，心肌細胞，內(nèi)皮細胞，神經(jīng)細胞，神經(jīng)膠質(zhì)細胞，血細胞，巨核細胞，淋巴細胞，巨噬細胞，中性粒細胞，嗜酸細胞，嗜堿細胞，肥大細胞，白細胞，粒細胞，膠質(zhì)細胞，軟骨細胞，成骨細胞，破骨細胞，肝細胞，以及內(nèi)分泌和外分泌腺細胞。依靠特定目標RNA的序列和導入的DsiRNA的劑量，該操作可以部分或完全使目標 RNA失去功能。降低或抑制RNA或RNA表達(既是RNA的表達也是編碼的多肽的表達)的程度至少是50%，60%，70%，80%，90%，95% or 99%或者更多。抑制目標RNA的水平或表達是根據(jù)缺失(或明顯降低)RNA的水平或RNA編碼的蛋白的水平確定，而特異性是根據(jù)只對目標RNA有抑制能力，而對于其他基因沒有明顯影響來確定。抑制的結(jié)果可以通過檢測細胞或組織表現(xiàn)出來的特性來確定(就如下面的這個例子)，或者用RNA溶解雜交、核酸酶保護試驗、Northern雜交、反轉(zhuǎn)錄、微陣列檢測基因的表達、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、 Western雜交、放射免疫測定法(RIA)及其他的免疫檢測和熒光激活細胞試驗(FACQ等生物化學技術來確定。無論在體內(nèi)還是在體外，本發(fā)明所述DsiRNA對目標RNA序列的抑制也可以通過其他方法來確定，例如，對于癌癥的治療，在攝入DsiRNA后，可以測量腫瘤的大小等表型。對于病毒感染的疾病，可以用病毒的載荷量/滴度來確定。對于病毒感染的疾病， 病毒的載荷量/滴度可以降低50%，60%，70%，80%，90%，95% or 99%或更多，通常是在對數(shù)期進行測量，例如，細胞、組織或個體攝入在DsiRNA后，病毒載荷量/滴度可以降低 10 倍，100 倍，1000 倍，105 倍，106 倍，107 倍。對于RNA介導的在一個細胞系或整個有機體內(nèi)的抑制，表達一個受體或藥物抗性基因的蛋白產(chǎn)物容易被檢測。這種受體包括乙酰羥酸合成酶(AHAS)、堿性磷酸酶(AP)、 β -半乳糖甘酶(LacZ)、β -葡萄糖甘酸酶(GUQ、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、綠色熒光蛋白 (GFP)、辣根過氧化物酶(HRP)、熒光素酶(Luc)、胭脂氨酸合成酶(N0Q、羧乙基精氨酸合成酶(0CQ以及他們的衍生物。多選擇標簽可以是對以下抗生素的抗性氨芐青霉素、博來霉素、氯霉素、慶大霉素、潮霉素、卡那霉素、潔霉素、甲氨蝶呤、草丁膦、嘌呤霉素和四環(huán)素抗性。依靠這些檢測，可以定量檢測基因的表達，通過與沒有處理的細胞比較后，確定抑制程度大于 10%，33%，50%，90%，95% 或 99%。低劑量注射RNA沉默物質(zhì)和注射后時間過長就只能抑制小部分的細胞(例如，至少10%，20%，50%，75%，90%，或95% )。在一個細胞中基因表達的量可以表現(xiàn)為抑制靶標RNA和翻譯的目標蛋白積累水平的總量。例如，抑制效應可以通過測量細胞中基因產(chǎn)物的量來確定；RNA可以用雜交探針來檢測，該探針的序列是在使用抑制DsiRNA區(qū)域的外側(cè)， 或者用針對翻譯的多肽某一特定區(qū)域的抗體來檢測。所述DsiRNA導入的量可以在每個細胞中至少有一個拷貝。更高劑量(例如，每個細胞至少5，10，100,500或1000拷貝)可能會產(chǎn)生更有效的抑制效果；低劑量也可以在特定的應用中使用。以RNA干擾為基礎的治療眾所周知，RNAi方法可以廣泛的應用于生物的各式各樣的基因上，而這些公開的組合物和方法可以在相應情況下應用。使用已公布的組合物和方法可以抑制的基因包括細胞中本身就具有的內(nèi)在的基因或不是細胞自身的基因。沒有限制，這些基因包括原癌基因、 細胞質(zhì)基因、特異基因型(Id)蛋白基因、朊病毒基因、表達誘導血管生成的分子的基因、粘附分子基因、細胞周期控制基因、表達EGF和EGF受體的基因，以及像MDRl這樣的多重抗藥性基因。更具體的說，該發(fā)明針對的目標mRNA是可以翻譯出細胞中一個特異氨基酸序列的蛋白(例如，一個細胞核的、細胞質(zhì)的、細胞膜的或與膜相連的蛋白)。在另一個實施例中，本發(fā)明針對的靶標mRNA針對的也可以是細胞外一個特異氨基酸序列的蛋白(例如，細胞外基質(zhì)蛋白或分泌蛋白)。這里所說蛋白的“特異氨基酸序列”是指該mRNA的序列可以通過遺傳密碼子翻譯出的氨基酸序列。以下蛋白種類都是為了舉例而列出發(fā)育蛋白(例如，粘附分子、細胞周期蛋白、 Wnt蛋白家族成員、Pax蛋白家族成員、飛行螺旋蛋白家族成員、Hox蛋白家族成員、細胞因子/淋巴因子以及它們的受體、生長/分化因子以及它們的受體、神經(jīng)傳導物質(zhì)以及它們的受體)，原癌基因編碼的蛋白(例如，ABLI, BCLI, BCL2, BCL6, CBF A2，CBL, CSFIR，ERBA, ERBB, EBRB2, ETSI，ETSI，ETV6, FGR, FOS, FYN, HCR, HRAS, JUN, KRAS, LCK, LYN, MDM2, MLL, MYB, MYC, MYCLI，MYCN，NRAS, PIM I，PML, RET，SRC, TALI, TCL3 和 YES)；腫瘤抑制蛋白(例如，APC, BRCAl, BRCA2, MADH4, MCC, NF I，NF2, RB I，TP53，和 WTI)；酶類(ACC 合成酶和氧化酶、ACP去飽和酶和羥化酶、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、ATP酶、乙醇脫氫酶、淀粉酶、淀粉轉(zhuǎn)葡糖苷酶、過氧化氫酶、纖維素酶、查爾酮合成酶、幾丁質(zhì)酶、環(huán)氧酶、脫羧酶、葡聚糖酶、DNA 聚合酶和RNA聚合酶、半乳糖甘酶、葡聚糖酶、葡糖氧化酶、顆粒結(jié)合淀粉合成酶、GTP酶、解旋酶、乳糖酶、脂酶、脂肪氧化酶、溶菌酶、胭脂氨酸合成酶、章魚堿合成酶、果膠酯酶、氧化物酶、硫酸酶、磷脂酶、磷酸化酶、植酸酶、植物生長調(diào)節(jié)劑合成酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶和肽酶、支鏈淀粉酶、重組酶、反轉(zhuǎn)錄酶、RUBIS⑶S、拓撲異構酶、木聚糖酶)。一方面，目標mRNA分子翻譯的蛋白氨基酸序列是與病理條件相關的。例如，這些蛋白可能是治病性相關的蛋白(例如，參與宿主免疫的抑制，對病原體產(chǎn)生應達，轉(zhuǎn)運病原體，維持病原體感染的病毒蛋白)，或幫助病原體進入宿主，病原體或宿主藥物代謝，病原菌基因組復制和整合，在宿主中定植或擴散感染，或子代病原體的組裝相關的宿主蛋白。病原體包括RNA病毒，例如，蟲媒病毒、小核糖核酸病毒、棒狀病毒、絲狀病毒、逆轉(zhuǎn)錄酶病毒，還包括慢病毒或DNA病毒，例如腺病毒、痘病毒、皰疹病毒、巨細胞病毒、肝病毒或其他病毒。 其他的病原體包括細菌、真菌、蠕蟲、吸血蟲和錐體蟲。另一方面，這些蛋白可能是與腫瘤相關的蛋白或與自身免疫疾病相關的蛋白。藥物組合物在某些實施例中，本發(fā)明提供一種包括有本發(fā)明所述的DsiRNA的藥物組合物。所述DsiRNA樣品可以適當?shù)脑O計，并可以導入到細胞中，通過采用合適的方法可以將足夠數(shù)量的樣品導入細胞中，以誘導基因沉默。很多dsNA的設計在該領域已經(jīng)被人們所知， 只要dsNA能進入細胞以便它發(fā)揮作用，這些dsNA的設計就可以被使用。例如，美國已經(jīng)發(fā)表的專利申請Nos. 2004/0203145Aland 2005/0054598A1都有相關介紹。例如，本發(fā)明的DsiRNA可以溶解在緩沖液中，例如磷酸鹽緩沖液，還可以構建在脂質(zhì)體、膠粒結(jié)構和衣殼中。DsiRNA與陽離子脂類一起可以用來幫助DsiRNA進入細胞，例如，陽離子脂類，比如脂質(zhì)體(U. S. Pat. No. 5，705，188)，陽離子丙三醇衍生物，以及聚陽離子脂質(zhì)，比如多熔素(已發(fā)表的PCT國際申請WO 97/30731)，都可以使用。適合的脂類包括Oligofectamine， Lipofectamine(Life Technologies), NC388(Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. , Boulder, Colo. ), or FuGene 6 (Roche)，它們都可以根據(jù)制造商的說明來使用。這種組合物通常會包含核酸分子和藥物可接受的載體。這里所說的“藥物可接受的載體”包括鹽、溶劑、分散介質(zhì)、包膜、抗細菌和抗真菌的物質(zhì)，等滲和延遲吸收等諸如此類的物質(zhì)，它們與藥物活性成分是相容的。補加的活性成分也可以包含在該組合物中。藥物組合物與已有的給藥途徑相適合。給藥途徑包括不經(jīng)胃腸道的給藥途徑，比如靜脈注射、皮內(nèi)注射、皮下注射、口服(例如，吸入藥劑)、透皮給藥(局部的)、粘膜吸收和直腸給藥。用于不經(jīng)胃腸道的、皮內(nèi)或皮下的溶液或懸液包括以下組分像注射用水、鹽溶液、固定油、聚乙二醇、丙三醇、或其他合成的溶劑等無菌稀釋液；如苯甲醇、木精類抗菌劑；如抗壞血酸、 亞硫酸氫鈉類的抗氧化劑；如乙二胺四乙酸類螯合劑；如乙酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽類緩沖液；如氯化鈉或右旋糖類可以調(diào)節(jié)溶液硬度的物質(zhì)。PH可以用酸或堿來調(diào)節(jié)，例如鹽酸或氫氧化鈉。胃腸道外給藥的前期準備過程可以在安瓶，一次性注射器或玻璃或塑料做的多劑量的小瓶中進行。適合血管注射用的藥物組合物包括無菌的水溶液(水溶性的)或分散的無菌的粉末，用的時候臨時用無菌注射溶液或分散系來溶解。對于靜脈注射，適合的載體有生理鹽水、抑菌水、聚氧乙烯蓖麻油(BASF，Parsippany，NJ.)或磷酸鹽緩沖液(PBS)。無論何種情況，這些藥物組合物必須是無菌的并且流動性應該達到容易容易通過注射器流動的程度。 它在制造和儲存的條件下應該是穩(wěn)定的，必須保存在沒有如細菌和真菌污染等微生物活動的地方。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，例如，水，乙醇，多元醇(如甘油，丙二醇，液體的聚乙烯乙二醇等等)并且要適和混合物。使用卵磷脂涂層，分散的情況下保持所需的粒度和使用表面活性劑都可以保持適當?shù)牧鲃有?。各種抗菌和抗真菌劑可以防止微生物的作用，例如，苯甲酸酯，三氯叔丁醇，酚，抗壞血酸，硫柳汞等。在許多情況下，藥物組合物中最好還包括等滲劑，例如，糖和甘露醇，山梨醇，氯化鈉等組成的多元醇。例如，使用單硬脂酸鋁和凝膠等延遲吸收的制劑，持續(xù)吸收的注射藥物組合物可以延長的吸收時間。無菌注射液，可以通過含有所需劑量的活性成分在的適當?shù)娜軇┲兄苽?，該溶劑含有一個或多個上面列舉的物質(zhì)，根據(jù)需要，輔以過濾除菌。一般來說，分散系的制備是將該活性成分加入到無菌的媒介中，該無菌的媒介中包含了一個基本的分散介質(zhì)和上面列舉的必需的其他成分。在制備無菌注射液的無菌粉末時，準備的首選方法是真空干燥和冷凍干燥，產(chǎn)生的活性成分的粉末可以添加先前用無菌過濾獲得的任何期望得到的成分。口服藥物組合物成分一般包括一種惰性稀釋劑或一種可食用的載體。為了到達口服治療給藥的目的，活性成分可以結(jié)合有輔料中，以片劑，膠囊劑，如明膠膠囊的形式使用。 口服藥物成分也可以用液體載體制備并以漱口水的方式來使用。藥物兼容的結(jié)合劑，和/ 或輔助材料可以作為該藥物組合物的組成部分。片劑，丸劑，膠囊劑，錠劑等都可以包含下列成分或類似性質(zhì)的組成，如微晶纖維素，膠黃蓍膠或明膠的粘結(jié)劑；賦形劑，如淀粉或乳糖，崩解劑或玉米淀粉等褐藻酸；潤滑劑，如硬脂酸鎂或留酮，如膠體二氧化硅的助流劑，甜味劑，如蔗糖或糖精；或調(diào)味劑，如薄荷，水楊酸甲酯，或橙子調(diào)味劑。
為了吸入藥劑，該藥物組合物以氣霧的形式從壓力容器或劑量器分配器 (dispenser)中給藥，其中包含一個合適的推進劑，例如，如二氧化碳氣體，或霧化器噴霧。這些方法已經(jīng)在美國專利中No. 6468798有所描述。也可以轉(zhuǎn)化粘液質(zhì)或透皮手段進行全身給藥。為了轉(zhuǎn)化粘液質(zhì)或透皮給藥，可以用滲透劑來滲透適當?shù)钠琳稀＿@樣的滲透劑一般都是人們所熟知的，包括，例如對于轉(zhuǎn)化粘液質(zhì)給藥，有洗滌劑，膽鹽，夫西地酸衍生物。轉(zhuǎn)化粘液質(zhì)給藥可以通過使用鼻腔噴霧劑或栓劑來實現(xiàn)。對于透皮給藥，活性混合物一般被配制成軟膏，藥膏，凝膠或面霜的形式。所述藥物組合物也可制成栓劑(例如，傳統(tǒng)的栓劑，如可可脂和其他甘油酯基地)的形式或灌腸劑的形式，以便于直腸給藥。該混合物也可以通過包括轉(zhuǎn)染或感染方式給藥，但不局限于下列文獻中描述所的方法(McCaffrey等.^00 ，Nature, 418(6893), 38-9(hydrodynamic transfection) ；Xia 等.(2002), Nature Biotechnol., 20 (10),1006-10(viral-mediated delivery) ；or Putnam(1996), Am. J. Health Syst. Pharm. 53(2)，151—160，erratum at Am. J. Health Syst. Pharm. 53(3)，325(1996))。所述藥物組合物也可通過任何適合于核酸給藥的方法進行給藥，如DNA疫苗。 這些方法包括基因槍，生物噴油，和皮膚補丁以及無針的方法，如美國專利No. 6，194，389 披露的微觀粒子DNA疫苗和美國專利技術No. 6168587披露的哺乳動物透皮粉狀疫苗的無針疫苗接種。此外，也可如 inter alia, Hamajima 等.(1998)，Clin. Immunol. Immunopatho 1.，88 (2)，205-10描述的那樣，鼻腔內(nèi)給藥也是可能的。脂質(zhì)體(例如，美國專利No. 6，472，37 和微膠囊也可以用。定位的可生物降解微粒給藥系統(tǒng)也可以使用(例如，美國專利No. 6，471，996)。在一個實施例中，藥物活性成分與載體一起制備，以防止該活性成分在體內(nèi)迅速消除，如一個釋放控制劑，包括植入物和微膠囊輸送系統(tǒng)。可生物降解的，生物相容性的聚合物，如乙烯-醋酸乙烯，聚酐，聚乙醇酸，膠原蛋白，聚原酸酯和聚乳酸。這些制劑可使用標準的技術來制備。這些材料也可以從Alza公司和Nova制藥公司購買得到，注射的脂質(zhì)體懸浮液(包括用病毒抗原和單克隆抗體的脂質(zhì)體有針對性地感染細胞)也可作為藥物可接受的載體。這些都可以通過被人們所熟知的方法來制備，如在美國專利No. 4，522，811所描述。可用細胞培養(yǎng)或動物實驗等標準制藥程序來確定這類藥物組合物的毒性和療效， 如確定LD5tl (50%的致死劑量)的ED5tl(50%的有效劑量治療)。毒性和治療效果之間的劑量比就是治療指數(shù)，它可以用LD5(i/ED5(i的比例表示。優(yōu)選的藥物組合物是具有較高治療指數(shù)的。而對于表現(xiàn)出有毒副作用的組合物，也可以使用，應設計一個轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，使這種混合物只針對受感染的組織位點，以盡量減少潛在的損害到未受感染的細胞，從而減少副作用。從細胞培養(yǎng)實驗和動物實驗獲得的數(shù)據(jù)可以用來制定在人體內(nèi)使用的劑量范圍。 這種藥物組合物的劑量，循環(huán)濃度的范圍最好在很少或根本沒有毒性的ED5tl范圍內(nèi)。根據(jù)采用的劑量形式和給藥途徑的不同，用量可以在此范圍內(nèi)變動。對于本發(fā)明所述方法中使用的任何組合物，治療有效劑量可用細胞培養(yǎng)實驗初步估計。在動物模型中制定出的劑量， 其循環(huán)的血藥濃度范圍會在細胞培養(yǎng)確定的IC5tl(即測試的混合物的濃度達到半數(shù)最大抑制的癥狀)之上。這些信息可用于更準確地確定在人體中有效劑量。例如，可通過高效液相色譜法測得的血漿中藥物的水平。本文中定義，核酸分子的治療有效的量(即有效劑量)取決于選定的核苷酸。例如，如果一個質(zhì)粒被用來編碼DsiRNA，使用的單劑量數(shù)量約在Ipg至IOOOmg的范圍內(nèi)；在一些實施例中，可使用 10，30，100，或 lOOOpg，或 10，30，100 或 lOOOng，或 10，30，100，或 10001^，或10，30，100或100011^。在一些實例中，可以使用l_5g的藥物組合物。該藥物組合物每天可以使用一次或多次到每周一次或多次；包括隔日一次。本領域的技術人員須知，某些因素可能會影響到有效地治療一個個體所需的劑量和時間，包括但并不局限于疾病或紊亂的嚴重程度、以前的治療情況、個體的健康和/或年齡問題以及目前其他的疾病。 此外，使用治療有效量的一種蛋白質(zhì)，多肽，抗體來治療一個個體時，可以是一個單一的治療方法，但最好能包括一系列的治療?？烧J可的，將所述DsiRNA分子引入細胞環(huán)境的方法，取決于細胞的類型和其環(huán)境。例如，當細胞在液體中時，最好使用脂質(zhì)的形式，例如脂質(zhì)體和DsiRNA可直接加入到細胞的液體環(huán)境中。脂質(zhì)的形式也可以用于如動物導入，如靜脈靜注，肌肉射注，或腹腔注射， 或口服或吸入或其他方法。當這種形式適合導入到動物，如哺乳動物或更具體的人類，這種形式藥學上也是可接受的。在藥學上可接受的可用于導入寡核苷酸的形式是已知的并且是可以被利用的。在某些情況下，最好是將DsiRNA溶解在緩沖液或生理鹽水溶液，直接注入細胞與研究的卵母細胞中。直接注射DsiRNA雙鏈也可以。對于導入dsNA的合適的方法 (例如，DsiRNA劑)，見美國已經(jīng)公布的專利申請?zhí)?2004/0203145Alo適當數(shù)量的DsiRNA必須引入并且這個數(shù)量可以用標準的方法來大致確定。通常情況下，在細胞環(huán)境中使用的單個DsiRNA的有效濃度約50nmol或更少，IOnmol或更少，或約Inmol或更少。在另一個實施例中，利用的約200pmol或更少的濃度，甚至約50pmol或更少，約20pmol或更少，約IOpmol或更少，或約5pmol或更少的方法，在許多情況下都可以使用。該方法可以添加DsiRNA的組合物到任何細胞外基質(zhì)中，被提供了 DsiRNA的組合物的細胞外基質(zhì)中的細胞能存活，以使足夠數(shù)量的DsiRNA可以進入細胞，從而發(fā)揮其作用。例如，對于像在液體培養(yǎng)或細胞生長培養(yǎng)基等液體中的細胞、組織外植體，或整個生物體，包括動物，如哺乳動物，特別是人類，目前使用的方法是適合的。可以利用現(xiàn)在已知的任何合適的方法或后來發(fā)展的方法來確定目標RNA的水平或活性。可以知道，用來衡量一個目標RNA和/或目標RNA的表達水平的方法依賴于靶RNA的性質(zhì)。例如，如果目標RNA 編碼蛋白質(zhì)，則“表達”時期可以參考蛋白質(zhì)或RNA/來自靶RNA的轉(zhuǎn)錄本的量。在這種情況下，確定一個目標RNA的表達，可通過測量相應的靶RNA的RNA量，或測量這種蛋白質(zhì)的量。蛋白可通過染色或免疫印跡來測量，或者如果該蛋白質(zhì)可催化一個反應，可以通過測量反應速率來測量蛋白質(zhì)的含量。所有這些已知的方法都可以使用。當要測量靶RNA的水平時，任何公認的RNA水平檢測的方法都可用(如RT-PCR，Northern雜交等)。當用該發(fā)明的DsiRNA來針對病毒的RNA時，也希望測量DsiRNA對目標病毒在個體，組織，細胞中降低的水平。無論在體外或體內(nèi)，或在細胞的提取物中，也可以用來確定目標病毒RNA(S)水平的減少程度。任何上述測量方法都可以用于細胞，細胞提取物，組織，組織提取物或任何其他合適的原材料的測量。可通過任何合適的并可以可靠地檢測RNA水平變化的方法來確定目標RNA的表達是否已經(jīng)減少。通常情況下，對導入細胞環(huán)境中未消化DsiRNA的確定，可以知道至少一部分DsiRNA進入細胞的細胞質(zhì)中，然后測量目標RNA水平。在相同的未經(jīng)處理的細胞進行相同的測量，并把每次測量所得的結(jié)果進行比較。
所述DsiRNA可作為藥物組合物的組成成分，其中包括一個藥理有效量的DsiRNA 和藥學上可接受的載體。一個藥理或治療有效量是指，一個DsiRNA的數(shù)量，有效地產(chǎn)生預期的藥理的、治療的或預防的結(jié)果。這里所說的“藥理有效量”和“治療有效量”或簡單的 “有效量”是指產(chǎn)生預期的藥理的、治療的或預防的結(jié)果的有效的RNA的量。例如，如果一個臨床治療被認為是有效的，只有當至少有一個可衡量的并與該疾病或紊亂相關的參數(shù)減少 20%，有效地治療這種疾病或紊亂的藥物治療量是至少在該參數(shù)減少20%所需的量。本發(fā)明所述的合適的藥物組合物的給藥途徑可以是本領域公知的任何方法，例如通過腸外路線，包括靜脈注射，肌肉注射，腹腔注射，皮下注射，透皮吸收，氣道(氣溶膠)， 直腸，陰道和外用(包括口腔和舌下)等已知的任何手段給藥。在一些實施例中，所述藥物組合物可通過靜脈注射或腸內(nèi)灌輸或注射給藥。在一般情況下，一個合適的dsNA劑量單位的范圍在0. 001到0. 25毫克每公斤體重每天每個受體，或在每天每公斤體重0. 01 20微克的范圍內(nèi)，或0. 01至10微克的范圍內(nèi)每天每公斤體重，或在0. 10至5微克的范圍內(nèi)每天每公斤體重，每天每公斤體重0. 1至 2.5微克的范圍內(nèi)。包含有dsNA的藥物組合物可每日給藥一次。然而，治療劑中也可以含有二，三，四，五，六個或更多的子劑量，在適當?shù)臅r間間隔全天分次服用。在這種情況下， dsNA在每個子劑量必須相應地小，以達到每日總劑量單位。劑量單位也可以組合成跨越數(shù)天的一個單劑量，例如使用傳統(tǒng)的緩釋制劑提供了數(shù)天持續(xù)和一致的dsNA釋放的。緩釋制劑在本領域是眾所周知。在這個實施例中，劑量單位包含相應的每日劑量的倍數(shù)。不管如何，藥品成分必須包含足夠的數(shù)量的dsNA，以抑制正在接受治療的動物或人類的靶基因的表達。以這樣一種方式，含有足夠劑量的多個單位的dsNA成分形成復合的混合物。從細胞培養(yǎng)實驗和動物實驗獲得的數(shù)據(jù)可以用來制定在人體內(nèi)使用的劑量范圍。 這種組合物的劑量，循環(huán)濃度的范圍最好在很少或根本沒有毒性的ED5tl (用已知的方法測得)范圍內(nèi)。根據(jù)采用的劑量形式和給藥途徑的不同，用量可以在此范圍內(nèi)變動。對于本發(fā)明所述方法中使用的任何組合物，治療有效劑量可用細胞培養(yǎng)實驗初步估計。在動物模型中制定出的劑量，其循環(huán)的血藥濃度范圍會在細胞培養(yǎng)確定的IC5tl(即測試的組合物的濃度達到半數(shù)最大抑制的癥狀)之上。這些信息可用于更準確地確定在人體中有效劑量。 例如，可通過高效液相色譜法測得的血漿中藥物的水平。藥物組合物可以包括在具有使用說明的試劑盒，容器，包裝袋或劑量器分配器中。治療方法本發(fā)明提供了預防和治療一個個體有(或容易)引起疾病或紊亂的風險，或全部或局部性已經(jīng)產(chǎn)生疾病，這種疾病由目標RNA表達和/或目標RNA的存在引起(例如，在病毒感染的情況下，病毒的基因組，衣殼蛋白，宿主細胞等組成部分等的目標RNA的存在)。此處使用的“治療”，或“處理”，被定義為給病人應用或服用一個治療劑(例如， DsiRNA或載體或編碼相同產(chǎn)物的基因)，或者給從有疾病或紊亂，或有疾病或紊亂的癥狀或有發(fā)展為疾病或紊亂的傾向的病人分離的組織或細胞系應用或服用一個治療劑，為了治愈，愈合，減輕，緩解，改變，補救，提高或影響該疾病或紊亂，疾病或紊亂的癥狀，或疾病的易感性。一方面，如上所述，該發(fā)明提供了一種防止個體疾病或紊亂的方法，該方法通過給個體使用一種治療劑(例如，一個DsiRNA或一個載體或編碼相同產(chǎn)物的基因)。有這種疾病的存在風險的個體可以用如本文所述的任何診斷或預兆分析相結(jié)合的方法來識別。一個藥物可以在疾病還未被發(fā)現(xiàn)的時候使用，例如，受病毒顆粒感染的個體，或表現(xiàn)出疾病或紊亂的癥狀特征，這樣疾病或紊亂就會被阻止或延遲其發(fā)展的速度。本發(fā)明所述發(fā)方法對個體治療的另一個方面，即改變疾病或紊亂的發(fā)病癥狀。這些方法可以在體外(例如，細胞和DsiRNA—起在體外培養(yǎng))或者在體內(nèi)執(zhí)行(例如，對個體給予DsiRNA)。對于所述關于預防和治療的方法，是以從藥物基因組學領域中獲得的知識為基礎，這樣的治療可以是特定的方案或者改進的方法。此處使用的“藥物基因組學”，是指在基因測序，統(tǒng)計遺傳學和基因表達分析，在臨床開發(fā)和市場上的藥物，如基因組學技術的應用。更具體地說，這個詞是指對病人的基因是如何確定他或她的反應的藥物(例如，病人的 “藥物反應表型”，或“藥物反應的基因型”)的研究。因此，另一方面，利用與本發(fā)明的目標 RNA分子或根據(jù)個體藥物反應的基因型的靶RNA調(diào)制器(RNAmodulators)，本發(fā)明提供了針對個體的預防或治療的制定的方法。藥物基因組學允許臨床醫(yī)生或內(nèi)科醫(yī)師使用的目標的預防或治療方法，是最受益于病人的治療方案，以避免治療的患者會遇到有毒的藥物引起相關副作用。治療的藥物可以在一個合適的動物模型進行測試。例如，對于本發(fā)明所述的一個DsiRNA(或表達載體或編碼相同產(chǎn)物的基因)，可以用動物模型來判斷該治療劑療效， 毒性或副作用。另外，治療劑可用于動物模型中，來確定該治療劑的作用機制。例如，一個治療劑可以用一個在動物模型來確定該治療劑的療效，毒性，副作用或療法。另外，一個治療劑可用于一個動物模型中，來確定該治療劑的作用機制。本發(fā)明采用的方法，除非另有說明，都是該領域內(nèi)的技術，包括傳統(tǒng)的化學，分子生物學，微生物學，DNA重組，遺傳學，免疫學，細胞生物學，細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因生物學，例如，Maniatis等，1982，分子克隆(冷泉港實驗室出版社，冷泉港實驗室，紐約)。Sambrook 等，1989年，分子克隆，第二版。(冷泉港實驗室出版社，冷泉港實驗室，紐約)；Sambrook and RuSSell，2001年，分子克隆，第3版，(冷泉港實驗室出版社，冷泉港實驗室，紐約)； Ausubel等，1992年，現(xiàn)代分子生物學指南(John Wiley父子，包括定期更新)；Glover，1985 年,DNA 克隆(IRL 出版社，牛津)；Anand, 1992 年，Guthrie 和 Fink, 1991 年，Harlow和 Lane， 1988年，抗體，(冷泉港實驗室出版社，冷泉港實驗室，紐約)Jakoby和Pastan, 1979年， 核酸雜交(B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984)；轉(zhuǎn)錄和翻譯(B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984)；固定化細胞和酶(IRL出版社，1986)；動物細胞培養(yǎng)(R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc. ,1987) ；B. Pertal，分子克隆實用指南(1984)；專著，酶學方法(科學出版社， 紐約)；(J. H. Miller and Μ. P. Calos eds.，1987年，冷泉港實驗室)哺乳動物細胞基因轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)運載體；酶學方法，第巧4倦和第155倦(mi等人合編)，在細胞和分子生物學中的免疫化學方法(Mayer and Walker，eds.，學術出版社，倫敦，1987年)；免疫學實驗手冊“， 第 I-IV 卷(D. M. Weir and C. C. Blackwel 1, eds.，1986) ；Riott，免疫學基礎，第 6 版，布萊克威爾科學出版物，牛津，1988年；Hogan等，小鼠胚胎操作，(紐約冷泉港實驗室，冷泉港實驗室出版社，1986) ；ffesterfield, M.斑馬魚，斑馬魚實驗使用指南(Danio rerio),(第4 版，俄勒R州尤金大學出版社，2000)。除非另有說明，這里所用的所有的技術和科學詞匯與該發(fā)明所屬領域的通常理解的涵義相同。雖然用來實踐或測試本發(fā)明方法和材料類似或相同于上述描述，合適的方法和材料描述如下。此處提及的所有出版物，專利申請，專利，和其他參考文獻都已全部納入。 如發(fā)生矛盾，本發(fā)明的說明書，包括定義，將受限制。此外，材料，方法和例子僅供說明，而本發(fā)明并不受限于此。
實施例本發(fā)明通過引用下面的實施例加以闡述，這些實施例只是為了提供說明，而并不會以任何方式限制本發(fā)明。采用了本領域所熟知的標準的技術或下文所述的技術。實施例1-方法寡核苷酸的合成，在體外使用根據(jù)標準方法 integrated DNA Technologies, Coralville, Iowa)合成一條 RNA 鏈，并用HPLC純化。所有寡核苷酸鏈的質(zhì)量控制在高效液相色譜法的化學純的基礎上，全長鏈的純度通過質(zhì)譜來分析。使用前，雙鏈RNA DsiRNAs通過將每一條鏈按同等數(shù)量混合來制備，在緩沖液(IDT)中快速加熱到100°C，然后讓混合物冷卻至室溫。寡核苷酸合成，在體內(nèi)使用根據(jù)標準方法(Oligoi^actory，Holliston,ΜΑ)合成一條 RNA 鏈，并用 HPLC 純化。 所有寡核苷酸鏈的質(zhì)量控制在高效液相色譜法的化學純的基礎上，全長鏈的純度通過質(zhì)譜來分析。使用前，雙鏈RNA =DsiRNAs通過將每一條鏈同等數(shù)量混合來制備，簡要地，在緩沖液(IDT)中加熱到100°C，然后讓混合物冷卻至室溫。細胞培養(yǎng)和RNA轉(zhuǎn)染從ATCC獲得HeLa細胞，培養(yǎng)在含10 %胎牛血清(HyClone)的Dulbecco ‘ s modified Eagle培養(yǎng)基(HyClone)上，培養(yǎng)條件37 °C，5 %的二氧化碳。對于圖2中的 RNA轉(zhuǎn)染，HeLa細胞以虹105細胞的密度接種到6孔板的培養(yǎng)皿中，最終體積2毫升，培養(yǎng)過夜。M小時后，按照制造商的說明，使用01 igofectamine (Invitrogen)以20nM終濃度的DsiRNA轉(zhuǎn)染細胞。簡單地說，含5 μ M的DsiRNA儲存液8 μ L用200 μ L的OPTI- MEM (Invitrogen)混合。在一個單獨的管中，12 μ L 01 igofectamine 與 48 μ LOPTI- MEM 混合后，在室溫(RT)下共孵育5分鐘，DsiRNA和Oligofectamine 會結(jié)合在一起，輕輕振蕩， 進一步在室溫下共孵育20分鐘，讓DsiRNA 01 igofectamine 形成復合物(轉(zhuǎn)染復合物)。 最后，培養(yǎng)基中添加最終體積的2ml的轉(zhuǎn)染混合物。經(jīng)過6個小時的共孵育，在每個孔的轉(zhuǎn)染/培養(yǎng)基用新鮮的培養(yǎng)基更換，接著細胞再共孵育18小時。對于圖3-5中RNA的轉(zhuǎn)染，根據(jù)制造商的說明，使用Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen)將最終濃度為0. InM的DsiRNAs轉(zhuǎn)染HeLa細胞。簡言之，含 0. 02 μ M 的 DsiRNA 儲存液 2. 5 μ L,混入 46. 5 μ L 的 Opti-MEM(Invitrogen)禾口 1 μ L 的 LipofectamineTMRNAiMAX。所得的50 μ L混合物加入到12孔板的每個孔中，并在室溫下孵育20分鐘，得到DsiRNA :Lipofectamine RNAiMAX復合物。同時，HeLa細胞用胰酶消化并用培養(yǎng)基重懸至終濃度為367細胞/μ L。最后，450μ L的細胞懸液加到每孔(終體積 500 μ L)平板中，并將平板放置到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)M小時。RNA的提取和分析，在體外的例子細胞用2ml的PBS洗滌一次，使用RNeasy Mini Kit (Qiagen)提取總RNA，最后的洗脫體積為30 μ L。根據(jù)制造商的說明，用Transcriptor 1st Strand cDNA Kit (Roche)反轉(zhuǎn)錄總的1 μ g RNA,并形成隨機六聚體。生成的三十分之一(0. 66 μ L)的cDNA與5 μ 1 iQ Multiplex Powermix(Bio-Rad)混合，再加入 3. 33 μ L 的水和 1 μ 1 濃度為 3 μ M 的 2對引物和2對探針的混合物，該探針和引物是特異性地針對人類HPRT-I基因(登錄號 ΝΜ_000194)和 SFRS9 基因(登錄號 ΝΜ_003769)Hu HPRT 正向引物 F517GACTTTGCTTTCCTTGGTCAGHu HPRT 反向引物 R591GGCTTATATCCAACACTTCGTGGGHu HPRT 探針 P554Cy5-ATGGTCAAGGTCGCAAGCTTGCTGGT_IBFQ
Hu SFRS9 正向引物 F569TGTGCAGAAGGATGGAGTHu SFRS9 反向引物 R712CTGGTGCTTCTCTC AGGATAHu SFRS9 探針 P644HEX-TGGAATATGCCCTGCGTAAACTGGA-IBFQ體內(nèi)樣品的制備和注射根據(jù)制造商(Invitrogen,Carlsbad, CA)的說明，采用 Invivofectamine 試齊[J 盒制備DsiRNA。簡言之，對所使用的小鼠N/組和小鼠的體重進行了測量，然后對各組治療小鼠所需要的DsiRNA量進行了計算。按10mg/kg的劑量，對于4只25g的小鼠來說， ImlIVF-oligo 就足夠了。Img 的 DsiRNA 加入到 Iml 的 Invivofectamine 中，并在室溫下混合30分鐘。使用Hml 5%的葡萄糖來稀釋制備的IVF-DsiRNA，在離心機(Amicon)上用50kDa截留分子量的膜濃縮IVF-DsiRNA。離心機在4°C下，4000rpm離心2小時，直到 IVF-DsiRNA體積減至不到1ml?；厥盏腎VF-DsiRNA用Iml 5%葡萄糖稀釋，并準備注射動物。動物注射和組織收獲通過注射氯氨酮/甲苯噻嗪來麻醉動物。每只小鼠在注射前稱量。按照lOOul/lOg 體重的量靜脈注射IVF-DsiRNA。M小時后，用吸入二氧化碳的方法處死小鼠。收集需要分析的組織并置于含有aiilRNAlate/^Qiagen)的管中，首先在室溫下旋轉(zhuǎn)30分鐘，然后在 40°C共孵育過夜。組織隨后儲存于_80°C，直到使用。組織RNA的制備與定量約50-100mg 組織塊在含有 lmlQIAzolT、Qiagen)的 Tissue Lyser (Qiagen)中制成勻漿。根據(jù)制造商的說明分離總RNA。簡言之，0.2ml氯仿(Sigma-Aldrich)添加到 QIAzol 裂解液中并大力震蕩混合，在4°C，14000rpm離心15min后，收集水相，加入0. 5ml 的異丙醇。再14，OOOrpm離心IOmin后，將RNA沉淀用75%乙醇洗滌一次，干燥。分離出的RNA懸浮于IOOul無RNase水中，根據(jù)制造商的說明，采用RNeasy 總RNA制備試劑盒 (QIAGEN)或SV96總RNA分離系統(tǒng)(ftOmega)來進一步純化。cDNA第一鏈的合成，示例在體內(nèi)的合成，根據(jù)制造商的說明，1 μ g總RNA使用 Transcriptor 1st Strand cDNA Kit (Roche)在 oligo-dT 的作用下反轉(zhuǎn)錄出第一鏈 cDNAo 產(chǎn)生的四十分之一(0. 66 μ L)的 cDNA 與 5 μ L IQ Multiplex Powermix(Bio-Rad) 混合在一起，再加入3. 33 μ L的水和1 μ L含有3 μ M的2套引物和探針的混合液，該引物和探針分別特異性地針對小鼠HPRT-I基因(登錄號匪013556)和KRAS基因(登錄號 ΝΜ_021284) Mm HPRT 正向引物 F576CAAACTTTGCTTTCCCTGGT
Mm HPRT 反向引物 R664CAACAAAGTCTGGCCTGTATC
Mm HPRT 探針 P616Cy5-TGGTTAAGGTTGCAAGCTTGCTGGTG_IBFQMm KRAS 正向引物 F275CTTTGTGGATGAGTACGACCMm KRAS 反向引物 R390CACTGTACTCCTCTTGACCTMm KRAS 探針 P297FAM-ACGATAGAGGACTCCTACAGGAAACAAGT-IBFQ定量RT-PCR一個有QOOO熱循環(huán)儀(BIO-RAD)的CFX96實時系統(tǒng)用于擴增反應。PCR反應條件95°C 3mm ；然后是40個循環(huán)的95°C，IOsee ；55°C, Imin0每個樣品進行三次測試。對于 HPRT基因，HPRT基因相對的mRNA的水平通過SFRS9mRNA的水平來標準化，并與轉(zhuǎn)染錯配雙鏈的對照組的mRNA水平或未經(jīng)處理的對照組的mRNA水平作對比。對于KRAS基因，KRAS基因相對的mRNA的水平通過HPRT-I mRNA的水平來標準化，并與用5%葡萄糖處理的小鼠的 mRNA水平作對比。數(shù)據(jù)經(jīng)Bio-Rad CFX Manager version 1.0(體外的例子)或1.5(體內(nèi)的例子)軟件來分析。實施例2-具有延長的DNA雙鏈的DsiRNA分子的效能對具有延長的DNA雙鏈的DsiRNA分子檢測其對序列特異性靶mRNA的抑制效率。 具體來說，針對HPRT的DsiRNA雙鏈，擁有RNA延長，DNA延長或混合DNA和RNA延長的結(jié)構，將它們以固定濃度20nM轉(zhuǎn)染HeLa細胞，M小時后，檢測HPRT基因的表達水平(圖2A和 2B)。轉(zhuǎn)染實驗每個做兩次，HPRT基因的表達量每個用定量PCR檢測三次。在這種條件下， 轉(zhuǎn)QOnM雙鏈，01 igofectamine轉(zhuǎn)染)，轉(zhuǎn)染1至6號雙鏈，HPRT基因表達減少了 30-50 %。 含有DNA替換物的6號雙鏈從引導鏈(反義鏈)的5'端開始，形成了一個IObp (堿基對) 區(qū)域，最終長度為33/35mer。7號雙鏈與6號雙鏈的長度和序列是相同的，但其含有4個DNA 核苷酸的修飾，如圖2B所示的位置。令人驚訝的是，7號雙鏈對HPRT基因表達量的減少明顯低于6號雙鏈，這表明Dicer酶識別延長的RNA區(qū)域是在DNA堿基之間，并切割雙鏈成為交替的siRNAs。并且可以看到，DsiRNA (雙鏈8)的硫代磷酸化修飾DNA: DNA延長區(qū)域，能夠消除DNA-延長的DsiRNA的RNA抑制活性。在有足夠多的PS-DNA基團替代與未修飾的 DNA基團存在的情況下，8號雙鏈的活性可以被恢復。事實上，這樣未修飾的DNA殘基的“加回”(”add-back")到這樣的雙鏈中，是本發(fā)明強調(diào)的一個主要的優(yōu)勢-與非延長的雙鏈相比，本發(fā)明所述雙鏈可進行更多的修飾，同時仍保留RNA的抑制活性，對于存在串聯(lián)和/ 或空間緊密的修飾殘基也是本發(fā)明的一個重要的進步(在這里，當串聯(lián)的配對的PS-DNA的殘基存在于8號雙鏈時，就會徹底去除RNA的抑制活性)。實施例327/^9mer雙鏈的劑量反應的比較。為了測試DNA雙鏈延長的DsiRNA在降低濃度時的的功效，以修飾后的針對HPRT 的雙鏈與一個優(yōu)化的雙鏈ΖΤΛΘπιθγ做比較，在10. 0納摩爾(ηΜ)，1. 0納摩爾(nm)和100 皮摩爾(IOOpM or 0. InM)的系列濃度下的實驗劑量，來降低HeLa細胞中HPRT基因mRNA 的水平。雙鏈DsiRNAl是一個25/27mer的DsiRNA雙鏈的衍生物，以前報道是具有活性的 HPRT-I, (Rose 等.NAR 2005，Collingwood 等· 2008。)；然而，目前的雙鏈(#1)每一條鏈有兩個堿基的插入，延長寡核苷酸雙鏈成為一個27/29mer。雙鏈2與雙鏈1的序列是相同的，但是在引導鏈(反義序列)上以DNA的形式有兩個堿基插入和添加的2個核苷酸。因此，在雙鏈2引導鏈的5'端以4DNA bp (堿基對)為末端，相比之下，以前報告在“過客(正義)鏈上有兩個堿基的DAN替代(Rose等，2005)。雙鏈3 (MM對照)來自于優(yōu)化的HPRT雙鏈1，但其中含有與目標RNA序列錯配的合成序列。每一條鏈的堿基組成和化學修飾、堿基序列和雙鏈3末端的懸垂或鈍性末端末端相對于優(yōu)化了的HPRT-I雙鏈都保持不變，以控制非針對性的化學效應(見圖5)。也測試了未經(jīng)處理的細胞中的HPRT的基本表達(圖3A中的“C”)。雙鏈1和雙鏈2的推定的Dicer加工產(chǎn)物彼此都是相同的(見圖IA)，并且也與圖 2b所示的Dicer酶的加工產(chǎn)物相同。轉(zhuǎn)染濃度在IOnM和hM時，雙鏈1和雙鏈2對HPRT 基因RNA表達水平的降低至少達95 %，這表明雙鏈2的末端添加雙鏈DNA并沒有干擾Dicer 酶與雙鏈的結(jié)合以及將雙鏈2加工成相應的結(jié)構，該結(jié)構進入并指導RISC作用于HPRT基因。雙鏈2的濃度在IOOpM時，HPRT基因表達量減少了 90%，活性超過雙鏈1的2倍以上， 雙鏈1減少了 HPRT基因的表達量約75%。實施例4- 二，六，八個DNA堿基對的雙鏈延長的比較為了研究可以引入到一個DsiRNA中雙鏈DNA延長的長度，與含有長度相當?shù)牡难娱L的雙鏈RNA的DsiRNA做比較時，DNA雙鏈-延長的DsiRNA具有提高了的功效和/或持續(xù)合成能力，于是生成了一系列雙鏈核酸，并檢測了兩個堿基對，6個堿基對，8個堿基對的延長的情況(這樣的延長物的正常的長度還包括正義鏈的3'末端倒數(shù)第二個和最后一個脫氧核糖核苷酸殘基，其于反義鏈的5'末端的同源脫氧核糖核苷酸堿基配對，如圖4A-4D所示，導致了 “DNA 4bp”雙鏈#4，“DNA 8bp”雙鏈#5、和“DNAlObp”雙鏈#6)。用來抑制基因表達的雙鏈3是33/35mer，含有延長兩個堿基對的DNA RNA雙鏈區(qū)和6個堿基對的RNA RNA 雙鏈區(qū)(見圖4A-4D)，相對于雙鏈1 (是一個27/29mer，有兩個堿基對RNAiRNA的雙鏈延長)和雙鏈2 (是一個31/3;3mer，有六堿基對RNAiRNA的雙鏈延長)，雙鏈3對基因表達的抑制作用有所降低，增加RNA雙鏈的長度會降低RNAi活性，這與以前的報道是一致的。值得注意的是，RNAiRNA延長雙鏈1，2和3與相應的具有DNAiDNA延長的雙鏈4，5和6相比， 都表現(xiàn)出活性的降低。RNA插入/DNA系列和DNA系列之間最大的活性差別是在ΙΟΟρΜ，但在IOpM時也檢測到差別(圖4B及4C)。圖4比較的雙鏈被設計為1)加強Dicer酶底物雙鏈混合加工的副作用，如果該副作用會發(fā)生；和2)消除核糖核酸酶H-介導的HPRT基因的mRNA降解的可能性。雙鏈的加工方式并不會產(chǎn)生一個標準的19-23個堿基長度的RNA鏈，如圖4b所示，從前導(反義)鏈的3'端開始，就不太可能發(fā)生有RISC介導的HPRT靶標mRNA水平降低。對長RNA雙鏈的偶然加工(例如，圖4D中的雙鏈3)會產(chǎn)生在種子區(qū)域包含錯配的引導鏈，從而降低了 RISC 對目標物的活性。偶然的加工也可能使RISC裝載過客(正義)鏈的寡核苷酸。在低濃度時，雙鏈3的活性明顯低于短的RNA，并有可能被加工成不太活躍的siRNA。如果含有DNA的長的雙鏈(例如，圖4D中的雙鏈6)被差異降解和/或不正確地加工，含有超過十個堿基單鏈寡核苷酸的反義DNA就有可能會生成。從理論上講，這種DNA可以激活核糖核酸酶H切割與其互補的靶mRNA。雙鏈4，5和6的DNA與HPRT基因錯配，因此觀察到的HPRT基因表達的減少與它們無關。在細胞攝取前，Dicer酶加工之前，或裝載到RISC之前，雙鏈的差異性降解也可能導致觀察到HPRT的差異性減少。雙鏈3含有兩個內(nèi)部替代的DNA核苷來控制該效應(從過客鏈的3'端開始標號的第9位和第10位)。如果DNA的替換增加了雙鏈的活性，僅僅是簡單的穩(wěn)定了雙鏈，以防止雙鏈被核酸酶降解，雙鏈3應該比雙鏈1或雙鏈 2更穩(wěn)定，并有可能同雙鏈4 一樣穩(wěn)定。相反，雙鏈3對HPRT目標mRNA水平降低的效率低于雙鏈1，2和4，說明當雙鏈DNA:DNA區(qū)域被引入時觀察到的促進作用，不能簡單地歸因于增強對核酸酶降解的抵抗力。類似的原理，如果DNA堿基對測試的雙鏈有明顯的穩(wěn)定作用， 那么增加的DNA堿基對的長度應該會逐步增強雙鏈4到雙鏈6的活性。然而，逐步增加DNA 的序列長度并沒有增加雙鏈的活性。鑒于上述結(jié)果，得出的結(jié)論是，DsiRNA擁有2個到10 個堿基對的雙鏈DNA:DNA延長區(qū)域(這樣的延長區(qū)域位于正義鏈的3'端預測的Dicer酶切割位點，和相應的位于反義鏈的5'端預測的Dicer酶切割位點)并在某些情況下，構成了有效增強的RNA抑制劑。實施例5-在低濃度下延長的DNA: DNA雙鏈功效的增加評估了一系列修飾了的、長度遞增的雙鏈在固定的濃度IOOpM時對HPRT基因mRNA 表達的降低情況。圖5A和5B顯示的是一個優(yōu)化了的25/27mer的Dicer酶的底物，含有化學修飾，引導(反義)鏈的3'端有兩個殘基的突出和兩個DNA堿基的替換，過客(正義) 鏈的3'端是平末端(Collingwood等，2008年)。每次插入兩個與HPRT基因非互補的堿基到RNA (雙鏈2至雙鏈5)或DNA (雙鏈6到雙鏈9，參見圖5和5B)以增加從27/29mers到 33/35mers總的雙鏈長度。雙鏈1與其他任何添加RNA堿基(雙鏈2至雙鏈5，圖5A)來“優(yōu)化的，，的雙鏈相比，能更有效地減少HPRT基因的表達水平，支持了更長的雙鏈有可能被加工成一個或多個不活躍的引導物這一觀點。所有的通過DNA堿基對(雙鏈6到雙鏈9 ；圖5A)來延長的雙鏈的活性明顯比雙鏈2-雙鏈5的活性更強，活性大致與雙鏈1相等。從雙鏈6到雙鏈9， 它們對HPRT基因表達量的減少程度沒有區(qū)別。因此，這些DNA堿基對區(qū)域并不是通過對核酸酶產(chǎn)生抵抗力而增加RNAi的活性(通過雙鏈2至雙鏈5之間的比較以及與雙鏈1的比較)。令人驚訝的是，增加DNA部分的的長度，也沒有對HPRT mRNA減少產(chǎn)生負面影響。所有的DNA雙鏈活性基本相同，并與同類RNA堿基的雙鏈相比有更大的活性。這些結(jié)果表明， 雙鏈2到雙鏈5中DNA的插入限制了 Dicer酶加工優(yōu)化的雙鏈1產(chǎn)生典型引導鏈的活性。實施例6-向左延長的DsiRNA的功效，包括含有錯配的DsiRNA (” DsiRNAmms")為了檢測有效的DNA:DNA延長的DsiRNA也是否和其反向(“翻轉(zhuǎn)”)的方向即上述的“向右延長的” DsiRNA —樣，通過上文所述方法，合成了 “向左延長的” DsiRNA，并測試了它的抑制效果。這種“向左延長的〃 DsiRNA(如圖7所示，在這個實施例中，30/^8mer的雙鏈在其正義鏈的5'末端區(qū)域的和反義鏈的3'的末端之間擁有5個堿基對的DNA:DNA 延長)直接比較了與相應的“向右延長的”DsiRNA的^/30mer對靶RNA的抑制效果。令人驚訝的是，觀察到“向左延長的” DsiRNA比“向右延長的” DsiRNA對KRAS基因的靶mRNA水平的抑制更有效。同樣令人吃驚的是，錯配的殘基既可以引入“向左延長的” 和“向右延長的” DNAiDNA延長的DsiRNA中一定的位置，而不是其他的，同時也保留這類分子的抑制功效。具體來說，DNAiDNA延長的“DsiRNAmm” (此處使用的名稱“DsiRNAmm”表示一個DsiRNA含有一個或多個錯配的堿基對，除了兩條鏈中的任一條的兩個末端核苷酸殘基的位置之外的一個位置)合成的錯配的堿基對存在于以下位置僅在第12位，僅在第14 位，僅在第16位，第14位和第18位一起，第12位和第16位一起(起始于預測的-Dicer 酶剪切的DsiRNAmm的反義鏈的5'末端殘基的第1位)。如圖8和圖9所示，單獨的第14位，單獨的第16位或第14、第18兩個位點一起具有錯配的DsiRNAmm，都是高效的抑制劑。令人驚訝的是，向左延長的“母本” DsiRNAs和DsiRNAmms在最初都有更大的抑制功效(IOOpM的量轉(zhuǎn)染HeLa細胞)，相比于向右延長的 “母本”DsiRNA劑和DsiRNAmm，其反義鏈的單獨的第14位，單獨的第16位或第14、第18兩個位置一起擁有錯配殘基的(當標號朝向3'方(即從5'到3'))，從預測-Dicer酶酶剪切DsiRNA或DsiRNAmm反義鏈上5'端第1位開始標號，見圖8)。除了具有反義鏈的第 14和第18兩個位點錯配的DsiRNAmm外，在濃度更高達IOOpM時，觀察到向左延長的DsiRNA 或DsiRNAmm與向右延長DsiRNA或DsiRNAmm相比具有更強的抑制效果，該實驗是可以重現(xiàn)的(圖9)。實施例7-有效的DsiRNA中硫代磷酸化修飾的位點和DNA殘基為了測試本發(fā)明的DNA:DNA延長的的序列是否可以在DsiRNA中提供額外的殘基，并且在這些殘基中可能進行有利的修飾，且保持DsiRNA的抑制活性，檢驗含多個硫代磷酸化修飾劑的堿基的DsiRNA的穩(wěn)定性。前期對硫代磷酸化修飾的siRNA研究顯示，當多個硫代磷酸化存在時，這類制劑可能對細胞有細胞毒性(Amarzguioui等.Nucleic Acids Research, 31 :589-595)，在一些siRNA的反義鏈的5 ‘或5'附件有硫代磷酸化修飾時， siRNA的抑制活性有所降低。如圖10所示，DsiRNA "DNA6bp(2PS) ”和“DNA6bp (4PS) ”展現(xiàn)出對相應的靶標mRNA (HPRT)的相似的抑制功效，這表明，這些分子的DNA延長雙鏈區(qū)可進行廣泛的修飾而不會對這些分子的靶標RNA的抑制功效產(chǎn)生不利影響。對Dicer酶對“向右延長的"DsiRNA的反義鏈上切割位點的5'端或其附近的脫氧核糖核酸的存在方式進行了研究。如圖10所示，從反義鏈5'末端一直至Dicer酶切割后反義鏈5'末端附近處含有脫氧核糖核苷酸延長的DsiRNA (見DP1055P/DP1057G和DP1058P/ DP1060G)都是有效的RNA干擾劑。DP1055P/DP1057G 和 DP1058P/DP1060G DsiRNA 并沒有到達預期的結(jié)果，因為以前認為，包括反義鏈的5'終端區(qū)域內(nèi)的末端脫氧核糖核苷酸應該位于正義鏈內(nèi)的所有 3' Dicer酶剪切位點的反義鏈的內(nèi)的5'處。(見DP1055P/DP1056G和DP1058P/DP1059G)。 如圖10所示，觀察到向左延長的DsiRNA是一種有效的抑制劑，而在DsiRNA的反義鏈的“種子”區(qū)范圍內(nèi)包含一個錯配的U:G，會造成抑制活性的水平稍微降低。檢測了本發(fā)明的"向右延長的”DsiRNA的硫代磷酸化修飾方式對鏈重量加重的影響。硫代磷酸化修飾“向右延長的"DsiRNA "DNA6bp (2PS)和“DNA6bp (4PS) ”的寡核苷酸鏈， 并將它們組合在一起，形成如圖11所示的DP1061P/DP1064G和DP1062G/DP1063P DsiRNA0 令人驚訝的是，DP1062G/DP1063P雙鏈，過客鏈上四個脫氧核糖核酸有硫代磷酸化修飾，在相應的引導鏈上只有兩個脫氧核糖核酸有硫代磷酸化修飾，而功效與“DNA6bp (2PS)，，一樣或比“DNA6bp(2PQ ”更好，然而DP1061P/DP1064G雙鏈，引導鏈有四個脫氧核糖核酸有硫代磷酸化修飾，在相應的過客鏈上只有兩個脫氧核糖核酸有硫代磷酸化修飾，不能作為有效的抑制分子。這些結(jié)果表明，本發(fā)明的DsiRNAs的延長區(qū)域的硫代磷酸化修飾方式，增加了修飾的過客鏈的重量，相對于具有相反的加重方式的引導鏈可能會保持最大的功效。實施例8-比較五個，十個或十二個DNA或RNA的堿基對的雙鏈延長情況進一步研究DsiRNAs結(jié)構延長的影響，在體外，合成了幾大系列的“向右延長的” 針對KRAS基因轉(zhuǎn)錄本的DsiRNAs，以評估對目標基因敲除的效能。圖12描述了一系列的 “向右延長的”針對KRAS轉(zhuǎn)錄本的“KRAS-200”位點的DsiRNAs的結(jié)構。圖12中的第一個雙鏈("DPI 174P/DP1175G”或雙鏈“01”相應的數(shù)據(jù)如圖13所示)是25/27mer的DsiRNA，只在其過客鏈的3'終端最后一位和倒數(shù)第二位有脫氧核糖核酸。圖12中的第二個雙鏈 (“DP1200P/DP1201G”或雙鏈“02”相應的數(shù)據(jù)如圖13所示)是一個25/27mer的DsiRNA, 所有過客鏈都有脫氧核糖核酸，位于過客鏈預測的經(jīng)Dicer酶剪切的3'末端位點上所殘基都是脫氧核糖核苷酸和位于引導鏈預測的經(jīng)Dicer酶剪切的5'末端所有殘基都是脫氧核糖核苷酸。圖12中第三條雙鏈(“DP1202P/DP1203G”或雙鏈“03”的相應的數(shù)據(jù)如圖 13所示)是一個30/3aner的DsiRNA，如圖所示(圖12第三個雙鏈的盒子區(qū))，“DPI174P/ DP1175G”雙鏈中插入了五堿基對的核糖核苷酸序列。圖12中第四條雙鏈(“DP1204P/ DP1205G”或雙鏈“04”的相應的數(shù)據(jù)如圖13所示)是一個30/3aner的DsiRNA，如圖所示 (圖12第四個雙鏈的盒子區(qū))，“DP1200P/DP1201G”雙鏈中插入了五個堿基對的脫氧核糖核苷酸序列。圖12中第五條雙鏈(“DP1206P/DP1207G”或雙鏈“05”相應的數(shù)據(jù)如圖13所示) 是一個35/37mer的DsiRNA，如圖所示(圖12第五個雙鏈的盒子區(qū))，“DPI174P/DP1175G” 雙鏈中插入十個堿基對的脫氧核糖核苷酸序列。圖12中第六條雙鏈(“DP1208P/DP1209G” 或雙面“06”相應的數(shù)據(jù)如圖13所示)是一個35/37mer的DsiRNA，如圖所示(圖12中第六個雙鏈的盒子區(qū))，“DP1200P/DP1201G”雙鏈中插入十個堿基對脫氧核糖核苷酸序列。圖13顯示了由圖12中的DsiRNAs在KRAS-200位點引起的對KRAS靶基因的抑制效果。如圖13所示，DsiRNAs擁有RNA雙鏈或DNA雙鏈延長五個，甚至10個堿基對長度保持很強的體外抑制效果(圖13的實驗是在HeLa細胞中進行的，用0. InM的DsiRNA處理M小時，并用RNAiMAX做了兩個重復；“ 13”和“ 14”是對應于單獨使用RNAiMAX和未經(jīng)處理的細胞所取得的結(jié)果；通過評估KRAS和HPRTl的水平來進行了多重實驗)。圖14描繪了一系列的“向右延長的” DsiRNAs針對KRAS基因轉(zhuǎn)錄本內(nèi)的“KRAS基因-909”的位點的的結(jié)構。圖14的第一個雙鏈("DPI 188P/DP1189G")是一個25/27mer的DsiRNA，只在其過客鏈的3'終最后一個和倒數(shù)第二個位置有脫氧核糖核酸。圖14中的第二個雙鏈 (“DP1210P/DP121IG，，)是一個25/27mer的DsiRNA，在其所有過客鏈上，位于預測的Dicer 酶酶切割位點的過客鏈的3'末端，和在其所有過客鏈上，位于預測的Dicer酶酶切割位點的引導鏈的5'末端都有脫氧核糖核酸。圖14中的第三個雙鏈(“DP1212P/DP1213G”)是一個30/3aiier的DsiRNA，如圖所示(圖14第三個雙鏈的盒子區(qū))，擁有五堿基對的核苷酸序列插入到“DPI188P/DP1189G”雙鏈中。圖14第四個雙鏈(“DP1214P/DP1215G”)是一個 30/32mer的DsiRNA，如圖所示(圖14第四個雙鏈的盒子區(qū))，擁有五個堿基對的脫氧核糖核苷酸序列插入到“DP1210P/DP121IG”雙鏈在。圖14第五個雙鏈(“DP1216P/DP1217G”) 是一個35/37mer的DsiRNA，如圖所示(圖14第五個雙鏈的盒子區(qū))擁有十堿基對的核苷酸序列插入到“DP1188P/DP1189G”雙鏈中。圖14第六個雙鏈(“DP1218P/DP1219G”)是一個 35/37mer的DsiRNA，如圖所示(圖14第六個雙鏈的盒子區(qū))，擁有十堿基對脫氧核糖核苷酸序列插入到“DP1210P/DP121IG”雙鏈中。圖15顯示了由圖14中的DsiRNAs在KRAS-909 位點引起的對KRAS靶基因的抑制效果。如圖15所示，然而25/27mer的“1188P/1189G”和 30/32mer的“ 1212P/1213G”，這兩個DsiRNAs對靶RNA抑制效果只是稍大于其他受檢測的 DsiRNAs，在體外，DsiRNAs擁有五個RNA雙鏈或DNA雙鏈延長的五個甚至十個堿基對長度顯示了強大的抑制功效(圖15是在HeLa細胞中進行的實驗，用0. InM的DsiRNA處理M小時，用RNAiMAX做兩次重復實驗；通過評估KRAS和HPRTl的水平來進行多重實驗)。實施例9-在“延長”的DsiRNAs上多硫代磷酸化修飾的影響
圖10顯示，當硫代磷酸化修飾后，DsiRNA分子的脫氧核糖核苷酸延長可以提供一個表面，如果有的話，會輕微影響硫代磷酸化修飾的DsiRNA對目標轉(zhuǎn)錄本抑制的效果。圖 16-18描述了 DsiRNA分子的合成，為了測試更廣泛水平的硫代磷酸化修飾是否可以存在于 (在這里，“向右延長”)延長的DsiRNAs中。具體來說，圖16顯示了一系列“KRAS基因-249” 的位點特異性的DsiRNAs，其中如圖所示，第一條雙鏈(“KM9M”)是25/^27!^!",只在過客鏈的倒數(shù)第二個和最后一個殘基的3'端擁有脫氧核糖核酸，沒有硫代磷酸化修飾，有一個 2' -0-甲基化修飾(有下劃線的殘基表明有2-0-甲基化修飾)。如圖所示，第二條雙鏈(“KM9D”)是31/33mer，在過客鏈的3'末端和引導鏈的鏈5’末端總共擁有8個脫氧核糖核苷酸堿基對，沒有硫代磷酸化修飾，有一個2' -0-甲基化修飾。第三條和第四條雙鏈(“K249DNA8”和“KM9DNA8p”)是33/35mers，在所有過客鏈預測的Dicer酶剪切位點3'端的殘基和所有引導鏈Dicer酶剪切位點所示的5'端的殘基為獨特的脫氧核糖核酸。2' -0-甲基修飾的模式與上文所述的“KM9D”DsiRNA使用的模式相同。第四條雙鏈(“K249DNA8p”)過客鏈3’末端/引導鏈5’末端所有的8個堿基對的核苷酸都有硫代磷酸化修飾。第五和第六雙鏈是(“K249DNA12”和“KM9DNA12p”)37/39merS，在所有過客鏈設計的Dicer酶剪切位點3'端的殘基和所有引導鏈Dicer酶剪切位點所示的5‘端的殘基為獨特的脫氧核糖核酸。2' -0-甲基修飾的模式與上文所述的“KM9D” DsiRNA使用的模式相同。第六雙鏈(“K249DNA12p”)的過客鏈3’末端/引導鏈5’末端組成的所有的12 個堿基對的核苷酸都有硫代磷酸化修飾。圖17顯示了 “KRAS-516”上2 —系列DsiRNAs作用的靶位點，其中第一條雙鏈和第二條雙鏈(“K516DNA8”和“K516DNA8p”)是33/35mers，在所有過客鏈預測的Dicer酶剪切位點3'端的殘基和所有引導鏈Dicer酶剪切位點所示的5' 端的殘基為獨特的脫氧核糖核酸。帶下劃線的殘基是帶有2' -0-甲基修飾的核苷酸。第二條雙鏈(“K516DNA8p”)的過客鏈3’末端/引導鏈5’末端組成的所有的8個堿基對都有核苷酸硫代磷酸化修飾。值得注意的是，這些延長的DsiRNAs都引入了 K249中4個堿基對的脫氧核糖核苷酸序列(見標記為“K249”的盒子區(qū)域)。第三條雙鏈和第四條雙鏈(“K516DNA12”和“K516DNA12p”)是37/39mers，在所有過客鏈預測的Dicer酶剪切位點3'端的殘基和所有引導鏈Dicer酶剪切位點所示的5'端的殘基為獨特的脫氧核糖核酸。2' -0-甲基修飾模式與上面所述的“K516DNA8” 和“K516DNA8p”的DsiRNAs使用的模式是相同的。第四條雙鏈(“K516DNA12p”)的過客鏈3’末端/引導鏈5’末端組成的所有的12個堿基對都有核苷酸硫代磷酸化修飾。至于 “K516DNA8，m“K516DNA8p”& DsiRNAs，這些延長的 DsiRNAs 都引入了 K249 中 4 個堿基對的脫氧核糖核苷酸序列(見標記為“K249”的盒子區(qū)域)。圖18顯示了一系列“KRAS-909”的DsiRNAs的作用靶位點，其中第一條雙鏈和第二條雙鏈(“K909DNA8”和“K909DNA8p”)是33/35mers，在所有過客鏈預測的Dicer酶剪切位點3'端的殘基和所有引導鏈Dicer酶剪切位點所示的5' 端的殘基為獨特的脫氧核糖核酸。2' -0-甲基修飾核苷酸顯示為帶下劃線的殘基。第二條雙鏈(“K909DNA8p”)的過客鏈的3' /引導鏈5'所有的8個堿基對的核苷酸都有硫代磷酸化修飾。延長的DsiRNAs也引入了 K249中的4個堿基對的脫氧核糖核苷酸序列(見標記為“以49”的盒子區(qū)域)。第三條雙鏈和第四條雙鏈(“K909DNA12”和“K909DNA12p”)是37/39mers，在所有過客鏈預測的Dicer酶剪切位點3'端的殘基和所有引導鏈Dicer酶剪切位點所示的 5'端的殘基為獨特的脫氧核糖核酸。2' -0-甲基修飾的模式與上面所述的K909DNA8”和 “K909DNA8p"DsiRNAs使用模式是相同的。第四條雙鏈(“K909DNA12p”)的過客鏈的3' / 引導鏈5的第12個堿基對的核苷酸都有硫代磷酸化修飾。至于DsiRNAs “K909DNA8”和 “K909DNA8p”這些延長的DsiRNAs也引入了 K249中的4個堿基對的脫氧核糖核苷酸序列 (見標記為"K249"的盒子區(qū)域)。圖16-18所示的是利用延長的DsiRNAs來測試對KRAS的目標轉(zhuǎn)錄本在體外的抑制效果。這些實驗的數(shù)據(jù)顯示在圖19中。令人驚訝的是，無論是33/35mer還是37/39mer 的DNA-延長的DsiRNAs都表現(xiàn)出顯著的抑制效果(請參考圖19中的“DNA8”和“DNA12” 導致的對KRAS-M9，516和909在目標位點的結(jié)果)；然而，對這些DNA延長的DsiRNAs區(qū)域的兩條鏈上進行廣泛的硫代磷酸化修飾，會降低它的抑制功效(見“DNA8p”和“DNA12P”對 KRAS-M9，516和909的目標位點的結(jié)果)。因此，即使觀察到兩條鏈上有兩個甚至四個連續(xù)的DNA堿基對有硫代磷酸化修飾，對DNA-延長的DsiRNA的功效只有很小或根本沒有影響 (見圖10)，圖19顯示，對本發(fā)明的“延長的"DsiRNAs插入連續(xù)八個或十二個硫代磷酸化修飾的脫氧核糖核苷酸堿基對(兩條鏈都進行硫代磷酸化修飾)，可以降低“延長的"DsiRNAs 的抑制功效。除了上述結(jié)果，需要注意的是，硫代磷酸化修飾的位置只有在延長的DsiRNAs的雙鏈延長區(qū)域的一條鏈上，才能表現(xiàn)出由硫代磷酸化修飾引起的作用時間更長，而不失去明顯的療效。例如，只有在延長的DsiRNAs的雙鏈延長區(qū)域的一條鏈上，即使包含多達15 個連續(xù)的硫代磷酸化修飾，這種修飾延長的DsiRNA具有耐受性而沒有明顯的療效損失(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，盡管如圖19的結(jié)果顯示，本發(fā)明的延長DsiRNAs的兩條鏈上，包括長片段的硫代磷酸化修飾產(chǎn)生影響，但從在整體上看，該發(fā)明的DsiRNAs的延長區(qū)域包含的DNA 已被證明可以提供一個進行廣泛且有利的修飾(例如，硫代磷酸化修飾，2' -0-甲基修飾或其他能夠增強穩(wěn)定性、傳遞，和/或增加該發(fā)明的延長DsiRNAs效能的修飾)的結(jié)構，而不產(chǎn)生負面的影響，例如，該發(fā)明的延長的DsiRNAs的抑制效果。實施例IO-DsiRNAs非種子區(qū)域內(nèi)的錯配位置和數(shù)量的相對影響上面的實施例6表明，本發(fā)明延長的DsiRNAs引入錯配堿基產(chǎn)生的“DsiRNAmm”可以擁有與靶序列完全互補的DsiRNAs相似的抑制功效。明顯地，從圖7-9中觀察到，檢測非種子區(qū)域錯配的位置，最影響功效的錯配的位置(“第12位”)也最接近Ago2對目標鏈序列預測切割位點的位置。進一步研究表明，在25/27merDsiRNA的非種子區(qū)域內(nèi)引入錯配的核苷酸序列的效應就是會破壞預定的Ago2切割位點。圖20顯示了一系列25/27mer DsiRNAs 的結(jié)構，合成了評估引入一個或多個錯配的殘基的影響(注意，圖20中DsiRNAmm分子，錯配僅指與靶標RNA序列錯配，而不是與DsiRNA過客鏈序列形成錯配；特別指出，“目標錯配” 的核苷酸或殘基的定義是為了本發(fā)明中目標錯配是指引導鏈與相應的目標核苷酸序列形成錯配，而不是必須與相應的DsiRNA過客鏈序列核苷酸形成錯配)，這樣的錯配可以從引導鏈3’端起始，或者從與過客鏈5’端殘基互補的引導鏈起始。如圖21所示，令人驚訝的是，測試25/27mer DsiRNA引導鏈的3'末端區(qū)域可以耐受引入一個或多個目標錯配的核苷酸。事實上，在測試的DsiRNA的引導鏈的3'末端引進一至三個錯配的核苷酸后，對目標物的抑制功效并沒有顯著性影響(見雙鏈DP1301P/DP1303G，DP1301P/DP1304G和DP1305P/ DP1306G)，然而，當在測試的DsiRNA的引導鏈的3'末端引進的四個，五個，甚至六個錯配的核苷酸后，仍然保留了顯著的抑制活性(見雙鏈DP1307P/DP1308G，DP1309P/DP1310G和 DP1311P/DP1312G)。從與DsiRNA的過客鏈的5’端殘基互補配對的引導鏈的位置起始，引入目標錯配殘基，產(chǎn)生的結(jié)果與觀察到的從引導鏈3’末端引入目標錯配的核苷酸是一致的。 具體來說，從與DsiRNA的過客鏈的5’端殘基互補配對的引導鏈的位置起始，引入一至四個的目標錯配核苷酸與從引導鏈的3'端引入三至六個目標錯配的核苷酸，對DsiRNA抑制效果的影響程度大致相同(在引導鏈序列3'末端最后和倒數(shù)第二個核苷酸，以及與引導鏈與DsiRNA過客鏈的5'端互補而與目標錯配的核苷酸，與觀察的現(xiàn)象是一致的)。實施例IlDsiRNA在體內(nèi)的療效，單劑量的結(jié)果在體內(nèi)研究了 DNA雙鏈延長DsiRNA對序列特異性的靶mRNA抑制效果。具體來說， 圖20中是未修飾的針對KRAS基因的DsiRNA“KM9”(“DP1301P/DP1302G”雙鏈)，2' -0-甲基修飾的針對KRAS基因的DsiRNA “K249M” (圖16第一個雙鏈)和2' -0-甲基修飾“向右延長的”針對KRAS基因的DsiRNA“KM9D”(圖16中的第二個雙鏈；在圖22-25中標記為 "K249DNA")，使用hvivofectamineTM制備好并按10mg/kg的量通過靜脈注射到CDLl小鼠體內(nèi)。注射后M小時，測定KRAS基因在肝，腎，脾和淋巴結(jié)組織的表達量，(圖22-25的每欄顯示的結(jié)果是每組從四只小鼠獲得的)，實時PCR(RT-PCR)檢測做三次重復評估KRAS基因的表達情況。在這種條件下，在所有檢測的組織中，“向右延長的”DsiRNA “K249DNA”表現(xiàn)出對KRAS靶基因的顯著性水平的抑制。在這樣的“KM9DNA”處理后，具體的對KRAS的抑制百分比水平和P值分別為肝(55% -87%，平均為71%,P = 0.010)，脾(92% -98%, 平均 94%，P0. 001)，腎臟(19% -53%，平均;35%，P = 0. 009)和淋巴結(jié)(47% -81%，平均 59%，P = 0.001)。因此，本發(fā)明所述延長的DsiRNAs在體內(nèi)的功效在許多類型的組織都得到了論證。實施例12-DsiRNA在體內(nèi)的功效，多劑量的結(jié)果在體內(nèi)實驗研究中，采用多次給藥的方法，用比實施例11還低的劑量，研究了 DNA 雙鏈延長DsiRNA對序列特異性的靶mRNA的抑制效果。具體來說，在hvivofectamine 中制備KRAS基因的2-0-甲基修飾DsiRNA “K249M” (圖16的第一個雙鏈)和“向右延長的” KRAS基因的2’ -0-甲基化修飾DsiRNA “K249D” (圖16中的第二個雙鏈)，按每3天 2mg/kg的量靜脈注射到CDl小鼠體內(nèi)，直到給每只小鼠注射4個劑量的藥。注射給藥M 小時后(圖沈至圖四，分別地，每欄顯示的結(jié)果都是從每個處理組的四只小鼠中獲得的結(jié)果)，采用實時PCR(RT-PCR)的方法，做三次重復試驗，檢測了 KRAS基因在肝，肺，脾，腎組織中的表達量。在這種條件下，當使用“向右延長的”DsiRNA “K249D”時，觀察到小鼠的肝臟和脾臟的KRAS的基因水平顯著降低。這樣處理小鼠后，觀察到的“KM9DNA”具體的抑制百分比和相關的P值分別為肝(46% -90%，平均為78%，P = 0. 002)，脾(36% -80%，平均 62%，P = 0. 004)，腎(0%，均值為 0%，P = 0.814**)禾口月市(17% -38%，平均 ^%，P = 0.065**)。因此，本發(fā)明所述延長的DsiRNAs采用多次注射(低劑量)方案時，在肝、脾組織體現(xiàn)了在體內(nèi)的療效。
實施例13-進一步評估DsiRNA在體內(nèi)的功效用標準的方法(例如，^lz0I⑧法(胍硫氰酸鹽-酚-氯仿)制備RNA，接著用 qRT-PCR檢測)來測量靶細胞其他目標RNA的水平(例如，注射小鼠后，檢測肝臟和/或腎細胞RNA水平；小鼠眼部注射后，檢測眼細胞RNA水平；或直接注射相同的小鼠后，檢測脊髓/腦/中樞神經(jīng)細胞RNA水平)。在進一步的體內(nèi)實驗中，該發(fā)明的延長的Dicer酶底物(例如，向左或向右延長的DsiRNA)，如果當使用該延長的Dicer酶底物與合適的對照(例如，只有空載體的對照， 隨機雙鏈的對照，針對不同的靶RNA的雙鏈的對照)做對比發(fā)現(xiàn)它可以使RNA水平顯著降低，因此可以視為該制劑在體內(nèi)是有效的。一般來說，如果這種比較的P值(例如，通過有尾的，配對的t檢驗產(chǎn)生)小于0. 05，該發(fā)明的延長的Dicer酶底物(例如，向左或向右延長的DsiRNA)就被認為是一個有效的RNA干擾劑。另外，當延長的Dicer酶底物的P值低于P-值的閾值時，就將該底物分類為一種有效的RNA干擾劑，而P-值的閾值可以設定為 0. 01,0. 001等，為了提供更嚴格的篩選條件，找出更大的差異，和/或調(diào)整多重假設檢驗等，也可以設置絕對活性水平來區(qū)分有效和無效的延長的Dicer酶底物。例如，在某些實例中，本發(fā)明的有效的延長的Dicer酶底物，不僅表現(xiàn)出在體內(nèi)對靶RNA水平的顯著降低，而且組織或細胞中的靶RNA水平與對照組相比時，至少減少約10%，減少約15%，至少減少約 20%，減少約25%，減少約30%等。并且還將進一步檢測該發(fā)明的延長的Dicer酶底物(例如，向左或向右的延長的DsiRNA)在體內(nèi)的功效。說明書中提到的所有專利和出版物都針對那些對該發(fā)明所涉及的領域的技術人員。此發(fā)明引用的所有參考文獻的引用程度是相同的，就如每篇參考文獻都通過引用全文納入。本領域的技術人員會很容易明白，本發(fā)明可很好地適應實驗的對象并最終得到前面提及的目的和優(yōu)點，as well as those inherent therein。本發(fā)明例舉的優(yōu)選實施例中描述的的方法和藥物組合物是杰出的，而并不限制該發(fā)明的范圍。對于本領域的技術人員而言，可以在其中做出改變以及用于其他的用途，包括在本發(fā)明中，和權利要求所要求保護的范圍中。對于本領域的技術人員來說，這將是顯而易見的，在不偏離范圍和發(fā)明創(chuàng)造精神的情況下，可以對在此公開的發(fā)明進行不同的替換和修飾。因此，這些額外實例是在本發(fā)明和下列要求的范圍內(nèi)。本發(fā)明指導本領域的技術人員檢測在此處描述的不同的組合和/或替代的化學修飾，以產(chǎn)生能提高RNAi的活性的核酸結(jié)構。這種提高的活性包括穩(wěn)定性的提高，生物利用度的提高，和/或RNAi介導的細胞反應激活的提高。因此，在此具體的實施方案中所述的均不局限于此，本領域的技術人員可以很清楚地理解在此描述的修改的具體組合，可以用適當?shù)膶嶒瀬頊y試并鑒定出提高了 RNAi活性的DsiRNA分子。此處闡述的本發(fā)明可在缺乏任何具體披露的組分、限度或無特別說明的限度即可操作時進行。因此，例如，在這里的每個實例中，任何命名為“包括”，“組成的本質(zhì)，和”組成的"都可以被其他的兩個命名所替換。這里用的命名和表述只是用于描述而不是限制，無意使用該命名和描述來排除任何展現(xiàn)和描述的相同物的特征或其中的一部分。但一般認為各種修改都可能在該發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，應該明白，盡管本發(fā)明已對本領域的技術人員明確披露了首選的實施例，優(yōu)化的功能、修飾和概念的變化，這樣的修改和變化是被定義在本發(fā)明描述和附加的聲明的范圍內(nèi)的。此外，根據(jù)Markush團隊或其他團隊對該發(fā)明的特征或方面的描述，那些對本領域的技術人員將認識到該發(fā)明也是根據(jù)Markush團隊或其他團隊的任何一個成員進行描述的。該發(fā)明中使用術語“1” ( “a”和“an”)和“所述”(“the”)以及相似的指示代詞 (尤其是在下面所述的情況下)既包括單數(shù)也包括復數(shù)，除非另有說明或文中已清楚地指出。術語“包括("comprising)、具有(〃 “having,“)、包括有(“including,“) 和"包含"可理解為開放式的術語(即，意為“包括但不限于”)，除非另有說明。在這里陳述的范圍值僅僅是作為在這范圍之內(nèi)的每一個值的一種簡寫的方法，除非另有注明，每個在說明書中單獨的值都是被納入的。此處所描述的所有方法，可以在任何合適的順序下進行操作，除非另有說明或下文中有明確的表述。此處使用的任何及所有的例子或典型的語言(舉例例如"such as")，只是為了更好地闡明該發(fā)明，并不限制該發(fā)明的范圍，除非另有聲明。說明書中的語言不應該理解為表明任何非聲明的成分是實施該發(fā)明所必需的。本發(fā)明的闡述的實施例，包括發(fā)明者所知道的實施該發(fā)明的的最佳模式。該領域普通技能的人在閱讀上述說明后，就能很明顯和清晰地知道各種變化的實施方案。發(fā)明者希望有經(jīng)驗的研究者適當?shù)乩眠@些變化手段，并且希望該發(fā)明具有實用性，而并非只局限于當前的具體的描述。因此，本發(fā)明在此的聲明中所包括的關于這一主題的所有變型和相同物都是使用法律所允許的。此外，所有可能出現(xiàn)的利用上述原理的任意組合都包含在該發(fā)明中，除非另有注明，或以其他方式在上下文明確指出。
權利要求
1.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有 5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，其中，所述第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，其中從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸開始(第1位)，第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，這23 個連續(xù)的核糖核苷酸與所述第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸進行堿基配對以形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的5’末端和所述第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4 個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端； 所述第一寡核苷酸鏈的第M至3’末端的核苷酸殘基中的至少一個是脫氧核糖核苷酸，并與所述第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸形成堿基對；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
2.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有 5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，其中，所述第一寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，該23 個連續(xù)的核糖核苷酸與所述第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸進行堿基配對以形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的5’末端和所述第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4 個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構，所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’ 末端形成1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；在所述第一寡核苷酸鏈的第M位至3’末端中至少有一個核苷酸殘基是脫氧核糖核苷酸，且該脫氧核糖核苷酸與所述第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸進行堿基配對；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
3.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有 5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，其中，所述第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基， 其中從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的堿基配對形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的5’末端和所述第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端，所述第一寡核苷酸鏈的3’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基與所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基形成一個或兩個錯配的堿基對， 在所述第一寡核苷酸鏈的第M位至3’末端中至少有一個殘基是脫氧核糖核苷酸，且與所述第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
4.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的所述第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的所述第二寡核苷酸鏈，其中，所述第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，其中從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸，所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，其與所述第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的5’末端和所述第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4 個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構，所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’ 末端形成鈍性末端；從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端處的第一個核苷酸(第1位)開始， 該第一寡核苷酸鏈的第1至第9個核苷酸殘基中含有一個與所述第二寡核苷酸鏈形成錯配的核苷酸；所述第一寡核苷酸鏈的第M位至3’末端的核苷酸殘基中的至少一個是脫氧核糖核苷酸，并與所述第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
5.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的所述第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的所述第二寡核苷酸鏈，其中，所述第一寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，其中從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的5’末端和所述第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4 個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構，所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’ 末端形成1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；所述第一寡核苷酸鏈的5’末端第1至第9個核苷酸殘基中的一個堿基與所述第二寡核苷酸鏈形成錯配；所述第一寡核苷酸鏈的第M 位至3’末端的核苷酸殘基中的至少一個是脫氧核糖核苷酸，并與所述第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
6.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有 5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，其中，所述第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基， 其中從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的5’末端和所述第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端，所述第一寡核苷酸鏈的3’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基與所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基形成一個或兩個錯配的堿基對； 所述第一寡核苷酸鏈的5’末端第1至第9個核苷酸殘基中一個堿基與所述第二寡核苷酸鏈形成錯配；所述第一寡核苷酸鏈的第M位至3’末端的核苷酸殘基中的至少一個是脫氧核糖核苷酸，并與所述第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
7.根據(jù)權利要求1-6任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第一寡核苷酸鏈的第M位至3’末端的核苷酸殘基中有2個或2個以上，4個或4個以上，6個或6 個以上，8個或8個以上，10個或10個以上，12個或12個以上，14個或14個以上，16個或 16個以上，和20個或20個以上的核苷酸殘基是脫氧核糖核苷酸，且與所述第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對。
8.根據(jù)權利要求1-7任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第一寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸與所述第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對是連續(xù)的。
9.根據(jù)權利要求1-8任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第一寡核苷酸鏈的第M至第27位核酸殘基為脫氧核糖核苷酸，其中有2個或者更多連續(xù)的核苷酸殘基與所述第二寡核苷酸鏈的堿基配對。
10.根據(jù)權利要求1-9任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第一寡核苷酸鏈的第M位和第25位核酸殘基都是脫氧核糖核苷酸，并與所述第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對。
11.根據(jù)權利要求1-10任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第一寡核苷酸鏈的第M位至第27位核酸殘基是脫氧核糖核苷酸，并與所述第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對。
12.根據(jù)權利要求1-11任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第一寡核苷酸鏈具有四-49個核苷酸殘基。
13.根據(jù)權利要求12所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第一寡核苷酸鏈的第M位至第27位核酸殘基都是脫氧核糖核苷酸，并與所述第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對。
14.根據(jù)權利要求1-11任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第一寡核苷酸鏈具有31-49個核苷酸殘基。
15.根據(jù)權利要求12或14所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第一寡核苷酸鏈的第M位至第四位核酸殘基都是脫氧核糖核苷酸，并與所述第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對。
16.根據(jù)權利要求1-11任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第一寡核苷酸鏈具有33-49個核苷酸殘基。
17.根據(jù)權利要求14或16所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第一寡核苷酸鏈的第M位至第31位核酸殘基都是脫氧核糖核苷酸，并與所述第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對。
18.根據(jù)權利要求1-11任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第一寡核苷酸鏈具有35-49個核苷酸殘基。
19.根據(jù)權利要求16或18所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第一寡核苷酸鏈的第M位至第33位核酸殘基都是脫氧核糖核苷酸，并與所述第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對。
20.根據(jù)權利要求1-11任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第一寡核苷酸鏈具有37-49個核苷酸殘基。
21.根據(jù)權利要求18或20所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第一寡核苷酸鏈的第M位至第35位核酸殘基都是脫氧核糖核苷酸，并與所述第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對。
22.根據(jù)權利要求1-11任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第一寡核苷酸鏈具有39-49個核苷酸殘基。
23.根據(jù)權利要求20或22所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第一寡核苷酸鏈的第M位至第37位核酸殘基都是脫氧核糖核苷酸，并與所述第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對。
24.根據(jù)權利要求1-23任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，與所述第一寡核苷酸鏈相配對的所述第二寡核苷酸鏈中的脫氧核糖核苷酸與靶標RNA不互補。
25.根據(jù)權利要求I-M任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第二寡核苷酸鏈的3’端具有一個1-4個核苷酸組成的懸垂。
26.根據(jù)權利要求25所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第二寡核苷酸鏈 3’懸垂的核苷酸中一個核苷酸被修飾。
27.根據(jù)權利要求沈所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，修飾核苷酸的基團為 2，-氧-甲基，2，-甲氧基乙氧基，2，-氟代，2，-烯丙基，2，-氧-[2-(甲氨基)-2-氧代乙基]，4’ -硫代，4’ -甲基-氧_2’ -橋聯(lián)，2’ -LNA、2’ -氨基和2’ _0_(氮-甲基氨基甲酸酯)。
28.根據(jù)權利要求1-27任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第一寡核苷酸鏈的第M位至3’末端的核苷酸殘基中的至少一個是修飾的核苷酸，修飾這個核苷酸的基團是2’ -氧-甲基，2’ -甲氧基乙氧基，2’ -氟代，2’ -烯丙基，2’ -氧-[2-(甲氨基)-2-氧代乙基]，4’-硫代，4’-甲基-氧-2’-橋聯(lián)，2’-LNA，2’-氨基、2’-0-(氮-甲基氨基甲酸酯)。
29.根據(jù)權利要求1、2、4、5和7- 任一項所述分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第一寡核苷酸鏈的3’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基是脫氧核糖核苷酸，所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基是核糖核苷酸。
30.根據(jù)權利要求1- 任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第二寡核苷酸鏈，從其與所述第一寡核苷酸鏈的5’末端核苷酸殘基互補配對的核苷酸殘基(第1* 位)開始，自第20*位至5’末端的所有位置上的核苷酸殘基里都是未被修飾的核苷酸殘基。
31.根據(jù)權利要求1-30任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，從所述第一寡核苷酸鏈3’末端的第一個核苷酸(第1*位)開始，第1*位、第2*位和/或第3*位是脫氧核糖核苷酸。
32.根據(jù)權利要求31所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第一寡核苷酸鏈的3’末端第1*位是脫氧核糖核苷酸。
33.根據(jù)權利要求31所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第一寡核苷酸鏈的3’末端第1*位和第2*位是脫氧核糖核苷酸。
34.根據(jù)權利要求1-33任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第二寡核苷酸鏈或所述第一寡核苷酸鏈中的核苷酸被經(jīng)修飾的核苷酸取代，該被修飾的核苷酸指導Dicer酶切定位。
35.根據(jù)權利要求1-34任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，從所述第二寡核苷酸鏈3’端第一個核苷酸(第1*位)起始，所述第二寡核苷酸鏈3’末端的第1*位、 第2*位和第3*位是被修飾的核苷酸。
36.根據(jù)權利要求1-35任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第一寡核苷酸鏈具有至少60 %，70 %，80 %，90 %，95 %或100 %與所述第二寡核苷酸鏈互補的核苷酸序列。
37.根據(jù)權利要求1-36任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第一寡核苷酸鏈的3’末端的核苷酸殘基通過核苷酸序列連接于所述第二寡核苷酸鏈的5’末端核苷酸殘基。
38.根據(jù)權利要求37所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，連接于所述第一寡核苷酸鏈的3’末端核苷酸殘基和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端核苷酸殘基的所述核苷酸序列包含有四核苷酸環(huán)或發(fā)夾結(jié)構。
39.根據(jù)權利要求1-36任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第一寡核苷酸鏈和所述第二寡核苷酸鏈通過化學連接劑鏈接。
40.根據(jù)權利要求39所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端通過化學試劑連接。
41.根據(jù)權利要求1-40任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，與所述第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷配對的所述第一寡核苷酸鏈的第M位至3’末端的核苷酸殘基中的至少一個是未被修飾的脫氧核糖核苷酸。
42.根據(jù)權利要求41所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第一寡核苷酸鏈的第M位至3’末端的核苷酸殘基中的至少一個是脫氧核糖核苷酸，并與所述第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸堿基配對，且配對的所述第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸是未被修飾的脫氧核糖核苷酸。
43.根據(jù)權利要求1-42任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第二寡核苷酸鏈的起始于與所述第一寡核苷酸鏈5’末端互補配對的核苷酸殘基中，包括有交替的被修飾和未被修飾的核苷酸殘基。
44.根據(jù)權利要求4-6任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，第3至第9位存在一個或更多的錯配。
45.根據(jù)權利要求4-6任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，第1至第7位存在一個或更多的錯配。
46.根據(jù)權利要求4-6任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，第3至第7位存在一個或更多的錯配。
47.根據(jù)權利要求4-6任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，第6位存在錯配。
48.根據(jù)權利要求4-6任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，于所述第一寡核苷酸鏈5'末端第一位核苷酸殘基(第1)開始，第1位至第9位核苷酸殘基有兩個或者更多核苷酸與所述第二寡核苷酸鏈形成錯配。
49.根據(jù)權利要求4-6任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，第2位和第6位核苷酸殘基與所述第二寡核苷酸鏈形成錯配。
50.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5，末端和3，末端的第二寡核苷酸鏈，所述第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，其中從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1至第23 個核苷酸是核糖核苷酸；所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈； 所述第一寡核苷酸鏈的5’末端和所述第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸的3’懸垂結(jié)構；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端，于與所述第一寡核苷酸鏈5'末端互補的所述第二寡核苷酸鏈的第一位核苷酸殘基(1*)開始，從所述第二寡核苷酸鏈5'方向第1位至第9位核苷酸殘基有一個核苷酸與靶標RNA形成錯配；在所述第一寡核苷酸鏈的第M位至3’末端中至少有一個殘基是脫氧核糖核苷酸，且與所述第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸配對；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
51.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，其中，所述第一寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，其中從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的5’末端和所述第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成一個1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；于與所述第一寡核苷酸鏈5’端互補的所述第二寡核苷酸鏈的第一位核苷酸殘基(1*)開始，從所述第二寡核苷酸鏈5方向第一位至第9 位核苷酸殘基有一個核苷酸與靶標RNA形成錯配，在所述第一寡核苷酸鏈的第M位至3’ 末端中至少有一個殘基是脫氧核糖核苷酸，且與所述第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸配對；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
52.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，其中，所述第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，其中從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的5’末端和所述所述第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成一個1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；于與所述第一寡核苷酸鏈5’端匹配的所述第二寡核苷酸鏈的第一位核苷酸殘基(1*)開始，從所述第二寡核苷酸鏈5’方向第1位至第9位核苷酸殘基有一個核苷酸與靶標RNA形成錯配，在所述第一寡核苷酸鏈的第M位至 3’末端至少有一個殘基是脫氧核苷酸，且與所述第二寡核苷酸鏈的脫氧核苷酸配對；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
53.根據(jù)權利要求50-52任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第二寡核苷酸鏈的3’懸垂結(jié)構含有一個與靶標RNA錯配的核苷酸。
54.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的所述第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的所述第二寡核苷酸鏈，其中，所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，其中從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，且這23個連續(xù)的核糖核苷酸與所述第二寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的堿基配對形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端；在所述第二寡核苷酸鏈的3’末端第M位后至少有一個殘基是脫氧核苷酸，且與所述第一寡核苷酸鏈的脫氧核苷酸配對；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19 個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
55.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，其中，所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，其中從所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第一寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第二寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的堿基配對形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成1-4個核苷酸組成的3’ 懸垂結(jié)構；在所述第二寡核苷酸鏈的第M位到3’末端中至少有一個殘基是脫氧核苷酸，且與所述第一寡核苷酸鏈的脫氧核苷酸配對；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
56.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，其中，所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，其中從所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第二寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的堿基配對形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基與所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基形成一個或兩個錯配的堿基對。在所述第二寡核苷酸鏈的第M位至3’末端中至少有一個殘基是脫氧核糖核苷酸，且與所述第一寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸配對；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
57.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的所述第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的所述第二寡核苷酸鏈，其中，所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，其中從所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸，第11至第21位核苷酸中包含一個與所述第一寡核苷酸鏈形成堿基錯配的核苷酸；所述第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第二寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端，在所述第二寡核苷酸鏈的3’末端第M位后至少有一個殘基是脫氧核苷酸，且與所述第一寡核苷酸鏈的脫氧核苷酸配對；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補， 以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
58.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，包括具有5’末端和3’末端的所述第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的所述第二寡核苷酸鏈，所述第二寡核苷酸鏈具有27-53 個核苷酸殘基，其中從所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第 1至第23個核苷酸是核糖核苷酸，第11至第21位核苷酸中包含一個與所述第一寡核苷酸鏈錯配的核苷酸；所述第一寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第二寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的堿基配對形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構，在所述第二寡核苷酸鏈的第M位至3’末端中至少有一個殘基是脫氧核糖核苷酸， 且與所述第一寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸配對；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
59.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，其中，所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，其中從所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，并具有21個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第二寡核苷酸鏈的第3至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端，所述第一寡核苷酸鏈的3’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基與所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基形成一個或兩個錯配的堿基對；在所述第二寡核苷酸鏈的第M位至3’末端中至少有一個殘基是脫氧核苷酸，且與所述第一寡核苷酸鏈的脫氧核苷酸配對；所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
60.根據(jù)權利要求M-59任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第二寡核苷酸鏈的第M位至3’末端的核苷酸殘基中有4個或4個以上，6個或6個以上，8個或 8個以上，10個或10個以上，12個或12個以上，14個或14個以上，16個或16個以上，或者20個或20個以上的核苷酸殘基是脫氧核糖核苷酸，并與所述第一寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對。
61.根據(jù)權利要求60所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸與所述第一寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對是連續(xù)的。
62.根據(jù)權利要求M-61任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第二寡核苷酸鏈的第M至第27位核苷酸殘基中2個或者2個以上是脫氧核糖核苷酸，并與所述第一寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對。
63.根據(jù)權利要求M-62任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第二寡核苷酸鏈的第M位和第25位都為脫氧核糖核苷酸，并與所述第一寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對。
64.根據(jù)權利要求M-63任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第二寡核苷酸鏈的第M位至第27位核酸殘基是脫氧核糖核苷酸，并與所述第一寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對。
65.根據(jù)權利要求M-64任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第二寡核苷酸鏈具有四-53個核苷酸殘基。
66.根據(jù)權利要求65所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第二寡核苷酸鏈的第M位至第27位核酸殘基都是脫氧核糖核苷酸，并與所述第一寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對。
67.根據(jù)權利要求M-64任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第二寡核苷酸鏈具有31-53個核苷酸殘基。
68.根據(jù)權利要求65或67所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第二寡核苷酸鏈的第M位至第四位核酸殘基都是脫氧核糖核苷酸，并與所述第一寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對。
69.根據(jù)權利要求M-64任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第二寡核苷酸鏈具有33-53個核苷酸殘基。
70.根據(jù)權利要求67或69所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第二寡核苷酸鏈的第M位至第31位核酸殘基都是脫氧核糖核苷酸，并與所述第一寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對。
71.根據(jù)權利要求M-64任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第二寡核苷酸鏈有35-53個核苷酸殘基。
72.根據(jù)權利要求67或69所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第二寡核苷酸鏈的第M位至第33位核酸殘基都是脫氧核糖核苷酸，并與所述第一寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對。
73.根據(jù)權利要求M-64任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第二寡核苷酸鏈有37-53個核苷酸殘基。
74.根據(jù)權利要求71或73所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第二寡核苷酸鏈的第M位至第35位核酸殘基都是脫氧核糖核苷酸，并與所述第一寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對。
75.根據(jù)權利要求M-64任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第二寡核苷酸鏈有39-53個核苷酸殘基。
76.根據(jù)權利要求73或75所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第二寡核苷酸鏈的第M位至第37位核酸殘基都是脫氧核糖核苷酸，并與所述第一寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對。
77.根據(jù)權利要求M-76任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第二寡核苷酸鏈的第M位到3’末端的核苷酸殘基中有1-25個脫氧核糖核苷酸，且每個脫氧核糖核苷酸與所述第一寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對。
78.根據(jù)權利要求M-77任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第二寡核苷酸鏈，從其與所述第一寡核苷酸鏈上緊挨著5' Dicer酶切位點的3'位置處的殘基互補的核苷酸殘基(第1*位)開始，在第20位至5’末端的所有位置上均為未經(jīng)修飾的核苷酸殘基。
79.根據(jù)權利要求M-78任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，起始于第二寡核苷酸鏈的所有3'的Dicer酶切處的5'緊接位置處的核苷酸(A位)， 朝第二寡核苷酸鏈5’方向A位，B位，和C位殘基是經(jīng)修飾的核苷酸。
80.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的所述第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的所述第二寡核苷酸鏈，其中，所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，其中從所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1 至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第一寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23 個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的堿基配對形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的5’末端和所述第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4 個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；所述第二寡核苷酸鏈的第M位至3’末端的核苷酸殘基中的至少一個是脫氧核糖核苷酸，并與所述第一寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達；其中所述第二寡核苷酸鏈的第11位至第21位含有一個與靶標RNA的核苷酸形成錯配的核苷酸。
81.根據(jù)權利要求57-59及80任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，第13 位至第21位核苷酸殘基存在一個或多個堿基錯配。
82.根據(jù)權利要求57-59及80任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，第14 位核苷酸殘基產(chǎn)生堿基錯配。
83.根據(jù)權利要求57-59及80任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，從所述第二寡核苷酸鏈5'端第一個核苷酸起始，所述第二寡核苷酸鏈的第11位至第21位存在兩個或者更多的核苷酸殘基與所述第一寡核苷酸鏈的核苷酸殘基錯配。
84.根據(jù)權利要求57-59及80任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第二寡核苷酸鏈第14位和第18位核苷酸殘基與所述第一寡核苷酸鏈的核苷酸殘基錯配。
85.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的所述第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的所述第二寡核苷酸鏈，其中，所述第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，其中從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1 至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23 個連續(xù)的核糖核苷酸，且這23個連續(xù)的核糖核苷酸與所述第一寡核苷酸鏈的第1至第23 個核糖核苷酸的堿基配對形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的5’末端和所述第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；所述第一寡核苷酸鏈的3’ 末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端；所述第一寡核苷酸鏈的第M位至3’ 末端的核苷酸殘基中的至少一個是被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)，并與所述第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
86.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，包括具有5’末端和3’末端的所述第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的所述第二寡核苷酸鏈，所述第一寡核苷酸鏈具有觀-53 個核苷酸殘基，其中從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第 1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的堿基配對形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的5’末端和所述第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或 1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；所述第一寡核苷酸鏈的第M位至3’末端的核苷酸殘基中的至少一個是被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)，并與所述第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
87.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，包括具有5’末端和3’末端的所述第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的所述第二寡核苷酸鏈，所述第一寡核苷酸鏈具有觀-53 個核苷酸殘基，其中從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第 1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有 23個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的堿基配對形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的5’末端和所述第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或 1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；所述第一寡核苷酸鏈的第M位至3’末端的核苷酸殘基中的至少一個是被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)，并與所述第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸的堿基配對；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
88.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的所述第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的所述第二寡核苷酸鏈，其中，所述第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，其中從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1 至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23 個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的5’末端和所述第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4 個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’ 末端形成鈍性末端；從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端開始，第1至第9位核苷酸殘基含有一個核苷酸與所述第二寡核苷酸鏈形成錯配；所述第二寡核苷酸鏈至少有一個與所述第一寡核苷酸鏈的第M位至3’末端的核苷酸殘基充分互補的核苷酸是被硫代磷酸基修飾的脫氧核糖核苷酸(PS-NA)；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
89.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，其中，所述第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，其中從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸。所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的5’末端和所述第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端；于與所述第一寡核苷酸鏈5’端互補的所述第二寡核苷酸鏈的第一位核苷酸殘基(1*)開始，朝所述第二寡核苷酸鏈5'方向的第一位(1*)至第9位(9*)核苷酸殘基有一個核苷酸與靶標RNA形成錯配；所述第二寡核苷酸鏈至少有一個與所述第一寡核苷酸鏈的第M位至3’末端的脫氧核糖核苷酸充分互補的核苷酸是被硫代磷酸基修飾的核苷酸 (PS-NA)；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
90.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的所述第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的所述第二寡核苷酸鏈，其中，所述第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，其中從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1 至第23個核苷酸是核糖核苷酸。所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23 個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的5’末端和所述第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4 個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’ 末端形成鈍性末端；從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第 1至第9位核苷酸殘基含有一個核苷酸與所述第二寡核苷酸鏈形成錯配；所述第一寡核苷酸鏈的第M位至3’末端的核苷酸殘基中的至少一個是脫氧核糖核苷酸，且與所述第二寡核苷酸鏈的的被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)充分互補；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
91.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，其中，所述第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，其中從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸。所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的5’末端和所述第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端；于與所述第一寡核苷酸鏈5’端互補的所述第二寡核苷酸鏈的第一位核苷酸殘基(1*)開始，朝所述第二寡核苷酸鏈5方向第一位(1*)至第9位(9*)核苷酸殘基有一個核苷酸與靶標RNA形成錯配；所述第一寡核苷酸鏈的第M位至3’末端的核苷酸殘基中的至少一個是脫氧核糖核苷酸，且與所述第二寡核苷酸鏈的的被硫代磷酸基修飾的核苷酸 (PS-NA)，充分互補；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
92.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的所述第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的所述第二寡核苷酸鏈，其中，所述第一寡核苷酸鏈具有觀-53個核苷酸殘基，其中從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1 至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23 個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的5’末端和所述第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4 個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’ 末端形成1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端開始，第1至第9位核苷酸殘基含有一個核苷酸與所述第二寡核苷酸鏈形成錯配；所述第一寡核苷酸鏈的第M位至3’末端的核苷酸殘基中的至少一個是被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)，并與所述第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸充分互補；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19 個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
93.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的所述第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的所述第二寡核苷酸鏈，其中，所述第一寡核苷酸鏈具有觀-53個核苷酸殘基，其中從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1 至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23 個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的5’末端和所述第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4 個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’ 末端形成1-4個核苷酸的3’懸垂結(jié)構；起始于與所述第一寡核苷酸鏈5’端互補的所述第二寡核苷酸鏈的第一位核苷酸殘基(1*)開始，朝所述第二寡核苷酸鏈5方向的第一位(1*) 至第9位(9*)核苷酸殘基中有一個核苷酸與靶標RNA形成錯配；所述第一寡核苷酸鏈的第 24位至3’末端的核苷酸殘基中的至少一個是被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)，并與所述第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸充分互補；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
94.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的所述第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的所述第二寡核苷酸鏈，其中，所述第一寡核苷酸鏈具有觀-53個核苷酸殘基，其中從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1 至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23 個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的5’末端和所述第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4 個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’ 末端形成1-4個核苷酸的3’懸垂結(jié)構；從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端第一個核苷酸(第 1)開始，第1至第9位核苷酸殘基含有一個核苷酸與所述第二寡核苷酸鏈形成錯配；所述第二寡核苷酸鏈至少有一個與所述第一寡核苷酸鏈的第M位至3’末端的核苷酸殘基充分互補的核苷酸是被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19 個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
95.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的所述第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的所述第二寡核苷酸鏈，其中，所述第一寡核苷酸鏈具有觀-53個核苷酸殘基，其中從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1 至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23 個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的5’末端和所述第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4 個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’ 末端形成1-4個核苷酸的3’懸垂結(jié)構；起始于與所述第一寡核苷酸鏈5’端互補的所述第二寡核苷酸鏈的第一位核苷酸殘基(第1*)開始，朝所述第二寡核苷酸鏈5方向第一位(1*) 至第9位(9*)核苷酸殘基有一個核苷酸與靶標RNA形成錯配。所述第一寡核苷酸鏈的第 24位至3’末端的核苷酸殘基中的至少一個是被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)，并與所述第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸充分互補；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
96.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的所述第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的所述第二寡核苷酸鏈，其中。所述第一寡核苷酸鏈具有觀-53 個核苷酸殘基，其中從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1 至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23 個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的5’末端和所述第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4 個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’ 末端形成1-4個核苷酸的3’懸垂結(jié)構；從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端開始，第1至第9 位核苷酸殘基含有一個核苷酸與所述第二寡核苷酸鏈形成錯配；所述第一寡核苷酸鏈的第 M位至3’末端的脫氧核糖核苷酸中至少有一個可以和所述第二寡核苷酸鏈被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)充分互補；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標 RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
97.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的所述第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的所述第二寡核苷酸鏈，其中，所述第一寡核苷酸鏈具有洲-53個核苷酸殘基，其中從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1 至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23 個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的5’末端和所述第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4 個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’ 末端形成1-4個核苷酸的3’懸垂結(jié)構；于與所述第一寡核苷酸鏈5’端匹配的所述第二寡核苷酸鏈的第一位核苷酸殘基(1*)開始，朝所述第二寡核苷酸鏈5’方向第一位(1*)至第 9位(9*)核苷酸殘基有一個核苷酸與靶標RNA形成錯配；所述第一寡核苷酸鏈的第M位至3’末端的脫氧核糖核苷酸中至少有一個可以和所述第二寡核苷酸鏈被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)充分互補；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA 充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
98.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，其中，所述第一寡核苷酸鏈具有觀-53個核苷酸殘基，其中從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的5’末端和所述第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端開始，第1至第9位核苷酸殘基含有一個核苷酸與所述第二寡核苷酸鏈形成錯配；所述第一寡核苷酸鏈的第 M位至3’末端的核苷酸殘基中的至少一個是脫氧核糖核苷酸，并與所述第二寡核苷酸鏈的被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)充分互補；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
99.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，其中，所述第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，其中從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的5’末端和所述第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成1-4個核苷酸組成的3’懸垂；起始于與所述第一寡核苷酸鏈5’端匹配的所述第二寡核苷酸鏈的第一位核苷酸殘基(1*)開始，朝所述第二寡核苷酸鏈5’方向第一位(1*)至第9 位(9*)核苷酸殘基有一個核苷酸與靶標RNA形成錯配；所述第一寡核苷酸鏈的第M位至 3’末端的核苷酸殘基中的至少一個是被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)，并與所述第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸充分互補；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
100.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，所述第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，其中從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的5’末端和所述第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4 個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’ 末端形成鈍性末端并且所述第一寡核苷酸鏈的3’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基與所述所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基形成一個或兩個錯配的堿基對；從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端開始，第1至第9位核苷酸殘基含有一個核苷酸與所述第二寡核苷酸鏈形成錯配；所述第二寡核苷酸鏈至少有一個與所述第一寡核苷酸鏈的第M位至3’末端的脫氧核糖核苷酸充分互補的核苷酸是被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
101.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，所述第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，其中從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的5’末端和所述第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4 個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端并且所述第一寡核苷酸鏈的3’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基與所述所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基形成一個或兩個錯配的堿基對；起始于與所述第一寡核苷酸鏈5’端匹配的所述第二寡核苷酸鏈的第一位核苷酸殘基(1*)開始，朝所述第二寡核苷酸鏈5’方向第一位(1*)至第9位(9*)核苷酸殘基有一個核苷酸與靶標RNA形成錯配；所述第一寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中的至少一個是被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)，并與所述第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸充分互補；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA 充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
102.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，其中，所述第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，其中從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的5’末端和所述第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端并且所述第一寡核苷酸鏈的3’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基與所述所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基形成一個或兩個錯配的堿基對；從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端開始，第1至第9位核苷酸殘基含有一個核苷酸與所述第二寡核苷酸鏈形成錯配；所述第二寡核苷酸鏈至少有一個與所述第一寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的脫氧核糖核苷酸充分互補的核苷酸是被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
103.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，其中，所述第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，其中從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的5’末端和所述第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端并且所述第一寡核苷酸鏈的3’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基與所述所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基形成一個或兩個錯配的堿基對；于與所述第一寡核苷酸鏈5’端匹配的所述第二寡核苷酸鏈的第一位核苷酸殘基(1*)開始，朝所述第二寡核苷酸鏈5’方向第一位(1*)至第9位(9*)核苷酸殘基有一個核苷酸與靶標RNA形成錯配；所述第二寡核苷酸鏈至少有一個與所述第一寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的脫氧核糖核苷酸充分互補的的核苷酸是被硫代磷酸基修飾的核苷酸的(PS-NA)；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
104.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的所述第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的所述第二寡核苷酸鏈，其中，所述第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，起始于所述第一寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，且這23個連續(xù)的核糖核苷酸與所述第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的5’末端和所述第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的3’懸垂結(jié)構；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端并且所述第一寡核苷酸鏈的3’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基與所述所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基形成一個或兩個錯配的堿基對；從所述第一寡核苷酸鏈的5’末端開始，第1至第9 位核苷酸殘基含有一個核苷酸與所述第二寡核苷酸鏈形成錯配；所述第一寡核苷酸鏈的第 24位至3’末端的核苷酸殘基中至少有一個可以和所述第二寡核苷酸鏈被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)充分互補；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA 充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
105.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，其中，所述第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，起始于所述第一寡核苷酸鏈5’末端的第一個核苷酸(第1)，且第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第一寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的5’末端和所述第二寡核苷酸鏈的3’末端形成鈍性末端或1-4個核苷酸組成的 3’懸垂結(jié)構；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端并且所述第一寡核苷酸鏈的3’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基與所述所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基形成一個或兩個錯配的堿基對；于與所述第一寡核苷酸鏈5’端匹配的所述第二寡核苷酸鏈的第一位核苷酸殘基(1*) 開始，朝所述第二寡核苷酸鏈5’方向第一位(1*)至第9位(9*)核苷酸殘基有一個核苷酸與靶標RNA形成錯配；所述第一寡核苷酸鏈的第24位至3’末端中至少有一個是脫氧核糖核苷酸，并可以和所述第二寡核苷酸鏈被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)充分互補；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
106.根據(jù)權利要求85-105任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第一寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中有2個或者更多是硫代磷酸基修飾的核苷酸殘基(PS-NA)，且與所述第二寡核苷酸鏈的脫氧核糖核苷酸充分互補。
107.根據(jù)權利要求106所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第一寡核苷酸鏈的硫代磷酸基修飾的核苷酸殘基(PS-NA)與所述第二寡核苷酸鏈的PS-NA脫氧核糖核苷酸充分互補。
108.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，其中，所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，其中從所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第一寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第二寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端；所述第二寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中至少有一個核苷酸殘基是被硫代磷酸基修飾的脫氧核糖核苷酸(PS-NA)；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA 充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
109.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，其中，所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，其中從所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第二寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端；所述第二寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中至少有一個脫氧核糖核苷酸，并與所述第一寡核苷酸鏈的被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)充分互補；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
110.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，其中，所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，其中從所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第一寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第二寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成1-4個核苷酸組成的3’ 懸垂結(jié)構；所述第二寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中至少有一個核苷酸殘基是被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
111.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，其中，其中從所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第一寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第二寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成1-4個核苷酸組成的3’ 懸垂結(jié)構；所述第二寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中至少一個是脫氧核糖核苷酸，并可與所述第一寡核苷酸鏈被硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)形成充分互補； 且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
112.—種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，其中，其中從所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第二寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基與所述所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基形成一個或兩個錯配的堿基對；所述第二寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中至少有一個核苷酸是硫代磷酸基修飾的核苷酸 (PS-NA)；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
113.—種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，其中，其中從所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第二寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基與所述所述第二寡核苷酸鏈的5’ 末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基形成一個或兩個錯配的堿基對；所述第二寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中至少有一個核苷酸是脫氧核糖核苷酸，且能與所述第一寡核苷酸鏈的PS-NA充分互補；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
114.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的所述第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的所述第二寡核苷酸鏈，其中，所述第二寡核苷酸鏈具有27-53 個核苷酸殘基，其中從所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第 1至第23個核苷酸是核糖核苷酸，其中第11位至第21位包含一個核苷酸與所述第一寡核苷酸鏈形成堿基錯配；所述第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第二寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端，所述第二寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中至少有一個核苷酸是硫代磷酸基修飾的脫氧核糖核苷酸(PS-NA)；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
115.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的所述第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的所述第二寡核苷酸鏈，其中，所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，其中從所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第二寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端；所述第一寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中至少有一個核苷酸是硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補， 以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達；其中所述第二寡核苷酸鏈的第11-21位包含一個與靶標RNA的核苷酸形成錯配的核苷酸。
116.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的所述第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的所述第二寡核苷酸鏈，其中，所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，其中從所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1 至第23個核苷酸是核糖核苷酸，其中第11位至第21位包含一個核苷酸與所述第一寡核苷酸鏈形成堿基錯配；所述第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第二寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端；所述第二寡核苷酸鏈第24位至3’末端的核苷酸殘基中至少有一個核苷酸堿基可以和所述第一寡核苷酸鏈的被硫代磷酸基修飾的核苷酸的(PS-NA)互補；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
117.—種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的所述第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的所述第二寡核苷酸鏈，其中，所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，其中從所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1 至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，并具有23 個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第二寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端；所述第二寡核苷酸鏈第24位至3’末端的核苷酸殘基中至少一個是脫氧核糖核苷酸，且和所述第一寡核苷酸鏈的被硫代磷酸基修飾的核苷酸的(PS-NA)互補；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達；其中所述第二寡核苷酸鏈的第11-21位包含一個與靶標RNA的核苷酸形成錯配的核苷酸。
118.—種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的所述第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的所述第二寡核苷酸鏈，其中，所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，其中從所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1 至第23個核苷酸是核糖核苷酸，其中第11位至第21位包含一個核苷酸與所述第一寡核苷酸鏈形成堿基錯配；所述第一寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第二寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成4個核苷酸的3'懸垂； 所述第二寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中至少有一個核苷酸是硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
119.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的所述第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的所述第二寡核苷酸鏈，其中，所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，其中從所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1 至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第一寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23 個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第二寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成1-4個核苷酸的3’懸垂結(jié)構，所述第二寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中至少有一個核苷酸是硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達；其中所述第二寡核苷酸鏈的第11-21位包含一個與靶標RNA的核苷酸形成錯配的核苷酸。
120.一種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的所述第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的所述第二寡核苷酸鏈，其中，所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，其中從所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸，其中第11位至第21位包含一個核苷酸與所述第一寡核苷酸鏈形成堿基錯配；所述第一寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第二寡核苷酸鏈的第1至第23個核糖核苷酸的充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成1-4個核苷酸的3’懸垂結(jié)構，所述第二寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中至少有一個核苷酸是脫氧核糖核苷酸，該脫氧核糖核苷酸與所述第一寡核苷酸鏈的硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA) 充分互補；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
121.—種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，其中，所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，其中從所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第一寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，并具有23個連續(xù)的核糖核苷酸，這23個連續(xù)的核糖核苷酸與所述第二寡核苷酸鏈的第1至第23位的核糖核苷酸充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成1-4個核苷酸的3’懸垂結(jié)構，所述第二寡核苷酸鏈第24位至3’末端的核苷酸殘基中至少有一個是可以和所述第一寡核苷酸鏈的被硫代磷酸基修飾的脫氧核糖核苷酸的(PS-NA) 互補的脫氧核糖核苷酸堿基；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA 充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達；其中所述第二寡核苷酸鏈的第11-21位包含一個與靶標RNA的核苷酸形成錯配的核苷酸。
122.—種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的第二寡核苷酸鏈，所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基， 其中，其中從所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1至第23 個核苷酸是核糖核苷酸，其中第11位至第21位包含一個核苷酸與所述第一寡核苷酸鏈形成堿基錯配；所述第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，并具有21個連續(xù)的核糖核苷酸，且與所述第二寡核苷酸鏈的第3至第23個核糖核苷酸充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端，所述第一寡核苷酸鏈的3’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基與所述所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基形成一個或兩個錯配的堿基對；所述第二寡核苷酸鏈的第 24位至3’末端的核苷酸殘基中至少有一個是硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
123.—種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的所述第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的所述第二寡核苷酸鏈，其中，所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，其中從所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1 至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第一寡核苷酸鏈有27-49個核苷酸殘基，并具有21個連續(xù)的核糖核苷酸，這21個連續(xù)的核糖核苷酸與所述第二寡核苷酸鏈的第3至第23個核糖核苷酸充分互補形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端，所述第一寡核苷酸鏈的3’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基與所述所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基形成一個或兩個錯配的堿基對；所述第二寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中至少有一個是硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標 RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達；其中所述第二寡核苷酸鏈的第11-21位包含一個與靶標RNA的核苷酸形成錯配的核苷酸。
124.—種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的所述第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的所述第二寡核苷酸鏈，其中，所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，其中從所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1 至第23個核苷酸是核糖核苷酸，其中第11位至第21位包含一個核苷酸與所述第一寡核苷酸鏈形成堿基錯配；所述第一寡核苷酸鏈具有27-49個核苷酸殘基，并具有21個連續(xù)的核糖核苷酸，與所述第二寡核苷酸鏈的第3至第23個核糖核苷酸充分互補而形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’末端形成鈍性末端，所述第一寡核苷酸鏈的3’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基與所述所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基形成一個或兩個錯配的堿基對；所述第二寡核苷酸鏈第24位至3’末端的核苷酸殘基中至少有一個是可以和所述第一寡核苷酸鏈的被硫代磷酸基修飾的脫氧核糖核苷酸的(PS-NA)互補的脫氧核糖核苷酸堿基；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達。
125.—種分離的雙鏈核酸(dsNA)，包括具有5’末端和3’末端的所述第一寡核苷酸鏈和具有5’末端和3’末端的所述第二寡核苷酸鏈，其中，所述第二寡核苷酸鏈具有27-53個核苷酸殘基，其中從所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的第一個核苷酸(第1位)開始，第1至第23個核苷酸是核糖核苷酸；所述第一寡核苷酸鏈有27-49個核苷酸殘基，并具有21個連續(xù)的核糖核苷酸，這21個連續(xù)的核糖核苷酸與所述第二寡核苷酸鏈的第3至第23個核糖核苷酸充分互補而形成雙鏈；所述第一寡核苷酸鏈的3’末端和所述第二寡核苷酸鏈的5’ 末端形成鈍性末端，所述第一寡核苷酸鏈的3’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基與所述所述第二寡核苷酸鏈的5’末端的最后一個和倒數(shù)第二個核苷酸殘基形成一個或兩個錯配的堿基對；所述第二寡核苷酸鏈第24位至3’末端的核苷酸殘基中至少有一個是可以和所述第一寡核苷酸鏈的被硫代磷酸基修飾的脫氧核糖核苷酸的(PS-NA)互補的脫氧核糖核苷酸堿基；且所述第二寡核苷酸鏈沿其至少19個核糖核苷酸與靶標RNA充分互補，以在雙鏈核酸被導入到哺乳動物細胞時降低目的基因的表達；其中所述第二寡核苷酸鏈的第 11-21位包含一個與靶標RNA的核苷酸形成錯配的核苷酸。
126.根據(jù)權利要求108-125任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第二寡核苷酸鏈的第24位至3’末端的核苷酸殘基中有2個或者更多是硫代磷酸基修飾的核苷酸(PS-NA)。
127.根據(jù)權利要求126所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第二寡核苷酸鏈上的PS-NA與所述第一寡核苷酸鏈上的PS-NA充分互補。
128.根據(jù)權利要求85-127任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，雙鏈核酸含有總共兩個或者更多，三個或者更多，四個或者更多，五個或者更多，六個或者更多，七個或者更多，八個或者更多，九個或者更多，十個或者更多，十一個或者更多，十二個或者更多，十三個或者更多，十四個或者更多，或者十五個或者更多的PS-NA殘基。
129.根據(jù)權利要求1-128任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，在哺乳動物細胞內(nèi)被Dicer酶切。
130.根據(jù)權利要求1-129任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述雙鏈核酸是在哺乳動物內(nèi)部被Dicer酶切，并產(chǎn)生一長度為19-23個核苷酸可抑制目的基因表達的雙鏈核酸。
131.根據(jù)權利要求1-130任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，分離的雙鏈核酸具有磷酸化、硫代磷酸化或者磷酸三脂的磷酸骨架修飾。
132.根據(jù)權利要求1-131任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述雙鏈核酸在哺乳動物體外實驗中可減少目的基因表達量的至少10%，至少50%，或者至少 80-90%。
133.根據(jù)權利要求1-132任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，與相應的雙鏈RNA，即不含DNA: DNA充分互補的雙鏈相比，雙鏈核酸在導入到哺乳動物細胞后降低目的基因的表達。
134.根據(jù)權利要求1-133任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，導入到哺乳動物細胞的雙鏈核酸的含量選擇如下InM或者更少，200pM或者更少，IOOpM或者更少， 50pM或者更少，20pM或者更少，IOpM或者更少，5pM或者更少，和IpM或者更少時可以降低目的基因的表達量達70%。
135.根據(jù)權利要求1-134任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，至少50% 雙鏈核酸的核甘酸殘基是未被修飾的。
136.根據(jù)權利要求1-135任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，至少50% 雙鏈核酸所述第二寡核苷酸鏈的核甘酸殘基是未被修飾的。
137.根據(jù)權利要求1-136任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，至少50% 雙鏈核酸的脫氧核糖核苷酸殘基是未被修飾的脫氧核糖核苷酸。
138.根據(jù)權利要求1-137任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，所述第一寡核苷酸鏈有至少80 %，90 %，95 %，或者100 %核苷酸序列是與所述第二寡核苷酸鏈互補。
139.根據(jù)權利要求1-138任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)，其特征是，目的RNA 是 KRAS。
140.一種降低細胞中目的基因的表達的方法，包括將權利要求1-139任一項所述的分離的dsNA與細胞接觸，所述的分離的dsNA相比于相應的雙鏈RNA能更高效的降低細胞內(nèi)目的基因的表達。
141.一種降低動物中目的基因的表達的方法，包括將權利要求1-139任一項所述的分離的dsNA與動物接觸，所述的分離的dsNA相比于相應的雙鏈RNA能更高效的降低動物細胞內(nèi)的目的基因的表達。
142.根據(jù)權利要求141所述的方法，其特征是，相比于適當?shù)膶φ誅siRNA，所述dsNA 具有以下特性中的任一種增強的藥效代謝動力學，增強的藥效學，降低了毒性，和增強的細胞內(nèi)攝取量。
143.一種用于在個體的細胞中降低目的基因的表達的藥物組合物，其包括有權利要求 1-139任一項所述分離的雙鏈核酸(dsNA)和藥學上可接受的載體，所述分離的雙鏈核酸相比于相應的dsRNA可以更高效的降低細胞中目的基因的表達。
144.一種合成權利要求1-139任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)的方法，包括化學合成所述dsNA或酶促合成所述dsNA。
145.一種包含權利要求1-139任一項所述的分離的雙鏈核酸(dsNA)和它的使用說明的試劑盒。
146.圖30-43C所示的任一種分離的雙鏈核酸(dsNA)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于抑制細胞中目的基因的表達的組合物和方法，包括用分離的雙鏈核酸(dsNAs)接觸細胞，從而有效降低細胞中目的基因的表達。本發(fā)明所述的dsNAs被設計為具有脫氧核糖核苷酸的結(jié)構(在大多數(shù)的實施例中，這種設計包括至少一個脫氧核糖核苷酸-脫氧核糖核苷酸的堿基對)，設計的脫氧核糖核苷酸可以指導Dicer酶在雙鏈核酸(dsNAs)的分子內(nèi)部剪切。本發(fā)明所述的dsNAs分子的脫氧核糖核苷酸位于dsNAs的區(qū)域內(nèi)部，并能通過Dicer酶剪切從而分離產(chǎn)生一種有活性的、不再含有脫氧核糖核苷酸結(jié)構(例如脫氧核糖核苷酸-脫氧核糖核苷酸的堿基對)siRNA。這種DNA延長的Dicer酶底物siRNAs(DsiRNAs)已被證實具有更多的RNA抑制劑活性，相比于雙鏈RNA延長的DsiRNAs而言。DsiRNAs也被發(fā)現(xiàn)能引導堿基鏈錯配。
文檔編號C07H21/04GK102325534SQ200980157015
公開日2012年1月18日 申請日期2009年12月18日 優(yōu)先權日2008年12月18日
發(fā)明者鮑勃·布朗 申請人:戴瑟納制藥公司