專利名稱：克氏原螯蝦甲殼肽基因及其編碼的甲殼肽與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種甲殼肽基因及其編碼的蛋白與應(yīng)用，尤其涉及一種克氏原螯蝦甲 殼肽(Crustin)基因及其編碼的甲殼肽與所述基因在制備具有抗菌活性的重組蛋白中的 應(yīng)用，屬基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
眾所周知，無脊椎動(dòng)物雖然不存在適應(yīng)性免疫，但它們具有強(qiáng)大的先天免疫防御 反應(yīng)，包括細(xì)胞和體液免疫，依靠這些防御反應(yīng)清除或消滅病原。體液免疫的主要效應(yīng)分子 包括抗菌肽、酚氧化酶依賴性黑化系統(tǒng)和凋亡相關(guān)基因系統(tǒng)等；其中抗菌肽是多種生物體 內(nèi)產(chǎn)生的可以抑制或殺死病原微生物的肽類或蛋白，是無脊椎動(dòng)物重要的體液免疫效應(yīng)分 子，是生物機(jī)體在抵御病原微生物的防御反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的一類物質(zhì)，是宿主防御病原 微生物入侵的重要分子屏障。與傳統(tǒng)抗菌藥物相比，抗菌肽具有以下優(yōu)點(diǎn)①穩(wěn)定性高，在100°C加熱IOmin條 件下仍能保持一定活力，且對(duì)較大的離子強(qiáng)度和較低或較高的PH值都有較強(qiáng)的抗性；②它 對(duì)正常真核細(xì)胞幾乎沒有毒性，僅作用于原核細(xì)胞和發(fā)生病變的真核細(xì)胞；③抗菌譜廣，除 了抗細(xì)菌外，有的抗菌肽還能作用于真菌、原蟲、病毒及癌細(xì)胞等；④由于抗菌肽的作用靶 標(biāo)主要是細(xì)菌的細(xì)胞膜，因此病原菌不易對(duì)其產(chǎn)生耐藥性；⑤不像其他抗生素那樣由于死 亡的細(xì)菌釋放內(nèi)毒素而間接引起敗血癥，抗菌肽能夠與內(nèi)毒素結(jié)合從而減少或避免膿毒性 沖擊。因而極有希望將抗菌肽開發(fā)成為一類新型的廣譜高效抗菌藥物。另外，抗菌肽還可 以應(yīng)用到食品工業(yè)，能快速抑制微生物的生長，人、畜食后易被體內(nèi)蛋白酶水解消化且無毒 副作用，在酸性條件下活性很強(qiáng)，具有良好的溶解性和穩(wěn)定性，是一種極具發(fā)展前景的新型 食品防腐劑。抗菌肽在農(nóng)業(yè)工程上也有應(yīng)用，利用昆蟲抗菌肽培育具有抗病菌品種的作物， 可大大減少農(nóng)藥用量，降低環(huán)境污染指數(shù)，生產(chǎn)出綠色農(nóng)產(chǎn)品。昆蟲抗菌肽被認(rèn)為是最有發(fā) 展前景的綠色飼料添加劑，抗菌肽可促進(jìn)動(dòng)物生長，提高動(dòng)物抗病能力，且不容易產(chǎn)生耐藥 性。應(yīng)用抗菌肽轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)，把特異的抗菌肽基因轉(zhuǎn)入畜禽特定細(xì)胞讓其表達(dá)，從而產(chǎn) 生抗病新品種。可以預(yù)見，抗菌肽及其基因工程產(chǎn)品在醫(yī)藥衛(wèi)生、食品工業(yè)、畜牧業(yè)及農(nóng)業(yè) 等方面將發(fā)揮極為重要的作用，抗菌肽的市場(chǎng)應(yīng)用前景必將更為廣闊。甲殼肽(Crustins)是廣泛存在于節(jié)肢動(dòng)物的一類抗菌肽，最初在草食蟹中分離 得到的。甲殼肽的C端有一個(gè)比較保守的乳清酸蛋白結(jié)構(gòu)域。根據(jù)氨基酸序列的不同，甲 殼肽可以分類為三類即I型、II型和III型甲殼肽。I型甲殼肽在信號(hào)肽區(qū)和乳清酸蛋白 結(jié)構(gòu)域之間有一個(gè)半胱氨酸富含區(qū)。II型甲殼肽除了半胱氨酸富含區(qū)和乳清酸蛋白結(jié)構(gòu)域 之外，還有一個(gè)甘氨酸富含區(qū)，III型甲殼肽含有一個(gè)乳清酸蛋白結(jié)構(gòu)域和富含脯氨酸和精 氨酸的模體。I型甲殼肽主要存在于在鱟和淡水小龍蝦中；II型和III型甲殼肽在對(duì)蝦中 發(fā)現(xiàn)的比較多。甲殼肽一般具有對(duì)革蘭氏陽性菌的抑菌活性?？耸显r(Procambarus clarkii)，俗稱淡水小龍蝦，是我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品 種。小龍蝦味道鮮美，磷、鈣、鐵等元素含量高，蛋白含量高，而脂肪含量低，是一種營養(yǎng)價(jià)值很高的經(jīng)濟(jì)型水產(chǎn)養(yǎng)殖品種。而且小龍蝦的蝦殼的提取物在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和化工業(yè)中有 著廣泛的應(yīng)用價(jià)值，因此，小龍蝦的疾病預(yù)防和治療方面的研究格外重要。小龍蝦對(duì)環(huán)境的 適應(yīng)能力較強(qiáng)，對(duì)各種流行性的疾病有一定的抵抗能力，鑒于此，研究小龍蝦的抗菌肽對(duì)于 我們了解蝦類的抗病機(jī)制有著重要的作用。 諸多研究表明，在蝦類等節(jié)肢動(dòng)物中存在多種可以抵抗外界病原微生物的蛋白或 肽類，如對(duì)蝦素、甲殼肽(crustins)等，但是在相關(guān)的報(bào)導(dǎo)中，未見有克氏原螯蝦的甲殼肽 基因的報(bào)導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供-
-種編碼從克氏原螯蝦中克隆的抗菌
肽一一甲殼肽的基因序列，并提供其重組表達(dá)與純化方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供從
-甲殼肽的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了該基因序列的用
克氏原螯蝦中克隆的抗菌肽_ 途，甲殼肽的用途。本發(fā)明的克氏原螯蝦甲殼肽基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其中所示fi 息為(a)序列特征*長度576堿基對(duì)*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型cDNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源克氏原螯蝦(Procambius clarkii)(f)序列描述:SEQ ID NO. 1atgctgcgcgtgctggtgttgtccatgctggtggtggcggccctcggccaccttccccga60
cccaagcccccacagccgggctgtaactactactgcaccaagcccgagggcccaaacaag120
ggcgccaagtactgctgcggtccccagttccttcccctaattagggaagaaaagcacaat180
ggtttctgtcctcctcctctcaaggactgcacaagaatcctaccacctcaggtgtgcccc240
catgacggacattgtcccataaaccagaagtgttgctttgacacctgtctcgacctccat300
acctgcaagcctgcacacttttacatcaattagcttgagaggaatagcgtagtcgccgct360
cctctgtgtggcacttcaagatggatctaagtcaatgatgattccctgagctgaactaca420
acaatgctgtgcttataggttgttggctcgcttgttcactttgtattgtttggtgtttat480
tttaaaggaatatatgtttcatgtataaatgagaggagttttgtctatta3.3. 3.3.3.3.3. 3.540
ctttccaaaa576。
本發(fā)明的克氏原螯蝦甲殼肽基因編碼的甲殼肽多肽，其氨基酸序列如SEQ ID 所示，其中所示信息為 (a)序列特征 *長度110氨基酸
*類型氨基酸*鏈型單鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型蛋白質(zhì)(c)序列描述:SEQ ID NO. 2Met Leu Arg Val Leu Val Leu Ser Met Leu Val Val Ala Ala Leu510 15Gly His Leu Pro Arg Pro LysPro Pro GlnPro Gly Cys Asn Tyr2025 30Tyr Cys Thr Lys Pro Glu GlyPro Asn LysGly Ala Lys Tyr Cys3540 45Cys Gly Pro Gln Phe Leu ProLeu lie ArgGlu Glu Lys His Asn5055 60Gly Phe Cys Pro Pro Pro LeuLys Asp CysThr Arg lie Leu Pro6570 75Pro Gln Val Cys Pro His AspGly His CysPro lie Asn Gln Lys8085 90Cys Cys Phe Asp Thr Cys LeuAsp Leu HisThr Cys Lys Pro Ala95100 105His Phe Tyr lie Asn110。本發(fā)明還提供了所述的SEQ IDNO. 2所示氨基酸序列的變異體，它編碼具有少于
8個(gè)氨基酸改變的同源變異蛋白，而且氨基酸改變是保守性氨基酸改變，例如Tyr29 —Trp ； Gly33 — Ala ；Phe47 — Trp ；Thr56 — Ser ；Arg57 — Lys ；Asp79 — Glu。本發(fā)明的克氏原螯蝦甲殼肽cDNA的克隆方法是利用克氏原螯蝦的鰓組織構(gòu)建 cDNA文庫，然后進(jìn)行隨機(jī)測(cè)序，對(duì)所得序列進(jìn)行相似性比對(duì)，得到了甲殼肽的cDNA的部分 序列，然后進(jìn)行3’和5’端快速擴(kuò)增，獲得全長序列?？梢岳帽景l(fā)明的克氏原螯蝦甲殼肽基因制備原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，表 達(dá)具有抗菌活性的重組蛋白?？梢岳帽景l(fā)明的克氏原螯蝦甲殼肽基因制備酵母表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染畢赤酵母獲得 工程菌株，誘導(dǎo)表達(dá)獲得具有抗菌活性的重組蛋白。例如將獲得的克氏原螯蝦甲殼肽基因 克隆到PPIC9K載體，轉(zhuǎn)染畢赤酵母Pichia pastoris KM71，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，純化；并利用獲 得重組蛋白進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。其抗菌譜和最小抑菌濃度(以菌體不生長的濃度為最小抑菌濃 度)見表1。表1 克氏原螯蝦甲殼肽最小抑菌濃度
由表1可以看到，甲殼肽既對(duì)革蘭氏陽性菌有抑制活性，又對(duì)革蘭氏陰性菌有抑 制活性。利用本發(fā)明的克氏原螯蝦甲殼肽基因通過基因工程方法將其轉(zhuǎn)入作物，可以獲得 具有抗菌能力的作物。利用本發(fā)明獲得的重組的甲殼肽可用于抗菌的飼料添加劑、食品保存、動(dòng)植物基 因轉(zhuǎn)化和藥物開發(fā)。


圖1為重組克氏原螯蝦甲殼肽純化后的電泳圖；其中，M 分子量標(biāo)記，1.誘導(dǎo)前表達(dá)菌株，2.誘導(dǎo)后表達(dá)菌株，3.純化的重組甲殼 肽。圖2為甲殼肽在畢赤酵母中的表達(dá)電泳圖；其中，C誘導(dǎo)前上清液，1甲醇誘導(dǎo)表達(dá)第一天上清液，2甲醇誘導(dǎo)表達(dá)第二天上清 液，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)第4天上清液，M分子量標(biāo)記。圖3為重組甲殼肽對(duì)鰻弧菌和枯草桿菌的抑菌活性示意圖，其中，(a):鰻弧菌； (b)枯草桿菌；1氨芐青霉素(陽性對(duì)照)，2培養(yǎng)基(陰性對(duì)照)，牛血清白蛋白(陰性對(duì) 照)，4重組甲殼肽。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明實(shí)施例1 克氏原鰲蝦甲殼肽cDNA的克隆1)總RNA的提取采用現(xiàn)有技術(shù)一步法提取總RNA。2) cDNA 第一鏈合成4 微升總 RNA，加 1 微升 SmartF (5，-TAC GGC TGC GAGAAGACGACA GAA GGG-3，)禾口 1 微升 Oligoanchor R (5’-GAC CAC GCG TAT CGA TGT CGA CT16 (A/C/G) -3’)，72°C反應(yīng) 5 分鐘，后加 5 倍 Buffer 4 微升，dNTP 1. 25 微升，RNA 酶抑制 劑0. 625微升，1微升MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶，無RNase的滅菌水12. 875微升42°C反應(yīng)60分鐘， 70 0C 10分鐘終止反應(yīng)。3) PCR反應(yīng)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)(PCR)試劑與條件首先將下列試劑混在一起
· IOxTaq DNA聚合酶緩沖液5微升(μ 1) 模板 cDNA1 μ 1 正向引物(IOmM)Ιμ 反向引物(IOmM)Ιμ 脫氧核苷酸混合物(dNTP)4μ 1參 Taq DNA 聚合酶0. 25 μ 1 滅菌水37. 75 μ 1_ 總體積50 μ 1根據(jù)克氏原鰲蝦文庫隨機(jī)測(cè)序所得的序列設(shè)計(jì)的引物為正向引物Fl5，GTC CTA GAG TTC ACC TGC AGC 3，反向引物Rl5，CTC ATT TGT CGT AGC TCT GAG 3，PCR反應(yīng)條件為首先94°C變性2分鐘，然后進(jìn)入下列循環(huán)94°C 30秒，53°C 45 秒，72°C 45秒，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。4)反應(yīng)產(chǎn)物純化利用德國奎因(QIAGEN)公司產(chǎn)品QIAquick Gel Extraction Kit,操作步驟按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。5)克氏原鰲蝦甲殼肽cDNA克隆取純化產(chǎn)物3微升，連接于pMD 18-T載體 (TaKaRa公司產(chǎn)品)。轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α菌株，在含有氨芐青霉素(100微克/毫升)、 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷(X-gal 0. 2微克/毫升)和異丙基硫代半乳糖苷 (IPTG 0.1摩爾/毫升)的平板生長過夜，挑取3個(gè)白斑，在LB液體培養(yǎng)基(5毫升，含100
微克/毫升安芐青霉素)中培養(yǎng)過夜。6)質(zhì)粒純化收取過夜培養(yǎng)菌液2毫升，離心(6000轉(zhuǎn)/分，3分鐘)收集細(xì)胞。 用微量DNA純化試劑盒(Wizard plus SV Minipreps DNA Purification System，美國普洛 麥格Promega公司)純化質(zhì)粒，純化步驟按說明書進(jìn)行。7)序列測(cè)定與同源檢索取純化質(zhì)粒4微升，用載體引物T7進(jìn)行全自動(dòng)測(cè)序(本 工作在上海生工公司完成)。將所得序列與基因庫序列比較。8)克氏原鰲蝦甲殼肽cDNA 3’端快速擴(kuò)增根據(jù)得到的抗菌肽基因片段，正向引物Fl和anchor R引物(5’ -GAC CAC GCG TATCGA TGT CGA C3，)進(jìn)行cDNA 3，端快速擴(kuò)增，操作步驟按寶生物3，RACE試劑盒說明書 進(jìn)行。取血細(xì)胞總RNA約20 μ g，其他試劑的調(diào)制和反應(yīng)條件按說明書進(jìn)行。用特異性引 物F3與3’接頭進(jìn)行3’端PCR擴(kuò)增，采用56°C退火，其余與上述的PCR擴(kuò)增程序相同，對(duì)所 得產(chǎn)物按前述方法進(jìn)行克隆、驗(yàn)證和測(cè)序。9)克氏原鰲蝦甲殼肽cDNA 5，端克隆以上述cDNA為模板，以試劑盒提供的5，PCR(5，-TAC GGC TGC GAG AAG ACG ACAGAA-3’ )引物和反向引物Rl為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得克氏原鰲蝦甲殼肽cDNA的5’ 序列。將3，和5，端序列拼接，即獲得SEQ ID NO. 1所示克氏原鰲蝦甲殼肽cDNA基因全 長核苷酸序列。
8
實(shí)施例2 原核重組表達(dá)載體構(gòu)建、表達(dá)與純化(1)根據(jù)克氏原螯蝦甲殼肽的序列(去掉信號(hào)肽序列)和表達(dá)載體 pPET30a(Novagen公司)的克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物Cru-pET F 5' TAC TCA GAA TTC CAC CTT AAA CGA CCC AAG CC 3' (EcoRI)Cru-pET R 5' TAC TCA CTC GAG CTA ATT GAT GTA AAA GTG TGC 3' (XhoI)本發(fā)明選擇了 pET30a克隆位點(diǎn)的EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)，因此，設(shè)計(jì)引物時(shí)在 上游引物引入了 EcoR I酶切位點(diǎn)，下游引物上引入了 Xho I酶切位點(diǎn)。(2)基因擴(kuò)增、克隆與重組質(zhì)粒篩選以pMD-18T-Lec為模板，用上述引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增條件為94°C，2min預(yù)變 性;94°C，30s，56°C，45s，72°C，45s，35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin02 %的瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物檢測(cè)將PCR產(chǎn)物作制備電泳，用UNIQ-5 Column DNA Gel Extraction Kit(上海生工產(chǎn) 品)回收、純化PCR產(chǎn)物，經(jīng)過EcoR I和Xho I內(nèi)切酶酶切，切下兩端帶有Xho I和EcoR I內(nèi)切酶位點(diǎn)的家蠅防御素成熟肽cDNA片段，同樣表達(dá)載體pET30a經(jīng)過EcoR I和Xho I內(nèi)切酶酶切，暴露出多克隆位點(diǎn)兩端的Xho I和EcoR I內(nèi)切酶位點(diǎn)。然后，將酶切后的 擴(kuò)增產(chǎn)物與表達(dá)載體用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，LB+Amp平板PCR篩選 陽性克隆。挑取PCR篩到的菌落，37°C振蕩擴(kuò)增培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒，EcoR I和Xho I雙酶切 與測(cè)序驗(yàn)證后，即為重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-LeC。接轉(zhuǎn)化Ε. coli表達(dá)菌株BL21DE3感受態(tài)細(xì) 胞，涂布LB+Amp平板，37°C倒置過夜培養(yǎng)。(3)篩選表達(dá)菌株從上述LB+Amp平板上挑取5個(gè)單克隆菌落，2ml LB+Amp液體培養(yǎng)基37°C振蕩過 夜培養(yǎng)，次日，取20 μ 1過夜培養(yǎng)液加入到2ml LB+Amp液體培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)培養(yǎng)，37°C振蕩培養(yǎng) 3h，至0D_在0. 5 0. 7之間，然后加入IPTG至終濃度為Immol，繼續(xù)37°C振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo) 表達(dá)4h。誘導(dǎo)前，從不同樣品中取出0. 5ml菌液，電泳檢測(cè)時(shí)以未誘導(dǎo)菌株為對(duì)照。表達(dá)完后，各取0.5ml菌液，5 OOOr/min離心5min收集細(xì)胞，包括未誘導(dǎo)菌株的樣 品，重懸于100 μ 1去離子水中，以此為電泳樣品作12. 5%的SDS-PGAE。根據(jù)電泳結(jié)果是否 存在誘導(dǎo)表達(dá)的重組甲殼肽的條帶，鑒定重組表達(dá)菌株。選取表達(dá)量高的菌株進(jìn)行下面的 大規(guī)模表達(dá)和純化。(5)重組甲殼肽表達(dá)與純化挑取表達(dá)菌株單克隆在LB+Amp液體培養(yǎng)基中37°C過夜振蕩培養(yǎng)，次日，按照體積 比1 100加入到IOOml LB+Amp培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)培養(yǎng)，37°C振蕩培養(yǎng)3h后，再加入IPTG至終 濃度為lmmol，再37°C振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)4h。誘導(dǎo)前取出0. 5ml的菌液，作為誘導(dǎo)前對(duì)照樣品。 誘導(dǎo)培養(yǎng)完后，菌液在合適的離心管中7 OOOr/min離心IOmin收集細(xì)胞，細(xì)胞重懸于5ml 預(yù)冷的1XPBS，加入50μ 1 20%的Triton X-100，充分混勻后冰浴30min。超聲波破碎細(xì) 胞，超聲循環(huán)為超聲1秒(s)；間隔Is ；全程40s。重復(fù)4次，每次間隙時(shí)將菌液在冰浴中 混勻，避免局部溫度太高，使蛋白質(zhì)變性。最后，將破碎后的菌液lOOOOr/min離心15min，收 集上清液和沉淀，上清液和沉淀分別留樣、備用。重組蛋白以包含體的形式存在，以常規(guī)方法經(jīng)過包含體純化、復(fù)性和常規(guī)的組氨 酸標(biāo)簽親和層析，即獲得到了重組蛋白——重組甲殼肽，電泳(SDS-PAGE)結(jié)果如圖1所示。該重組蛋白的分子量與根據(jù)序列預(yù)測(cè)的分子量大小一致。另外，我們利用組氨酸標(biāo)簽抗體 進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，也證明所得到的重組蛋白就是SEQ ID NO. 2序列所述的蛋白。(6)重組蛋白活性測(cè)定采用平板抑菌的方法，重組表達(dá)的甲殼肽顯示出對(duì)少數(shù)革蘭氏陽性菌有抑菌活 性。實(shí)施例3 甲殼肽在畢赤酵母中的重組表達(dá)與抑菌活性測(cè)定(l)pPIC9K (Invetrogen公司)重組表達(dá)載體的構(gòu)建本發(fā)明選擇了 pPIC9K克隆位點(diǎn)的EcoR I和Not I酶切位點(diǎn)，因此，設(shè)計(jì)引物時(shí) 在上游引物引入了 EcoR I酶切位點(diǎn)，下游引物上引入了 Not I酶切位點(diǎn)Cru-pPIC F 5' TAC TCA GAA TTC CAC CTT AAA CGA CCC AAG CC 3' (EcoRI)Cru-pPIC R5' TAC TCA GCGGCCGC CTA ATG ATG ATG ATG ATG ATG ATG ATGATT GAT GTA AAA GTG TGC 3' (NotI)以克氏原螯蝦血細(xì)胞cDNA為模板，用常規(guī)PCR方法擴(kuò)增得到甲殼肽成熟肽的序 列，并將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化。然后用EcoR I、Not I雙酶切pPIC9K及Crustin的PCR擴(kuò)增 片斷。酶切后的質(zhì)粒作制備電泳，將大小為300bp的基因片段和切開后的載體從膠上切下， UNIQ-5柱式膠回收試劑盒回收?；厥盏玫降幕蚱魏捅磉_(dá)載體用T4DNA連接酶16°C連接 過夜，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α。鋪平板。從平板上挑取單克隆，進(jìn)行利用上述表達(dá)引物進(jìn) 行PCR篩選。然后將陽性克隆接種于5mL LB+Amp液體培養(yǎng)基中37°C振蕩培養(yǎng)過夜，次日， 取一部分菌液加入10%甘油后-70°C保種。其余用來提取質(zhì)粒(Crustin-pPIC9K質(zhì)粒)。 將上述新鮮提取的質(zhì)粒均以EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。(2)轉(zhuǎn)化KM71感受態(tài)細(xì)胞并篩選重組轉(zhuǎn)化子首先將載體線性化將Crustin-pPIC9K重組質(zhì)粒和pPIC9K空質(zhì)粒分別進(jìn)行Sal I酶切，酚/氯仿抽提純化。酶切反應(yīng)體系20 μ L，冰浴上操作，如表2所示表2IOXBuffer2μ LSal I1 μ L質(zhì)粒15 μ L_力口 (1(1!120至20 μ L37°C水浴，酶切3小時(shí)。用瓊脂糖電泳檢測(cè)確認(rèn)酶切完全后，酚氯仿抽提線性 化的質(zhì)粒，去除酶蛋白，最后將線性化的質(zhì)粒溶于 ο μ L去離子水中，-20°c儲(chǔ)存?zhèn)溆谩EG法轉(zhuǎn)化KM71酵母感受態(tài)細(xì)胞酶切完全的純化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母KM71感受態(tài)細(xì) 胞。轉(zhuǎn)化方法如下將IOyL線性化的重組載體和4 μ L擔(dān)體DNA加入到冰凍狀態(tài)的酵母感 受態(tài)細(xì)胞ΚΜ71，冰上混勻。然后37°C水浴5min，期間混勻一至兩次。再加入1. 5mL Buffer B，仔細(xì)混合，30°C水浴lhr，5，OOOrpm離心lOmin。棄上清液，在1. 5mL Buffer C中懸浮細(xì) 胞，5，OOOrpm離心lOmin。去掉大部分上清液，留200 μ L左右，輕輕懸起細(xì)胞。用三角玻棒將 細(xì)胞涂布在 MD (Minimal Dextrose Medium :1· 34% YNB ；4X10-5% Biotin ；2% Dextrose, 1. 5% agar)平板上，28°C -30°C倒置培養(yǎng)2-3天。
(3)篩選重組轉(zhuǎn)化子PCR篩選重組的陽性克隆，挑取MD平板上的單菌落進(jìn)行PCR篩選，同時(shí)保種在MD 平板上。PCR用前引物為載體上α-Factor F，后引物R為Crustin基因的特異性引物。將陽 性克隆接種于 5mL YPD 液體培養(yǎng)基(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium 1 % Yeast Extract ；2% Peptone2% Dextrose (glucose))中，28°C振蕩培養(yǎng)。加入 10%甘油后 _80°C 保存菌種。(4)多拷貝篩選將在YPD培養(yǎng)基中28°C振蕩培養(yǎng)過夜的陽性克隆的菌液，以接種環(huán)劃線于含0. 5、 1. 0,2. 0mg/ml梯度濃度G418抗生素的YPD平板上，28°C倒置培養(yǎng)，挑取單菌落PCR篩選。(5)重組蛋白的表達(dá)將含有重組的菌株接入50mL BMGY液體培養(yǎng)基(Buffered Glycerol-complex Medium 1 % yeast extract，2 % tryptone, IOOmM 磷酸緩沖液(pH = 6· 0)，1. 34 % YNB, 4Χ10_5% biotin, 1% glycerol 或者 0· 5% methanol)中，28°C、250 300rpm 振蕩培養(yǎng)至 0D600 = 2 6 (約18 24hrs)，5，OOOrpm離心收集細(xì)胞，棄上清，25mL BMMY重懸細(xì)胞，取 ImL離心留上清作誘導(dǎo)前對(duì)照，添加100%甲醇至終濃度0. 5%，繼續(xù)28 30°C振蕩培養(yǎng)， 每24hrs取樣ImL離心留上清_20°C保存，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝電泳檢測(cè)甲殼肽的表達(dá) (如圖2所示)。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后(4天)，將培養(yǎng)液5，OOOrpm離心20分鐘，最后將上清液 用His標(biāo)簽柱親和純化。(6)重組蛋白活性測(cè)定牛津杯法檢測(cè)Crul和Cru2抗菌活性5mlLB液體培養(yǎng)基37°C 200rpm過夜培養(yǎng) 鰻弧菌(Vibrio anguillarum)、蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis)、金黃色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus)、參錄月農(nóng)If 胃(Pseudomonas aeruginosa)lif (Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌；2. 5. 2取3-5 μ 1菌加至8ml 50°C的液態(tài)PB固體培養(yǎng)基中，混勻， 作為上層膠鋪平板，1. 5%瓊脂作為下層膠；2. 5. 3牛津杯法測(cè)定甲殼肽的抗菌活性，加入 100 μ 1發(fā)酵液，Lys做陰性對(duì)照，100 μ IAMP (0. 025mg/ml)作為陽性對(duì)照；30°C過夜培養(yǎng)，觀 察抑菌圈大小。液體生長抑制方法分別取測(cè)試菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌等單菌 落LB過夜培養(yǎng)液，用LB液體培養(yǎng)基稀釋到0D_ = 0. 01 (約IO6左右)為測(cè)試菌液。取 100 μ 1測(cè)試菌液分別與10倍稀釋的重組甲殼肽樣品混勻，于96孔培養(yǎng)板30°C振蕩培養(yǎng)，5 小時(shí)后每隔2h用酶標(biāo)儀測(cè)A63tl吸收值，用Microsoft Excel處理數(shù)據(jù)，繪制生長曲線圖，以 氨芐青霉素和洗脫液(Elution Buffer)為對(duì)照。抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果重組甲殼肽對(duì)多種細(xì)菌有抑菌活性，其抑菌圈如圖3所示，其抗菌 譜和最小抑菌濃度(以菌體不生長的濃度為最小抑菌濃度)如表1所示。
1權(quán)利要求
一種克氏原螯蝦甲殼肽基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中所示信息為(a)序列特征*長度576堿基對(duì)*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型cDNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源克氏原螯蝦(Procambius clarkii)(f)序列描述SEQ ID NO.1atgctgcgcg tgctggtgtt gtccatgctg gtggtggcgg ccctcggcca ccttccccga 60cccaagcccc cacagccggg ctgtaactac tactgcacca agcccgaggg cccaaacaag 120ggcgccaagt actgctgcgg tccccagttc cttcccctaa ttagggaaga aaagcacaat 180ggtttctgtc ctcctcctct caaggactgc acaagaatcc taccacctca ggtgtgcccc 240catgacggac attgtcccat aaaccagaag tgttgctttg acacctgtct cgacctccat 300acctgcaagc ctgcacactt ttacatcaat tagcttgaga ggaatagcgt agtcgccgct 360cctctgtgtg gcacttcaag atggatctaa gtcaatgatg attccctgag ctgaactaca 420acaatgctgt gcttataggt tgttggctcg cttgttcact ttgtattgtt tggtgtttat 480tttaaaggaa tatatgtttc atgtataaat gagaggagtt ttgtctatta aataaaaata 540ctttccaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 576。
2.權(quán)利要求1所述的克氏原螯蝦甲殼肽基因編碼的甲殼肽多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，其中所示信息為(a)序列特征 *長度110氨基酸 *類型氨基酸 *鏈型單鏈 *拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型蛋白質(zhì)(c)序列描述:SEQID NO. 2 Met Leu Arg Val Leu Val Leu Ser5Gly His Leu Pro Arg Pro Lys Pro 20Tyr Cys Thr Lys Pro Glu Gly Pro 35Cys Gly Pro Gln Phe Leu Pro Leu 50Gly Phe Cys Pro Pro Pro Leu LysMet Leu Val Val Ala Ala Leu1015Pro Gln Pro Gly Cys Asn Tyr 2530Asn Lys Gly Ala Lys Tyr Cys 4045lie Arg Glu Glu Lys His Asn5560Asp Cys Thr Arg lie Leu Pro657075Pro Gln Val Cys Pro His Asp Gly His Cys Pro lie Asn Gln Lys 808590Cys Cys Phe Asp Thr Cys Leu Asp Leu His Thr Cys Lys Pro Ala 95100105His Phe Tyr lie Asn 110。
3.權(quán)利要求2所述的SEQID NO. 2所示氨基酸序列的變異體，其特征在于它編碼具 有少于8個(gè)氨基酸改變的同源變異蛋白，而且氨基酸改變是保守性氨基酸改變。
4.權(quán)利要求1所述的克氏原螯蝦甲殼肽基因在制備具有抗菌能力的作物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于其方法是構(gòu)建含有甲殼肽基因的重組載 體，然后將其導(dǎo)入受體細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)而培養(yǎng)得到具有抗菌能力的作物植株。
6.權(quán)利要求1所述的克氏原螯蝦甲殼肽基因在制備具有抗菌活性的重組蛋白中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于其方法是通過基因重組技術(shù)使克氏原螯 蝦甲殼肽基因在大腸桿菌、酵母或昆蟲型核多角體病毒中進(jìn)行表達(dá)，獲得具有抗菌活性的 重組蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種編碼從克氏原螯蝦中克隆的抗菌肽——甲殼肽的基因序列，并提供其重組表達(dá)與純化方法。本發(fā)明還公開了從克氏原螯蝦中克隆的抗菌肽——甲殼肽的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了該基因序列的用途，甲殼肽的用途?？梢岳帽景l(fā)明的克氏原螯蝦甲殼肽基因制備酵母表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染畢赤酵母獲得工程菌株，誘導(dǎo)表達(dá)獲得具有抗菌活性的重組蛋白。利用本發(fā)明獲得的重組的甲殼肽可用于抗菌的飼料添加劑、食品保存、動(dòng)植物基因轉(zhuǎn)化和藥物開發(fā)。
文檔編號(hào)C07K14/435GK101886081SQ20101019161
公開日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2010年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月4日
發(fā)明者王金星, 趙小凡 申請(qǐng)人:山東大學(xué)