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一種連續(xù)提取番茄紅素的方法

文檔序號:3569814閱讀:325來源:國知局
專利名稱:一種連續(xù)提取番茄紅素的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物分離領(lǐng)域,涉及一種連續(xù)提取番茄紅素的方法。利用該方法可以 有效地從毛霉菌屬真菌三孢布拉霉菌(Blaleslea trispora)發(fā)酵菌絲體中提取番茄紅素。
背景技術(shù)
番茄紅素是一種脂溶性天然色素,屬于類胡蘿卜素。番茄紅素具有比其他類胡蘿 卜素更為優(yōu)越的性能,如其抗氧化性在類胡蘿卜素中最強,猝滅單線態(tài)氧能力是VE的100
倍,是β-胡蘿卜素的2倍多,清除自由基的能力也優(yōu)于其他類胡蘿卜素。其具有極強的抗 氧化作用,可抑制癌細(xì)胞生長,減緩低密度脂蛋白(LDL)的氧化,防治動脈硬化,保護心血 管,清除香煙和汽車廢氣中的有毒物質(zhì)等。番茄紅素的生產(chǎn)方法主要有天然提取、化學(xué)合成、微生物發(fā)酵等,而微生物發(fā)酵 法生產(chǎn)番茄紅素具有成本低、污染小、安全及工藝簡單等優(yōu)勢,近年來成為研究熱點之一。 目前,不少研究人員開始研究利用微生物生產(chǎn)番茄紅素,其中研究最多的是利用三孢布拉 霉(Blakeslea trispora)真菌發(fā)酵獲得番茄紅素的方法(CN 1353765A ;CN 1370241A ;US 2005/0106657A1 ;US 3369974 ;GB 1008469)。目前報道的提取方法絕大多數(shù)為有機溶劑提 取,溶劑消耗大,提取過程中番茄紅素受到光照、空氣等影響極易氧化,番茄紅素?fù)p失較大。 專利CN1760282A報道超臨界CO2萃取番茄紅素,提取率高,無溶劑殘留,提取時間短,但因 設(shè)備昂貴,成本高而無法實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足,而提供一種適合于工業(yè)化生產(chǎn)番茄紅 素,并且生產(chǎn)成本低、操作方便安全、提取率高的利用三孢布拉霉菌工業(yè)化生產(chǎn)番茄紅素的 方法。本發(fā)明的目的可以通過下列技術(shù)措施來達到一種利用混合溶劑連續(xù)提取番茄紅素的方法,其特征在于包含以下步驟a.三孢布拉霉菌發(fā)酵菌絲體加入乙醇進行脫水處理,過濾分離菌絲體與乙醇處理 液;對濕菌絲體通過真空干燥和粉碎,得到干燥菌絲體;b.經(jīng)步驟a處理的菌絲體,加入混合溶劑進行固相_液相萃取在連續(xù)提取系統(tǒng) 的各提取單元中加入經(jīng)步驟a處理的菌絲體,采用混合提取溶劑連續(xù)循環(huán)提取一定時間使 各單元按濃度梯度排列,再階段逆流提取至番茄紅素提取干凈,收集萃取液;c.步驟(b)中萃取液經(jīng)真空濃縮,得到番茄紅素濃縮液。所述的方法,其中步驟a中乙醇濃度在50% -100%之間,乙醇與三孢布拉霉菌發(fā) 酵菌絲體的體積質(zhì)量比(L/Kg)在1 1-10 1,常溫下處理5-180分鐘。 所述的方法,其中乙醇處理液經(jīng)低壓蒸餾處理可循環(huán)使用。 所述的方法,其中步驟a中真空干燥溫度在30°C -80°C,真空干燥時間在1_24小
時,優(yōu)選4-12小時。
所述的方法,其中步驟b中固相-液相萃取階段所用的混合提取溶劑以正己烷 為主要溶劑,以丙酮、乙酸乙酯或石油醚為輔助溶劑,主要溶劑與輔助溶劑的體積比為 1 1-10 1,優(yōu)選正己烷/丙酮混合溶劑,正己烷與丙酮的體積比為1 1-5 1,優(yōu)選 2:1-5:1。所述的方法,其中步驟b中連續(xù)提取系統(tǒng)由6-16根層析柱、儲液罐、循環(huán)泵、閥門 和管道組成;每一提取單元由2-5根層析柱串聯(lián)而成,包括配套儲液罐、循環(huán)泵、閥門和管 道;連續(xù)提取系統(tǒng)能避光操作。所述的方法,其中步驟b中每個單元按濃度梯度排列按以下操作實現(xiàn)單元1-5分 別加入等量經(jīng)步驟a處理的菌絲體,單元5加入新鮮混合提取溶劑提取t ( 一次階段提取時 間)后排出提取液,單元2-4分別進行t1/4、t2/4、t3/4(即為1/4、2/4、3/4階段提取時間)的 提取,將單元2和4的溶劑互換,最后在單元5加入新鮮混合提取溶劑,使各個單元按照圖 2過程一開始提取時所示的濃度梯度排列,即制造好濃度梯度。所述的方法,其中連續(xù)提取系統(tǒng)每一過程均提取t1/4后對番茄紅素被提凈的單元 5進行排渣裝料,對不飽和溶劑按番茄紅素濃度遞減的反方向遷移至隔一單元;經(jīng)過六個 操作過程,所有單元又回到起始濃度狀態(tài),實現(xiàn)連續(xù)操作,如圖2所示。所述的方法,其中連續(xù)提取的方式為逆流提?。惶崛囟仍谟?0-60°C,優(yōu) 選30-50°C ;提取溶劑用量在于5-40mL/g菌絲體,優(yōu)選5_20mL/g菌絲體;回流速度為 0. 6-3. 6BV/h (BV為床體積),優(yōu)選0. 6-1. 8BV/h ;回流次數(shù)在于3_6次,優(yōu)選2_3次;提取時 間為2-8h,優(yōu)選于2-4h ;提取單元組數(shù)為3-6組,優(yōu)選5-6組。所述的方法,其中各提取單元中加入等量經(jīng)步驟a處理的菌絲體。進一步,具體操作過程如下(1)三孢布拉霉菌發(fā)酵液經(jīng)過濾處理后,得到濕菌絲體。(2)將步驟(1)中的濕菌絲體進行預(yù)處理,其預(yù)處理條件優(yōu)選為a).濕菌絲體與乙醇在常溫下攪拌,過濾得到脫水菌絲體和乙醇處理液,濕菌絲體 與乙醇質(zhì)量體積比為1 1-1 10之間,優(yōu)選于1 1-1 5之間;b).乙醇處理液經(jīng)低壓蒸餾處理可循環(huán)使用;脫水濕菌絲體通過真空干燥和粉 碎,得到干燥菌絲體。(3)經(jīng)步驟(2)的干燥菌絲體,加入混合溶劑進行固相_液相萃取,在連續(xù)提取系 統(tǒng)的各提取單元中加入等量經(jīng)步驟(2)處理的菌絲體,采用混合提取溶劑連續(xù)循環(huán)提取一 定時間使各單元按濃度梯度排列,再階段逆流提取至番茄紅素提取干凈,收集萃取液。其提 取條件優(yōu)選于a).各單元濃度梯度排列按以下操作實現(xiàn)單元5加入新鮮混合提取溶劑提取 t ( 一次階段提取時間)后排出提取液,單元2-4分別進行t1/4、t2/4、t3/4階段提取時間的提 取,將單元2和4的溶劑互換,最后在單元5加入新鮮混合提取溶劑,使各個單元按照圖2 過程一開始提取時所示的濃度梯度排列,即制造好濃度梯度;b).連續(xù)提取過程按以下操作實現(xiàn)每一過程均提取t1/4后對番茄紅素被提凈的 單元5進行排渣裝料,對不飽和溶劑按番茄紅素濃度遞減的反方向遷移至隔一單元;經(jīng)過 六個操作過程,所有單元又回到起始濃度狀態(tài),實現(xiàn)連續(xù)操作,如圖2所示;c).混合提取溶劑以正己烷為主要溶劑,丙酮為輔助溶劑,其體積比為1 1-10 1之間,優(yōu)選于2 1-5 1之間;d).連續(xù)提取的方式為逆流提??;e).提取溫度在于20_60°C之間,優(yōu)選于30_50°C之間;f).提取溶劑用量在于5_40mL/g菌絲體之間,優(yōu)選于5_20mL/g菌絲體之間;g) ·回流速度為0. 6-3. 6BV/h的流速之間,優(yōu)選于0. 6-1. 8BV/h之間;h).回流次數(shù)在于2-6次之間,優(yōu)選于2-3次之間;i).提取單元組數(shù)為3-6組,優(yōu)選于5-6組之間;j).提取時間為2_8h,優(yōu)選于2_4h之間。(4)將步驟(3)中萃取液經(jīng)真空濃縮,得到番茄紅素濃縮液。連續(xù)提取系統(tǒng)主要包括層析柱、儲液罐、循環(huán)泵、控制閥、管道。連續(xù)提取系統(tǒng)中的層析柱是指可裝填菌絲體進行萃取的柱狀容器。本發(fā)明的優(yōu)點在于1、本發(fā)明采用混合溶劑提取番茄紅素,充分發(fā)揮各溶劑對番茄紅素的溶解作用。2、本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)勢在于操作的連續(xù)性,且可避光操作,減少了間歇操作對番茄 紅素不穩(wěn)定的影響。3、本發(fā)明與傳統(tǒng)溶劑提取法比,溶劑消耗少,處理量大,提取時間短,能耗低,成本 相對較低,易工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1為實施例中的連續(xù)提取系統(tǒng)裝置簡圖,該系統(tǒng)由5個提取單元組成,每個提取 單元包括層析柱、儲液罐、循環(huán)泵、控制閥、管道。圖中1管道,2層析柱,3儲液罐,4控制 閥,5循環(huán)泵,6總管道(連接各單元)。圖2為連續(xù)提取工藝流程示意圖。
具體實施例方式以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的闡述。本發(fā)明所述的三孢布拉霉菌發(fā)酵菌絲體是采用下列方法制備得到的本發(fā)明采用三孢布拉霉菌(Blaleslea trispora) (+)(-)為發(fā)酵菌種,經(jīng)搖瓶一級 種子培養(yǎng)、二級種子發(fā)酵培養(yǎng)和發(fā)酵罐三級發(fā)酵培養(yǎng)得到三孢布拉霉菌發(fā)酵液;發(fā)酵完成 后采用板框壓濾法去除發(fā)酵液中過多的水分,濕菌絲體經(jīng)95%乙醇攪拌處理2h,再經(jīng)板框 壓濾干燥得預(yù)處理菌絲體,酒精處理液經(jīng)精餾塔回收利用。本發(fā)明采用的提取過程結(jié)合圖1和圖2,提取“過程一”至“過程五”各提取單元溶劑遷移路線、進料和排 渣、加入新鮮溶劑和提取液導(dǎo)出等操作規(guī)律(系經(jīng)過多個過程后建立的),“過程六”及以后 的四個提取過程為“過程一”至“過程五”的重復(fù)。具體操作包括a.造梯度先分別將單元1和5裝入預(yù)處理后菌絲體,單元5加入新鮮混合提取 溶劑提取一次階段提取時間t后排出提取液,單元2-4分別進行t1/4、t2/4、t3/4階段提取時 間的提取,將單元2和4的溶劑互換,最后在單元5加入新鮮混合提取溶劑,使各個單元按照圖2過程一開始提取時所示的濃度梯度排列,即制造好圖2所示濃度梯度;b.排渣裝料每一過程均再提取t1/4后對番茄紅素被提凈的單元5進行排渣,裝 料;c.飽和溶劑遷移將單元1的飽和溶劑轉(zhuǎn)移入儲液罐中,本過程只涉及溶劑已飽 和的單元(即被提凈單元5的下一單元);d.不飽和溶劑遷移①3— 1;②5 — 3;③2 — 5;④4 — 2,本過程涉及4個單 元,其遷移遵循規(guī)律即按番茄紅素濃度遞減的反方向遷移至隔一單元;e.填充溶劑對單元4填入新鮮混合提取溶劑;f.經(jīng)過六個操作過程,所有單元又回到起始濃度狀態(tài),實現(xiàn)連續(xù)操作。實施例1將三孢布拉霉菌(Blaleslea trispora)原菌株單菌落自斜面接種到500mL搖瓶 中進行搖瓶種子培養(yǎng),裝液量10%,培養(yǎng)溫度30°C,轉(zhuǎn)速200r/min,培養(yǎng)30h。將一級搖瓶 種子液接種至2. 5L搖瓶中進行二級種子培養(yǎng),培養(yǎng)溫度維持在30°C,轉(zhuǎn)速200r/min,培養(yǎng) 30h。種子培養(yǎng)完畢將其接種到50L發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng),裝料系數(shù)60 %,裝料量30L,培 養(yǎng)溫度維持在30°C,轉(zhuǎn)速200r/min,通氣量0. 2-0. 5L/min,培養(yǎng)120h。發(fā)酵完成后得28L發(fā)酵液,采用離心法去除發(fā)酵液中過多的水分,得到3kg濕菌 絲體,然后加入3L 95%乙醇混合攪拌2h,再經(jīng)板框壓濾得到0. 8kg菌絲體,濕菌絲體通過 真空干燥(真空干燥溫度在30°C -80°C之間,真空干燥時間優(yōu)選4-12小時)和粉碎,得到 預(yù)處理后的干燥菌絲體,乙醇處理液經(jīng)低壓蒸餾處理可循環(huán)使用;預(yù)處理菌絲體用正己烷 /丙酮混合溶劑(體積比為1 1-10 1,優(yōu)選3 1)采用連續(xù)提取系統(tǒng)進行逆流提取 (提取過程如前所述),提取條件為提取溫度30°C,提取溶劑用量10mL/g菌絲體,回流速 度1. 2BV/h,回流2-3次,提取時間2-4h,提取單元組數(shù)5組;提取液經(jīng)真空濃縮得到番茄紅 素濃縮液。實施例2取實施例1所述經(jīng)預(yù)處理的菌絲體10g,置500mL圓底燒瓶中,加入400mL正己 烷/丙酮混合提取溶劑,40°C攪拌提取lh,提取三次,該操作條件下番茄紅素的提取率達 81. 42%o取實施例1所述經(jīng)預(yù)處理的菌絲體50g裝入層析柱中,加500mL正己烷/丙酮混 合溶劑,30°C下以1. 2BV/h的流速逆流循環(huán)提取1. 5h,回流三次,該操作條件下番茄紅素的 提取率達88%。實施例3取實施例1所述經(jīng)預(yù)處理的菌絲體250g,等量加入如圖1所示的具有5個提取單 元的連續(xù)提取系統(tǒng)的各層析柱中,單元5加入新鮮溶劑一次階段提取1. 5h后排出提取液, 單元2-4分別進行22. 5min、45min、67. 5min的一次階段提取,將單元2和4的溶劑互換,最 后在單元5加入新鮮溶劑,使各個單元按照圖2所示的濃度梯度排列;繼續(xù)提取22. 5min后 對已被提凈的單元5進行排渣裝料,將單元1的飽和溶劑轉(zhuǎn)移至儲液罐中;對不飽和溶劑按 番茄紅素濃度遞減的反方向遷移至隔一單元;遷移完后對單元4填入新鮮溶劑。各單元提 取條件為溫度30°C,提取單元組5組,每組10mL/g菌絲體的溶劑,以1. 2BV/h的流速逆流 循環(huán)提取1. 5h。其他同實施例1,該操作條件下番茄紅素的提取率可達94. 76%。
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各種工藝的提取結(jié)果見表1 表1提取工藝比較
攪拌提取 81.423 120 40
單柱提取 884.5 60 30
連續(xù)逆流提取 94.761.875 20 30 連續(xù)動態(tài)逆流提取的番茄紅素提取率最高,分別比攪拌法和單柱法高了 13. 34% 和6. 76%,提取時間比單柱法縮短了三分之一,溶劑用量僅為攪拌法的1/6,提取溫度近乎 常溫,顯示出了連續(xù)逆流提取的優(yōu)越性。
權(quán)利要求
1.一種利用混合溶劑連續(xù)提取番茄紅素的方法,其特征在于包含以下步驟a.三孢布拉霉菌發(fā)酵菌絲體加入乙醇進行脫水處理,過濾分離菌絲體與乙醇處理液; 對濕菌絲體通過真空干燥和粉碎,得到干燥菌絲體;b.經(jīng)步驟a處理的菌絲體,加入混合溶劑進行固相-液相萃取在連續(xù)提取系統(tǒng)的各 提取單元中加入經(jīng)步驟a處理的菌絲體,采用混合提取溶劑連續(xù)循環(huán)提取一定時間使各單 元按濃度梯度排列,再階段逆流提取至番茄紅素提取干凈,收集萃取液;c.步驟(b)中萃取液經(jīng)真空濃縮,得到番茄紅素濃縮液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于步驟a中乙醇濃度在50%-100%之間,乙 醇與三孢布拉霉菌發(fā)酵菌絲體的體積質(zhì)量比在1 1-10 1,常溫下處理5-180分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法,其特征在于乙醇處理液經(jīng)低壓蒸餾處理可循環(huán)使用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于步驟a中真空干燥溫度在30°C-80°C,真空 干燥時間在1-24小時,優(yōu)選4-12小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于步驟b中固相-液相萃取階段所用的混 合提取溶劑以正己烷為主要溶劑,以丙酮、乙酸乙酯或石油醚為輔助溶劑,主要溶劑與輔 助溶劑的體積比為1 1-10 1,優(yōu)選正己烷/丙酮混合溶劑,正己烷與丙酮的體積比為 1:1-5: 1,優(yōu)選 2 1-5 1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于步驟b中連續(xù)提取系統(tǒng)由6-16根層析柱、 儲液罐、循環(huán)泵、閥門和管道組成;每一提取單元由2-5根層析柱串聯(lián)而成,包括配套儲液 罐、循環(huán)泵、閥門和管道;連續(xù)提取系統(tǒng)能避光操作。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于步驟b中每個單元按濃度梯度排列按以下 操作實現(xiàn)單元1-5分別加入等量經(jīng)步驟a處理的菌絲體,單元5加入新鮮混合提取溶劑提 取t(一次階段提取時間)后排出提取液,單元2-4分別進行t1/4、t2/4、t3/4(即為1/4、2/4、 3/4階段提取時間)的提取,將單元2和4的溶劑互換,最后在單元5加入新鮮混合提取溶 劑,使各個單元按照圖2過程一開始提取時所示的濃度梯度排列,即制造好濃度梯度。
8.根據(jù)權(quán)利7所述的方法,其特征在于連續(xù)提取系統(tǒng)每一過程均提取t1/4后對番茄紅 素被提凈的單元5進行排渣裝料,對不飽和溶劑按番茄紅素濃度遞減的反方向遷移至隔一 單元;經(jīng)過六個操作過程,所有單元又回到起始濃度狀態(tài),實現(xiàn)連續(xù)操作,如圖2所示。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于連續(xù)提取的方式為逆流提??;提取溫度在 于20-60°C,優(yōu)選30-50°C ;提取溶劑用量在于5_40mL/g菌絲體,優(yōu)選5_20mL/g菌絲體;回 流速度為0. 6-3. 6BV/h (BV為床體積),優(yōu)選0. 6-1. 8BV/h ;回流次數(shù)在于3-6次,優(yōu)選2-3 次;提取時間為2-他,優(yōu)選于2-4h ;提取單元組數(shù)為3-6組,優(yōu)選5-6組。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于各提取單元中加入等量經(jīng)步驟a處理的菌 絲體。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物分離領(lǐng)域,公開了一種連續(xù)提取番茄紅素的方法。該方法將三孢布拉霉菌發(fā)酵菌絲體加入乙醇進行脫水處理,過濾分離菌絲體與乙醇處理液;對濕菌絲體通過真空干燥和粉碎,得到干燥菌絲體;將所得干燥菌絲體加入混合溶劑進行固相-液相萃取在連續(xù)提取系統(tǒng)的各提取單元中加入菌絲體,采用混合提取溶劑連續(xù)循環(huán)提取一定時間使各單元按濃度梯度排列,再階段逆流提取至番茄紅素提取干凈,收集萃取液;萃取液經(jīng)真空濃縮,得到番茄紅素濃縮液。該方法采用混合溶劑提取番茄紅素,充分發(fā)揮各溶劑對番茄紅素的溶解作用,操作具有連續(xù)性且可避光操作,溶劑消耗少,處理量大,提取時間短,能耗低,成本相對較低,易工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C07C7/10GK102140052SQ20101061557
公開日2011年8月3日 申請日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者萬紅貴, 盧定強, 吳啟賜 申請人:南京工業(yè)大學(xué)
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