專利名稱：番茄潰瘍病菌單克隆抗體制備方法及其試劑盒和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高特異性、高靈敏性檢測(cè)引發(fā)番茄潰瘍病的密執(zhí)安棒桿菌的單克隆抗體，屬于植物檢疫和植物保護(hù)領(lǐng)域，專一針對(duì)番茄潰瘍病菌(Clavikicter michiganensis subsp. michiganensis, Cmm)的檢測(cè)。該抗體適用于番茄潰瘍病的田間預(yù)防和植物檢疫及植物保護(hù)中番茄潰瘍病菌的快速檢測(cè)。
背景技術(shù)：
番茄潰瘍病(Bacterial canker of toma to)是番茄生產(chǎn)中最為嚴(yán)重、具有毀滅性的病害之一，病原菌為密執(zhí)安棒形桿菌密執(zhí)安亞種(Clavikicter michiganensis subsp. michiganensis, Cmm)。該病自從1909年首次在美國(guó)密執(zhí)安州的溫室番茄上發(fā)現(xiàn)以來(lái)，現(xiàn)已廣泛分布于美國(guó)各番茄產(chǎn)區(qū)，并逐漸成為世界性病害。自1989年以來(lái)，我國(guó)相繼在北京、黑龍江、吉林等10多個(gè)省區(qū)報(bào)道發(fā)生此病，使許多地區(qū)番茄生產(chǎn)受到了不同程度的影響。因此，我國(guó)將該病原菌列入全國(guó)農(nóng)業(yè)和進(jìn)境植物檢疫性有害生物名單中。番茄潰瘍病主要危害植株維管束，苗期至成株期均可染病。苗期染病，發(fā)病初始產(chǎn)生于下部葉緣，并逐漸由下部葉片向上部葉片引起萎蔫，甚至在胚軸或葉柄產(chǎn)生潰瘍狀稍凹陷小條斑，造成病苗矮化或枯死。成株期染病，發(fā)病初始下部近地面葉片萎蔫下垂或卷縮，似缺水狀，上部葉片仍正常生長(zhǎng)，此時(shí)內(nèi)部病菌在維管束內(nèi)擴(kuò)散迅速，擴(kuò)展后在病株莖桿上產(chǎn)生狹長(zhǎng)稍凹陷的開(kāi)裂狀條斑，使病部增粗，產(chǎn)生氣生根，并向病莖部上下擴(kuò)散。發(fā)病后期病株莖桿出現(xiàn)狹長(zhǎng)的褐色條斑，上下擴(kuò)展，莖桿增粗，呈現(xiàn)出黃綠相間凹陷斑。濕度大時(shí)，可見(jiàn)菌膿從病莖或葉柄中溢出，呈白色污狀物，后期莖內(nèi)變褐并中空，沿凹陷處枯黃開(kāi)裂。主莖上常產(chǎn)生大量氣生根。幼苗被害，皺縮滯育、畸形，受害果實(shí)出現(xiàn)白色圓形小點(diǎn)，后變黃褐色，病斑中央粗糙突起，四周有白色暈圈，呈“烏眼狀”。莖桿潰瘍和果實(shí)的斑點(diǎn)往往不在同一植株上出現(xiàn)?！盀跹郯摺笔遣」囊环N特異癥狀，由在侵染引起，不一定與莖部系統(tǒng)浸染同發(fā)一株。建立番茄潰瘍病菌快速、有效的檢測(cè)方法，對(duì)密執(zhí)安棒桿菌的防治非常重要?，F(xiàn)行的檢測(cè)方法主要包括傳統(tǒng)的鑒別培養(yǎng)方法和免疫學(xué)、分子生物學(xué)等發(fā)展較快的現(xiàn)代方法。免疫學(xué)方法經(jīng)過(guò)近幾年不斷的研究改進(jìn)可針對(duì)現(xiàn)場(chǎng)大量樣品快速篩查，具有簡(jiǎn)單、快速、高靈敏度、高特異性、可同時(shí)篩查大量樣品的優(yōu)點(diǎn)。用于樣品中密執(zhí)安棒桿菌的單克隆抗體在特異性和靈敏度等方面仍需要進(jìn)一步的完善，因此選擇適宜抗原制備高特異性、高靈敏度的單克隆抗體是非常必要的。本發(fā)明以密執(zhí)安棒桿菌全菌為抗原免疫BALB C小鼠制備了該菌特異性單克隆抗體，并進(jìn)行了鑒定，為番茄潰瘍病菌的進(jìn)一步檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于避免現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種番茄潰瘍病菌單克隆抗體的制備方法。發(fā)明的又一目的提供一種番茄潰瘍病菌單克隆抗體的試劑盒和番茄潰瘍病菌單克隆抗體的試劑盒的使用方法。本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)在于運(yùn)用單克隆抗體的原理和技術(shù)并加以改進(jìn)，制備出番茄潰瘍病菌的特異性抗體，運(yùn)用到植物病原的檢測(cè)上來(lái)，將B淋巴細(xì)胞分泌抗體的能力和腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖的能力相結(jié)合，用番茄潰瘍病的致病菌密執(zhí)安棒桿菌免疫 BALB/C小鼠，以獲得可以分泌產(chǎn)生這種細(xì)菌抗體的特異性的B淋巴細(xì)胞，將此B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合，通過(guò)雜交瘤細(xì)胞的篩選，克隆化培養(yǎng)、單克隆抗體的制備與鑒定等一系列的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，制備出番茄潰瘍病菌的單克隆抗體。建立了一種將免疫學(xué)和分子生物學(xué)有機(jī)結(jié)合起來(lái)的檢測(cè)方法，檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度也大幅度提高，以克服傳統(tǒng)現(xiàn)有植物病原菌檢測(cè)方法靈敏性低、特異性差、檢測(cè)措施不得力的缺陷。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為一種番茄潰瘍病菌單克隆抗體的制備方法，其主要特點(diǎn)是用密執(zhí)安棒桿菌免疫BALB/C小鼠，以獲得分泌產(chǎn)生該種細(xì)菌抗體的特異性的B淋巴細(xì)胞，將此B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合，依次通過(guò)HAT、HT培養(yǎng)基篩選出針對(duì)番茄潰瘍病菌陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞， 用有限稀釋克隆的方法進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，通過(guò)雜交瘤細(xì)胞體內(nèi)誘導(dǎo)腹水產(chǎn)生和體外培養(yǎng)， 制備大量單克隆抗體；進(jìn)一步分離和純化單克隆抗體，得到單克隆抗體。所述的番茄潰瘍病菌單克隆抗體的試劑盒，包括有①包被緩沖液稀釋抗番茄潰瘍病菌的單抗100-150uL ；② 待測(cè)樣品包被酶標(biāo)板lOOul，以雙蒸水為陰性對(duì)照；以CMM菌液IOOul為陽(yáng)性對(duì)照；③洗板， PBST洗滌4次，每次aiiin ；④酶標(biāo)抗體HRP羊抗鼠IgG，每孔IOOul ；⑤洗板，PBST洗滌4次， 每次aiiin;⑥加TMB為3'，3'，5'，5'，-四甲基聯(lián)苯胺顯色液，每孔IOOul。所述的番茄潰瘍病菌單克隆抗體的試劑盒的使用方法，用包被緩沖液將抗番茄潰瘍病菌的單抗作為一抗，稀釋至l-10ug/mL，在酶標(biāo)板反應(yīng)孔中加0. ImL ；然后加濃度為103_8cfu/mL稀釋的待檢樣品0. ImL,同時(shí)做空白對(duì)照，以雙蒸水為陰性對(duì)照；以CMM菌液IOOul為陽(yáng)性對(duì)照；再加酶標(biāo)抗體HRP羊抗鼠IgG ；再加底物液顯色；最后終止反應(yīng)于各反應(yīng)孔中加入終止液0. ImL ； 測(cè)0D450/630值，并計(jì)算P/N值，N為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照孔的OD值，P為競(jìng)爭(zhēng)抑制物的OD值；重復(fù)3次，以測(cè)定值大于2. 1者判定為陽(yáng)性。酶標(biāo)板分別用CMM(密執(zhí)安幫桿菌)標(biāo)準(zhǔn)菌株和 CMT(小麥花葉病菌)、CMS(馬鈴薯環(huán)腐病菌)、CMI (苜蓿細(xì)菌性萎蔫病菌)、CMN(玉米高氏細(xì)菌萎蔫病菌)菌株倍比稀釋包被酶標(biāo)板。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明用番茄潰瘍病菌多次皮下免疫BALB/C小鼠，以獲得可以分泌產(chǎn)生這種細(xì)菌抗體的特異性的B淋巴細(xì)胞，將此B 淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合，通過(guò)HAT、HT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞，篩選得到大量針對(duì)不同抗原或不同抗原表位的抗體，用有限稀釋克隆的方法進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，通過(guò)體內(nèi)雜交瘤細(xì)胞誘導(dǎo)腹水的產(chǎn)生和體外凍存的方法大量制備單克隆抗體，同時(shí)由于單克隆抗體的均質(zhì)性及易于大量生產(chǎn)，進(jìn)而解決了抗體全部依賴進(jìn)口，檢測(cè)成本高等問(wèn)題，使免疫學(xué)檢測(cè)在番茄潰瘍病檢測(cè)中的運(yùn)用得到普及，為番茄潰瘍病菌敏感、穩(wěn)定和快捷的檢測(cè)提供必要的保證。


圖1單克隆抗體制備原理圖；圖2單克隆抗體制備流程圖；圖3純化菌液直接 PCR結(jié)果；圖4細(xì)胞融合后亞克隆過(guò)程中雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)情況；圖5體內(nèi)誘生腹水法制備單克隆抗體；圖6單抗純度鑒定；圖7圖6單克隆抗體特異性鑒定。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1 一種番茄潰瘍病菌單克隆抗體的制備方法，其特征是番茄潰瘍病病原菌為密執(zhí)安棒形桿菌密執(zhí)安亞禾中(Clavibactermi chiganensissubsp. michiganensis，Cmm)， 用密執(zhí)安棒桿菌免疫BALB/C小鼠，以獲得可以分泌產(chǎn)生該種細(xì)菌抗體的特異性的B淋巴細(xì)胞，將此B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合，依次通過(guò)HAT、HT培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細(xì)胞，用有限稀釋克隆的方法進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，通過(guò)雜交瘤細(xì)胞誘導(dǎo)腹水產(chǎn)生和體外培養(yǎng)，制備大量單克隆抗體。最后，進(jìn)一步分離和純化單克隆抗體，鑒定單克隆抗體亞類，測(cè)定抗體親和力，效價(jià)等。(見(jiàn)圖1 2)制備特異性識(shí)別番茄潰瘍病菌的單克隆抗體，步驟如下1抗原制備 取Cmm菌株于523液體培養(yǎng)基(包括蔗糖10g、聚蛋白胨Sg、酵母粉4g、瓊脂18g、磷酸氫二鉀2g、結(jié)晶硫酸鎂0. 3g)中25 (最適溫度^°C)，振蕩培養(yǎng)18h，用接種環(huán)挑取密執(zhí)安棒桿菌液在523固體培養(yǎng)基上劃線，28°C靜置培養(yǎng)48h ；用接種針將培養(yǎng)后長(zhǎng)出的單個(gè)菌落挑取少許接種于523液體培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩器上振蕩培養(yǎng)15 18h，此時(shí)菌液0D600nm值為0.25(細(xì)菌約為108cfu/mL)收集菌體，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。用PCR對(duì)該菌進(jìn)行鑒定，將該菌液分裝于IOmL離心管中離心，6000rpm、20min，棄去上清，加入適量生理鹽水， 混勻后再離心。同上操作三次后用生理鹽水將所得沉淀垂懸，調(diào)節(jié)濃度至2X109cfu/ml，無(wú)菌檢驗(yàn)合格后做免疫抗原。(見(jiàn)圖3)2.動(dòng)物免疫(1)取純化菌液與等量福氏完全佐劑混合乳化至滴入水中呈不分散狀時(shí)，以皮下四點(diǎn)免疫方法分別免疫4只6 8周的BALB/C小鼠， 免疫劑量0.5mL/只(全菌3 X IO8Cfu/只)。首免21d后加強(qiáng)免疫，間隔14d追加免疫，直至間接ELISA檢測(cè)血清抗體效價(jià)達(dá)1 10000以上。首免用福氏完全佐劑乳化，以后用福氏不完全佐劑。融合前3d再?zèng)_擊免疫1次。(2)實(shí)驗(yàn)所需溶液ELISA檢測(cè)用溶液(1)包被液稱取 NaHCO3 2. 93g, Na2CO3 1. 59g，加蒸餾水至 lOOOmL，調(diào)節(jié) PH 值 9. 6，4°C保存。(2) PBS 緩沖液稱取 NaC18. Og, 4ΗΡ04 · 12H20。2. 9g，KCl 0. 2g，KH2PO4O. 2g，加蒸餾水至 IOOOmL,調(diào)節(jié) PH7. 4。(3)洗滌液1000mL PBS 緩沖液，加 0. 5mL Tween-20。(4)底物緩沖溶液(TMB3， 3，5，5，_四甲基聯(lián)苯)購(gòu)置北京天耕。( 終止液蒸餾水與濃硫酸按照1778 222比例混合，制得2M H2SO4溶液。單克隆抗體制備用溶液(1)雙抗溶液100mL雙餾水中加入青霉素80萬(wàn)U、鏈霉素100萬(wàn)U，0. 22 μ m濾膜過(guò)濾除菌。⑵不完全培養(yǎng)液PRMI_1640培養(yǎng)液(購(gòu)于美國(guó)Sigma公司)1袋按照使用說(shuō)明書(shū)稱取相應(yīng)的藥品加超純水定容，0. 22 μ m濾膜過(guò)濾除菌。( 完全培養(yǎng)液不完全培養(yǎng)液和標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清按照1 4的比例進(jìn)行混合。 (4)HAT培養(yǎng)液(購(gòu)于美國(guó)Sigma公司)完全培養(yǎng)液與HAT(購(gòu)于美國(guó)Sigma公司)按照 49 1比例混合。(5)HT培養(yǎng)液(購(gòu)于美國(guó)Sigma公司)完全培養(yǎng)液與HT按照49 1比例混合。 3.細(xì)胞融合將已制備好的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞及脾細(xì)胞以1 5混合，1000r/min 離心5min，棄上清，用手指輕彈離心管，振散細(xì)胞團(tuán)塊。將離心管傾斜，緩慢加入37°C預(yù)熱的PEG1500 (在30s內(nèi)勻速加完0. 6mL, 1. 5min滴完，再作用90s，并輕輕吹打幾次)，再緩慢滴入1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基10mL，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)離心管將細(xì)胞懸起，1000r/min離心5min，同樣的方法再洗滌2次，徹底去除PEG。最后一次離心后棄上清，加入IOml的IXHT培養(yǎng)液輕輕將細(xì)胞懸起，滴入已準(zhǔn)備好飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中，每孔100 μ L，置37°C 5%的(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4.間接ELISA檢測(cè)方法的建立與陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的克隆、篩選用倍比稀釋的方法測(cè)定免疫小鼠的多抗血清效價(jià)，在酶標(biāo)板上做方陣點(diǎn)樣，根據(jù)反應(yīng)結(jié)果確定抗原、抗體的最佳稀釋度，最適封閉液和封閉時(shí)間，包被溫度和時(shí)間。以標(biāo)準(zhǔn)菌株CMM作抗原篩選多抗血清和陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，操作步驟如下CMM菌液包被酶標(biāo)板，免疫小鼠多抗血清用保溫液 100X、200X、400X、800X、1600X ,3200X ,6400X、12800X 稀釋縱向加入，正常小鼠血清 1000X倍比稀釋作為陰性對(duì)照，二抗加1 8000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠。待底物顯色適中，每孔滴加100 μ L終止液，酶聯(lián)檢測(cè)儀測(cè)定雙波長(zhǎng)0D450630值。用建立的ELISA方法測(cè)定雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)，選擇效價(jià)高的細(xì)胞進(jìn)行亞克隆。4次亞克隆后陽(yáng)性率為100% 的細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，然后細(xì)胞凍存。(見(jiàn)圖4)有限稀釋克隆方法(1)制備飼養(yǎng)層細(xì)胞取正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，接種96孔板，每孔0. Iml，含個(gè)細(xì)胞2 X IO4個(gè)細(xì)胞。 (2)吹打雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)板中孔內(nèi)的克隆，懸浮于完全培養(yǎng)液中。(3)取樣，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至100、50、10個(gè)/ml. (4)分別用三種濃度的雜交瘤細(xì)胞濃度接種于含飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)板中，每孔0. lml，理論上每孔含10、5、1個(gè)細(xì)胞。(5)置37°C 5%的0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)5-7天取細(xì)胞上清進(jìn)行抗體檢測(cè)。(6)對(duì)陽(yáng)性單克隆再克隆化培養(yǎng)，直到100%的克隆分泌特異性抗體為止。5.單克隆抗體的大量制備選8 10周體重20g以上雌性BALB/C小鼠，采用動(dòng)物體內(nèi)誘生單克隆抗體的方法制備。將0. 5mL的石蠟油注射到小鼠腹腔1周后，將細(xì)胞注入經(jīng)石蠟油處理過(guò)的小鼠腹腔，IO5Cfu/只。7 IOd后，當(dāng)小鼠腹部極度膨脹時(shí)用無(wú)菌18號(hào)針頭抽取腹水。將收集好的腹水置37°C 2h，隨后置4°C過(guò)夜， 第2d將腹水lOOOr/min離心lOmin，20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?見(jiàn)圖5)6.單克隆抗體鑒定6. 1 單克隆抗體效價(jià)測(cè)定將單克隆抗體倍比稀釋，用建立的ELISA方法測(cè)定純化后腹水中的抗體效價(jià)，以待測(cè)孔的OD值大于或等于陰性對(duì)照孔的2. 1倍者判為陽(yáng)性，以判為陽(yáng)性的最高稀釋倍數(shù)為效價(jià)判定終點(diǎn)效價(jià)。試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值。6. 2單克隆抗體的亞類鑒定及純化按亞類測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定單抗亞型。IgG采用辛酸=飽和硫酸銨法進(jìn)行純化，純化的腹水IgG進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳測(cè)定抗體分子量，具體操作參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，參考抗體的含量測(cè)定采用雙波長(zhǎng)紫外分光光度法。(見(jiàn)圖6)6. 3單克隆抗體的親和力測(cè)定采用間接ELISA法。CMM菌液包被酶標(biāo)板，用純化的單克隆抗體倍比稀釋進(jìn)行間接 ELISA檢測(cè)，繪制反應(yīng)曲線。以曲線上趨于平坦段的最大0D490值一半時(shí)的抗體濃度計(jì)算單克隆抗體的親和常數(shù)，確定抗體與抗原的結(jié)合能力。6. 4雜交瘤細(xì)胞染色體的計(jì)數(shù)采用秋水仙素阻斷法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞染色體的平均數(shù)目。6. 5、單克隆抗體特異性檢測(cè)酶標(biāo)板分別用CMM標(biāo)準(zhǔn)菌株和CMT、CMS、CMI, CMN等菌株倍比稀釋包被酶標(biāo)板，然后按間接ELISA操作程序加單克隆抗體及HRP-羊抗鼠IgG，測(cè)定0D450/630值，并計(jì)算P/N值(N為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照孔的OD值，P為競(jìng)爭(zhēng)抑制物的OD值)。重復(fù)3次，以測(cè)定值大于2. 1者判定為陽(yáng)性。實(shí)施例2 番茄潰瘍病菌單克隆抗體的試劑盒，其主要特點(diǎn)是包括有①包被緩沖液稀釋抗番茄潰瘍病菌的單抗100-150uL ；②待測(cè)樣品包被酶標(biāo)板lOOul，以雙蒸水為陰性對(duì)照；以CMM 菌液IOOul為陽(yáng)性對(duì)照；③洗板，PBST洗滌4次，每次aiiin ；④酶標(biāo)抗體HRP羊抗鼠IgG， 每孔IOOul ；⑤洗板，PBST洗滌4次，每次aiiin ；⑥加TMB (3，3，5，5，-四甲基聯(lián)苯)顯色液，每孔lOOul。實(shí)施例3 番茄潰瘍病菌單克隆抗體的試劑盒的使用方法，用包被緩沖液將抗番茄潰瘍病菌的單抗作為一抗，稀釋至Ι-lOug/mL，在酶標(biāo)板反應(yīng)孔中加0. ImL ；然后加一定濃度(IO3-8CfuAiL)稀釋的待檢樣品0. ImL,同時(shí)做空白對(duì)照，陰性對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照； 再加酶標(biāo)抗體HRP羊抗鼠IgG ；再加底物液顯色；最后終止反應(yīng)于各反應(yīng)孔中加入終止液 0. ImL ；測(cè)0D450/630值，并計(jì)算P/N值，N為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照孔的OD值，P為競(jìng)爭(zhēng)抑制物的OD 值；重復(fù)3次，以測(cè)定值大于2. 1者判定為陽(yáng)性。實(shí)施例4 對(duì)番茄潰瘍病菌和非番茄潰瘍病菌菌株特異性性驗(yàn)證試驗(yàn)(見(jiàn)圖7)收集1株番茄潰瘍病菌(Clavikicter michiganensis subsp. michiganensis, Cmm)和4株非番茄潰瘍病菌菌株驗(yàn)證本試劑盒的特異性，這4株病菌分另 1J為玉米高氏細(xì)菌萎蔫病菌:Clavibacter michiganensis subsp, nebrakensis (CMN) 小麥花葉病菌 :Clavibacter michiganensissubsp，tessellarius (CMT)馬鈴暮環(huán)腐病菌 Clavibacter michiganensissubsp, sepedonicum(CMS) "猜細(xì)菌t生妻薦病菌:Clavibacter michiganensissubsp，insidisus (CMI)。將 CMM、CMN、CMS、CMT、CMI 菌液各 100 μ L(濃度為108Cfu/mL)，包被酶標(biāo)板；置于96孔酶標(biāo)板中，37°C孵育池后4°C過(guò)夜，然后棄去96孔酶標(biāo)板內(nèi)的檢測(cè)樣品，用PBST沖洗2-3次，然后用10%的BSA(小牛血清)封閉，37°C，1. 5h ； 免疫小鼠雜交瘤細(xì)胞血清用保溫液100 X、200 X、400 X、800 X、1600 X、3200 X、6400 X、 12800X稀釋縱向加入，正常小鼠血清1000X倍比稀釋作為陰性對(duì)照，37°C，lh，用PBST沖洗2-3次；二抗加1 8000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠100 μ L，37°C，lh，用PBST沖洗2-3次; 然后加TMB顯色液，100 μ L，15-30min,室溫；待底物顯色適中，每孔滴加100 μ L終止液，酶聯(lián)檢測(cè)儀測(cè)定0D630值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本抗體和其它4種菌株交叉反應(yīng)不明顯，說(shuō)明對(duì)番茄潰瘍病菌具有較高的特異性。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明， 凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種番茄潰瘍病菌單克隆抗體的制備方法，其特征是用密執(zhí)安棒桿菌免疫BALB/C 小鼠，以獲得分泌產(chǎn)生該種細(xì)菌抗體的特異性的B淋巴細(xì)胞，將此B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合，依次通過(guò)HAT、HT培養(yǎng)基篩選出針對(duì)番茄潰瘍病菌陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞，用有限稀釋克隆的方法進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，通過(guò)雜交瘤細(xì)胞體內(nèi)誘導(dǎo)腹水產(chǎn)生和體外培養(yǎng)，制備大量單克隆抗體；進(jìn)一步分離和純化單克隆抗體，得到單克隆抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的番茄潰瘍病菌單克隆抗體的試劑盒，其特征是包括有①包被緩沖液稀釋抗番茄潰瘍病菌的單抗100-150uL ；②待測(cè)樣品包被酶標(biāo)板lOOul，以雙蒸水為陰性對(duì)照；以CMM菌液IOOul為陽(yáng)性對(duì)照；③洗板，PBST洗滌4次，每次^iin ；④酶標(biāo)抗體 HRP羊抗鼠IgG，每孔IOOul ；⑤洗板，PBST洗滌4次，每次aiiin;⑥加TMB為3'，3'，5'， 5'，-四甲基聯(lián)苯胺顯色液，每孔lOOul。
3.如權(quán)利要求2所述的番茄潰瘍病菌單克隆抗體的試劑盒的使用方法，其特征是用包被緩沖液將抗番茄潰瘍病菌的單抗作為一抗，稀釋至Ι-lOug/mL，在酶標(biāo)板反應(yīng)孔中加 0. ImL ；然后加濃度為103_8cfu/mL稀釋的待檢樣品0. ImL,同時(shí)做空白對(duì)照，以雙蒸水為陰性對(duì)照；以CMM菌液IOOul為陽(yáng)性對(duì)照；再加酶標(biāo)抗體HRP羊抗鼠IgG ；再加底物液顯色；最后終止反應(yīng)于各反應(yīng)孔中加入終止液0. ImL ；測(cè)0D450/630值，并計(jì)算P/N值，N為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照孔的OD值，P為競(jìng)爭(zhēng)抑制物的OD值；重復(fù)3次，以測(cè)定值大于2. 1者判定為陽(yáng)性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高特異性、高靈敏性檢測(cè)引發(fā)番茄潰瘍病的密執(zhí)安棒桿菌的單克隆抗體，屬于植物檢疫和植物保護(hù)領(lǐng)域，專一針對(duì)番茄潰瘍病菌的檢測(cè)。一種番茄潰瘍病菌單克隆抗體的制備方法，其主要特點(diǎn)是用番茄潰瘍病菌免疫BALB/C小鼠，以獲得分泌產(chǎn)生該種細(xì)菌抗體的特異性的B淋巴細(xì)胞，將此B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合，依次通過(guò)HAT、HT培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細(xì)胞，用有限稀釋克隆的方法進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，通過(guò)雜交瘤細(xì)胞誘導(dǎo)腹水產(chǎn)生和體外培養(yǎng)，制備大量單克隆抗體；進(jìn)一步分離和純化單克隆抗體。
文檔編號(hào)C07K16/12GK102206274SQ201110068329
公開(kāi)日2011年10月5日 申請(qǐng)日期2011年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月22日
發(fā)明者劉箐, 孔君, 熊亮斌 申請(qǐng)人:上?；墼派锟萍加邢薰?br>