專利名稱：山羊tnnc1基因和克隆山羊tnnc1基因編碼區(qū)全序列的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是山羊TNNCl基因和克隆山羊TNNCl基因編碼區(qū)全序列的方法。
背景技術(shù)：
慢肌肌鈣蛋白(TNNCl)是存在于心肌和慢收縮性骨骼肌中的鈣離子結(jié)合蛋白復(fù)合物成員之一。肌鈣蛋白C(TNC)與肌鈣蛋白T和肌鈣蛋白一起形成蛋白復(fù)合物，在肌肉的收縮和舒張中起著關(guān)鍵作用。肌鈣蛋白Cl是慢速收縮骨骼肌和心肌的鈣離子受體，并且是鈣離子激活肌小節(jié)收縮的關(guān)鍵。鈣離子的結(jié)合啟動(dòng)了細(xì)肌絲褶皺般的結(jié)構(gòu)的變化通過(guò)細(xì)肌絲組成蛋白。導(dǎo)致肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白間的橫橋的形成，促使細(xì)肌絲向粗肌絲的滑動(dòng)產(chǎn)生肌肉收縮的效果肌肉收縮的效果。快肌肌鈣蛋白Cl含有4個(gè)鈣離子結(jié)合位點(diǎn)，但只要鈣離子結(jié)合位點(diǎn)II，III和IV有接受鈣離子產(chǎn)生效應(yīng)的位點(diǎn)。每個(gè)鈣離子結(jié)合位點(diǎn)均有一個(gè)由12個(gè)氨基酸殘基組成的鈣離子結(jié)合環(huán)，鈣離子結(jié)合環(huán)存在于一對(duì)a-helices中。每個(gè)鈣離子結(jié)合環(huán)都富含酸性氨基酸(Asp and Glu)負(fù)責(zé)結(jié)合單個(gè)鈣離子。TNNCl整體結(jié)構(gòu)包括一個(gè)N-末端和一個(gè)C-末端的球形區(qū)域，這兩個(gè)球形區(qū)域被一個(gè)靈活的螺旋鏈接形成啞鈴形。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種山羊TNNCl基因及其克隆山羊TNNCl基因編碼區(qū)全序列的方法。山羊TNNCl基因，核苷酸序列為SEQ ID NO :1。所述的山羊TNNCl基因，所述基因的編碼區(qū)序列為SEQ ID NO :2。所述的山羊TNNCl基因，所述基因的編碼區(qū)序列編碼氨基酸為SEQ ID NO :3。所述的山羊TNNCl基因的克隆方法，包括如下步驟步驟一提取山羊心肌組織中的總RNA，然后將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA ；步驟二引物的設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)；依據(jù)已發(fā)表的牛的TNNCl基因的序列設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物，上游引物在起始密碼子的上游區(qū)域設(shè)計(jì)，下游引物在終止密碼子的下游區(qū)域設(shè)計(jì)； 所述簡(jiǎn)并引物為上游引物P1 5 ‘ -CCTGTGAGTCGCCAGTATG-3 ‘下游引物P2:5' -TGGGTGAAGGTTGGTGTC-3 ‘用所述cDNA為模板進(jìn)行梯度PCR反應(yīng)；步驟三PCR產(chǎn)物的回收和純化；步驟四克隆。所述的方法，所述步驟二中，所述PCR反應(yīng)體系為PCR反應(yīng)體系為20 μ 1體系 10μ L的2XMaster Mix Tap，上下游引物各1 μ L，4 μ L的cDNA，4 μ L的ddH20 ；反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性 5min ；35 個(gè)循環(huán)(94°C,40s ；50°C 60°C，40s ；72°C，50s)，最后 72°C IOmin0目前還沒(méi)有山羊TNNCl基因的相關(guān)報(bào)道，為獲得山羊TNNCl基因的完整編碼區(qū)序列，研究RT-PCR克隆法獲取山羊TNNC1(慢肌肌鈣蛋白)基因編碼區(qū)全序列的方法，以建立一種基因克隆的新方法。


圖1是TNNCl基因的8個(gè)溫度點(diǎn)的梯度PCR產(chǎn)物電泳圖。圖2是山羊TNNCl基因編碼區(qū)的核苷酸序列和編碼的氨基酸序列。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。步驟一提取山羊心肌組織中的總RNA (核糖核酸)，然后將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA ；1.組織的采集選取周歲的天府肉羊頸動(dòng)脈放血后立即取約Ig心肌放入液氮罐中用于提取總 RNA。2. RNA的制備及cDNA的合成在實(shí)驗(yàn)室用液氮將心肌磨成粉末裝入1. 5ml的EP管，放入零下80的超低溫冰箱中備用。取新的1. 5ml的EP管，加入1. Iml的Trizol液，然后加入約80mg的心肌組織粉末。立即用手搖晃混勻后，用震蕩儀震蕩約30秒后室溫放置4分鐘。4°C下13000rpm離心3分鐘將液體用移液槍轉(zhuǎn)運(yùn)到另一個(gè)新的1. 5ml的EP管，并往這個(gè)新EP管中加入0. 2ml的氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管約15秒，然后4°C下 13000rpm離心8分鐘。離心結(jié)束以后用移液槍將這個(gè)EP管中的上層水相約0. 4ml移入一新的離心管，加入0. 4ml的異丙醇，室溫放置10分鐘，接著4°C下12000rpm離心10分鐘。 棄去上清液，加入Iml的75%乙醇(DEPC水配制)混勻，4°C下7500g離心5分鐘。小心棄去上清液，然后用移液槍吸干管壁上多余的乙醇，注意不要把RNA吸掉，然后根據(jù)RNA量的多少，加入50到150 μ L的DEPC水。用1. 5%瓊脂糖電泳法檢測(cè)RNA的質(zhì)量，將效果好的RNA立即反轉(zhuǎn)錄成cDNA。步驟二引物的設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)；依據(jù)已發(fā)表的牛的TNNCl基因的序列(登錄號(hào)為BC102995. 1)設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物，上游引物在起始密碼子的上游區(qū)域設(shè)計(jì)，下游引物在終止密碼子的下游區(qū)域設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)的引物為上游引物 P1 5 ‘ -CCTGTGAGTCGCCAGTATG-3 ‘下游引物P2 5 ‘ -TGGGTGAAGGTTGGTGTC-3 ‘用cDNA為模板進(jìn)行梯度PCR反應(yīng)，擴(kuò)增TNNCl基因，溫度為范圍在50°C到65°C之間的8個(gè)溫度點(diǎn)，PCR反應(yīng)體系為20 μ 1體系(IOyL的2XMaster Mix Tap，上下游引物各 lyL，4yL 的 cDNA，4yL 的 ddH20.)，反應(yīng)條件為 95°C預(yù)變性 5min，35 個(gè)循環(huán)(94°C,40s ； 50°〇 601，408;721，508)，最后721 IOmin。反應(yīng)結(jié)束后將約有500bp的PCR產(chǎn)物收集到一個(gè)EP管中并切膠回收(圖1)，將回收的基因片段克隆到質(zhì)粒載體中，然后挑取陽(yáng)性菌進(jìn)行PCR反應(yīng)，產(chǎn)物送測(cè)序公司測(cè)序。設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物不會(huì)出現(xiàn)影響PCR反應(yīng)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，引物二聚體，上下游引物交聯(lián)。適宜的PCR反應(yīng)溫度范圍跨度大。步驟三PCR產(chǎn)物的回收和純化；PCR產(chǎn)物用寶生物膠回收試劑盒純化回收，具體操作步驟為a. PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖IlOV電泳分離后，在紫外光下用消毒刀片切下與預(yù)期片段大小一致的DNA條帶，裝入1. 5mL的EP管中，將膠輕柔切碎。b.在離心管中加入600 μ 1的溶膠液Α，放置于55°C水浴鍋中水浴IOmin溶膠，中
間取出離心管緩慢搖動(dòng)一到兩次。c.膠溶解后放至室溫，加入加20 μ L溶液B，混勻，轉(zhuǎn)入離心柱，8000rpm離心40s。d.棄離心液，將柱子放入新的1. 5M1 EP管中，加50(^1^洗脫液(，8000印111離心 Imin重復(fù)此步驟3次。e.將離心柱放入新離心管，加20 μ 1滅菌蒸餾水，浸潤(rùn)lOmin，IOOOOrpm離心 1. 5min。f.離心管中的溶液即為回收的DNA片段的水溶液。g.取2μ L回收產(chǎn)物于1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)回收效率和純度。步驟四克隆；(1)目的片段與載體連接將回收、檢測(cè)后的目的片段與PMD-18T載體連接，根據(jù)TaKaRa的pMD_18T載體試劑盒使用說(shuō)明書，操作連接體系為PMD-18T Vectorl.OyL純化回后的PCR片段4. OyL連接液 Ligase buffer5. 0 μ LTotal10. 0μ L以上操作在冰上進(jìn)行，稍離心混勻，16°C在PCR儀中連接過(guò)夜，-20°C保存?zhèn)溆谩?2)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(CaCl2法)a.挑取大腸桿菌Dffia菌種，在LB瓊脂板上畫線，37°C培養(yǎng)過(guò)夜(12_16h)。b.挑取單菌落，接種到IOOmL LB液體培養(yǎng)基中。37°C 190rpm振蕩培養(yǎng)12h，當(dāng) ODD600值達(dá)到0. 4-0. 5時(shí)(輕搖培養(yǎng)基肉眼可見云霧狀)，停止培養(yǎng)。c.將菌液以50mL/份分裝至預(yù)冷的IOOmL滅菌離心管中，冰浴10_15min，4000rpm 4°C離心 IOmin0d.棄上清，每管用50mL的預(yù)冷的0. IMol的CaCl2 (液體中有冰粒效果最好)重懸菌體沉淀，冰浴30min后，4000rpm 4°C離心3min。e.棄上清，每管用IOmL預(yù)冷的0. IM的CaCl2重懸菌體沉淀，冰浴10-15min，即為感受態(tài)細(xì)胞。f.現(xiàn)制現(xiàn)用?；?qū)⒅苽浜玫母惺軕B(tài)細(xì)胞加入30%甘油至終濃度為15-20%，混勻， 分裝成200uL/份，投入液氮快速冷凍后，-80°C保存(3)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化a.從_80°C冰箱取出保存的感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍。
b.將2. 5μ1連接產(chǎn)物緩慢打入200μ1的感受態(tài)細(xì)胞中，動(dòng)作要輕柔，冰浴 20minoc. 42°C水浴熱激90s (中間不能搖晃離心管)，迅速取出置于冰上，冰浴5-lOmin。d.加入800 μ 1 LB液體培養(yǎng)基(不加Amp)，于37°C、小于150rpm振蕩培養(yǎng)50min 以復(fù)蘇細(xì)胞。e.3000rpm離心5min，吸去部分上清，輕柔懸浮細(xì)菌，涂布于選擇性平板上。待液體完全滲入瓊脂后，倒扣平板，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9_16h。(4)陽(yáng)性菌落的篩選隨機(jī)挑選菌落接種于LB氨節(jié)培養(yǎng)液中，培養(yǎng)至中等濃度后以菌液為模板，用于相應(yīng)基因PCR擴(kuò)增相同的引物及反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)， 將擴(kuò)增產(chǎn)物與目的片段大小一致的菌液0.5mL裝入1.5ml EP離心管中，加入30%甘油。交送寶生物工程技術(shù)有限公司完成測(cè)序。步驟五檢驗(yàn)試驗(yàn)的正確性；將測(cè)序結(jié)果在NCBI上運(yùn)用blast在線比對(duì)軟件以驗(yàn)證序列的正確性和該方法的可靠性。結(jié)果表明該方法獲得的山羊TNNCl基因完整編碼區(qū)序列的核苷酸序列與其他已知的哺乳動(dòng)物的TNNCl基因序列同源性為92. 18% 99. 38%。表明該方法能達(dá)到獲得山羊 TNNCl基因的完整編碼區(qū)序列的目的。獲得的山羊TNNCl基因核苷酸序列為SEQ ID NO :1， 編碼區(qū)序列為SEQ ID NO :2，編碼氨基酸序列SEQ ID NO :3。本發(fā)明簡(jiǎn)單、快捷的獲取了山羊TNNCl基因的完整編碼區(qū)序列，填補(bǔ)了該基因在山羊上的空白，為進(jìn)一步研究山羊的該基因奠定了基礎(chǔ)。該技術(shù)相比較分段克隆和RACE技術(shù)而言，目的PCR片段的長(zhǎng)短大致明確，工作量小(只需克隆一次)，具有成本低，效率高的優(yōu)勢(shì)。應(yīng)當(dāng)理解的是，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以根據(jù)上述說(shuō)明加以改進(jìn)或變換， 而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.山羊TNNCl基因，其特征在于，核苷酸序列為SEQID NO :1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的山羊TNNCl基因，其特征在于，所述基因的編碼區(qū)序列為SEQ ID NO :2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的山羊TNNCl基因，其特征在于，所述基因的編碼區(qū)序列編碼氨基酸為 SEQ ID NO :3ο
4.權(quán)利要求1所述的山羊TNNCl基因的克隆方法，其特征在于，包括如下步驟 步驟一提取山羊心肌組織中的總RNA，然后將總RNA反轉(zhuǎn)錄成eDNA ；步驟二引物的設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)；依據(jù)已發(fā)表的牛的TNNCl基因的序列設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物，上游引物在起始密碼子的上游區(qū)域設(shè)計(jì)，下游引物在終止密碼子的下游區(qū)域設(shè)計(jì)；所述簡(jiǎn)并引物為上游引物 P1 5 ‘ -CCTGTGAGTCGCCAGTATG-3 ‘ 下游引物 P2 5 ‘ -TGGGTGAAGGTTGGTGTC-3 ‘ 用所述cDNA為模板進(jìn)行梯度PCR反應(yīng)； 步驟三PCR產(chǎn)物的回收和純化； 步驟四克隆。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟二中，所述PCR反應(yīng)體系為PCR 反應(yīng)體系為20μ 1體系10μ L的2XMaster Mix iTap,上下游引物各1 μ L，4 μ L的cDNA, 4μ L 的 ddH20 ；反應(yīng)條件為95 °C 預(yù)變性 5min ；35 個(gè)循環(huán)(94°C，40s ； 50°C 60°C，40 s ； 72°C，50s)，最后 72°C IOmin0
全文摘要
本發(fā)明公開了山羊TNNC1基因，核苷酸序列為SEQ ID NO1。所述基因的編碼區(qū)序列為SEQ ID NO2。所述基因的編碼區(qū)序列編碼氨基酸為SEQ ID NO3。還提供一種山羊TNNC1基因的克隆方法，包括如下步驟步驟一，提取山羊心肌組織中的總RNA，然后將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；步驟二，引物的設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)；步驟三，PCR產(chǎn)物的回收和純化；步驟四，克隆。本發(fā)明簡(jiǎn)單、快捷的獲取了山羊TNNC1基因的完整編碼區(qū)序列，填補(bǔ)了該基因在山羊上的空白，為進(jìn)一步研究山羊的該基因奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C07K14/47GK102181451SQ20111007475
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月28日
發(fā)明者徐剛毅, 汪代華, 鄭程莉, 陳浩林 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)