專(zhuān)利名稱(chēng)：一種基于親和層析的分離鹿角膠中功能多肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域中的多肽分離技術(shù)，尤其涉及一種基于親和層析方法從鹿角膠中分離功能多肽的方法。
背景技術(shù)：
鹿角膠是鹿角經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠，它的主要成分是膠原蛋白。鹿角膠膠原蛋白是指以鹿角為原料采用熱處理、酸/堿處理、酶法降解或結(jié)合多種方式降解獲得的混合物，其主要成份是鹿角膠中膠原降解后形成的分子量不均一的多肽類(lèi)物質(zhì)。鹿角膠可作為保健品或藥品原原料，具有提高人體免疫力、促進(jìn)鈣的吸收、改善血液微循環(huán)以及補(bǔ)充氨基酸營(yíng)養(yǎng)成份等功能，從鹿角膠膠原蛋白中有效識(shí)別不同功能的多肽組份是近年來(lái)膠原蛋白產(chǎn)品開(kāi)發(fā)中的熱點(diǎn)。傳統(tǒng)的鹿角膠原蛋白產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的重點(diǎn)主要集中于鹿角膠制備過(guò)程對(duì)分子量范圍及產(chǎn)品性能的影響，而且采用的制備方法一般是酶解法。Hoon H. Simwoo等人利用酸水解法提取鹿角膠原蛋白，對(duì)鹿角從上到下分為四部分，對(duì)其每一部分分別進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)鹿角最頂端的膠原蛋白含量最高(J. Agric. Food Chem. ,1995,43 =2846-2849) ；Rajaram 等人利用凝膠電泳從鹿茸骨中粗提膠原蛋白，然后用硝酸纖維素膜進(jìn)一步純化膠原蛋白 (Resonance, 2004) ；Li Yinqing等人采用醇提法制備鹿茸膠原，并利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鹿茸膠原對(duì)大鼠成骨細(xì)胞具有明顯的促貼壁和增殖作用，對(duì)去勢(shì)雌性大鼠骨質(zhì)疏松癥具有一定的治療作用(AfricanJournal of Biotechnology，2010，9，38 :6437-6441)；徐云鳳等人采用胰蛋白酶酶解法制備鹿茸膠原蛋白，并確定了其最佳制備工藝，利用高效凝膠色譜測(cè)定了酶解膠原蛋白的分子量分布，酶解池后，分子量低于15kDa(中華中醫(yī)藥雜志， 2011，26，1 :53-56)；韓國(guó)Hee-Guk Byim利用離子交換色譜和凝膠過(guò)濾色譜的方法從膠原蛋白中分離出具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性的多肽(Process Biochemistry, 2001, 36 1155-1162)；日本Maruyama S從膠原蛋白中分離出可抑制血小板活性的多肽(Biochimi. Biophysi. Acta ；1993,1164, 215-223)；傳統(tǒng)的膠原蛋白中不同多肽的分離方法主要基于分子量范圍、帶電荷狀態(tài)等性質(zhì)進(jìn)行分離，存在分辨率低和特征性不強(qiáng)等缺點(diǎn)，而且研究者主要研究鹿茸膠原蛋白對(duì)骨細(xì)胞的作用，對(duì)鹿茸膠原蛋白的很多功能作用都尚未開(kāi)發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于親和層析的分離鹿角膠中功能多肽的分離方法。 纖維連接蛋白或凝血因子等血漿中的蛋白質(zhì)可與膠原蛋白降解物中的許多多肽特異性結(jié)合，利用纖維連接蛋白或凝血因子等血漿中的蛋白質(zhì)作為配基采用親和層析的方法可分離鹿角膠中的部分多肽，本發(fā)明涉及的膠原蛋白中功能多肽分離方法具有分辨率高和特征性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的詳細(xì)內(nèi)容(1)將鹿角膠溶于水制成膠原蛋白溶液，并將該溶液的pH值調(diào)至6. 0-9. O ；
(2)將膠原蛋白溶液上親和層析柱，循環(huán)上樣至親和層析柱吸附樣品達(dá)到飽和。(3)使用淋洗劑將未與層析介質(zhì)配基結(jié)合的多肽淋洗出。(4)使用洗脫劑將與親和層析介質(zhì)配基結(jié)合的多肽洗脫出，洗脫過(guò)程的溫度可控制在 15-37°C。(5)利用凝膠過(guò)濾層析法或膜超濾的方法將得到的洗脫液濃縮，得到濃縮液；(6)將濃縮液冷凍干燥，所得白色粉末即鹿角膠膠原蛋白中的功能多肽。本發(fā)明基于親和層析的鹿角膠中功能多肽的分離方法中，如果待分離的膠原蛋白原料是水溶液，則省去(1)所述的膠原蛋白溶解過(guò)程，直接將膠原蛋白溶液的PH值調(diào)制 6. 0-9. O0所述的鹿角膠原料可以是鹿角膠或其膠原蛋白降解物。所述的親和層析介質(zhì)的基質(zhì)是直徑為40-120微米瓊脂糖微球。所述的親和層析柱中層析介質(zhì)的配基可以是纖維連接蛋白或血漿中的其他蛋白質(zhì)。所述的洗脫劑可以是含2-8mol/L脲、pH值為3. 0_8. 0的緩沖液，也可以是含 5-50%乙醇的水溶液或5-50%乙腈的水溶液。如果采用5-50%乙醇的水溶液或5-50%乙腈的水溶液作為洗脫劑，則省去(5)所述的利用凝膠過(guò)濾層析法或膜超濾的方法將得到的洗脫液濃縮，得到濃縮過(guò)程，洗脫液直接進(jìn)行冷凍干燥。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1原料2mg/ml鹿角膠膠原蛋白水溶液(1)將原料鹿角膠水溶液的pH調(diào)至7. 0-9. 0。(2)將鹿角膠水溶液上樣至親和層析柱至透過(guò)液中檢測(cè)出膠原蛋白，親和層析介質(zhì)的基質(zhì)瓊脂糖微球。親和層析柱配基人血漿纖維連接蛋白，柱填料體積40ml，填料粒徑:60-120微米。(3)使用20ml 0. 2mol/L碳酸氫銨作為淋洗劑淋洗層析柱，流速lml/min。(4)使用20%乙醇溶液在30°C下洗滌層析柱，流速lml/min，收集前30min組份，(5)將收集到的組份直接冷凍干燥，獲得的白色粉末即為鹿角膠膠原蛋白中的功能多肽。實(shí)施例2原料鹿角膠水溶液(1)將原料鹿角膠水溶液的pH調(diào)制7. 0，濃度控制在3-10mg/mL。(2)將鹿角膠水溶液上樣至親和層析柱至透過(guò)液中檢測(cè)出膠原蛋白，親和層析介質(zhì)的基質(zhì)瓊脂糖微球。親和層析柱配基人血漿纖維連接蛋白，柱填料體積40ml，填料粒徑:60-120微米。(3)使用20ml 0. 2mol/L碳酸氫銨作為淋洗劑淋洗層析柱，流速lml/min。(4)使用8M脲溶液(含0. INH4HCO3)在20°C下洗滌層析柱，流速lml/min，收集前 35min組份，(5)將收集到的洗脫液使用凝膠過(guò)濾層析柱(S^hadex G10)除去溶液中的脲。
(6)脫鹽后的多肽直接冷凍干燥，獲得的白色粉末即為鹿角膠中的功能多肽。
權(quán)利要求
1.一種基于親和層析的分離鹿角膠中功能多肽的方法，其特征在于將從鹿角膠溶解后上樣至親和層析柱，淋洗去除未被親和吸附的多肽，使用洗脫劑將鹿角膠中與層析介質(zhì)親和的功能多肽洗脫出，使用干燥方法獲得功能多肽粉末。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，鹿角膠中的功能多肽分離是基于親和層析的分離技術(shù)。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，親和層析介質(zhì)的配基是纖維連接蛋白或凝血因子等人血漿中的蛋白質(zhì)。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，親和層析介質(zhì)的基質(zhì)是直徑為40-120微米瓊脂糖微球。
5.按照權(quán)利要求1所述的方法，從鹿角膠中分離出的功能多肽是指鹿角膠中可以與纖維連接蛋白或凝血因子等人血漿中的蛋白質(zhì)相結(jié)合的多肽。
6.按照權(quán)利要求1所述的方法，原料是鹿角膠溶解后溶液或從鹿角膠中分離出的膠原蛋白降解物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，干燥方法是冷凍干燥或噴霧干雜。
全文摘要
一種基于親和層析的分離鹿角膠中功能多肽的方法，其工藝過(guò)程為將鹿角膠膠原蛋白水溶液上樣至以纖維連接蛋白為配基的親和層析柱，循環(huán)上樣至親和層析柱吸附樣品達(dá)到飽和，使用淋洗劑將未吸附的多肽淋洗出，使用洗脫劑將與親和層析介質(zhì)配基結(jié)合的多肽洗脫出，將洗脫液濃縮，冷凍干燥后所得白色粉末即鹿角膠膠原蛋白中的功能多肽。該方法具有過(guò)程簡(jiǎn)單和分離獲得的多肽特征性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C07K1/22GK102199193SQ20111007635
公開(kāi)日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2011年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月28日
發(fā)明者孔英俊, 張宏, 張貴鋒, 查圣華, 蘇志國(guó), 馬光輝, 高建萍 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所, 北京同仁堂健康藥業(yè)股份有限公司