專利名稱：基于內(nèi)嗎啡肽2和神經(jīng)肽ff的嵌合肽及其合成和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生化技術領域，涉及一種基于內(nèi)嗎啡肽2和神經(jīng)肽FF而構(gòu)建的嵌合肽及其合成方法；本發(fā)明同時還涉及該嵌合肽在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應用。
背景技術：
在臨床上，嗎啡類的阿片藥物已被人們廣泛的應用于治療和緩解各種疼痛，但是由于阿片類的鎮(zhèn)痛藥能引起嚴重的不良反應和阿片依賴作用，而大大限制其在臨床治療中的應用。已有的研究表明哺乳動物中樞和外周都廣泛存在著阿片受體。1997年， 發(fā)現(xiàn)內(nèi)嗎啡肽(endomorphins，EMs),即內(nèi)嗎啡肽 1 (EM-1，Tyr-Pro- Trp-Phe-NH2)和 2 (EM-2，Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2)為μ阿片受體(MOR)內(nèi)源性的高效選擇性的激動劑，它們對 μ 阿片受體的 Ki 分別為 360 ρΜ Π 690 pM (.Nature. 1997，386:499; Ann. N. Y. Acad. Sci. 1999;897:136)。它們的性能類似于嗎啡，能參與體內(nèi)多種生理功能的調(diào)節(jié)， 尤其是痛覺調(diào)節(jié)，因此被視為潛在的可替代嗎啡的深層次鎮(zhèn)痛藥物C/卯.J. Pharmacol. 1998，78337 -,Brain Res. 2000，881:1 -J. Pharmacol. Exp. Ther. 1999，291:12; Pharmacol. Rev. 2007, 59:88等)。內(nèi)嗎啡肽為μ -阿片受體的高效選擇性激動劑，能介導明顯的鎮(zhèn)痛活性。已有研究發(fā)現(xiàn)中樞注射EM-I和ΕΜ-2在CPP實驗中表現(xiàn)出完全相反的結(jié)果，即分別引起環(huán)境的偏愛和厭惡O； Pharmacol. Exp. Ther. 2004, 309:816 ； Neurosci. Lett. 2004，365:157等)。因此EM-2比EM-I具有更低的藥物成癮性。1985 年，神經(jīng)肽 FF (NPFF, Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2)作為一種抗阿片肽而從牛腦中被分離和鑒定，并發(fā)現(xiàn)它具有抗嗎啡鎮(zhèn)痛的作用Nat. Acad. Sci. U.S.A. 1985，82:7757)。隨后的研究表明，神經(jīng)肽FF系統(tǒng)涉及到兩種不同的受體前體(Pro-NPFFA 和 NPFI7b 受體)和兩種不同受體(NPFF1 和 NPFF2 受體)QFEBS Lett. 1997， 409426 -MoL Pharmacol. 1999，55:804 -,Nat. Cell Biol. 2000，2: 703 -J. Biol. Chem. 2001，276:36961 -J. Biol. Chem. 2000，275:25965 -J. Biol. Chem. 2000， 275:393 等)。大量的研究結(jié)果表明，NPFF及其相關肽能介導多種生物學活性，即在痛覺、 心血管活性、體溫、胃腸道活動、攝食、內(nèi)分泌、阿片耐受和依賴等方面具有一定的調(diào)節(jié)作用，特別是對阿片類物質(zhì)所引起的鎮(zhèn)痛、耐受和成癮都具有重要的影響(/ ; Neurobiol. 1996，48:461 -,Eur. J. Pharmacol. 1998，345 (1) 1 -,Curr. Top. Med. Chem. 2005， 5:341 等)。眾所周知，內(nèi)源性的神經(jīng)肽在機體內(nèi)都能介導一種或多種主要的生理和藥理學活性。但是，神經(jīng)肽在發(fā)揮其主要活性的同時，經(jīng)常伴隨著產(chǎn)生了其次要活性，而這些次要活性就成為了它的副作用。比如，阿片肽在緩解疼痛的同時，會伴隨著耐受、成癮和呼吸抑制等副作用的出現(xiàn)。為了解決這一矛盾，傳統(tǒng)的研究策略是以神經(jīng)肽的母體為化學模板，來進行系統(tǒng)的化學修飾而篩選出受體選擇性較高且具有優(yōu)勢構(gòu)象的神經(jīng)肽類似物，從而達到保持較高生物活性并降低其副作用的預期效果。近年來還發(fā)展了一些新策略，基于內(nèi)源性神經(jīng)肽設計并構(gòu)建了一系列雜合肽并對其進行了研究，以期使嵌合肽能夠在發(fā)揮主要活性的同時，最大限度的減少其副作用的出現(xiàn)。尤其是，F(xiàn)oran等人基于阿片肽EM-2和速激肽P物質(zhì)(SP )而成功地設計構(gòu)建了一類全新的雜合肽ESP7 (Tyr-Pro-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2) ，并且發(fā)現(xiàn)脊髓水平注射ESP7能產(chǎn)生阿片受體依賴的鎮(zhèn)痛作用，但又不產(chǎn)生鎮(zhèn)痛耐受現(xiàn)象的副作用(/"roc. Nat. Acad. Sci. U. S. Α. 2000，97:7621)。 近年的藥理學活性鑒定表明，NPFF不僅具有抗阿片的功能，還具有原阿片活性，從而被歸為一類重要的阿片調(diào)節(jié)肽(β/rr. Top. Med. Chem. 2005, 5341 )。NPFF自身對基礎痛閾值無影響，即在生理劑量水平對機體的生物學活性影響不大。但NPFF作為阿片調(diào)節(jié)肽之一，在維持機體的內(nèi)源性阿片和抗阿片系統(tǒng)平衡過程中起著重要作用，參與了鎮(zhèn)痛耐受的調(diào)節(jié)，并能減弱嗎啡等阿片物質(zhì)所引起的條件位置偏愛作用(β/rr. Top. Med. Chem. 2005，5:341 -,Peptides. 2006, 27:964 -,Peptides. 2007, 28:2235 -,Peptides. 2010， 31:1374等)。因此，NPFF的藥理學特性使其適合作為化學模板分子來發(fā)展成一類全新的阿片類嵌合肽。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對嗎啡等阿片類鎮(zhèn)痛藥物在臨床應用中具有阿片依賴和成癮等副作用，提供一種基于內(nèi)嗎啡肽2和神經(jīng)肽FF的嵌合肽。本發(fā)明的另一目的是提供一種合成基于內(nèi)嗎啡肽2和神經(jīng)肽FF的嵌合肽的方法。本發(fā)明還有一個目的，就是提供該嵌合肽在制備鎮(zhèn)痛藥物中的應用。(一)基于內(nèi)嗎啡肽2和神經(jīng)肽FF的嵌合肽
本發(fā)明基于內(nèi)嗎啡肽2和神經(jīng)肽FF的嵌合肽，基于內(nèi)嗎啡肽2和神經(jīng)肽FF而構(gòu)建的， 其N末端和C末端分別為內(nèi)嗎啡肽-2和神經(jīng)肽FF (3-8)的結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)式如下
權利要求
1.基于內(nèi)嗎啡肽2和神經(jīng)肽FF的嵌合肽，其結(jié)構(gòu)式
2.如權利要求1所述基于內(nèi)嗎啡肽2和神經(jīng)肽FF的嵌合肽的制備方法，包括以下工藝步驟(1)樹脂預處理將Rink-Amide-MBHA樹脂在二氯甲烷中攪拌30-40min,使樹脂充分溶脹后減壓抽干溶劑；(2)脫除Fmoc基團保護使溶脹、抽干溶劑后的樹脂在體積濃度20-22%的六氫吡啶 DMF溶液中，攪拌3-5min后抽干，重復2_3次；再加入到體積濃度20-22%的六氫吡啶DMF 溶液，攪拌10-15min，使Fmoc基團脫除完全，然后抽干溶劑；最后用DMF洗滌除凈六氫吡啶；(3)縮合依次將24eq的α-Fmoc保護基團氨基酸、N-羥基苯并三氮唑、0_苯并三氮唑-N，N，N',艫-四甲基脲-六氟磷酸鹽完全溶解于DMF中，再加入4_8eq的二異丙基乙胺后混勻混合溶液；然后在氬氣保護下使脫除Fmoc基團保護的樹脂在上述混合溶液中攪拌反應50-60min，抽干溶劑；用DMF重復洗滌除去未反應的α -Fmoc保護基團氨基酸、 N-羥基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N，N, N',艫-四甲基脲-六氟磷酸鹽；(4)肽鏈的延長重復步驟(2)、(3)，依次將帶有α-Fmoc保護基團氨基酸逐個縮合至樹脂上，直至完成所有氨基酸殘基的縮合，得到肽樹脂；(5)肽鏈從樹脂上的切割肽鏈縮合全部完成后，按照步驟(2)的方法將肽樹脂最后一個氨基酸的Fmoc基團完全脫除；用DCM、MeOH交替洗滌樹脂，充分抽干溶劑后，按每克肽樹脂加入15-20ml的切割劑，于室溫下切割反應2-3小時；過濾，濾液在不高于37°C的條件下充分減壓旋干，然后用不高于-10°C的乙醚析出沉淀；靜置后先去除上清的乙醚，再用水充分溶解后用分液漏斗除去乙醚相，合并水相，冷凍干燥得白色的粗肽固體粉末；(6)粗肽的脫鹽和純化以體積濃度15-20%的乙酸溶液為流動相，將粗肽過kphadex G25交聯(lián)葡聚糖凝膠柱脫鹽，利用紫外檢測儀收集主峰后冷凍干燥，得脫鹽的肽化合物；再利用反向高效液相色譜柱進行分離純化，收集主峰，冷凍干燥后得到白色的純肽固體粉末。
3.如權利要求1所述基于內(nèi)嗎啡肽2和神經(jīng)肽FF的嵌合肽的制備方法，其特征在于 步驟(5)所述切割劑是由三氟乙酸、三異丙基硅烷、水以95:2. 5:2. 5的體積比混合形成的溶劑。
4.如權利要求1所述基于內(nèi)嗎啡肽2和神經(jīng)肽FF的嵌合肽在制備鎮(zhèn)痛藥的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基于內(nèi)嗎啡肽2和神經(jīng)肽FF的嵌合肽，其在保留內(nèi)嗎啡肽2的N末端結(jié)構(gòu)和神經(jīng)肽FF的C末端結(jié)構(gòu)基礎上，利用內(nèi)嗎啡肽2的C末端和神經(jīng)肽FF的N末端中都存在的苯丙氨酸殘基的特點而構(gòu)建的一種全新的嵌合肽EN-9。體內(nèi)的藥理學研究發(fā)現(xiàn)EN-9表現(xiàn)出比內(nèi)嗎啡肽2更強、更持續(xù)的鎮(zhèn)痛活性，并具有無耐受作用、低成癮性等優(yōu)點。此外，化合物EN-9皮下EN-9能引起顯著的鎮(zhèn)痛作用，能克服內(nèi)嗎啡肽外周注射無鎮(zhèn)痛活性的缺陷，從而具有用于臨床疼痛治療的潛在應用價值。
文檔編號C07K1/06GK102206285SQ20111009784
公開日2011年10月5日 申請日期2011年4月19日 優(yōu)先權日2011年4月19日
發(fā)明者方泉, 李寧, 王銳, 韓政嵐 申請人:蘭州大學