專利名稱：抗IMMT全人源Fab抗體及其在制備抗肝癌藥物中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種抗IMMT全人源Fab抗體及其在制備抗肝癌細胞H印G2藥物中應用。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肝癌是危害人類健康的重要疾病之一，多次被我國政府列為研究和防治的重點。肝癌的治療長期以來一直是一個世界性的難題。肝癌發(fā)病隱匿，患者就診時多屬中、 晚期，而且肝癌是一種惡性程度高、浸潤和轉(zhuǎn)移性強以及先天性耐藥的惡性腫瘤，手術(shù)、放療、化療及介入等常規(guī)治療療效均不理想，也不能從根本上解決肝癌的轉(zhuǎn)移和復發(fā)，特別是面對那些分化程度低或未分化、已經(jīng)遠處轉(zhuǎn)移、病期較晚的肝癌患者可謂束手無策。此外抗癌藥物的普通制劑給藥后在全身分布，殺傷癌細胞的同時也損傷正常細胞，產(chǎn)生嚴重的不良反應。因此研發(fā)特異性強、靶向性強、療效高、副作用小的藥物成為一項關(guān)系到人民生命健康的重要工程，已成為腫瘤領(lǐng)域的研究熱點。南京醫(yī)科大學衛(wèi)生部抗體技術(shù)重點實驗室承擔衛(wèi)生部科學研究基金課題“肝癌早期相關(guān)基因和腫瘤標志物篩選”的研究課題期間，使用經(jīng)典方法二乙基亞硝胺誘導Wistar 大鼠成功建立肝癌模型，分別把不同時期(非特異性肝損傷、肝硬化、肝細胞不典型增生、 早期肝癌結(jié)節(jié)和肝癌晚期出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移灶)的肝臟組織提取RNA，進行Affymetrix芯片檢測(GeneChip Rat Genome 2302. OArray)。分析發(fā)現(xiàn)線粒體內(nèi)膜蛋白 IMMT Qnner Membrane Protein, Mitochondrial)在大鼠肝癌呈高水平表達，是正常組織的25倍，而在非特異損傷和硬化階段表達卻沒有檢測到表達升高，并經(jīng)過熒光定量PCR技術(shù)和綠色熒光蛋白示蹤技術(shù)所證實。大鼠肝癌發(fā)生與人體肝癌發(fā)生的過程非常相似，而大鼠IMMT與人體的IMMT高度同源(100%)。本實驗室已經(jīng)在臨床原發(fā)性肝癌組織標本和相應的非肝癌肝組織標本中通過熒光實時定量PCR比較發(fā)現(xiàn)，IMMT表達水平在肝癌組織中高于非肝癌肝組織，IMMT可能通過影響肝癌細胞內(nèi)骨架蛋白的構(gòu)像和分布，從而改變肝癌細胞的運動能力，參與肝癌侵襲機制。IMMT高表達的肝癌細胞獲得淋巴細胞的“偽裝”，逃避人體免疫系統(tǒng)的識別和殺傷，更易進入淋巴結(jié)，形成轉(zhuǎn)移。因此IMMT成為肝癌靶向治療的一個良好的靶點。通過在美國Pubmed和中國CNKI數(shù)據(jù)庫的檢索，目前尚未見相關(guān)研究報道。目前抗肝癌IMMT鼠源單克隆抗體在本實驗室已研制成功。用于肝癌治療的人源抗IMMT基因工程抗體，目前國內(nèi)外均無報道。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明旨在提供抗IMMT Fab抗體重、輕鏈可變區(qū)基因及其編碼的多肽，以及該抗體在制備抗肝癌藥物中的應用。技術(shù)方案抗IMMT全人源Fab抗體，輕鏈的氨基酸序列如SEQ ID No 1所示，重鏈的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。抗IMMT全人源Fab抗體，輕鏈的核苷酸序列如SEQ ID No 3所示，重鏈的核苷酸序列如SEQ ID No 4所示。所述的抗IMMT全人源Fab抗體在制備抗肝癌藥物中的應用。本發(fā)明人從原發(fā)性肝癌患者全血中分離的B淋巴細胞中克隆了基因組所有的抗體重、輕鏈可變區(qū)基因，采取基因工程方法，構(gòu)建庫容量為1.3X IO9的全人源免疫型Fab抗體庫。用純化的IMMT蛋白對噬菌體抗體庫進行富集篩選，分離了 1株抗IMMT型的特異性人源Fab抗體。測序結(jié)果證實其Fd鏈和L鏈的DNA序列及氨基酸序列(命名為hFabrl)。 對克隆可溶性表達后的沉淀及上清進行SDS-PAGE和Wfestern blot分析，證實在約^kD和 30kD左右有二條目的條帶，確定抗體有可溶性表達。ELISA顯示克隆與IMMT蛋白反應陽性 (OD450nm = 1. 218)，說明該克隆是與IMMT有特異性結(jié)合活性的Fab抗體片段。有益效果體外觀察hFabrl抗肝癌效應結(jié)果表明，hFabrl能抑制H印G2細胞的增殖和侵襲，誘導H印G2細胞凋亡。動物體內(nèi)實驗表明hFabrl能明顯抑制荷瘤裸鼠體內(nèi)H印G2 移植瘤的生長。全人源抗IMMT基因工程抗體的獲得不僅為原發(fā)性肝癌的預防和治療帶來了希望，也為研制能用于肝癌和其它惡性腫瘤生物治療的抗體藥物提供了新的思路和技術(shù)貯備。


圖1為抗體重鏈、輕鏈可變區(qū)基因及其抗體hFabrl基因PCR產(chǎn)物，其中M DNAMarker ；1 =Fab ；2 :LK ；3 =Lx ；4 :Fd ；5 :CL ；6 :CH ；7 -.Yk ；8 -.Yλ ；9 :VH ；圖2為SDS-PAGE檢測純化的hFabrl抗體；圖3為hFab hFabrl作用48h后H印G2細胞凋亡的分布；圖4為LSCM檢測細胞凋亡0 晚期凋亡細胞)，其中A.空白對照組正常細胞膜聯(lián)蛋白V(-)PI(_) ；B.低劑量組晚期凋亡細胞膜聯(lián)蛋白V⑴PI (+) ；C.中劑量組晚期凋亡細胞膜聯(lián)蛋白V(+)PI(+) ；D.高劑量組晚期凋亡細胞膜聯(lián)蛋白V(+)PI(+)；圖5為透射電鏡觀察HepG2細胞超微結(jié)構(gòu)，其中A.空白對照組細胞結(jié)構(gòu)清楚，核膜完整，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻。胞質(zhì)內(nèi)可見較多的結(jié)構(gòu)清晰的線粒體等細胞器；B.低劑量組細胞核內(nèi)染色質(zhì)趨邊凝集，胞質(zhì)內(nèi)線粒體輕度腫脹；C.中劑量組細胞核內(nèi)染色質(zhì)趨邊凝集或成塊狀凝集。胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹、空化，胞質(zhì)輕度空化；D.高劑量組細胞核呈固縮狀，核內(nèi)異染色質(zhì)趨邊凝集，胞質(zhì)電子密度加深，細胞質(zhì)空化明顯。圖6為Transwel 1小室H印G2細胞遷徙實驗，其中A.空白對照組；B.低劑量組； C.中劑量組；D.高劑量組；
具體實施例方式1.大容量全人源免疫型抗IMMT Fab噬菌體抗體庫的構(gòu)建從原發(fā)性肝癌患者全血中分離的B淋巴細胞中克隆了基因組所有的抗體重、輕鏈可變區(qū)基因，采取基因工程方法，構(gòu)建庫容量為1.3X IO9的全人源免疫型Fab抗體庫。2.抗IMMT Fab抗體的篩選、表達、純化及鑒定用純化的IMMT蛋白對構(gòu)建的噬菌體抗體庫進行富集篩選，分離了 1株抗IMMT的特異性人源Fab抗體。SDS-PAGE與flfestern-blot分析表明，轉(zhuǎn)化工程菌能正確表達Fab抗體。變性條件下，F(xiàn)ab抗體分子的異二聚體分解為Fd與Kappa鏈。經(jīng)ftOtein L純化的hFabrl基本與其他蛋白分離，SDS/PAGE進一步證實了其結(jié)構(gòu)與分子量與Fab相符，同時也證實了其純度。ELISA鑒定結(jié)果顯示純化的hFabrl有明顯的與IMMT結(jié)合的能力，隨劑量的遞減， OD值呈下降趨勢。3.免疫熒光檢測Fab抗體與IMMT結(jié)合位點hFabhl與肝癌H印G2細胞表面的IMMT結(jié)合，結(jié)合部位為細胞膜。4.抗體在預防及治療肝癌試驗中的應用主要包括體外細胞試驗和體內(nèi)裸鼠模型試驗4. IhFabrl抗體對肝癌!fepG2細胞增殖、侵襲及凋亡的作用研究hFabrl抗體對肝癌H印G2細胞增殖和侵襲有抑制作用，并能誘導H印G2細胞凋亡。4. 2hFabrl抗體對裸鼠肝癌H印G2細胞移植瘤的作用研究高劑量組腫瘤生長速度減慢，中劑量組同樣減慢但比高劑量組快，陰性對照組與空白對照組差異不明顯；hFab rl 二個劑量組腫瘤生長抑制率比對照組高，在兩周內(nèi)均呈上升趨勢，但高劑量組上升趨勢更大。說明hFab rl對腫瘤的生長有抑制作用，且抑制效果與用藥劑量及用藥時間關(guān)系密切，但并不能完全停止腫瘤的生長或使腫瘤體積縮小。實施例1全人源免疫型Fab噬菌體抗體庫的構(gòu)建采集原發(fā)性肝癌患者全血80份，分離淋巴細胞，采用hvitrogen公司的Trizol 抽提總RNA，用0lig0(dT)2(l為引物，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。然后利用特異性引物PCR分別擴增其重、輕鏈可變區(qū)基因。經(jīng)Overlap PCR合成Fab基因(圖1)，與經(jīng)相同酶切的表達載體 pComb3XSS連接，構(gòu)建Fab的原核重組表達載體；電轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌XLl-Blue，構(gòu)建了容量為1. 3 X IO9的全人源免疫型Fab抗體庫。所述構(gòu)建的Fab基因與pComb3xSS載體連接是指將純化定量后的Fab基因分別以SfiI內(nèi)切酶進行雙酶切消化；純化、定量后與同樣雙酶切pComb3xSS載體連接；所述的轉(zhuǎn)化是指a)0. 2cm電轉(zhuǎn)杯，25 μ F，2. 5kV，200 Ω的電轉(zhuǎn)條件轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 XLl-Blue ；b)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物加入LB培養(yǎng)基后37°C振蕩培養(yǎng)2h，10倍梯度稀釋將菌液涂布于 SOBAG瓊脂板上，30°C過夜培養(yǎng)；c)次日計算平板上的克隆數(shù)，估算庫容為1.3X109;d)將電轉(zhuǎn)化后菌液加入輔助噬菌體ΜΠΚ07超感染，離心沉淀菌體，用LB培養(yǎng)基重懸，37°C振蕩過夜，離心沉淀菌體，吸取上清即為Fab噬菌體表面展示文庫。實施例2抗IMMT特異性抗體的篩選、表達及純化(1)用純化的IMMT的包被固相篩選ELISA板，每孔1 μ g，洗滌，加封閉液，洗滌，加入噬菌體抗體庫抗體，洗滌去除未結(jié)合的噬菌體抗體；加入胰蛋白酶，洗脫特異性結(jié)合的噬菌體抗體，感染增值，輔助噬菌體ΜΠΚ07超感染；重復以上篩選步驟，共進行五輪“吸附-洗脫-擴增”富集篩選；(2)將最后一輪篩選且增值得到的噬菌體稀釋后鋪于培養(yǎng)板上培養(yǎng)過夜，挑取31 個單菌落于細胞培養(yǎng)板中，振搖培養(yǎng)過夜；從第一塊板各孔中分別轉(zhuǎn)移5 μ L菌液至第二塊板，振搖培養(yǎng)；加輔助噬菌體Μ ;3Κ07超感染，振搖培養(yǎng)；離心，培養(yǎng)基重懸沉淀，振搖培養(yǎng)過夜。離心取上清進行ELISA檢測，測定每孔450nm和650nm吸光值，按A450nm-A650nm計算每孔吸光值；當P/N值(Positive/Negative)大于2. 1時，該菌株為陽性單克隆噬菌體菌株；共得到25個陽性克隆。陽性克隆經(jīng)核酸序列分析后，發(fā)現(xiàn)有9株不同序列Fab克隆與人IgG-Fc重組蛋白有較強的結(jié)合活性，F(xiàn)ab重、輕鏈可變區(qū)基因序列分析應用以下兩個服務(wù)器http://imgt. cines. fr/IMGT_vquest/vquest ？ livret = 0&0ption = mouselghttp://blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi對所得1條序列與現(xiàn)有已報道的其他抗體基因進行同源性比較，并分析其胚系基因來源，結(jié)果如下hFabrl抗體的重鏈可變區(qū)基因的核苷酸序列FdATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCC TGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATAGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTG GGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATACTACGCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAG ACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGA GGGGTAGCAGCTCGCTACTGGTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACCGTCTCCCCTGCCTCCACCAA GGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCA AGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCT GTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTA CATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTA GTGGCCAGGCCGGCCAGCACCATCACCATCACCATGGCGCATACCCGTACGACGTTCCGGACTACGCTTCTTAGhFabrl抗體的重鏈可變區(qū)基因的氨基酸序列FdMAQVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNffVRQAPGKGLEffVSSISSSSSYIYYADSVKGR FTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGVAARYffYFDLffGRGTLVTVSPASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTSGQAGQHHHHHHGAYPYDVPDYAShFabrl抗體的輕鏈可變區(qū)基因的核苷酸序列LGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGC CGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTA TGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCA TCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGTAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCATTCACTTTCGGCCCT GGGACCAAAGTGGATATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAA ATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATA ACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGC ACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTT GCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGhFabrl抗體的輕鏈可變區(qū)基因的氨基酸序列L ELQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASQSISSYLNVYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFVTYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTSKADYEKHKVYACEVTHQGLSLPVTKS(3)將1株陽性克隆噬菌體感染非抑制型ToplOF，，含有重組質(zhì)粒pC0mb3X-Fab 的菌株接種IOmL的LB液體培養(yǎng)基中(含有l(wèi)OOug/mL的氨芐青霉素)，37°C搖床培養(yǎng)至 0D600nm 至 0. 9，加入終濃度為 ImM 的 IPTG，37°C誘導 4 小時。用 SDS-PAGE 和 Western-blot 鑒定。G) Fab單鏈抗體的純化緩沖液結(jié)合緩沖液20mM磷酸鈉緩沖液，0. 5M NaCl, 45mM咪唑，pH7. 4.洗脫緩沖液20mM磷酸鈉緩沖液，0. 5M NaCl,500mM咪唑，pH7. 4.樣品準備經(jīng)鑒定的高表達菌株，挑單克隆置25mL的LB液體培養(yǎng)基中(含有100ug/mL的氨芐青霉素)，250rpm, 37 °C培養(yǎng)過夜。把25mL過夜培養(yǎng)物加至500mL的LB液體培養(yǎng)基中(含有氨芐青霉素)，250rpm, 37°C培養(yǎng)2小時，加入IPTG至終濃度為1mm。再誘導表達4小時。培養(yǎng)物5，OOOg離心20分鐘，棄上清。用50mL預冷的結(jié)合緩沖液(含有ImM的蛋白酶抑制劑PMSF)重懸菌體沉淀，在冰浴條件下超聲波破碎細菌。在菌體裂解物中加入終濃度為1 %的Triton X-100,室溫輕輕攪拌30分鐘，以利于破碎包涵體。20，OOOg離心30分鐘，上清液過0. 45 μ m濾膜，備用。純化把MSO4親和層析柱安裝至蛋白質(zhì)純化儀上，用10個柱床體積的結(jié)合緩沖液沖洗酒精。用10個柱床體積的結(jié)合緩沖液平衡柱床后，上樣品，流速為ImL/分鐘。用結(jié)合緩沖液洗滌柱床至A280nm吸光度到基線，用5_10個柱床體積的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，用SDS-PAGE鑒定(圖2)。實施例3具有結(jié)合活性的全人源Fab抗體的鑒定用于實驗的肝癌！fepG2細胞系購自中國科學院上海細胞研究所細胞庫。與IMMT結(jié)合特性分析，ELISA鑒定結(jié)果顯示純化的hFabrl有明顯與IMMT結(jié)合的能力，且隨hFabrl劑量的遞減，OD值呈下降趨勢。免疫熒光檢查結(jié)果顯示hFabrl與肝癌 HepG2細胞表面的IMMT結(jié)合，結(jié)合部位為細胞膜。ELISA鑒定hFabrl與I匪T的結(jié)合能力(OD450J
權(quán)利要求
1.抗IMMT全人源Fab抗體，其特征在于輕鏈的氨基酸序列如SEQID No :1所示，重鏈的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
2.抗IMMT全人源Fab抗體，其特征在于輕鏈的核苷酸序列如SEQID No: 3所示，重鏈的核苷酸序列如SEQ ID No:4所示。
3.權(quán)利要求1或2所述的抗IMMT全人源Fab抗體在制備抗肝癌藥物中的應用。
全文摘要
抗IMMT全人源Fab抗體及其在制備抗肝癌藥物中的應用，輕鏈的氨基酸序列如SEQIDNo:1所示，重鏈的氨基酸序列如SEQIDNo:2所示；輕鏈的核苷酸序列如SEQIDNo:3所示，重鏈的核苷酸序列如SEQIDNo:4所示；體外觀察hFabr1抗肝癌效應結(jié)果表明，hFabr1能抑制HepG2細胞的增殖和侵襲，誘導HepG2細胞凋亡。動物體內(nèi)實驗表明hFabr1能明顯抑制荷瘤裸鼠體內(nèi)HepG2移植瘤的生長。全人源抗IMMT基因工程抗體的獲得不僅為原發(fā)性肝癌的預防和治療帶來了希望，也為研制能用于肝癌和其它惡性腫瘤生物治療的抗體藥物提供了新的思路和技術(shù)貯備。
文檔編號C07K16/18GK102229671SQ20111015056
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月7日
發(fā)明者任勇亞, 任政, 馮振卿, 張曉 , 李紅, 杜麗堅 申請人:南京醫(yī)科大學