專利名稱：抗原特異性t細(xì)胞受體和t細(xì)胞表位的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用于免疫治療的T細(xì)胞受體和T細(xì)胞表位的提供。
背景技術(shù)：
免疫系統(tǒng)的進(jìn)化使得脊椎動物處于基于兩種類型的防御(先天和獲得性免疫)的高效網(wǎng)絡(luò)中。
與依賴于不變受體(其識別與病原體相關(guān)的常見分子模式)的在進(jìn)化上古老的先天免疫系統(tǒng)相比，獲得性免疫基于B細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞)和T細(xì)胞(T淋巴細(xì)胞)上的高度特異性抗原受體以及克隆選擇。
B細(xì)胞通過分泌抗體引起體液免疫應(yīng)答，而T細(xì)胞介導(dǎo)導(dǎo)致所識別細(xì)胞被破壞的細(xì)胞免疫應(yīng)答。
T細(xì)胞在人和動物的細(xì)胞介導(dǎo)免疫中發(fā)揮核心作用。在T細(xì)胞表面上表達(dá)的T細(xì)胞受體(TCR)介導(dǎo)特定抗原的識別和結(jié)合。
T細(xì)胞的T細(xì)胞受體(TCR)能夠與結(jié)合于主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子并且在靶細(xì)胞表面上呈遞的免疫原性肽(表位)相互作用。TCR的特異性結(jié)合觸發(fā)T細(xì)胞內(nèi)的信號級聯(lián)，導(dǎo)致增殖和分化成成熟的效應(yīng)T細(xì)胞。為了能夠靶向大量的多種抗原，T細(xì)胞受體需要具備極大的多樣性。
通過編碼TCR不同結(jié)構(gòu)區(qū)域之基因的不同不連續(xù)區(qū)段的基因重排獲得該多樣性。TCR由一條α-鏈和一條β-鏈或者一條Y-鏈和一條δ鏈構(gòu)成。TCRa/β鏈由參與抗原識別的N端高多態(tài)性可變區(qū)和不變的恒定區(qū)構(gòu)成。在基因水平上，這些鏈被分成幾個區(qū)，可變(V)區(qū)，多樣⑶區(qū)(僅和δ-鏈)，結(jié)合(J)區(qū)和恒定(C)區(qū)。人β-鏈基因包含超過60個可變(V)，2個多樣(D)，超過10個結(jié)合(J)區(qū)段和2個恒定區(qū)區(qū)段(C)。人a -鏈基因包含超過50個V區(qū)段，以及超過60個J區(qū)段但是沒有D區(qū)段，以及一個C區(qū)段。鼠β -鏈基因包含超過30個可變(V)，2個多樣(D)，超過10個結(jié)合(J)區(qū)段和2個恒定區(qū)區(qū)段(C)。鼠a -鏈基因包含幾乎100個V區(qū)段，60個J區(qū)段，沒有D區(qū)段，但有一個C區(qū)段。在T細(xì)胞分化過程中，通過重排一個V，一個D(僅β-和3-鏈)，一個和一個(:區(qū)基因產(chǎn)生特異性T細(xì)胞受體基因。通過不精確的V-(D)-J重排進(jìn)一步擴(kuò)大TCR的多樣性，在所述重排中隨機(jī)核苷酸在重排位點被引入和/或缺失。由于TCR基因座重排發(fā)生在T細(xì)胞成熟過程中的基因組中，所以每個成熟T細(xì)胞僅表達(dá)一種特定的α/β TCR或y/STCR。
MHC和抗原結(jié)合是通過 TCR的互補(bǔ)決定區(qū)1，2和3 (CDR1，⑶R2，⑶R3)介導(dǎo)的。通過重排的TCRi1-鏈基因的V-D-J連結(jié)編碼對于抗原識別和結(jié)合最關(guān)鍵的β -鏈⑶R3。
TCR是復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)裝置的一部分，其包括TCR a -和β -鏈的異源二聚體復(fù)合物，輔助受體⑶4或0)8以及0)3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模塊(Q)3signal transduction modul)(

圖1)。⑶3鏈轉(zhuǎn)移細(xì)胞內(nèi)激活信號，而TCRa/β異源二聚體僅負(fù)責(zé)抗原識別。因此，TCRa/β鏈的轉(zhuǎn)移為T細(xì)胞向任何的目的抗原重定向提供了機(jī)會。
免疫治療
抗原特異性免疫治療旨在提高或誘導(dǎo)患者體內(nèi)的特異性免疫應(yīng)答以控制感染性或惡性疾病。越來越多的病原體和腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的鑒定產(chǎn)生了一大批用于免疫治療的合適靶標(biāo)。可通過主動或被動的免疫策略特異性靶向呈遞源自這些抗原的免疫原性肽(表位)的細(xì)胞。
主動免疫傾向于誘導(dǎo)患者的抗原特異性T細(xì)胞并使其擴(kuò)增，所述T細(xì)胞能夠特異性識別和殺死病變細(xì)胞。相反，被動免疫依賴于T細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移，其在體外被擴(kuò)增并任選地進(jìn)行遺傳改造(過繼T細(xì)胞治療)。
疫苗接種
腫瘤疫苗旨在通過主動免疫誘導(dǎo)內(nèi)源性腫瘤特異性免疫應(yīng)答?？梢杂糜谀[瘤疫苗接種的不同抗原形式包括全癌細(xì)胞、蛋白質(zhì)、肽或免疫載體(如RNA、DNA或病毒載體)，其可在體內(nèi)直接施用或在體外通過致敏DC隨后轉(zhuǎn)移入患者。
鑒于免疫策略和抗原特異性免疫應(yīng)答檢測方法的改進(jìn)，可鑒定治療誘導(dǎo)之免疫應(yīng)答的臨床研究的數(shù)目正在穩(wěn)定增長(Connerotte, T.等.(2008).Cancer Res.68,3931-3940 ；Schmitt, Μ.等.(2008)Bloodlll, 1357-1365 ；Speiser, D.E.等.(2008)Proc.Nail.Acad.Sc1.U.S.A105，3849-3854 ；Adams, S.等.(2008) J, Immunol.181,776-784)。
然而，在大多數(shù)情況下，檢測到的免疫應(yīng)答不完全與臨床結(jié)果相關(guān)(Curigliano，G.等.(2006) Ann.0ncol.17,750-762 ；Rosenberg, S.A.等.(2004) Nat.Med.10,909-915)。
因此來自腫瘤抗原的肽表位的準(zhǔn)確確定可有助于提高疫苗接種策略和免疫監(jiān)測方法的特異性和效力。
過繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移(Adoptivecell transfer, ACT)
基于ACT的免疫治療可以被廣義地定義為用先前致敏的T細(xì)胞進(jìn)行的被動免疫形式，所述T細(xì)胞從低前體頻次離體擴(kuò)增至臨床相關(guān)的細(xì)胞數(shù)后被轉(zhuǎn)移至未免疫接受者或自體宿主。已被用于ACT實驗的細(xì)胞類型是淋巴因子激活的殺傷(lymphokine-activated killer, LAK)細(xì)胞(Mule, J.J.et al.(1984)Science225,1487-1489 ；Rosenberg, S.A.et al.(1985) N.Engl.J.Med.313，1485-1492)、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor-1nfiltratinglymphocyte, TIL)(Rosenberg, S.A.et al.(1994)J.Nail.Cancer Inst.86，1159-1166)、造血干細(xì)胞移植(HSCT)后的供體淋巴細(xì)胞以及腫瘤特異性 T 細(xì)胞系或克隆(Dudley, M.E.et al.(2001) J.1mmunother.24，363-373 ；Ye ；C.etal.(2002) Proc.Nat.Acad.Sc1.U.S.A99,16168-16173)。
證明過繼T細(xì)胞轉(zhuǎn)移對人的病毒感染(如CMV)具有治療活性。雖然健康個體的免疫系統(tǒng)控制CMV感染和內(nèi)源潛伏病毒的再活化，但在免疫受損的個體(如移植接受者或AIDS患者)中導(dǎo)致顯著的發(fā)病率和死亡率。Riddell和他的同事證明在轉(zhuǎn)移來自HLA匹配的CMV血清陽性移植供體的CD8+CMV特異性T細(xì)胞克隆之后，在免疫抑制患者中通過過繼T 細(xì)胞治療重建病毒免疫(Riddell, S.R.(1992) Science257，238-241)。
作為一種替代方法，多克隆供體來源的CMV或EBV特異性T細(xì)胞類群被轉(zhuǎn)移到移植接受者，導(dǎo)致轉(zhuǎn)移T細(xì)胞的持久性的增加(Rooney, C.M.et al.(1998)Blood92,1549-1555 ；Peggs, K.S.et al.(2003)Lancet362，1375-1377)。
對于黑色素瘤的過繼 免疫治療，Rosenberg和他的同事建立了一種ACT方法，其依賴于輸注分離自切除腫瘤的體外擴(kuò)增的自體腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)與非清髓性淋巴細(xì)胞刪除性化學(xué)療法和高劑量IL-2的組合。最近發(fā)表的臨床研究的結(jié)果是治療的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者有約50%的客觀反應(yīng)率(Dudley, M.E.et al.(2005) J.Chin.0ncol.23:2346-2357)。
然而，患者必須滿足幾個前提以適于ACT免疫治療。他們必須具有可切除的腫瘤。腫瘤必須在細(xì)胞培養(yǎng)條件下生成有活力的TIL。TIL必須針對腫瘤抗原有反應(yīng)性，并且必須在體外擴(kuò)增至足夠的數(shù)量。特別是在除黑色素瘤外的其他癌癥中，難以獲得這樣的腫瘤反應(yīng)性TIL。此外，正常人T淋巴細(xì)胞的反復(fù)體外刺激和克隆擴(kuò)增導(dǎo)致端粒酶活性逐漸減少和端?？s短，從而導(dǎo)致復(fù)制性衰老和轉(zhuǎn)移T細(xì)胞持久能力的下降(Shen，X.et al.(2007)J.1mmunother.30: 123-129)。
克服ACT局限性的一種方法是自體T細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移，所述T細(xì)胞在短時間的離體培養(yǎng)中被重新編程以表達(dá)具有確定特異性的腫瘤反應(yīng)性TCR，然后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)。這種策略使ACT適用于多種常見的惡性腫瘤，即使在患者體內(nèi)缺乏腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞時也適用。由于T細(xì)胞的抗原特異性完全依靠T CR α -和β -鏈的異源二聚體復(fù)合物，克隆的TCR基因向T細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供了將它們重定向為任何目的抗原的潛力。因此，TCR基因治療提供了具有吸引力的策略以開發(fā)用自體淋巴細(xì)胞作為治療選擇的抗原特異性免疫治療。TCR基因轉(zhuǎn)移的主要優(yōu)點是在幾天之內(nèi)產(chǎn)生治療量的抗原特異性T細(xì)胞，以及可以引入在患者的所有內(nèi)源性TCR中不存在的特異性。
幾個小組證實，TCR基因轉(zhuǎn)移是重定向原發(fā)T細(xì)胞的抗原特異性的有吸引力的策略(Morgan, R.A.et al.(2003) J.Tmmunol.171,3287-3295 ；Cooper, L.J.et al.(2000)J.Virol.74,8207-8212 ；Fujio,K.et al.(2000)J.1mmunol.165,528-532 ；Kessels,H.ff.etal.(2001)Nat.Tmmunol.2,957-961 ；Dembic, Z.et al.(1986)Nature320,232-238)。
Rosenberg和他的小組最近在惡性黑色素瘤治療的臨床試驗證實了在人中進(jìn)行TCR基因治療的可行性。用黑色素瘤/黑色素細(xì)胞抗原特異性TCR進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的自體淋巴細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移導(dǎo)致在高達(dá)30%的所治療黑色素瘤患者中癌癥消退(Morgan，R.A.et al.(2006)Science314,126-129 ；Johnson, L.A.etal.(2009)Bloodll4，535-546)。
抗原特異性免疫治療的靶結(jié)構(gòu)
多個腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的發(fā)現(xiàn)為抗原特異性免疫療法的概念提供了基礎(chǔ)(Novellino,L.et al.(2005)Cancer Immunol.1mmunother.54,187-207)。由于遺傳不穩(wěn)定性，TAA是在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的不常見蛋白質(zhì)，其在正常細(xì)胞中沒有或有有限的表達(dá)。這些的TAA可以導(dǎo)致免疫系統(tǒng)特異性識別惡性細(xì)胞。
通過使用自體腫瘤特異性T細(xì)胞(vander Bruggen, P.et al.(1991) Science254,1643-1647)或循環(huán)抗體(Sabin，U.et al.(1995) Proc.Natl.Mad.Sc1.U.S.A92,11810-11813)篩選腫瘤衍生的cDNA表達(dá)文庫進(jìn)行TAA分子克隆、反向免疫學(xué)方法、生物化學(xué)方法(Hunt, D.F.et al.(1992) Science256，1817-1820)、基因表達(dá)分析或用計算機(jī)進(jìn)行的克隆策略(Heiftenbein，G.et al.(2008) Gene414，76-84)產(chǎn)生了用于免疫治療策略的顯著數(shù)量的靶候選物。TAA分為幾個類別，包括分化抗原，過表達(dá)的抗原，腫瘤特異性的剪接變體，突變基因的產(chǎn)物，病毒抗原和所謂的癌睪丸抗原(CTA)。由于其表達(dá)限于睪丸和多種不同的腫瘤實體，癌癥睪丸家族是非常有前途的TAA類別(Scanlan，M.J.etal.(2002) Tmmunol.Rev, 188, 22-32)。至今為止，已經(jīng)描述了超過 50 種 CT 基因(Scanlan,M.J.et al.(2004) Cancer Inimun.4,1)并且其中一些已在臨床研究中使用(Adams,S.et al.(2008)J.1mmunol.181, 776-784 ；Atanackovic, D.et al.(2004)J.Tmmunol.172，3289-3296 ；Chen, Q.et al.(2004) Proc.Natl.Acad.Sci , U.S.AlO I，9363-9368 ；Connerotte,T.et al.(2008).Cancer Res.68，3931-3940 ；Davis,1.D.et al.(2004)Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A101，10697-10702 ； Jager, E.(2000) Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A97，12198-12203 ；Marchand, M.et at.(1999) hit.J.Cancer80, 219-230 ；Schuler-Thurner,B.et al.(2000)J.Tmmunol.165,3492-3496)。
盡管用于免疫治療方法的有吸引力的靶結(jié)構(gòu)越來越多，但僅對于它們中的幾個存在確定HLA限制性的T細(xì)胞克隆或系(Chaux, P.et al.(1999) J.1mmunol.163，2928-2936 ；Zhang, Y.at al.(2002)Tissue Antigens60,365-371 ；Zhao, Y.et al.(2005)J.1mmunol.174，4415-4423)。對于大多數(shù)的CTA (包括TPTE)，即便連存在特異性T細(xì)胞應(yīng)答的跡象都不存在。
發(fā)明描述
發(fā)明概述
免疫治療策略是治療感染性疾病和癌癥的有前景選擇。越來越多的病原體和腫瘤相關(guān)抗原的鑒定產(chǎn)生了用于免疫治療的大量合適靶標(biāo)。
通過過繼轉(zhuǎn)移經(jīng)改造以表達(dá)確定抗原特異性T細(xì)胞受體(TCR)的T細(xì)胞，這些抗原可以被特異性靶向，從而導(dǎo)致所靶向的惡性或受感染細(xì)胞的選擇性破壞。由于TCR特異性由高度多態(tài)性的MHC分子限制，過繼TCR轉(zhuǎn)移的廣泛應(yīng)用依賴于“現(xiàn)成(off the shelf)"使用的多種TCR試劑(覆蓋寬范圍的抗原和MHC限制性)的產(chǎn)生。然而，至今為止僅鑒定了有限數(shù)量的合適TCR候選物。這主要是由于用于TCR基因分離的T細(xì)胞克隆的建立費(fèi)力。
本發(fā)明涉及用于提供抗原特異性淋巴樣細(xì)胞的有效方法。這些淋巴樣細(xì)胞可以用于提供具有確定的MHC限制性的抗原特異性T細(xì)胞受體，以及用于鑒定免疫相關(guān)T細(xì)胞表位。
一方面，本發(fā)明涉及用于提供抗原特異性淋巴樣細(xì)胞的方法，其包括以下步驟:
(a)提供來自包含T細(xì)胞之樣品的單一抗原反應(yīng)性T細(xì)胞，其中所述樣品從之前暴露于所述抗原的對象中獲得；
(b)提供編碼T細(xì)胞受體的核酸,所述T細(xì)胞受體具有所述單一抗原反應(yīng)性T細(xì)胞的T細(xì)胞受體的特異性；以及
(C)將所述核酸引入淋巴樣細(xì)胞以提供所述抗原特異性淋巴樣細(xì)胞。
在一個實施方案中，該方法還包括確 定所述抗原特異性淋巴樣細(xì)胞的表位特異性的步驟和/或確定所述抗原特異性淋巴樣細(xì)胞的MHC限制性的步驟。
另一方面，本發(fā)明涉及用于提供具有確定的MHC限制性的抗原特異性T細(xì)胞受體的方法，其包括以下步驟:
(a)提供來自包含T細(xì)胞之樣品的單一抗原反應(yīng)性T細(xì)胞，其中所述樣品從之前暴露于所述抗原的對象中獲得；
(b)提供編碼T細(xì)胞受體的核酸,所述T細(xì)胞受體具有所述單一抗原反應(yīng)性T細(xì)胞的T細(xì)胞受體的特異性；
(C)將所述核酸引入淋巴樣細(xì)胞以提供抗原特異性淋巴樣細(xì)胞；以及
(d)確定所述抗原特異性淋巴樣細(xì)胞的MHC限制性。
在一個實施方案中，該方法還包括確定所述抗原特異性淋巴樣細(xì)胞的表位特異性的步驟。
另一方面，本發(fā)明涉及用于鑒定抗原中的T細(xì)胞表位的方法，其包括以下步驟:
(a)提供來自包含T細(xì)胞之樣品的單一抗原反應(yīng)性T細(xì)胞，其中所述樣品從之前暴露于所述抗原的對象中獲得；
(b)提供編碼T細(xì)胞受體的核酸,所述T細(xì)胞受體具有所述單一抗原反應(yīng)性T細(xì)胞的T細(xì)胞受體的特異性；
(c)將所述核酸引入淋巴樣細(xì)胞以提供抗原特異性淋巴樣細(xì)胞；以及
(d)確定所述抗原特異性淋巴樣細(xì)胞的表位特異性。
在一個實施方案中，該方法還包括確定所述抗原特異性淋巴樣細(xì)胞的MHC限制性的步驟。
在一個優(yōu)選的實施方案中，所述單一抗原反應(yīng)性T細(xì)胞和所述編碼T細(xì)胞受體(其具有所述單一抗原反應(yīng)性T細(xì)胞的T細(xì)胞受體的特異性)的核酸對施用給對象的抗原有反應(yīng)性。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述單一抗原反應(yīng)性T細(xì)胞通過分離提供。
在根據(jù)上述所有方面的方法的一個實施方案中，所述表位是MHC呈遞的肽。在根據(jù)上述所有方面的方法的一個實施方案中，所述確定所述抗原特異性淋巴樣細(xì)胞的表位特異性的步驟包括:確定所述抗·原特異性淋巴樣細(xì)胞對MHC分子的反應(yīng)性，所述MHC分子暴露于(優(yōu)選致敏(pulse)，即裝載)來自所述抗原的肽。優(yōu)選地，所述MHC分子是在對象中表達(dá)的MHC分子。優(yōu)選地，所述MHC分子存在于靶細(xì)胞上。所述肽可以是源于所述抗原的肽文庫的一部分，并且肽文庫可以包含來自所述抗原的一組重疊肽。優(yōu)選地，所述重疊肽的組覆蓋該抗原的完整序列。
在根據(jù)上述所有方面的方法的一個實施方案中，確定所述抗原特異性淋巴細(xì)胞的MHC限制性的步驟包括:確定所述抗原特異性淋巴樣細(xì)胞對選定MHC分子的反應(yīng)性。優(yōu)選地，所述選定MHC分子存在于靶細(xì)胞上。優(yōu)選地，所述選定MHC分子是在對象中表達(dá)的MHC分子。優(yōu)選地，所述選定MHC分子存在于表達(dá)所述抗原或其一部分的靶細(xì)胞上。優(yōu)選地，所述抗原特異性淋巴樣細(xì)胞或其T細(xì)胞受體受在對象中表達(dá)的MHC分子的限制。
優(yōu)選地，確定抗原特異性淋巴樣細(xì)胞的反應(yīng)性包括確定淋巴樣細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌，其中所述細(xì)胞因子可以是干擾素-Y (IFNY)?？梢允褂玫牧硪恍┗罨瘶?biāo)志物是例如CD 154 和 / 或 CD137。
在根據(jù)上述所有方面的方法的一個特別優(yōu)選實施方案中，所述編碼T細(xì)胞受體(其具有所述單一抗原反應(yīng)性T細(xì)胞的T細(xì)胞受體的特異性)的核酸是RNA (優(yōu)選體外轉(zhuǎn)錄的RNA)。優(yōu)選地，所述淋巴樣細(xì)胞缺乏內(nèi)源性TCR的表面表達(dá)或者對不相關(guān)抗原特異。在一個實施方案中，淋巴樣細(xì)胞是淋巴細(xì)胞，優(yōu)選T細(xì)胞。
在根據(jù)上述所有方面的方法的一個實施方案中，所述提供編碼T細(xì)胞受體(其具有所述單一抗原反應(yīng)性T細(xì)胞的T細(xì)胞受體的特異性)的核酸的步驟包括提供編碼這樣的T細(xì)胞受體的核酸,其包含所述單一抗原反應(yīng)性T細(xì)胞的T細(xì)胞受體的至少CDR序列、優(yōu)選至少可變區(qū)。
在根據(jù)上述所有方面的方法的一個實施方案中，所述提供編碼T細(xì)胞受體(其具有所述單一抗原反應(yīng)性T細(xì)胞的T細(xì)胞受體的特異性)的核酸的步驟包括從所述單一抗原反應(yīng)性T細(xì)胞或其克隆群中分離RNA (優(yōu)選多聚A+-RNA)，并且優(yōu)選還包括從所述RNA獲得CDNA0在一個實施方案中，所述提供編碼T細(xì)胞受體(其具有所述單一抗原反應(yīng)性T細(xì)胞的T細(xì)胞受體的特異性)的核酸的步驟還包括擴(kuò)增cDNA的至少一部分，所述部分包含編碼至少CDR序列(優(yōu)選至少所述單一抗原反應(yīng)性T細(xì)胞的T細(xì)胞受體的可變區(qū))的核酸序列。
在根據(jù)上述所有方面的方法的一個實施方案中，所述對象對所述抗原或包含所述抗原的物質(zhì)(agent)呈血清學(xué)陽性。對象的血清學(xué)陽性可通過測定對抗原或物質(zhì)或其組分的免疫應(yīng)答來確定。
在根據(jù)上述所有方面的方法的一個實施方案中，在提供單一抗原反應(yīng)性T細(xì)胞之前對所述T細(xì)胞進(jìn)行抗原特異性擴(kuò)增和再攻擊(rechallenge)，其中抗原特異性擴(kuò)增和再攻擊可以通過將T細(xì)胞暴露于優(yōu)選呈遞抗原之自體抗原呈遞細(xì)胞來實現(xiàn)。在根據(jù)上述所有方面的方法的一個實施方案中，所述單一抗原反應(yīng)性T細(xì)胞為活化標(biāo)志物(如IFNy或CD137 和 CD8 或 CD4)陽性。
在根據(jù)上述所有方面的方法的一個實施方案中，所述單一抗原反應(yīng)性T細(xì)胞使用流式細(xì)胞術(shù)從包含T細(xì)胞的樣品中分離。分選優(yōu)選根據(jù)對于活化標(biāo)志物(尤其IFN Y或⑶137，和⑶8或⑶4)呈陽性而進(jìn)行。
在根據(jù)上述所有方面的方法的一個實施方案中，所述T細(xì)胞受體包含T細(xì)胞受體α -和β -鏈。
在根據(jù)上述所有方面的方法的一個實施方案中，所述編碼T細(xì)胞受體(其具有所述單一抗原反應(yīng)性T細(xì)胞的T細(xì)胞受體的特異性)的核酸包含編碼至少⑶R序列(優(yōu)選至少所述單一抗原反應(yīng)性T細(xì)胞 的T細(xì)胞受體的可變區(qū))的核酸序列。
在根據(jù)上述所有方面的方法的一個實施方案中，所述對象是哺乳動物，優(yōu)選人。優(yōu)選地，所述對象具有涉及表達(dá)抗原的細(xì)胞的疾病，優(yōu)選T細(xì)胞相關(guān)疾病。所述疾病可以選自免疫系統(tǒng)疾病、感染和惡性疾病。
此外，本發(fā)明涉及對病毒抗原CMV-pp65或腫瘤相關(guān)抗原NY_ES0_1、TPTE或PLACl (尤其是在呈遞于細(xì)胞如病變細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞表面上時)特異的T細(xì)胞受體，以及包含被這些T細(xì)胞受體識別的表位的肽。
一方面，本發(fā)明涉及包含以下氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列選自SEQ ID NO:108至139，172，173，175，178至187和196或者所述氨基酸序列的變體。
在一個實施方案中，所述肽是MHC I類或II類呈遞肽，優(yōu)選MHC I類呈遞肽，或者，如果存在于細(xì)胞內(nèi)，所述肽可以被加工產(chǎn)生其加工產(chǎn)物，所述加工產(chǎn)物是MHC I類或II類呈遞肽，優(yōu)選MHC I類呈遞肽。優(yōu)選地，所述MHC I類或II類呈遞肽具有基本上對應(yīng)于給定氨基酸序列(即選自SEQ ID NO:108至139，172，173，175，178至187和196或者所述氨基酸序列變體的氨基酸序列)的序列。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的肽能夠刺激針對這樣的疾病的細(xì)胞應(yīng)答，所述疾病涉及特征為呈遞肽所源自的抗原(即具有MHC I類的CMV-pp65、NY-ES0-1、TPTE 或 PLACI)的細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明肽的核酸以及包含該核酸的細(xì)胞。該核酸可以存在于質(zhì)?；虮磉_(dá)載體中并且可以與啟動子功能性連接。優(yōu)選地，所述細(xì)胞表達(dá)所述肽。所述細(xì)胞可以是重組細(xì)胞并且可分泌編碼的肽或其加工產(chǎn)物，可在表面表達(dá)它并且優(yōu)選地可以額外表達(dá)MHC分子，該MHC分子結(jié)合所述肽或其加工產(chǎn)物并且優(yōu)選地在細(xì)胞表面上呈遞所述肽或其加工產(chǎn)物。在一個實施方案中，所述細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)MHC分子。在另一個實施方案中，所述細(xì)胞以重組方式表達(dá)MHC分子和/或所述肽。所述細(xì)胞優(yōu)選是非增殖性的。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述細(xì)胞是抗原呈遞細(xì)胞，尤其是樹突細(xì)胞，單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明涉及呈遞本發(fā)明肽或其加工產(chǎn)物的細(xì)胞，其中該加工產(chǎn)物優(yōu)選是具有給定氨基酸序列(即選自SEQ ID NO:108至139，172，173，175，178至187和196或者所述氨基酸序列變體的氨基酸序列)的肽。該細(xì)胞可通過其表面的MHC分子呈遞所述肽或其加工產(chǎn)物。在一個實施方案中，所述細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)MHC分子。在另一個實施方案中，所述細(xì)胞重組表達(dá)MHC分子。在一個實施方案中，通過向細(xì)胞添加肽使細(xì)胞的MHC分子加載(致敏)所述肽。所述細(xì)胞可以重組表達(dá)所述肽并且在細(xì)胞表面呈遞所述肽或其加工產(chǎn)物。所述細(xì)胞優(yōu)選是非增殖性的。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述細(xì)胞是抗原呈遞細(xì)胞，例如樹突細(xì)胞，單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明涉及對本發(fā)明的肽有反應(yīng)性的免疫反應(yīng)性細(xì)胞，尤其是當(dāng)所述肽在細(xì)胞表面上呈遞時。所述免疫反應(yīng)性細(xì)胞可以是已在體外致敏以識別所述肽的細(xì)胞。所述免疫反應(yīng)性細(xì)胞可以是T細(xì)胞，優(yōu)選細(xì)胞毒性T細(xì)胞。優(yōu)選地，所述免疫反應(yīng)性細(xì)胞結(jié)合基本對應(yīng)于給定氨基酸序列(即選自SEQ ID NO:108至139，172，173，175，178至187和196或者所述氨基酸序列的變體的氨基酸序列)的肽中的序列。
另一方面，本發(fā)明涉及對本發(fā)明的肽或其多肽鏈有反應(yīng)性的T細(xì)胞受體。
另一方面,本發(fā)明涉及T細(xì)胞受體α -鏈或包含所述T細(xì)胞受體α-鏈的T細(xì)胞受體，所述 T 細(xì)胞受體 α -鏈包含選自 SEQ ID NO:4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88， 90，92，94，96，98，100，102，104，106，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，164，166，168，170，176，188，190，192 和 194 或其變體的 T 細(xì)胞受體α -鏈的至少一個、優(yōu)選兩個、更優(yōu)選全部三個⑶R序列。⑶R序列在本文給出的上述T細(xì)胞受體α-鏈序列中用下劃線顯示。
另一方面,本發(fā)明涉及T細(xì)胞受體α -鏈或包含所述T細(xì)胞受體α-鏈的T細(xì)胞受體，其中所述T細(xì)胞受體α -鏈序列選自SEQ ID NO:4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，164，166，168，170，176，188，190，192 和 194 或其變體。
另一方面，本發(fā)明涉及T細(xì)胞受體β -鏈或包含所述T細(xì)胞受體β -鏈的T細(xì)胞受體，所述 T 細(xì)胞受體 β-鏈包含選自 SEQ ID NO:5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79,81,83,85,87,89,91,93,95,97,99,101，103，105，107，141，143，145，147，149，151，153，155，157，159，161，163，165，167，169，171，177，189，191，193，和 195 或其變體的 T 細(xì)胞受體β -鏈的至少一個、優(yōu)選兩個、更優(yōu)選全部三個⑶R序列。⑶R序列在本文給出的上述T細(xì)胞受體鏈序列中用下劃線顯示。
另一方面，本發(fā)明涉及T細(xì)胞受體β -鏈或包含所述T細(xì)胞受體β -鏈的T細(xì)胞受體，所述 T 細(xì)胞受體 3 -鏈序列選自 SEQ ID NO:5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79,81,83,85,87,89,91,93,95,97,99,101，103，105，107，141，143，145，147，149，151，153，155，157，159，161，163，165，167，169，171，177，189，191，193 和 195 或其變體。另一方面，本發(fā)明涉及T細(xì)胞受體，其包含:⑴T細(xì)胞受體a -鏈，其包含SEQ ID NO:x或其變體的T細(xì)胞受體a -鏈的至少一個、優(yōu)選兩個、更優(yōu)選全部三個⑶R序列，和(ii) T細(xì)胞受體￠-鏈，其包含SEQ ID NO:X+1或其變體的T細(xì)胞受體￠-鏈的至少一個、優(yōu)選兩個、更優(yōu)選全部三個⑶R序列；其中X選自4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，3040，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，164，166，168，170，176，188，190，192 和 194。另一方面，本發(fā)明涉及T細(xì)胞受體，其包含:⑴T細(xì)胞受體a -鏈，其包含SEQ ID NO:x或其變體的T細(xì)胞受體a -鏈序列，以及(ii)T細(xì)胞受體@ -鏈，其包含SEQ ID NO:X+1或其變體的T細(xì)胞受體@ -鏈序列；其中X 選自 4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94,96,98,100，102，104，106，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，164，166，168，170，176，188，190，192 和 194。上述T細(xì)胞受體優(yōu)選對病毒抗原CMV-pp65或腫瘤相關(guān)抗原NY_ES0_1、TPTE或PLACl (尤其當(dāng)它們呈遞于細(xì)胞(如病變細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞)表面時)具有特異性。另一方面，本發(fā)明涉及編碼根據(jù)上述任一方面的T細(xì)胞受體鏈或T細(xì)胞受體的核酸。另一方面,本發(fā)明涉及包含根據(jù)上述任一方面的T細(xì)胞受體鏈或T細(xì)胞受體或者編碼根據(jù)上述任一方面之T細(xì)胞受體鏈或T細(xì)胞受體的核酸的細(xì)胞。所述細(xì)胞可以是效應(yīng)細(xì)胞或干細(xì)胞，優(yōu)選是免疫反應(yīng)性細(xì)胞。所述免疫反應(yīng)性細(xì)胞可以是T細(xì)胞，優(yōu)選是細(xì)胞毒性T細(xì)胞。優(yōu)選地，所述免疫反應(yīng)性細(xì)胞與病毒抗原CMV-pp65或腫瘤相關(guān)抗原NY-ES0-1、TPTE或PLACl (尤其是當(dāng)它們呈遞在細(xì)胞(如病變細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞)表面上存在時)有反應(yīng)性，特別是對本發(fā)明的肽有反應(yīng)性并且優(yōu)選與基本上對應(yīng)于給定氨基酸序列(即選自SEQ ID NO:108至139，172，173，175，178至187和196的氨基酸序列或者所述氨基酸序列的變體)的肽中的序列結(jié)合。另外，本發(fā)明一般地包括通過靶向病變細(xì)胞治療疾病。所述方法提供了對呈遞抗原(即病毒抗原CMV-pp65或腫瘤相關(guān)抗原NY-ES0-1、TPTE或PLAC1)的細(xì)胞的選擇性消除，從而將對不呈遞所述抗原的正常細(xì)胞的不良影響降到最低。因此，治療的優(yōu)選疾病是表達(dá)和呈遞本文所述抗原之一的疾病，例如病毒感染性疾病或惡性疾病，特別是病毒疾病和癌癥疾病，例如在本文中描述的 那些。一方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含以下一種或更多種:
(i)上述的肽；(ii)上述編碼肽的核酸或編碼T細(xì)胞受體鏈或T細(xì)胞受體的核酸；(iii)上述包含編碼肽的核酸的細(xì)胞,上述呈遞肽或其加工產(chǎn)物的細(xì)胞,或者上述包含T細(xì)胞受體鏈或T細(xì)胞受體或核酸的細(xì)胞；(iv)上述T細(xì)胞受體；或者(V)上述免疫反應(yīng)性細(xì)胞。本發(fā)明的藥物組合物可以包含可藥用載體并且可任選地包含一種或更多種佐劑，穩(wěn)定劑等。該藥物組合物可以為治療或預(yù)防性疫苗的形式。在一個實施方案中，所述藥物組合物用于治療或預(yù)防本文所述的病毒疾病(如hCMV感染)或惡性疾病。施用上述藥物組合物可提供MHC 11類呈遞表位，其能夠引發(fā)針對本文所述抗原的CD4+輔助T細(xì)胞應(yīng)答和/或CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。作為替代的或另外的，施用如上所述的藥物組合物可提供MHC I類呈遞表位，其能夠引發(fā)針對本文所述的腫瘤抗原的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。在一個實施方案中，相關(guān)的抗原是hCMV_pp65，并且本發(fā)明的藥物組合物可用于治療和/或預(yù)防hCMV感染。在一個實施方案中，相關(guān)的抗原是NY-ES0-1、TPTE或PLAC1，并且本發(fā)明的藥物組合物可用于治療和/或預(yù)防惡性疾病。另一方面 涉及在對象中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，其包括向所述對象施用本發(fā)明的藥物組合物。另一方面涉及用于刺激，引發(fā)(priming)和/或擴(kuò)增T細(xì)胞的方法，其包括將T細(xì)胞與以下的一種或更多種接觸⑴上述肽；(ii)上述編碼肽的核酸；以及(iii)上述包含編碼肽的核酸的細(xì)胞或者上述呈遞肽或其加工產(chǎn)物的細(xì)胞。在這方面，本發(fā)明可涉及用于制備抗原特異性T細(xì)胞的方法。所述T細(xì)胞可以在體外或體內(nèi)被刺激，引發(fā)和/或擴(kuò)增。優(yōu)選地，所述T細(xì)胞存在于從對象獲得的樣品中。被刺激，引發(fā)和/或擴(kuò)增的T細(xì)胞可以向?qū)ο笫┯貌⑶覍τ趯ο罂梢允亲泽w(autologous)、異體(allogeneic)、同基因(syngeneic)的。用于在對象中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法或者用于刺激，引發(fā)和/或擴(kuò)增T細(xì)胞的方法的本發(fā)明上述方面可以涉及用于治療對象的hCMV感染或惡性疾病的方法。在一個實施方案中，相關(guān)抗原是hCMV_pp65并且所述治療是對hCMV感染的治療或預(yù)防性治療。在一個實施方案中，相關(guān)抗原是NY-ES0-1、TPTE或PLACl并且所述治療是對惡性疾病的治療或預(yù)防性治療。在治療惡性疾病的情況下，本文所述的物質(zhì)(agent)和組合物優(yōu)選這樣的方式施用，其使得治療活性物質(zhì)不或基本上不被遞送到這樣的組織或器官，其中的細(xì)胞在所述組織或器官(尤其是睪丸組織)沒有惡性疾病時表達(dá)本文所述的腫瘤相關(guān)抗原。為此,本文所描述的物質(zhì)和組合物可以局部施用。本文所述的組合物和物質(zhì)優(yōu)選能夠誘導(dǎo)或促進(jìn)針對以下疾病的細(xì)胞應(yīng)答(優(yōu)選細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性)，所述疾病的特征為以MHC I類呈遞本文所述的抗原，例如病毒性疾病或惡性疾病。
一方面，本發(fā)明提供了用于本文所述治療方法的本文所述的物質(zhì)和組合物。本文所述的惡性疾病的治療可與手術(shù)切除和/或放射和/或傳統(tǒng)的化學(xué)治療相聯(lián)
八
口 ο另一方面，本發(fā)明涉及確定對象中免疫應(yīng)答的方法，其包括在從所述對象分離的生物樣品中測定T細(xì)胞與上述肽或者上述呈遞肽或加工產(chǎn)物之細(xì)胞的反應(yīng)性。所述方法可包括以下步驟:(a)用以下的一種或更多種孵育包含分離自對象之T細(xì)胞的樣品:⑴上述肽；(ii)上述編碼肽的核酸；以及(iii)上述包含編碼肽的核酸的細(xì)胞或上述呈遞肽或加工產(chǎn)物的細(xì)胞；以及(b)檢測所述T細(xì)胞的特異性活化，由此確定所述對象中免疫應(yīng)答的存在或不存在。用于確定對象中免疫應(yīng)答的方法的本發(fā)明上述方面可以涉及用于在對象中診斷hCMV感染或惡性疾病的方法。在一個實施方案中，相關(guān)抗原是hCMV_pp65并且診斷是對hCMV感染的診斷。在一個實施方案中，相關(guān)抗原是NY-ES0-1、TPTE或PLACl并且診斷是對惡性疾病的診斷。在所述診斷方法的一個實施方案中，所述生物樣品來自這樣的組織或器官，其中的細(xì)胞在組織或器官沒有疾病時基本上不表達(dá)所述相關(guān)抗原。通常，將生物樣品中的T細(xì)胞水平與參照水平進(jìn)行比較，其中與所述參照水平的偏離指示對象中疾病的存在和/或階段。所述參照水平可以是在對照樣品(例如，來自正常的組織或?qū)ο?中確定的水平或者可以是來自正常對象的中值水平。與所述參照水平的“偏離”表示任何顯著的變化，例如增加至少10 %，20 %或30 %，優(yōu)選至少40 %或50 %，或者甚至更高。優(yōu)選地，所述生物樣品中T細(xì)胞的存在或與參照水平相比所述生物樣品中T細(xì)胞的量升高指示疾病的存在。T細(xì)胞可以從患者的外周血，淋巴結(jié)，組織樣品(如來自活檢和切除)或其他來源中分離。反應(yīng)性測定可在原代T細(xì)胞或其他適當(dāng)?shù)难苌锷线M(jìn)行。例如，可以融合T細(xì)胞以產(chǎn)生雜交瘤。用于測量T細(xì)胞應(yīng)答性的測定在本領(lǐng)域中是已知的，并且包括增殖測定和細(xì)胞因子釋放測定。用于檢測反應(yīng)性T細(xì)胞的測定和指標(biāo)包括但不限于使用IFN Y ELISP0T和IFNy細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色。用于確定T細(xì)胞克隆是否應(yīng)答于特定肽的多種其他方法在本領(lǐng)域中是已知的。通常，將肽添加到T細(xì)胞懸液中一到三天的時間?？梢酝ㄟ^增殖(例如經(jīng)標(biāo)記胸苷的攝取)來衡量T細(xì)胞的應(yīng)答，或通過細(xì)胞因子的釋放，例如IL-2?？色@得檢測所釋放細(xì)胞因子的存在的多種測定。T細(xì)胞 細(xì)胞毒性測定可用于檢測具有抗原特異性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。在一個實施方案中，測試細(xì)胞毒性T細(xì)胞殺傷用MHC I類分子呈遞抗原之靶細(xì)胞的能力?？梢詷?biāo)記呈遞抗原的靶細(xì)胞，并將其加入到來自患者樣品的T細(xì)胞懸液中?？梢酝ㄟ^對從裂解細(xì)胞釋放的標(biāo)記物進(jìn)行定量來測量細(xì)胞毒性。在該測定中可包括對自發(fā)釋放和總釋放的對照。另一方面，本發(fā)明提供了非放射性測定以監(jiān)測和量化殺傷靶細(xì)胞的活性(例如通過細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)介導(dǎo))。該測定可以提供對細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞活性的測量，并可以可靠地檢測靶細(xì)胞的抗原特異性CTL殺傷。該測定為最常用于量化CTL應(yīng)答的標(biāo)準(zhǔn)51Cr-釋放測定提供了更安全的替代方式。該測定可用于研究不同細(xì)胞品系的原代宿主靶細(xì)胞的CTL介導(dǎo)殺傷，并為新疫苗和免疫療法的開發(fā)提供有價值的工具。本發(fā)明涉及用于測定細(xì)胞毒活性的方法，其包括如下步驟:(i)提供包含產(chǎn)生報告酶之靶細(xì)胞的樣品；(ii)使所述靶細(xì)胞經(jīng)受待測定其細(xì)胞毒活性的物質(zhì)；以及(iii)對所述樣品進(jìn)行檢測測定以建立所述樣品的有活力細(xì)胞中包含的報告酶水平。 優(yōu)選地，所述細(xì)胞毒活性是細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性，并且待測定其細(xì)胞毒活性的物質(zhì)是細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞，例如選自細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，自然殺傷(NK)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的細(xì)胞，優(yōu)選細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。在一個實施方案中，所述報告酶是ATP依賴的。在一個實施方案中，所述報告酶是發(fā)光酶，如產(chǎn)生光的酶。優(yōu)選地，所述報告酶是螢光素酶。在一個實施方案中，編碼所述報告酶的RNA被引入所述靶細(xì)胞。所述方法還可以包括這樣的步驟:向樣品中添加ATP降解酶(如ATP酶)以基本上降解樣品中的任何細(xì)胞外ATP。該方法還可以包括添加至少可部分滲透有活力細(xì)胞的底物的步驟。所述底物可以是發(fā)光分子并且可以是螢光素衍生物。在這個實施方案中，該方法可以包括檢測樣品的發(fā)光，由此檢測樣品中有活力細(xì)胞的數(shù)目或存在。本發(fā)明的另一些特征和優(yōu)點通過下面的詳細(xì)描述和權(quán)利要求將顯而易見。發(fā)明詳述雖然在下面詳細(xì)描述本發(fā)明，但是應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明并不限于本文所描述的特定方法，方案和物質(zhì)，因為它們可會有所變化。還應(yīng)當(dāng)理解的是，本文使用的術(shù)語僅以描述特定實施方案為目的，并不是為了限制本發(fā)明的范圍，其僅由所附權(quán)利要求限制。除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的相同的含義。在下文中，將描述本發(fā)明的要素。這些要素是通過特定的實施方案列出的，然而應(yīng)當(dāng)理解的是它們可以以任何方式和任何數(shù)目組合以創(chuàng)建另外的實施方案。不同描述的實施例和優(yōu)選的實施方案不應(yīng)該被解釋為僅將本發(fā)明限制到明確描述的實施方案。此描述應(yīng)被理解為支持和包括結(jié)合了具有任何數(shù)量公開和/或優(yōu)選元素的明確描述的實施方式的實施方案。此外，除非文中另有說明，否則應(yīng)當(dāng)認(rèn)為任何在本申請中所有描述的元素的排列和組合是本申請說明書所披露的。優(yōu)選地，本文使用的術(shù)語如A multilingual glossary of biotechnologicalterms: (IUPAC Recommendations) ,H.G.ff.Leuenberger,B.Nagel,
權(quán)利要求
1.用于提供抗原特異性淋巴樣細(xì)胞的方法，其包括以下步驟: (a)提供來自包含T細(xì)胞之樣品的單一抗原反應(yīng)性T細(xì)胞，其中所述樣品從之前暴露于所述抗原的對象中獲得； (b)提供編碼T細(xì)胞受體的核酸,所述T細(xì)胞受體具有所述單一抗原反應(yīng)性T細(xì)胞的T細(xì)胞受體的特異性；以及 (c)將所述核酸引入淋巴樣細(xì)胞中以提供所述抗原特異性淋巴樣細(xì)胞。
2.用于提供具有確定的MHC限制性的抗原特異性T細(xì)胞受體的方法，其包括以下步驟: (a)提供來自包含T細(xì)胞之樣品的單一抗原反應(yīng)性T細(xì)胞，其中所述樣品從之前暴露于所述抗原的對象中獲得； (b)提供編碼T細(xì)胞受體的核酸,所述T細(xì)胞受體具有所述單一抗原反應(yīng)性T細(xì)胞的T細(xì)胞受體的特異性； (C)將所述核酸引入淋巴樣細(xì)胞中以提供抗原特異性淋巴樣細(xì)胞；以及 (d)確定所述抗原特異性淋巴樣細(xì)胞的MHC限制性。
3.用于鑒定抗原中的T細(xì)胞表位的方法，其包括以下步驟: (a)提供來自包含T細(xì)胞之樣品的單一抗原反應(yīng)性T細(xì)胞，其中所述樣品從之前暴露于所述抗原的對象中獲得； (b)提供編碼T細(xì)胞受體的核酸,所述T細(xì)胞受體具有所述單一抗原反應(yīng)性T細(xì)胞的T細(xì)胞受體的特異性； (C)將所述核酸引入淋巴樣細(xì)胞以提供抗原特異性淋巴樣細(xì)胞；以及 (d)確定所述抗原特異性淋巴樣細(xì)胞的表位特異性。
4.權(quán)利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述核酸是RNA。
5.權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述提供編碼具有所述單一抗原反應(yīng)性T細(xì)胞之T細(xì)胞受體的特異性的T細(xì)胞受體的核酸的步驟包括提供編碼這樣的T細(xì)胞受體的核酸，其包含所述單一抗原反應(yīng)性T細(xì)胞的T細(xì)胞受體的至少CDR序列，優(yōu)選至少可變區(qū)。
6.權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其中所述對象對所述抗原或包含所述抗原的物質(zhì)為血清陽性。
7.權(quán)利要求1至6中任一項所述的方法，其中所述單一抗原反應(yīng)性T細(xì)胞使用流式細(xì)胞術(shù)從包含T細(xì)胞的樣品中分離。
8.肽，其包含選自SEQID NO:108至139、172、173、175、178至187和196的氨基酸序列或所述氨基酸序列的變體。
9.編碼權(quán)利要求8所述肽的核酸或者包含所述核酸的細(xì)胞。
10.呈遞權(quán)利要求8所述肽或其加工產(chǎn)物的細(xì)胞。
11.對權(quán)利要求8所述肽有反應(yīng)性的免疫反應(yīng)性細(xì)胞或T細(xì)胞受體,或者所述T細(xì)胞受體的多肽鏈。
12.T細(xì)胞受體α -鏈或包含所述T細(xì)胞受體α -鏈的T細(xì)胞受體,其中所述T細(xì)胞受體α-鏈選自:(i)包含選自 SE Q ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、.40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、.90、92、94、96、98、100、102、104、106、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、.162、164、166、168、170、176、188、190、192和194或其變體的T細(xì)胞受體α -鏈的至少一個、優(yōu)選兩個、更優(yōu)選全部三個CDR序列的T細(xì)胞受體α -鏈，和(ii)包含選自 SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、.40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、.90、92、94、96、98、100、102、104、106、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、.162、164、166、168、170、176、188、190、192和194或其變體的T細(xì)胞受體α-鏈序列的T細(xì)胞受體α -鏈。
13.T細(xì)胞受體β -鏈或包含所述T細(xì)胞受體β -鏈的T細(xì)胞受體,其中所述T細(xì)胞受體β-鏈選自:(i)包含選自SEQ ID NO:5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、.41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、.91、93、95、97、99、101、103、105、107、141、143、1455、147、149、151、153、155、157、159、161、.163、165、167、169、171、177、189、191、193和195或其變體的T細(xì)胞受體β-鏈的至少一個、優(yōu)選兩個、更優(yōu)選全部三個CDR序列的T細(xì)胞受體β -鏈，和(ii)包含選自SEQ ID NO:5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、.41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、.91、93、95、97、99、101、103、105、107、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、.163、165、167、169、171、177、189、191、193和195或其變體的T細(xì)胞受體β -鏈序列的T細(xì)胞受體鏈。
14.T細(xì)胞受體，其選自: (I)包含以下的T細(xì)胞受體: (i)包含SEQID NO:x或其變體的T細(xì)胞受體α -鏈的至少一個、優(yōu)選兩個、更優(yōu)選全部三個⑶R序列的T細(xì)胞受體α-鏈，和 (ii)包含SEQID NO:X+1或其變體的T細(xì)胞受體β -鏈的至少一個、優(yōu)選兩個、更優(yōu)選全部三個⑶R序列的T細(xì)胞受體β-鏈；其中 X 選自 4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、.48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、.98、100、102、104、106、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、.168、170、176、188、190、192 和 194， 以及 (II)包含以下的T細(xì)胞 受體: (i)包含SEQID NO:x或其變體的T細(xì)胞受體α -鏈序列的T細(xì)胞受體α -鏈，和 (ii)包含SEQID NO:X+1或其變體的T細(xì)胞受體β -鏈序列的T細(xì)胞受體β -鏈； 其中 X 選自 4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、.48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、.98、100、102、104、106、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、.168、170、176、188、190、192 和 194。
15.編碼權(quán)利要求11至14中任一項所述T細(xì)胞受體鏈或T細(xì)胞受體的核酸,或者包含權(quán)利要求11至14中任一項所述T細(xì)胞受體鏈或T細(xì)胞受體或所述核酸的細(xì)胞。
16.藥物組合物，其包含以下的一種或更多種: (i)權(quán)利要求8所述的肽； (ii)權(quán)利要求9或15所述的核酸； (iii)權(quán)利要求9、10和15中任一項所述的細(xì)胞； (iv)權(quán)利要求11所述的免疫反應(yīng)性細(xì)胞；以及 (V)權(quán)利要求11至14中任一項所述的T細(xì)胞受體。
17.在對象中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，其包括向所述對象施用權(quán)利要求16的藥物組合物。
18.刺激、引發(fā)和/或擴(kuò)增T細(xì)胞的方法，其包括將T細(xì)胞與以下的一種或更多種接觸: (i)權(quán)利要求8所述的肽； (ii)權(quán)利要求9所述的核酸；和 (iii)權(quán)利要求9或10所述的細(xì)胞。
19.測定對象中的免疫應(yīng)答的方法，其包括測定從所述對象分離的生物樣品中與權(quán)利要求8所述肽或權(quán)利要求10所述細(xì)胞有反應(yīng)性的T細(xì)胞。
20.測定細(xì)胞毒活性的方法，其包括以下步驟: (i)提供包含產(chǎn)生報告酶之靶細(xì)胞的樣品； (ii)使所述靶細(xì)胞接觸待測定 其細(xì)胞毒活性的物質(zhì)；以及 ii)對所述樣品進(jìn)行檢測測定以建立所述樣品的有活力細(xì)胞中包含的報告酶水平。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于提供抗原特異性淋巴樣細(xì)胞的有效方法。這些淋巴樣細(xì)胞可以用于提供具有確定的MHC限制性的抗原特異性T細(xì)胞受體和用于鑒定免疫相關(guān)T細(xì)胞表位。此外，本發(fā)明涉及抗原特異性T細(xì)胞受體和T細(xì)胞表位以及它們在免疫治療中的用途。
文檔編號C07K14/045GK103249430SQ201180045314
公開日2013年8月14日 申請日期2011年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月20日
發(fā)明者烏爾·沙欣, 厄茲萊姆·圖雷奇, 彼得拉·西蒙, 塔納·歐莫科科 申請人:生物技術(shù)公司, 約翰·古騰堡大學(xué)美因茲醫(yī)學(xué)大學(xué), 約翰·古騰堡大學(xué)美因茲醫(yī)學(xué)大學(xué)轉(zhuǎn)化腫瘤學(xué)公司