專利名稱：一組特異識別伏馬菌素b1的寡核苷酸適配子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一組特異識別伏馬菌素BI的寡核苷酸適配子及其制備方法，特別涉及到利用分子生物學(xué)技術(shù)中的SELEX技術(shù)(指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(shù))·制備一組特異結(jié)合伏馬菌素BI的寡核苷酸適配子，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
·伏馬菌素(Fumonisins)是串珠鐮刀菌在一定濕度和溫度條件下繁殖所產(chǎn)生的水溶性次級代謝產(chǎn)物，在全世界范圍內(nèi)分布廣泛，主要污染糧食作物及飼料尤其對玉米及其制品污染嚴重，還可存在于以谷物為原料的一些產(chǎn)品中，如面條、啤酒、調(diào)味品等。伏馬菌素的熱穩(wěn)定性高，不易被破壞，對人畜具有神經(jīng)毒性、肺毒性等多種毒性及致癌性，主要損傷肝臟和腎臟，嚴重危害人類和動物的健康。國際癌癥研究院(The International Agencyfor Research onCancer)已將伏馬菌素定為2B組致癌物質(zhì)(可能是人類致癌物)，其中伏馬菌素BI的毒性強且污染率高。加入WTO之后，農(nóng)產(chǎn)品及相關(guān)食品的國際貿(mào)易量日益增加，隨之對進出口產(chǎn)品生物安全性的要求也越來越高。為了保證這類產(chǎn)品的順利進出口貿(mào)易和食用者的健康，出入境檢疫、海關(guān)、生產(chǎn)企業(yè)、監(jiān)督部門等部門迫切需要一種特異、快速、簡便的伏馬菌素BI檢測方法。目前伏馬菌素BI的測定方法有多種，如薄層層析法(TLC)、氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC/MS)、毛細管電泳法(CE)、液相色譜-質(zhì)譜法(LC/MS)和酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)等方法。薄層層析法操作簡單，適合于沒有經(jīng)過專門培訓(xùn)的人員操作，且成本低，無需價格昂貴的儀器；但其步驟較繁瑣，靈敏度低。HPLC法準確度高，靈敏度性強，可作為定量檢測方法，但是這種方法前處理過程繁瑣，操作復(fù)雜，在實驗時需要對伏馬菌素進行柱前衍生化處理，而且通常需要專業(yè)人員進行操作，儀器設(shè)備昂貴，檢測過程耗時且費用較高，不適于在基層推廣及大量樣品的現(xiàn)場快速檢測。ELISA法特異性強，靈敏度高，準確性好，操作簡便，適于大批量樣品的檢測；但檢測的靈敏度和試劑盒的穩(wěn)定性方面離實際應(yīng)用還有一定的距離，此外免疫法需依賴于制備繁瑣耗時且成本昂貴的抗體，且制得的抗體批次間穩(wěn)定性不如寡核苷酸，抗體的儲存條件也較寡核苷酸嚴苛。近些年來，寡核苷酸適配子作為抗體分子的前景性替代分子，其研究較為引人注目。寡核苷酸適配子是通過SELEX過程篩選的與靶物質(zhì)特異性結(jié)合的一簇小分子DNA或RNA 片段。SELEX 技術(shù)(Systematic Evolution ofLigands by Exponential Enrichment,系統(tǒng)進化指數(shù)富集技術(shù))是20世紀90年代發(fā)展起來的一種新的組合化學(xué)技術(shù)，具有經(jīng)濟、簡便、快速、適用范圍廣等特點。SELEX技術(shù)利用大容量的隨機寡核苷酸文庫與靶分子相互作用，從中篩選出與靶分子特異結(jié)合的寡核苷酸，并結(jié)合PCR體外擴增技術(shù)，使其得到指數(shù)級富集，經(jīng)過多輪篩選最終獲得高親和力、高特異性的寡核苷酸適配子。與其他組合化學(xué)庫如隨機肽庫、抗體庫和噬菌體表面展示文庫相比，從寡核苷酸隨機文庫中篩選出的適配子具有很多優(yōu)勢(I)寡核苷酸分子本身分子量很小，其化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)提供了易于標記的特性，易于合成及化學(xué)修飾使之便于后續(xù)試驗；(2)不依賴于動物體內(nèi)免疫，不存在抗體由于不同批次生產(chǎn)帶來的差異性；(3)某些寡核苷酸適配子具有強于抗體的親和性和特異性，無免疫原性；(4)核苷酸穩(wěn)定性好，易于保存和運輸，對高溫和劇烈環(huán)境不如抗體敏感。本發(fā)明以食品及環(huán)境中常見的伏馬菌素BI為靶標，利用競爭SELEX技術(shù)制備獲得了與伏馬菌素BI高特異性高親和力結(jié)合的寡核苷酸適配子。該寡核苷酸適配子經(jīng)修飾后可直接用于熒光或化學(xué)發(fā)光、發(fā)色方法檢測伏馬菌素BI以豐富實驗室檢測手段，也可用于開發(fā)伏馬菌素BI試紙條或便攜式小型儀器以實現(xiàn)家庭、農(nóng)田、工廠快速檢測，因此該發(fā)明可以在食品安全檢測、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能與伏馬菌素BI特異性結(jié)合的寡核苷酸適配子并用于快速、準確檢測伏馬菌素BI，為開發(fā)新型伏馬菌素BI分析方法或檢測工具奠定良好基礎(chǔ)。本發(fā)明采用以下技術(shù)方案體外合成一個長度為80nt的含40個隨機序列的單鏈DNA文庫，以及長度均為20nt的上下游引物及磷酸化下游引物；優(yōu)化PCR條件及Lambda核酸外切酶消化磷酸化反義鏈制備單鏈次級文庫的條件；將伏馬菌素BI通過戊二醛二步偶聯(lián)法固定在磁珠上作為篩選靶標，采用競爭SELEX技術(shù)篩選出具有高親和力的伏馬菌素BI寡核苷酸適配子；通過DNAMAN軟件分析序列同源性將測序所得序列分為11個家族，并通過結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件RNAStructureProgram分析預(yù)測寡核苷酸適配子的二級結(jié)構(gòu)；合成生物素標記的11條寡核苷酸適配子，通過與伏馬菌素BI磁珠的結(jié)合試驗分析寡核苷酸適配子的親和力，以及與鏈霉親和素磁珠的競爭結(jié)合解離試驗鑒定寡核苷酸適配子的特異性。本發(fā)明的優(yōu)點(I)以Lambda核酸外切酶消化磷酸化反義鏈制備單鏈次級文庫，克服了變性尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳、非對稱PCR或借助鏈霉親和素磁珠分離單鏈方法中存在的操作繁 瑣、耗時長、效率低或易引入背景污染(如雙鏈DNA模板、生物素化互補鏈或鏈霉親和素分子)等不足，使其制備的ss DNA具有更高的純度和效率。(2)獲得了能與伏馬菌素BI高親和力、高特異性結(jié)合的寡核苷酸適配子，為進一步開發(fā)伏馬菌素BI的新型分析方法或檢測工具奠定了基礎(chǔ)。(3)因為是通過SELEX技術(shù)獲得的小分子寡核苷酸適配子，本發(fā)明具有制備方法簡單、周期短、無需動物體內(nèi)免疫，且寡核苷酸適配子的合成簡便、易于標記、穩(wěn)定性好、成本低廉等優(yōu)點，相對于抗體的優(yōu)勢顯而易見。


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表
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I是Lambda核酸外切酶消化制備單鏈次級文庫的變性PAGE電泳2是伏馬菌素BI寡核苷酸適配子11個家族代表序列的二級結(jié)構(gòu)分析圖3是伏馬菌素BI寡核苷酸適配子1F、3F及8F的特異性試驗結(jié)果I是SELEX篩選過程中每一輪篩選條件的說明；
2是伏馬菌素BI寡核苷酸適配子11條代表序列的解離常數(shù)Kd值。
具體實施例方式以下結(jié)合說明書附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但不是限制本發(fā)明。實施例1 :伏馬菌素BI特異性結(jié)合寡核苷酸適配子的競爭SELEX篩選1、體外化學(xué)合成初始隨機單鏈DNA(ssDNA)文庫及引物(由美國IDT公司完成)序列如下5'-AGCAGCACAGAGGTCAGATG(40N)CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3' (40N代表40個隨機核苷酸);上游引物5'-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3'下游引物5'-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3'
5'磷酸化下游引物5' -P-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3'將隨機ssDNA文庫和引物均用TE緩沖液配制成100 μ M貯存液存于_20°C備用。2、PCR擴增條件及Lambda核酸外切酶消化制備單鏈次庫的條件將合成的隨機單鏈文庫(ssDNA)稀釋作為PCR模板擴增出磷酸化的雙鏈DNA(dsDNA)產(chǎn)物，研究Lambda核酸外切酶消化磷酸化反義鏈制備單鏈次庫的影響因素，最終確定制備單鏈次庫的最佳條件。PCR反應(yīng)體系為稀釋隨機文庫作為模板DNAl μ L(IOOng)，上游引物及磷酸化下游引物(20 μ Μ)各lyL，(1見1^!￡(6&(*251111)14 1^，10\ 0 擴增緩沖液5 4 1^，滅菌超純水
40μ L，Taq酶I μ L，總體積為50 μ L。PCR擴增程序95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s ；57V退火30s ;72°C延伸30s ;循環(huán)25次；最后72°C延伸5min。通過8%非變性PAGE驗證擴增效果。將電泳條帶位置正確且單一的PCR擴增產(chǎn)物匯集在一個2mL離心管中，加入與PCR產(chǎn)物溶液等體積的酚氯仿異戊醇(V : V : V = 25 : 24 :1)，旋渦混勻管內(nèi)容物使呈乳狀，12000rpm，4°C離心15s，將上層液體小心移入另一離心管，棄去兩相界面和有機相。重復(fù)操作一次，直至兩相界面上見不到蛋白質(zhì)為止。向含樣品的離心管中加入1/10體積的3M醋酸鈉(pH5.2)溶液及2倍體積的無水乙醇，充分混勻后放-70°C冰箱內(nèi)過夜。取出平衡，12000rpm,4°C離心15min。吸棄上清,用4°C預(yù)冷的70%乙醇O. 5-lmL上下顛倒洗漆白色固體沉淀，12000rpm，4°C離心5min。吸棄上清，打開蓋子將沉淀晾干后，重溶于適當體積的滅菌超純水中，通過Thermo NanoDrop2000超微量分光光度計測定dsDNA濃度。取確定濃度的純化PCR產(chǎn)物溶液，往其中加入按酶活定義計算出的所需核酸外切酶(5U/yL)，加入1/10體積的IOX反應(yīng)液混合均勻，在37°C下反應(yīng)30min 2h，75°C水浴IOmin使酶失活停止反應(yīng)。通過7M尿素變性8 %聚丙烯酰胺凝膠進行電泳,置O. 5 μ g/mL溴化乙錠溶液中染色后，將膠置于凝膠成像儀中觀察驗證酶切反應(yīng)是否完全(結(jié)果如圖1所示)，確定最佳酶切條件后再進行放大酶切。將酶切產(chǎn)物匯集在一個1. 5mL離心管中，以酚氯仿乙醇沉降法提純，將ssDNA沉淀物重溶于適當體積的緩沖液中，通過ThermoNanoDrop2000超微量分光光度計測定ssDNA濃度。3、篩選所用靶標的獲取與處理為了實現(xiàn)快速分離孵育體系中的與靶標結(jié)合ssDNA與不結(jié)合ssDNA的目的，將伏馬菌素BI小分子以共價鍵結(jié)合的形式固定在氨基磁珠表面。伏馬菌素BI分子本身有一個伯胺基，因而采用戊二醛二步偶聯(lián)法。先用5%戊二醛-PBS溶液室溫活化氨基磁珠2h，使氨基磁珠表面接上“連接臂”戊二醛分子，用PBS溶液洗滌3次后，加入伏馬菌素BI溶液，繼續(xù)室溫反應(yīng)24h。采用傅里葉紅外光譜儀分析戊二醛偶聯(lián)磁珠及伏馬菌素BI偶聯(lián)磁珠，定性驗證偶聯(lián)成功；并采用領(lǐng)苯二甲醛衍生化-HPLC法測定反應(yīng)前后溶液中伏馬菌素BI濃度的變化，定量驗證偶聯(lián)成功。將伏馬菌素BI偶聯(lián)磁珠及戊二醛偶聯(lián)磁珠，用結(jié)合緩沖液BB (IOOmMNaCl，20mM Tris-HCl, 2mM MgCl2, 5mM KCl, ImM CaCl2,0. 02% Tween20, pH7. 4)清洗多次后重新分散在BB中(濃度為4mg磁珠/mL)保存于4°C冰箱中待用。4、SELEX 篩選 13 輪第一輪篩選時，取溶解在500 μ L結(jié)合緩沖液BB中的2nmol隨機ssDNA文庫，經(jīng)94°C水浴加熱7min，立即冰浴15min后室溫放置10min(目的一是回溫平衡，目的二是ssDNA與Ep管孵育以除去與Ep管結(jié)合的ssDNA序列)；此 間取500 μ L伏馬菌素BI靶標磁珠懸液，用BB沖洗6次，磁分離棄上清；將ssDNA溶液500 μ L從原管中轉(zhuǎn)移到磁珠管中，在漩渦振蕩混合儀上混合均勻，室溫搖晃孵育lh。孵育結(jié)束后，用BB緩沖液反復(fù)洗滌磁珠-ssDNA復(fù)合物6次，每次500 μ L BB0最后將磁珠重新分散于100 μ L解離緩沖液(20mMTris-HCl, 2mM MgSO4, IOmM KCl, ImM CaCl2,0. 02% Tween20, pH7. 4)中，于 94°C水浴 IOmin后迅速取出在漩渦震蕩儀上震蕩10s，加磁鐵將上清液吸出即為解離液。重復(fù)解離操作3次，將多次解離液匯集在一管中混勻作為PCR擴增的模板DNA。PCR反應(yīng)體系為單鏈DNA解離液5 μ L，上游引物及磷酸化下游引物(20 μ Μ)各I μ L，含 Mg2+ClNTPniixI μ L (25mM)，10 X PCR 緩沖液 5 μ L，Taq 聚合酶(5U/ μ L) I μ L，加滅菌超純水至 50 μ L。反應(yīng)程序為95°C,5min ；95°C,30s ；57°C,30s ；72°C,30s ;循環(huán) 25 次；72°C,5min。第1-13輪篩選的PCR產(chǎn)物，均通過非變性8%聚丙烯酰胺凝膠電泳驗證擴增效果，然后將PCR總體積擴大為100 μ L/管進行大批量擴增純化，并用Lambda核酸外切酶消化法制備單鏈次庫作為下一輪SELEX篩選投入的次庫。第二輪篩選時，將溶解在BB中的200pmol單鏈次庫(第1_13輪ssDNA文庫投入量見表I)，經(jīng)94°C水浴加熱7min，立即冰浴15min后室溫放置IOmin ;此間取500 μ L戊二醛偶聯(lián)磁珠懸液，用BB沖洗6次，磁分離棄上清；將ssDNA溶液500 μ L從原管中轉(zhuǎn)移到磁珠管中，在漩渦振蕩混合儀上混合均勻，室溫搖晃孵育lh。孵育結(jié)束后，磁分離用移液槍小心吸取溶液，加入到事先準備好的裝有伏馬菌素BI靶標磁珠懸液的離心管中，室溫搖晃孵育lh。孵育結(jié)束后，用BB緩沖液反復(fù)洗滌磁珠-ssDNA復(fù)合物6次，每次500 μ L BB。最后將磁珠重新分散于100 μ L解離緩沖液中，于94°C水浴IOmin后迅速取出在漩渦震蕩儀上震蕩IOs，立刻加磁鐵將上清液吸出即為解離液。將多次解離液匯集在一管中混勻作為擴增模板進行PCR擴增(非變性8% PAGE電泳驗證)，核酸純化；Lambda酶切(尿素變性8%PAGE電泳驗證)制備單鏈次庫，核酸純化后Thermo NanODrOp2000超微量分光光度計測定ssDNA濃度計算下一輪文庫投入體積。第三輪篩選時，將溶解在BB中的200pmol單鏈次庫，經(jīng)94°C水浴加熱7min，立即冰浴15min后室溫放置IOmin ;此間取500 μ L戊二醛偶聯(lián)磁珠，用BB沖洗6次，磁分離棄上清；將ssDNA溶液500 μ L從原管中轉(zhuǎn)移到磁珠管中，在漩渦振蕩混合儀上混合均勻，室溫搖晃孵育lh。孵育結(jié)束后，磁分離用移液槍小心吸取溶液，加入到事先準備好的裝有2mg伏馬菌素BI靶標磁珠的離心管中，室溫搖晃孵育lh。孵育結(jié)束后，用BB緩沖液反復(fù)洗滌磁珠-ssDNA復(fù)合物6次，每次500 μ L BB0最后將磁珠重新分散于100 μ L解離緩沖液中，于94°C水浴IOmin后迅速取出在漩渦震蕩儀上震蕩10s，加磁鐵將上清液吸出即為解離液。重復(fù)解離操作3次，將300 μ L解離液加入到伏馬菌素Β2偶聯(lián)磁珠中，室溫孵育30min后，磁分離用移液器小心吸出上清液即為第三輪篩選獲得的與伏馬菌素BI結(jié)合但是不與戊二醛偶聯(lián)磁珠及伏馬菌素B2磁珠結(jié)合的寡核苷酸適配子。之后每一輪SELEX篩選均按照類似操作進行，但隨著篩選的推進，解離前BB洗滌靶標磁珠-ssDNA復(fù)合物的次數(shù)由6次增加到9次。同時，為了篩選到富集快速且親和力高的寡核苷酸適配子序列，在隨后的篩選中逐漸縮短孵育時間及減少對解離ssDNA的擴增循環(huán)次數(shù)。此外，從第3輪開始，加入伏馬菌素B2磁珠、玉米赤霉烯酮磁珠、黃曲霉毒素AFBl磁珠或黃曲霉毒素AFB2磁珠的反篩；并且從第11輪開始，往孵育體系中加入競爭結(jié)合的因素(伏馬菌素B2、黃曲霉毒素AFBl、黃曲霉毒素AFB2及玉米赤霉烯酮ZEN溶液)，并在解離緩沖液中加入微量伏馬菌素BI，以提高寡核苷酸適配子對伏馬菌素BI的特異性。13輪篩 選的條件控制說明如表I所示
權(quán)利要求
1.一組特異識別伏馬菌素BI的寡核苷酸適配子，其核苷酸序列為1)序列表I 3所示的核苷酸序列；2)序列表I 3所示核苷酸序列經(jīng)替換、缺失和/或者插入一個或幾個核苷酸形成的具有同等功能的序列；或，3)含有序列表I 3所示核苷酸序列為核心序列并兩邊延長的序列。
2.權(quán)利要求1所述的伏馬菌素BI適配子，其特征在于其5'端或3'端可以進行生物素、FITC、地高辛等化學(xué)修飾，其特征還在于單獨或聯(lián)合使用修飾或不修飾適配子均能用于伏馬菌素BI的分析檢測。
3.權(quán)利要求1所述伏馬菌素BI適配子在分析檢測或分離富集伏馬菌素BI中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一組伏馬菌素B1的單鏈DNA核酸適配子，是通過SELEX技術(shù)結(jié)合表面固定了伏馬菌素B1的磁珠對原始單鏈DNA隨機文庫進行篩選、擴增、測序、親和力及特異性分析得到的。該組DNA適配子作為伏馬菌素B1的一種特異高效識別配體，為開發(fā)替代現(xiàn)有依賴抗體檢測伏馬菌素B1的方法提供了新的選擇，可用于分析檢測或分離富集食品、環(huán)境中的伏馬菌素B1。所述核酸適配子分子量小，化學(xué)合成成本低且易于標記，親和性和特異性強，變性與復(fù)性可逆且速度快，可反復(fù)使用、室溫運輸和長期保存。
文檔編號C07C213/10GK103013999SQ201210475128
公開日2013年4月3日 申請日期2012年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月22日
發(fā)明者王周平, 陳秀娟, 段諾, 吳世嘉 申請人:江南大學(xué)