專利名稱：一種狂犬病毒疫苗增效蛋白及編碼該蛋白的基因和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種狂犬病毒疫苗增效蛋白及編碼該蛋白的基因和應用。
背景技術：
狂犬病是當前威脅人類健康的一種比較嚴重的急性傳染病，人類患者一旦被病畜咬傷而發(fā)病，死亡率高達95%以上。當前我國狂犬病形勢也相當嚴峻，發(fā)病率居世界第二位，僅次于印度。通過注射狂犬病毒疫苗預防狂犬病的感染是當前控制狂犬病發(fā)病的重要途徑。但是目前狂犬病毒疫苗的免疫效果在人群中存在較大差異，且注射后體內狂犬病毒抗體的滴度上升到具有保護效力的滴度所需要的時間較長，不足以在病毒潛伏期內產(chǎn)生足夠的抗體以抵抗狂犬病毒的感染和發(fā)病。因此尋找能夠有效增強狂犬病毒疫苗免疫源性的分子作為佐劑是解決該問題的一個重要途徑。采用基因工程原理，應用原核(如大腸桿菌)表達系統(tǒng)或真核(如酵母、哺乳動物細胞等)表達系統(tǒng)克隆表達某種蛋白是獲取大量該蛋白的最為有效的方法。將其與狂犬病毒疫苗一同免疫動物，再用ELISA方法測定動物體內狂犬病毒特異性抗原的抗體效價，可以很方便地觀察到該蛋白是否能夠增強狂犬病毒疫苗的免疫效果，從而推斷該蛋白在狂犬病毒疫苗領域是否具有潛在的應用價值。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種狂犬病毒疫苗的增效蛋白及編碼該蛋白的基因，并提供表達該蛋白的方法和應用。本發(fā)明提供的狂犬 病毒疫苗的增效蛋白(記為SBP)，其核苷酸序列為SEQ.1D.N0.1所示，具有如下功能特征:①可與狂犬病毒疫苗親和，測得親和常數(shù)可達1.16 XlOVmoI ;②與狂犬病毒疫苗注射動物或人體，可以縮短達到保護效力的抗體滴度的時間，提高免疫應答效率和強度。本發(fā)明還提供編碼所述狂犬病毒疫苗的增效蛋白的基因，其氨基酸序列為SEQ.1D.N0.2 所示。通過基因工程改造，本發(fā)明還獲得了一系列同源性達80%以上的具有對狂犬病毒疫苗有增效功能的序列。具體包含以下序列:
1、通過體外擴增拼接或DNA人工合成得到若干具有和SBP同樣免疫增效功能的基因序列，基因序列號為SEQ.1D.N0.3— SEQ.1D.N0.5，經(jīng)過修飾的蛋白序列:SEQ.1D.N0.6、SEQ.1D.N0.7。2、通過定點突變、基因重組等手段獲得了幾種具有更強親和力免疫增效功能的蛋白序列:SEQ.1D.N0.8、SEQ.1D.N0.9。3、通過各種方法獲得的與上述基因或蛋白質序列(SEQ.1D.N0.1— SEQ.1D.N0.9)同源性達80%以上并具有與狂犬病毒疫苗高度親和性及對狂犬病毒疫苗具有顯著增效功能的序列，上述序列統(tǒng)稱為SBPs。將上述DNA序列/片段直接克隆到PBV220或其它原核表達載體，經(jīng)誘導表達獲得重組蛋白；也可將上述表達片段克隆到真核表達載體如pEGFP-Nl、pICZa (a, b, c)等在哺乳細胞和酵母中表達。運用N1-NTA agarose、交聯(lián)有SPA、ConA、mAb等的親和柱進行純化，最終得到純化的目的蛋白。本發(fā)明的核苷酸序列為SEQ.1D.N0.1的蛋白可作為狂犬病毒疫苗佐劑。該蛋白與狂犬病毒疫苗具有高親和性，與狂犬病毒(抗原)疫苗聯(lián)用可顯著加速狂犬病毒(抗原)抗體產(chǎn)生的時間，提高疫苗的免疫效果，提高動物體內保護性抗體滴度，可用于在動物受病毒侵染后應急防治保護。本發(fā)明的氨基酸序列為S EQ.1D.N0.2的蛋白可作為狂犬病毒疫苗佐劑。通過重組表達與SBP具有80%以上同源性的蛋白，包括和其他抗原成分(如各種蛋白多肽)的融合、聚合、混合等各種聯(lián)合方式一起使用，產(chǎn)生協(xié)同增效作用的有效形式。該蛋白對狂犬病毒疫苗親和性實驗的結果:用不同稀釋度的疫苗液體(1:5、1:10、1:20、1:40、1:80)包被96孔酶標板，孵育后加入SBP作為一抗，抗人IgG為二抗進行ELISA反應，測得的OD值與未加入SBP的結果進行對照，觀察SBP與狂犬病毒疫苗的親和性。結果證明SBP與狂犬病毒具有極強的親和力，親和常數(shù)Ka>107L/mol。該蛋白對狂犬病毒疫苗免疫效果的影響:將實驗動物分為試驗組和對照組。以小鼠為例，按常規(guī)方法用狂犬病毒疫苗免疫小鼠，皮下注射。在免疫后的第12、20、28、42天從小鼠尾靜脈取血，分離血清。用ELISA方法測定小鼠體內抗狂犬病毒抗體的滴度。SPSS軟件分析試驗組和對照組的差異。結果發(fā)現(xiàn)該蛋白可以明顯增強小鼠體內抗體的滴度，即該蛋白可以增強狂犬病毒疫苗的免疫效果。由此可見，該蛋白對狂犬病毒疫苗具有極強的親和性，利用該蛋白可以增強狂犬病毒疫苗的免疫原性，可降低狂犬病毒抗體在體內達到保護性作用滴度的時間，有利于體內在短時間內生成具有保護性的狂犬病毒抗體。因此可將其作為一種狂犬病毒疫苗的增效分子即佐劑而應用于狂犬病毒疫苗領域，提高現(xiàn)有狂犬病毒疫苗的效力，降低狂犬病的發(fā)病率和致死率。


圖1該蛋白對狂犬病毒疫苗的親和性。圖2該蛋白對Balb/c小鼠抗狂犬病毒抗體效價的影響。
具體實施例方式一、基因序列的獲得與改造
通過人工合成、體外基因擴增拼接的方式對SBP基因序列進行修飾或同義突變，獲得多種和SBP具有相同功能的基因序列(SEQ.1D.N0.3-5)。例如，在該cDNA的N或C端引入6Xhis purification tag 和腸激酶酶切位點 DDDDK,6Xhis purification tag 有利于目的融合蛋白的親和純化，腸激酶酶切位點可以使純化的融合蛋白在腸激酶的作用下切除掉6 Xhis tag 和 DDDDK。根據(jù)SBP和HBsAg三維互作模式，特別是靜電分布狀態(tài)的分析結果，采用點突變和基因重組的方法對SBP進行結構改造(如:V3D，T8D)，獲得具有強化免疫增效功能的蛋白序列(SEQ.1D.N0.8-9)。二、基因工程表達和純化目的蛋白
1、原核表達。在該cDNA的N端引入6Xhispurification tag和腸激酶酶切位點DDDDK0將這一完整的DNA克隆到pBV220原核表達載體中，轉化大腸桿菌，篩選陽性轉化子。挑取陽性單克隆于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)并進行溫度誘導發(fā)酵:首先在37 C，250rpm培養(yǎng)轉化的大腸桿菌至0D_=0.5^0.6，然后迅速升溫至42°C開始誘導發(fā)酵5小時。發(fā)酵結束后離心收集菌體，裂解菌體以提取包涵體，包涵體粗純后用N1-NTA agarose柱親和純化,經(jīng)透析復性后最終得到目的蛋白。用Western和ELISA實驗驗證所獲得的蛋白正是所需要的目的蛋白；
2、酵母真核表達。將上述基因克隆到真核表達載體pICZa(a，b，c)轉化畢赤酵母(GS115)，在BMMY培養(yǎng)基中進行甲醇誘導培養(yǎng)，重組蛋白可經(jīng)交聯(lián)有SPA、ConA、mAb的親和柱和離子交換柱等分離純化，最后得到了較高純度的目的蛋白；
3、真核細胞表達。將上述基因序列及其改造后的序列克隆到pEGFP-Nl等哺乳細胞表達載體中，轉染CHO細胞，經(jīng)RPM1-1640完全培養(yǎng)基中大量培養(yǎng)，收獲細胞并在不損害蛋白活性的前提下裂解細胞，經(jīng)N1-NTA agarose柱及經(jīng)交聯(lián)有SPA、ConA、mAb的親和柱親和純化，獲得高活性的目的蛋白。三、SBP蛋白對狂犬病毒疫苗效果的影響評價
1、該蛋白對狂犬病毒疫苗親和性實驗的結果:用不同稀釋度的疫苗液體(1:5、1:10、1:20、1:40、1:80)包被96孔酶標板，孵育后加入SBP作為一抗，抗人IgG為二抗進行ELISA反應，測得的OD值與未加入SBP的結果進行對照，觀察SBP與狂犬病毒疫苗的親和性。結果證明SBP與狂犬病毒具有極強的親和力，親和常數(shù)Ka>107L/mol。2、蛋白對狂犬病毒疫苗免疫效果的影響:將實驗動物分為試驗組和對照組。以小鼠為例，按常規(guī)方法用狂犬病毒疫苗免疫小鼠，皮下注射。在免疫后的第12、20、28、42天從小鼠尾靜脈取血，分離血清。用ELISA方法測定小鼠體內抗狂犬病毒抗體的滴度。SPSS軟件分析試驗組和對照組的差異。結果(圖1、圖2)發(fā)現(xiàn)，SBP與狂犬病毒疫苗具有極強的親和作用。實驗小鼠在免疫后14天左右抗體效價達到了 8000，而對照組在免疫14天后抗體仍未產(chǎn)生。在免疫后20天，實驗組的小鼠抗體效價達到了 10000，而對照組的抗體僅為4000。以上結果說明SBP蛋白能夠通過增強與狂犬病毒疫苗的親和力而上調小鼠體內抗狂犬病毒抗體的能力，可以增強狂犬病毒疫苗的免疫效果。四、具體應用
傳統(tǒng)的狂犬病毒疫苗往往不能在短時間內提高體內抗體的滴度，從而不能很好地在狂犬病毒潛伏期內提供足夠的抗體水平以抵抗病毒的侵染。本發(fā)明提供的這種狂犬病毒疫苗增效蛋白能夠在短時期內顯著提高小鼠體內狂犬病毒抗體的滴度水平，明顯增強狂犬病毒疫苗的免疫效果，因此，可將其用于狂犬病毒疫苗佐劑的開發(fā)。在注射狂犬病毒疫苗的同時，注射一定量的該蛋白，能夠增強狂犬病毒疫苗的免疫原性，在短時間內增加體內抗狂犬病毒抗體的效價，從而提 高疫苗的免疫效率，并減少狂犬病毒疫苗的用量和注射次數(shù)。
權利要求
1.種狂犬病毒疫苗增效蛋白，其特征在于核苷酸序列為SEQ.1D.N0.1。
2.種編碼如權利要求1所述狂犬病毒疫苗增效蛋白的基因，其特征在于氨基酸序列為 SEQ.1D.N0.2。
3.種具有與權利要求1所述狂犬病毒疫苗增效蛋白同樣功能的蛋白，其特征在于核苷酸序列為 SEQ.1D.N0.3— SEQ.1D.N0.5 之一所示。
4.種經(jīng)過修飾的蛋白序列，其特征在于氨基酸序列為SEQ.1D.N0.6或SEQ.1D.N0.7所示。
5.種表達如權利要求1所述的狂犬病毒疫苗增效蛋白的方法，其特征在于具體步驟為:將基因序列克隆到原核 表達載體PBV220轉化大腸桿菌，或真核表達載體pICZa(a，b，c)轉化畢赤酵母(GS115)，或pEGFP-Nl哺乳細胞表達載體中，轉染CHO細胞，經(jīng)過誘導表達和純化，獲得一系列高純度的目的蛋白。
6.權利要求1所述蛋白作為狂犬病毒疫苗佐劑的應用。
7.氨基酸序列為SEQ.1D.N0.2的蛋白基因作為狂犬病毒疫苗佐劑的應用。
全文摘要
發(fā)明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種狂犬病毒疫苗增效蛋白及編碼該蛋白的基因和應用。將該蛋白的cDNA用基因工程方法克隆至原核細胞、真核(酵母、動物、植物)細胞表達由該cDNA編碼的蛋白。該蛋白與狂犬病毒疫苗具有高親和性，與狂犬病毒(抗原)疫苗聯(lián)用可顯著加速狂犬病毒(抗原)抗體產(chǎn)生的時間，提高疫苗的免疫效果，提高動物體內保護性抗體滴度。本發(fā)明的蛋白可以用作狂犬病毒疫苗的佐劑，用于開發(fā)高效快速的增效型狂犬病毒疫苗，以達到在動物受病毒侵染后應急防治保護作用。
文檔編號C07K14/00GK103087155SQ201310019108
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月20日 優(yōu)先權日2013年1月20日
發(fā)明者朱乃碩, 胡曉波 申請人:復旦大學