一種采用沉淀法提取多粘菌素b的工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提取多粘菌素B的工藝，該工藝采用沉淀法，先將多粘菌素B發(fā)酵液用草酸進(jìn)行沉淀，分離沉淀的固體加堿性物質(zhì)進(jìn)行溶解，隨后用弱酸性陽離子交換樹脂進(jìn)行吸附，純化水洗滌后，用稀硫酸進(jìn)行預(yù)洗、解析，解析液用堿性物質(zhì)沉淀，酸性物質(zhì)溶解，固液分離，液體經(jīng)脫色納濾、干燥得到多粘菌素B。所述工藝工序短，無需使用有機(jī)溶劑，制備得到的多粘菌素B含量高，適于工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。
【專利說明】一種采用沉淀法提取多粘菌素B的工藝

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種采用沉淀法提取多粘菌素B的工藝。

【背景技術(shù)】
[0002]多粘菌素是由多粘芽孢桿菌在代謝過程中合成和分泌的具有良好抗菌活性的堿性環(huán)狀多肽，多粘菌素B是多粘菌素的一種，常用其硫酸鹽，為白色結(jié)晶性粉末，易溶于水，有引濕性，在酸性溶液中穩(wěn)定，其中性溶液在室溫放置一周不影響效價，堿性溶液不穩(wěn)定，在醚、酮、酯、烴等有機(jī)溶劑中幾乎不溶解。
[0003]多粘菌素B對大多數(shù)的革蘭氏陰性桿菌有較強(qiáng)的抗菌作用，對綠膿桿菌的作用更為顯著，對大腸桿菌、沙門氏菌、痢疾桿菌、流感桿菌、百日咳桿菌、產(chǎn)氣桿菌及肺炎桿菌等也有良好的作用。多粘菌素B對生長繁殖期和靜止期的細(xì)菌都有效，過去臨床上主要用于治療革蘭氏陰性菌感染，特別是綠膿桿菌和大腸桿菌引起的各種感染，如呼吸系統(tǒng)感染、腹膜炎、膽管感染、尿路感染、燒傷感染、眼角膜感染及敗血癥等。目前仍可局部用于敏感菌所致的眼、耳、皮膚、粘膜感染及燒傷綠膿桿菌感染。
[0004]多粘菌素B可由發(fā)酵液經(jīng)分離、提取、純化、干燥而得。專利GB742589、GB782926等都涉及到用弱酸性陽離子交換樹脂進(jìn)行吸附濾液，解析液繼續(xù)用樹脂進(jìn)行純化，該方法多次使用樹脂，具有生產(chǎn)工時過長、吸附收率較低等缺點(diǎn)。GB9798887、CN103130875、CN103130876等專利提到使用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取達(dá)到分離的目的，該方法使用有機(jī)溶劑，會對操作人員和環(huán)境造成一定的傷害，且環(huán)保成本較高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種工序短、含量高、對環(huán)境友好的提取多粘菌素B的工藝，解決了現(xiàn)有技術(shù)中多粘菌素B提取方法工序長、對環(huán)境污染嚴(yán)重、所得產(chǎn)品含量低的問題。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所述目的，發(fā)明人提供了以下技術(shù)方案。
[0007]—種采用沉淀法提取多粘菌素B的工藝，包括以下操作步驟:
[0008]a.將多粘菌素B的發(fā)酵液加草酸調(diào)節(jié)pH值為1.0?2.0，隨后進(jìn)行固液分離，將分離得到的液體降溫至15?25°C，加堿性物質(zhì)調(diào)節(jié)pH值為6.0?8.0，所得溶液轉(zhuǎn)移至弱酸性陽離子交換樹脂柱進(jìn)行吸附，用純化水洗滌樹脂柱至流出液的透光度為80?100%，然后使用0.01?0.05mol/L的硫酸對樹脂柱進(jìn)行預(yù)洗，最后用0.1?0.5mol/L的硫酸對樹脂柱進(jìn)行解析，收集解析液；
[0009]b.向步驟a得到的解析液中加堿性物質(zhì)調(diào)節(jié)pH值為8.0?10.0,隨后進(jìn)行固液分離，將分離得到的固體用純化水洗滌，向洗滌后的固體中加入純化水，攪拌，然后加酸性溶液直至固體全部溶解，期間控制pH值為4.6?5.0，過濾，所得濾液備用；
[0010]C.將步驟b得到的濾液進(jìn)行脫色、納濾、干燥，即得到多粘菌素B。
[0011]步驟a和步驟b中所述堿性物質(zhì)為3%?7%氫氧化鈉水溶液。
[0012]步驟b中所述酸性物質(zhì)為0.01?0.05mol/L的硫酸。
[0013]步驟a中將分離得到的液體降溫至15?20°C。
[0014]步驟a中用純化水洗滌樹脂柱至流出液的透光度為98%?100%。能夠除去水溶性雜質(zhì)，再通過0.01?0.02mol/L的硫酸預(yù)洗，使解析液的純度達(dá)到75%以上。
[0015]步驟a中使用0.01?0.02mol/L的硫酸對樹脂柱進(jìn)行預(yù)洗。
[0016]步驟a中用0.1-0.2mol/L的硫酸對樹脂柱進(jìn)行解析。
[0017]步驟b中向步驟a得到的解析液中加堿性物質(zhì)調(diào)節(jié)pH值為9.0?10.0。
[0018]步驟b中所述將分離得到的固體用純化水洗滌，純化水與固體的質(zhì)量比為(60?90):1。
[0019]步驟b中所述向洗滌后的固體中加入純化水，純化水與固體的質(zhì)量比為(2?5):1。
[0020]本發(fā)明所述提取多粘菌素B的工藝，采用沉淀法，先向多粘菌素B的發(fā)酵液加入草酸調(diào)節(jié)PH值，目的:①由于草酸和發(fā)酵液中的鈣鎂離子形成沉淀，能夠除去部分鈣鎂離子；②調(diào)至酸性后能夠?qū)⑺嵝缘鞍壮恋沓ァ?br> [0021]發(fā)酵液固液分離后，濾液加堿性物質(zhì)調(diào)節(jié)pH值為6.0?8.0，使濾液在中性條件下進(jìn)行吸附。吸附結(jié)束后，用純化水洗滌樹脂柱至流出液的透光度為80?100%，除去水溶性的雜質(zhì)。然后通過預(yù)洗解析得到解析液。
[0022]向解析液中加堿性物質(zhì)調(diào)節(jié)pH值為8.0?10.0,使硫酸粘菌素B沉淀，然后將沉淀用純化水洗滌，主要是為了除去沉淀中包裹的鈉離子，使硫酸溶解后的料液灰分保持合格。
[0023]步驟b中加堿性物質(zhì)調(diào)節(jié)pH值沉淀及純化水洗滌，能夠使產(chǎn)品的灰分合格，再通過0.01?0.05mol/L硫酸溶解，控制pH值為4.6?5.0,保證最終產(chǎn)品的硫酸鹽和PH合格。
[0024]本發(fā)明所述多粘菌素B的發(fā)酵液可以采用本領(lǐng)域常用菌種經(jīng)過48h發(fā)酵后得到的發(fā)酵液。本發(fā)明所提供的提取多粘菌素B的工藝，工序短，操作簡單，整個過程無需使用有機(jī)溶劑，因此不會對操作人員的身體健康造成損害，也不會對環(huán)境造成污染，能夠減輕生產(chǎn)企業(yè)的環(huán)保壓力，制備得到的多粘菌素B含量在88%以上，經(jīng)濟(jì)效益可觀，適于推廣應(yīng)用。

【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明所述內(nèi)容做進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0026]實(shí)施例1
[0027]a.多粘菌素B的發(fā)酵液200L，含量1.2mg/mL，加草酸調(diào)節(jié)pH值為1.5，在常溫下用陶瓷膜進(jìn)行過濾，將濾液降溫至18°C，加5%氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值為6.9，所得溶液轉(zhuǎn)移至D152樹脂柱進(jìn)行吸附，用純化水洗滌樹脂柱至流出液的透光度為98%，然后使用0.02mol/L的硫酸對樹脂柱進(jìn)行預(yù)洗，最后用0.2mol/L的硫酸對樹脂柱進(jìn)行解析，收集解析液；
[0028]b.向步驟a得到的解析液中加5%氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值為9.0,隨后進(jìn)行過濾，得到固體410g(濕品)，將分離得到的固體用純化水30L洗滌，向洗滌后的固體中加入純化水100mL,攪拌，使固體在純化水中均勻分散，然后加0.03mol/L硫酸直至固體全部溶解，力口入過程控制pH值為4.6-5.0,固體全部溶解時pH值為4.65，停止加硫酸，過濾，所得濾液備用；
[0029]c.將步驟b得到的濾液進(jìn)行脫色、納濾、干燥，即得到多粘菌素B成品142g，含量90.3%，收率 67.5%。
[0030]實(shí)施例2
[0031]a.多粘菌素B的發(fā)酵液250L，含量0.9mg/mL，加草酸調(diào)節(jié)pH值為1.0，在常溫下用板框過濾，將分離得到的液體降溫至17°C，加5%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為6.0，所得溶液轉(zhuǎn)移至D152樹脂柱進(jìn)行吸附，用純化水洗滌樹脂柱至流出液的透光度為98.5%，然后使用0.01mol/L的硫酸對樹脂柱進(jìn)行預(yù)洗，最后用0.lmol/L的硫酸對樹脂柱進(jìn)行解析，收集解析液；
[0032]b.向步驟a得到的解析液中加5%氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值為8.0，過濾沉淀，得到固體425g(濕品)，將分離得到的固體用純化水35L洗滌，向洗滌后的固體中加入純化水1200mL，攪拌，使固體在純化水中均勻分散，然后加0.05mol/L硫酸控制pH值為4.6-5.0,固體完全溶解時PH值為4.73，過濾，所得濾液備用；
[0033]c.將步驟b得到的濾液進(jìn)行脫色、納濾、干燥，即得到多粘菌素B成品130g，含量88.7%，收率 66.6%o
[0034]實(shí)施例3
[0035]a.多粘菌素B的發(fā)酵液150L，含量1.6mg/mL，加草酸調(diào)節(jié)pH值為2.0，在常溫下用陶瓷膜進(jìn)行過濾，固液分離，將分離得到的液體降溫至15°C，加6%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為8.0，所得溶液用D152樹脂柱進(jìn)行吸附，用純化水洗滌樹脂柱至流出液的透光度為99%，然后使用0.05mol/L的硫酸對樹脂柱進(jìn)行預(yù)洗，最后用0.5mol/L的硫酸對樹脂柱進(jìn)行解析，收集解析液；
[0036]b.向步驟a得到的解析液中加6%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為10.0,隨后進(jìn)行過濾，得到固體450g(濕品)，將分離得到的固體用純化水40L洗滌，向洗滌后的固體中加入純化水1500mL，攪拌，使固體在純化水中均勻分散，然后加0.04mol/L的硫酸直至固體全部溶解，加入過程控制PH值為4.6-5.0,固體全部溶解時pH值為4.72，過濾，所得濾液備用；
[0037]c.將步驟b得到的濾液進(jìn)行脫色、納濾、干燥，即得到多粘菌素B成品150g，含量90.3%，收率 70.8%。
【權(quán)利要求】
1.一種采用沉淀法提取多粘菌素B的工藝，其特征在于，包括以下操作步驟: a.將多粘菌素B的發(fā)酵液加草酸調(diào)節(jié)pH值為1.0?2.0，隨后進(jìn)行固液分離，將分離得到的液體降溫至15?25°C，加堿性物質(zhì)調(diào)節(jié)pH值為6.0?8.0，所得溶液轉(zhuǎn)移至弱酸性陽離子交換樹脂柱進(jìn)行吸附，用純化水洗滌樹脂柱至流出液的透光度為80?100%，然后使用0.01?0.05mol/L的硫酸對樹脂柱進(jìn)行預(yù)洗，最后用0.1?0.5mol/L的硫酸對樹脂柱進(jìn)行解析，收集解析液； b.向步驟a得到的解析液中加堿性物質(zhì)調(diào)節(jié)pH值為8.0?10.0，隨后進(jìn)行固液分離，將分離得到的固體用純化水洗滌，向洗滌后的固體中加入純化水，攪拌，然后加酸性溶液直至固體全部溶解，期間控制pH值為4.6?5.0,過濾,所得濾液備用； c.將步驟b得到的濾液進(jìn)行脫色、納濾、干燥，即得到多粘菌素B。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種采用沉淀法提取多粘菌素B的工藝，其特征在于，步驟a和步驟b中所述堿性物質(zhì)為3%?7%氫氧化鈉水溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種采用沉淀法提取多粘菌素B的工藝，其特征在于，步驟b中所述酸性物質(zhì)為0.01?0.05mol/L的硫酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種采用沉淀法提取多粘菌素B的工藝，其特征在于，步驟a中將分離得到的液體降溫至15?20°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種采用沉淀法提取多粘菌素B的工藝，其特征在于，步驟a中用純化水洗滌樹脂柱至流出液的透光度為98%?100%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種采用沉淀法提取多粘菌素B的工藝，其特征在于，步驟a中使用0.01?0.02mol/L的硫酸對樹脂柱進(jìn)行預(yù)洗。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種采用沉淀法提取多粘菌素B的工藝，其特征在于，步驟a中用0.1-0.2mol/L的硫酸對樹脂柱進(jìn)行解析。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種采用沉淀法提取多粘菌素B的工藝，其特征在于，步驟b中向步驟a得到的解析液中加堿性物質(zhì)調(diào)節(jié)pH值為9.0?10.0。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種采用沉淀法提取多粘菌素B的工藝，其特征在于，步驟b中所述將分離得到的固體用純化水洗滌，純化水與固體的質(zhì)量比為(60?90):1。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種采用沉淀法提取多粘菌素B的工藝，其特征在于，步驟b中所述向洗滌后的固體中加入純化水，純化水與固體的質(zhì)量比為(2?5):1。
【文檔編號】C07K1/36GK104327167SQ201410510088
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月28日
【發(fā)明者】宋志倩, 谷新華 申請人:河北圣雪大成制藥有限責(zé)任公司