從楸樹內生真菌發(fā)酵液中濃縮分離楸靈素的方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種從楸樹內生真菌發(fā)酵液中濃縮分離楸靈素的方法及其應用；所述方法包括如下步驟：步驟一、調整楸樹內生真菌發(fā)酵液pH為4～10；步驟二、預冷pH調整后的楸樹內生真菌發(fā)酵液至預冷溫度為0～4℃；步驟三、在保持晶核存在的情況下對步驟二所述楸樹內生真菌發(fā)酵液進行緩慢降溫至結冰；步驟四、繼續(xù)緩慢降溫結冰，直至剩余液態(tài)發(fā)酵液的體積縮至設定值，停止降溫，收集未結冰的液體部分，即得楸靈素濃縮液。本發(fā)明將楸樹內生真菌發(fā)酵液濃縮到原體積的十分之一以下，同時保證90％以上的楸靈素收率。與現有技術相比，本發(fā)明不僅可以更有效的保證原料中楸靈素的穩(wěn)定、確保較高的濃縮收率，而且不添加任何有機溶劑，保證濃縮液質量。
【專利說明】從楸樹內生真菌發(fā)酵液中濃縮分離楸靈素的方法及其應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物化學領域，具體涉及一種從楸樹內生真菌發(fā)酵液中濃縮分離楸靈素的方法及其應用。

【背景技術】
[0002]內生真菌是指那些生活在于植物組織內部并不會使植物產生明顯病害的真菌。內生真菌可以產生與宿主植物相同或相似的生物活性物質，具有巨大的潛在價值，可以成為新型抗癌藥物的來源。本課題組已從胡桃楸里分離提取了一株具有很強抗癌活力的內生真菌(CCTCC M 208102)，初步鑒定該菌為半知菌亞門，絲孢綱，叢梗孢目，木霉菌屬，其發(fā)酵提取液對肝癌細胞有很強的抑制作用。這是一個本實驗室獨有的全新菌種，其具有抗癌能力的發(fā)酵液制備方法已經獲得專利保護(ZL200810041214.8)。由于發(fā)酵液中生物活性成分楸靈素的濃度較低，需要濃縮后才能進行有效的后期精細分離。但楸靈素對溫度敏感，旋轉蒸發(fā)等操作造成楸靈素大量降解，反相吸附又由于楸靈素不能有效洗脫而造成濃縮收率底下。
[0003]針對上述技術問題，本發(fā)明開發(fā)了一種對楸樹內生真菌發(fā)酵液的高效濃縮方法，在保證楸靈素收率的情況下降發(fā)酵液濃縮10倍以上，能大幅度改善后續(xù)的楸靈素精細分離過程，是高效分離純化楸靈素的基礎和關鍵技術。


【發(fā)明內容】

[0004]針對現有技術中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種從楸樹內生真菌發(fā)酵液中濃縮分離楸靈素的方法及其應用，是一種利用結冰從楸樹內生真菌發(fā)酵液中濃縮分離楸靈素的方法，該方法不僅可以實現楸靈素的濃縮分離，也可用于其他物質溶液的濃縮分離。
[0005]本發(fā)明是通過以下技術方案實現的:
[0006]本發(fā)明涉及一種從楸樹內生真菌發(fā)酵液中濃縮分離楸靈素的方法，所述方法包括以下步驟:
[0007]步驟一、調整楸樹內生真菌發(fā)酵液pH為4?10 ;
[0008]步驟二、預冷pH調整后的楸樹內生真菌發(fā)酵液至預冷溫度為O?4°C ;
[0009]步驟三、在保持晶核存在的情況下對步驟二所述楸樹內生真菌發(fā)酵液進行緩慢降溫至結冰；
[0010]步驟四、繼續(xù)緩慢降溫結冰，直至未結冰發(fā)酵液體積與發(fā)酵液總體積比為設定值；停止降溫，收集未結冰的發(fā)酵液，即得楸靈素濃縮液。
[0011]優(yōu)選地，所述楸樹內生真菌發(fā)酵液按照專利ZL200810041214.8所述方法制備。
[0012]優(yōu)選地，步驟一中，所述楸樹內生真菌發(fā)酵液的pH為8?10。
[0013]優(yōu)選地，步驟二中，所述楸樹內生真菌發(fā)酵液的預冷溫度為1°C。
[0014]優(yōu)選地，步驟三中，所述緩慢降溫中的傳熱溫差不大于6°C ；
[0015]更優(yōu)選地，所述緩慢降溫中的傳熱溫差為2?6°C。
[0016]優(yōu)選地，步驟四中，所述緩慢降溫中的傳熱溫差不大于4°C ；
[0017]更優(yōu)選地，所述緩慢降溫中的傳熱溫差為1?4°C。
[0018]優(yōu)選地，步驟三、四中，所述緩慢降溫的方式包括持續(xù)加入晶核。
[0019]更優(yōu)選地,所述晶核包括0 °C碎冰。
[0020]優(yōu)選地，步驟三、四中，所述緩慢降溫的操作具體為:每次加入1毫升0°C的碎冰，當碎冰完全融化后再次加入1毫升o°c的碎冰。
[0021]步驟四中，所述設定值可根據技術人員實際需求而定；具體為:技術人員可根據實驗需求，控制發(fā)酵液結冰量，從而獲得一定體積的未結冰發(fā)酵液的體積。
[0022]第二方面，本發(fā)明涉及一種從楸樹內生真菌發(fā)酵液中濃縮分離楸靈素的方法的應用，所述應用具體為，用于溶液中溶質的濃縮、分離。
[0023]優(yōu)選地，所述溶液的溶劑包括水。
[0024]與現有技術相比，本發(fā)明具有如下的有益效果:
[0025](1)本發(fā)明所述方法濃縮比較大，可實現發(fā)酵液10倍以上濃縮，并且所需時間短，無需持續(xù)加熱，操作過程安全；
[0026](2)所有操作都在低溫下操作，保證了楸靈素的穩(wěn)定；
[0027](3)本發(fā)明所述方法收率高，活性成分楸靈素的收率可以達到90%以上；
[0028](4)本發(fā)明采用物理方法，通過天然結冰機制完成，整個操作過程中不使用任何有機溶劑，有效防止有機溶劑污染，保留發(fā)酵液原有成分，保證楸靈素純度，并對操作人員無毒害。

【具體實施方式】
[0029]下面結合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0030]下述實施例中楸樹內生真菌發(fā)酵液的制備包括如下步驟:
[0031]一、內生真菌的分離:分裂內生真菌并且采用菌絲尖端切割法進行純化；
[0032]二、誘導孢子產生:將長枝木霉CCTCC Μ 208102接種到PDA培養(yǎng)基上，將長有菌絲的PDA培養(yǎng)基切下一塊，放于CMX培養(yǎng)基上，室溫下培養(yǎng)，1到3天后有孢子長出；
[0033]三、液體發(fā)酵培養(yǎng):挑取孢子轉接到裝有PDA液體培養(yǎng)基中，26?28°C，180rpm搖床震蕩培養(yǎng)，1?8天后終止發(fā)酵，即得。
[0034]實施例1
[0035]本實施例涉及一種楸樹內生真菌發(fā)酵液濃縮分離楸靈素的方法，包括如下步驟:
[0036](1)調整發(fā)酵液pH為4 ;
[0037](2)發(fā)酵液預冷到1°C ；
[0038](3)設定發(fā)酵液和冷阱之間的傳熱溫差為4°C冷凍發(fā)酵液，每次加入1毫升0°C的碎冰，當碎冰完全融化后再次加入1毫升o°c的碎冰，直到發(fā)酵液開始結冰為止；
[0039](4)設定發(fā)酵液和冷阱之間的傳熱溫差為2°C繼續(xù)冷凍發(fā)酵液，直到液態(tài)發(fā)酵液體積縮小為原來的十分之一，實現10倍濃縮，停止冷凍。
[0040]去除冰塊，收集發(fā)酵液，發(fā)現發(fā)酵液顏色加深，采用HPLC方法測定發(fā)酵液中楸靈素濃度，計算楸靈素含收率為90% ；
[0041]本實施例方法在90%收率情況下實現了楸樹內生真菌發(fā)酵液10倍濃縮。
[0042]實施例2
[0043]本實施例涉及一種楸樹內生真菌發(fā)酵液濃縮分離楸靈素的方法，包括如下步驟:
[0044](I)調整發(fā)酵液pH為8 ;
[0045](2)發(fā)酵液預冷到4°C ；
[0046](3)設定發(fā)酵液和冷阱之間的傳熱溫差為6°C冷凍發(fā)酵液，每次加入I毫升0°C的碎冰，當碎冰完全融化后再次加入I毫升0°C的碎冰，直到發(fā)酵液開始結冰為止。
[0047](4)設定發(fā)酵液和冷阱之間的傳熱溫差為4°C繼續(xù)冷凍發(fā)酵液，直到液態(tài)發(fā)酵液體積縮小為原來的十五分之一，實現15倍濃縮，停止冷凍。
[0048]去除冰塊，收集發(fā)酵液，發(fā)現發(fā)酵液顏色加深，采用HPLC方法測定發(fā)酵液中楸靈素濃度，計算楸靈素含收率為93% ；
[0049]本實施例方法在93%收率情況下實現了楸樹內生真菌發(fā)酵液15倍濃縮。
[0050]實施例3
[0051]本實施例涉及一種楸樹內生真菌發(fā)酵液濃縮分離方法，包括如下步驟:
[0052](I)調整發(fā)酵液pH為10 ;
[0053](2)發(fā)酵液預冷到1°C ；
[0054](3)設定發(fā)酵液和冷阱之間的傳熱溫差為2°C冷凍發(fā)酵液，每次加入I毫升0°C的碎冰，當碎冰完全融化后再次加入I毫升o°c的碎冰，直到發(fā)酵液開始結冰為止。
[0055](4)設定發(fā)酵液和冷阱之間的傳熱溫差為1°C繼續(xù)冷凍發(fā)酵液，直到液態(tài)發(fā)酵液體積縮小為原來的十五分之一，實現15倍濃縮，停止冷凍。
[0056]去除冰塊，收集發(fā)酵液，發(fā)現發(fā)酵液顏色加深，采用HPLC方法測定發(fā)酵液中楸靈素濃度，計算楸靈素含收率為96% ；
[0057]本實施例方法在96%收率情況下實現了楸樹內生真菌發(fā)酵液15倍濃縮。
[0058]實施例4
[0059]本實施例涉及一種楸樹內生真菌發(fā)酵液濃縮分離方法，包括如下步驟:
[0060](I)調整發(fā)酵液pH為8 ;
[0061](2)發(fā)酵液預冷到1°C ；
[0062](3)設定發(fā)酵液和冷阱之間的傳熱溫差為2°C冷凍發(fā)酵液，每次加入I毫升0°C的碎冰，當碎冰完全融化后再次加入I毫升o°c的碎冰，直到發(fā)酵液開始結冰為止。
[0063](4)設定發(fā)酵液和冷阱之間的傳熱溫差為1°C繼續(xù)冷凍發(fā)酵液，直到液態(tài)發(fā)酵液體積縮小為原來的二十分之一，實現20倍濃縮，停止冷凍。
[0064]去除冰塊，收集發(fā)酵液，發(fā)現發(fā)酵液顏色加深，采用HPLC方法測定發(fā)酵液中楸靈素濃度，計算楸靈素含收率為96% ；
[0065]本實施例方法在96%收率情況下實現了楸樹內生真菌發(fā)酵液20倍濃縮。
[0066]實施例5
[0067]本實施例涉及一種楸樹內生真菌發(fā)酵液濃縮分離方法，技術方案與實施例4相同，不同之處在于，步驟(2)中預冷溫度為0°C。采用HPLC方法測定發(fā)酵液中楸靈素濃度，計算楸靈素含收率為92%。
[0068]對比例1
[0069]本對比例是實施例4的對比例，技術方案與實施例4相同，不同之處在于參數設置，即在步驟(1)中，發(fā)酵液的pH為3;采用HPLC方法測定發(fā)酵液中楸靈素濃度，計算楸靈素含收率為62%。
[0070]對比例2
[0071]本對比例是實施例4的對比例，技術方案與實施例4相同，不同之處在于參數設置，即在步驟(1)中，發(fā)酵液的pH為11 ;采用HPLC方法測定發(fā)酵液中楸靈素濃度，計算楸靈素含收率為80%。
[0072]對比例3
[0073]本對比例是實施例4的對比例，技術方案與實施例4相同，不同之處在于參數設置，即在步驟(2)中，發(fā)酵液的預冷溫度為_1°C;采用HPLC方法測定發(fā)酵液中楸靈素濃度，計算楸靈素含收率為64%。
[0074]對比例4
[0075]在60°C和0.07大氣壓真空條件下旋轉蒸發(fā)濃縮1升的內生真菌發(fā)酵液到100毫升，發(fā)現發(fā)酵液顏色加深，采用HPLC方法測定發(fā)酵液中楸靈素濃度，計算楸靈素含收率為36% ;本對比例在36%收率情況下實現了楸樹內生真菌發(fā)酵液10倍濃縮。
[0076]綜上所述，本發(fā)明所述通過冷凍結冰過程濃縮分離楸樹內生真菌發(fā)酵液的方法可以實現10倍以上的濃縮比，同時保證90%以上的活性成分楸靈素含量。克服了較高溫度的旋轉蒸發(fā)濃縮內生真菌發(fā)酵液時發(fā)生的或形成成分楸靈素降解和收率下降問題，可以實現楸樹內生真菌發(fā)酵液中楸靈素的高效濃縮，為后續(xù)精細分離奠定基礎，是楸靈素分離的關鍵技術之一。
[0077]以上對本發(fā)明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實施方式，本領域技術人員可以在權利要求的范圍內做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實質內容。
【權利要求】
1.一種從楸樹內生真菌發(fā)酵液中濃縮分離楸靈素的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: 步驟一、調整楸樹內生真菌發(fā)酵液pH為4?10 ; 步驟二、預冷PH調整后的楸樹內生真菌發(fā)酵液至預冷溫度O?4°C ; 步驟三、在保持晶核存在的情況下對步驟二所得楸樹內生真菌發(fā)酵液進行緩慢降溫至結冰； 步驟四、繼續(xù)緩慢降溫結冰，直至未結冰發(fā)酵液體積與發(fā)酵液總體積比為設定值；停止降溫，收集未結冰的發(fā)酵液，即得楸靈素濃縮液。
2.根據權利要求1所述的從楸樹內生真菌發(fā)酵液中濃縮分離楸靈素的方法，其特征在于，步驟一中，所述楸樹內生真菌發(fā)酵液的pH為8?10。
3.根據權利要求1所述的從楸樹內生真菌發(fā)酵液中濃縮分離楸靈素的方法，其特征在于，步驟二中，所述楸樹內生真菌發(fā)酵液的預冷溫度為IV。
4.根據權利要求1所述的從楸樹內生真菌發(fā)酵液中濃縮分離楸靈素的方法，其特征在于，步驟三中，所述緩慢降溫中的傳熱溫差不大于6°C。
5.根據權利要求1所述的從楸樹內生真菌發(fā)酵液中濃縮分離楸靈素的方法，其特征在于，步驟四中，所述緩慢降溫中的傳熱溫差不大于4°C。
6.根據權利要求1所述的從楸樹內生真菌發(fā)酵液中濃縮分離楸靈素的方法，其特征在于，步驟三、四中，所述緩慢降溫的方式包括持續(xù)加入晶核。
7.根據權利要求6所述的從楸樹內生真菌發(fā)酵液中濃縮分離楸靈素的方法，其特征在于，所述晶核包括O V碎冰。
8.一種從楸樹內生真菌發(fā)酵液中濃縮分離楸靈素的方法的應用，所述應用具體為，用于溶液中溶質的濃縮、分離。
【文檔編號】C07G99/00GK104387425SQ201410532262
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月11日 優(yōu)先權日:2014年10月11日
【發(fā)明者】苗志奇, 朱閃爍, 胡郁楠, 馮婷婷, 胡丹 申請人:上海交通大學