專利名稱：用于固定酶及生物活性物的再生絲素蛋白及其復合材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬高分子化學技術(shù)領(lǐng)域，是一種酶及生物活性物的固定基材。
酶是一種高效、高度專一的生物催化劑，在人類歷史上它的應用很早就開始了，而且日益廣泛。但酶一個致命的弱點是穩(wěn)定性較低，對于高溫、有機溶劑或極端的PH極其敏感。從而給酶的分離、制備、應用以及回收帶來了一定的困難。固定化酶的出現(xiàn)克服了這一缺點，為酶的應用開辟了新的前景。
酶的固定化方法很多，大致可以分為物理方法(如吸附、、包埋)和化學方法(如共價鍵合)。固定化酶的性能如何取決于固定基材及方法。最近幾年，發(fā)現(xiàn)絲素蛋白作為酶的固定基材具有其它高分子材料所沒有的優(yōu)點。它固定酶的原理是建立在絲素蛋白從可溶性的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成不溶性的3一折疊結(jié)構(gòu)同時完成酶的固定化。1986年日本的Nakayama，H.等用絲素蛋白固定了脂肪酶，隨后日本學者Asakura，T.等報道用絲素蛋白固定了葡萄糖化酶、過氧化物酶等。本發(fā)明者也曾用絲素蛋白固定了葡萄糖化酶和脲酶，并制成了酶電極作為生物傳感器。90年代以來，日本學者還用絲素蛋白來固定抗體、抗原、動物細胞及微生物。用絲素蛋白作為酶及生物活性物的固定基材，雖然有其獨特的優(yōu)點。但是，絲素蛋白一般直接從桑蠶中制取，受到季節(jié)的嚴格限制。另一方面，絲素蛋白在干燥條件下及有機體系中容易變脆，影響了它有應用。
本發(fā)明的目的在于提供一種來源廣泛、性能優(yōu)良的材料作為酶及生物活性物的固定基材。
過去人們一直認為蠶絲在絲織廠經(jīng)過拉伸和高溫處理，蠶絲蛋白發(fā)生變性，失去了它原有的一些性能，不能恢復其原來的結(jié)構(gòu)。因而，沒有人利用絲織廠里的廢絲，作為固定酶及生物活性物的基本材料來源。本發(fā)明為解決目前固定基材的材料來源問題，從絲織廠廢蠶絲中制得再生絲素蛋白，并進一步利用性能優(yōu)良的高分子材料進行物理改性，獲得性能優(yōu)良的再生絲素蛋白高分子復合材料，作為酶及生物活性物的固定基材。
本發(fā)明采用絲織廠里的廢蠶絲經(jīng)過再生處理得到再生絲素蛋白。這種再生絲素蛋白仍具有活蠶體中的蠶絲蛋白的有關(guān)性能，可以應用于酶及其他生物活性物的固定。這些酶包括葡萄糖氧化酶、過氧化物酶、脲酶、脲酸氧化酶、氨基酸氧化酶、脂肪酸、纖維素酶等各種酶，生物活性物包括抗體、抗原、動物細胞、微生物等。用再生絲素蛋白固定后，其活性保持不變，生物壽命大大延長。
再生絲素蛋白的制備方法如下將絲織廠的廢蠶絲用0.1～3％的NaHCO3在90～105℃溫度條件處理20～60分鐘，然后用去離子水清洗，再將其溶解在7—10MLiBr溶液中，在半透膜袋中透析48～96小時，除去不溶物，即得到完全清晰透明的再生絲素蛋白溶液。對酶(或生物活性物)固定化時，按一定比例的酶溶液和再生絲素蛋白溶液完全混和均勻。除去溶劑水，根據(jù)需要，可以將固定化酶制成粉末、顆粒、膠凍及膜薄等。對其他生物活性物的固定化方法相似。
為了克服再生絲素蛋自在干燥狀態(tài)下和在有機體系中變脆不利于重復使用的問題，本發(fā)明進一步用性能優(yōu)良的高分子材料進行物理改性，即將再生絲素蛋白和這些高分子材料制成復合材料。用于復合的高分子材料有聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、海藻酸納、纖維素及其衍生物等。這些復合材料作為酶和生物活性物的固定基材非常理想，既保持了絲素蛋白的優(yōu)點，又發(fā)揮了高分子材料的優(yōu)良性能，消除了絲素蛋白的弱點，從而解決了工業(yè)化生產(chǎn)中的原料來源和材料性能問題。
復合材料的制備方法如下將前述的高分子材料的一種，如聚乙烯醇，完全溶解于水中，除去一些不溶物，得到具有一定粘度的清晰透明的高分子材料溶液，重量濃度為1—5％，按1∶0.4～1∶6的比例，更合適為1∶3～1∶5的比例與重量濃度為1—3％的再生絲素蛋白溶液，完全混合，除去溶劑，即得到復合材料。根據(jù)需要，可以將這種復合材料制成粉末、顆粒、膠凍及薄膜等。
酶的固定化是把酶完全溶解于由上述再生絲素蛋白和某種高分子復合材料配制而成的溶液中，除去溶劑水，即得到不同形狀的固定化酶。其他生物活性物的固定化方法都類似。
由于采用包理方法，不用任何交聯(lián)劑，所以方便可行，根據(jù)需要，固定化酶可以制成粉末、顆粒、膠凍及薄膜，固定化酶可以在更寬的PH值(6.0～8.0℃)、更高的溫度(60℃)時使用，而且保存2個月后，活性基本不變，連續(xù)工作8小時酶的活性還可以保存85％。用再生絲素蛋白固定生物活性物，如抗體、抗原、動物細胞、微生物等，它們的活性也基本保持不變，壽命大大增長。上述這些固定物可以應用于生物傳感器及反應器等方面。如固定化的葡萄糖氧化酶可以制成葡萄糖傳感器，過氧化物酶可以在更高的溫度和更寬的PH值范圍內(nèi)使用，而且快速、重現(xiàn)性好，測定一個樣品只要20秒，同一樣品10次測定的標準偏差只有2.8％。
下面以葡萄糖氧化酶固定為例子，說明本發(fā)明提供的再生絲素蛋白及其高分子復合材料作為固定基材的有關(guān)性能。以再生絲素蛋白用于對葡萄糖氧化酶的固定，得到的固定化酶的性能如下線性范圍2.5×10-5～3.2×10-3mol/L，使用的PH值范圍為5.0～9.0，最佳值為7.0～7.5。使用的溫度范圍不高于65℃，使用壽命在30℃下連續(xù)工作5小時，活性仍達80％，保存壽命在4℃下保存75天，活性沒有明顯變化，有90％的活性。
以再生絲素蛋白與聚乙烯醇的復合材料用于對葡萄糖氧化酶的固定。復合材料性能吸水性和機械強度大大提高，純再生絲素膜的吸水性為100％，最大拉伸強度為3.4×103牛頓/cm2，而復合材料的吸水性提到500％，最大拉伸強度提高到5.9×103牛頓/cm2。固定化酶的性能線性范圍為1.0× 10-5～1.8×10-3mol/L，使用的PH值范圍為5.0～9.0，最佳值為7.0～7.5，使用的溫度范圍為在50℃以下，使用壽命在30℃下連續(xù)工作5小時，活性還有85％，保存壽命在4℃下保存75天，其活性變化不大，仍有86％的活性。
權(quán)利要求
1.一種用于固定酶及生物活性物的基材，其特征于該基材為由廢絲經(jīng)過再生處理制得的再生絲素蛋白及其高分子復合材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于固定酶及生物活性物的基材，其特征在于復合材料中的高分子材料為聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、海藻酸鈉、纖維素及其衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于固定酶及生物活性物的基材，其特征在于其中的再生絲素蛋自由如下方法制備將絲織廠的廢絲用0.1～3％的NaHCO3在90～105℃溫度下處理20～60分鐘，然后用去離子水清洗，再將其溶解于7—10MLiBr溶液中，在半透膜袋中透折48～96小時，除去不溶物，即得清晰透明的再生絲素蛋白溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于固定酶及生物活性物的基材，其特征在于其中的復合材料由如下方法制備將高分子材料完全溶解于水中，除去不溶物，得到濃度為1—5％的清晰透明的高分子材料溶液，再按1∶0.4～1∶6的比例與濃度為1～3％的再生絲素蛋白溶液完全混合，除去溶劑，即得到復合材料。
全文摘要
本發(fā)明屬高分子化學技術(shù)領(lǐng)域，是一種酶及生物活性物的固定基材。本發(fā)明利用絲織廠的廢絲，經(jīng)處理制得再生絲素蛋白，并進一步利用高分子材料進行物理改性，獲得再生絲素蛋白高分子復合材料。用再生絲素蛋白及其高分子復合材料作為固定基材，可以克服絲素蛋白的材料來源和材料性能的問題，并使固定化酶及生物活生物具有良好的性能。根據(jù)需要產(chǎn)品可以制成粉末、顆粒、膠凍及膜等形式。活性可以在更寬的pH值、溫度范圍內(nèi)保留，壽命也大大提高。
文檔編號C07K1/34GK1128764SQ9511164
公開日1996年8月14日 申請日期1995年5月24日 優(yōu)先權(quán)日1995年5月24日
發(fā)明者劉永成, 于同隱 申請人:復旦大學