專(zhuān)利名稱(chēng)：精制油組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及處理含有以甘油酯為形式、飽和與不飽和脂肪酸的一種油組合物的新型方法，以獲得較高濃度多不飽和脂肪酸的精制產(chǎn)品。本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案提供了增加魚(yú)油組合物中EPA和DHA濃度的方法。
在本說(shuō)明書(shū)中，根據(jù)體系判別多不飽和脂肪酸，體系中σ-或n-數(shù)表示從末端甲基開(kāi)始數(shù)第一個(gè)雙鍵的位置，例如，在σ-3或n-3脂肪酸中，第一個(gè)雙鍵是從酸的末端甲基開(kāi)始數(shù)第3個(gè)碳酸鍵。另外，判別一個(gè)脂肪酸時(shí)，例如C18∶3，它表示鏈中有18個(gè)碳原子和3個(gè)雙鍵的脂肪酸。
商業(yè)上重要的多不飽和脂肪酸有EPA(二十碳五烯酸C20∶5)、DHA(二十二碳六烯酸C22∶6)和AA(二十碳四烯酸，C20∶4)。根據(jù)IUPAC體系命名的這些酸的全稱(chēng)是EPA順-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸DHA順-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸AA順-5，8，11，14-二十碳四烯酸眾所周知，EPA和DHA特別是在醫(yī)藥和食品工業(yè)上被證明有著越來(lái)越高的價(jià)值。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些酸在某些海產(chǎn)油中的濃度相當(dāng)高，但對(duì)于許多的應(yīng)用，這些海產(chǎn)油必須經(jīng)過(guò)精制，以使EPA和/或DHA的含量增加至適當(dāng)值，或者以降低甚至去除原料油中固有的某些其它物質(zhì)的濃度。例如，用于制藥和食品工業(yè)時(shí)，必須基本上完全去除海產(chǎn)油中所有常見(jiàn)的寄生蟲(chóng)，甚至從離密集耕種的大陸地區(qū)十分遙遠(yuǎn)的海域中捕到的魚(yú)中得到的油也必須經(jīng)過(guò)這種處理。
如果要求EPA和DHA具有非毒性的生物活性，對(duì)應(yīng)于其自然產(chǎn)生狀態(tài)，它們必須是全-順式(Z-Z)構(gòu)型。但是，這些酸在加熱時(shí)極其脆弱，它們非常易于發(fā)生快速低聚、異構(gòu)化和過(guò)氧化反應(yīng)。因此，很難不冒這些所需的酸以其有用的形式受到損失的危險(xiǎn)來(lái)凈化含有EPA和DHA的海嚴(yán)油組合物。
存在于海產(chǎn)油中的EPA和DHA絕大多數(shù)的形式是其甘油三酯。直到現(xiàn)在，大多數(shù)實(shí)際應(yīng)用的精制方法是用低分子量醇(通常為乙醇)酯化油開(kāi)始，或者以水解油生成游離酸或其鹽開(kāi)始，然后開(kāi)始分餾該油，回收所需的產(chǎn)品。
但是，由于海洋生原材料的復(fù)雜性，用任何單一的分餾技術(shù)都不易制備高純度的多不飽和脂肪酸衍生物。因此，通常采用多種技術(shù)組合，選擇的特定組合取決于原材料組成物、產(chǎn)品所需的濃度和其它質(zhì)量指標(biāo)。尿素配合法是常用于回收高含量EPA和/或DHA組合物方法的一種分餾技術(shù)。
尿素具有與直鏈有機(jī)化合物形成固體配合物的有用特性。如果將含有脂肪酸或酯的海產(chǎn)油組合物加入尿素溶液中，它就會(huì)與酸的較飽和部分形成晶體配合物。可以除去晶體，剩下較不飽和的脂肪酸或脂肪酸酯的殘留液。
尿素配合法已被用于游離脂肪酸和該脂肪酸的甲酯或乙酯。可以使用表面被刮的換熱器作為尿素吸著形成的反應(yīng)器，連續(xù)操作。分餾酯時(shí)，通常的步驟似乎是首先使油與醇和/或醇/水反應(yīng)，然后在尿素配合前分離酯/游離脂肪酸。但是，也可以按EP-A-0255824所述進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)組合的酯化和尿素分餾過(guò)程。
當(dāng)這一方法與諸如兩個(gè)或多個(gè)分子精餾步驟組合使用時(shí)，有可能從原料海產(chǎn)油中制備出精制產(chǎn)品，其中含有85％wt.或更多的n-3多不飽和脂肪酸，主要是EPA和DHA。但是，精制產(chǎn)品的總回收率不合需要的低。在采用這類(lèi)常規(guī)分餾方法的典型工業(yè)操作中，人們不太可能僅期望從1000噸原料海產(chǎn)油中回收約60-80噸85％n-3脂肪酸濃縮物，即回收率只有6-8％。這一不佳的產(chǎn)率不僅意味著這類(lèi)精制方法非常昂貴，而且意味著它們需要笨重而復(fù)雜的設(shè)備。
許多環(huán)境污染物(如殺蟲(chóng)劑和多氯聯(lián)苯)的親油特性造成這些化合物在海洋脂類(lèi)中的積累。不幸的是，尿素不與許多這類(lèi)污染物形成配合物，結(jié)果是，尿素配合后剩下的濃縮物中含有與原始海產(chǎn)油相比更多的殺蟲(chóng)劑和其它環(huán)境污染產(chǎn)物，這種高含量值在許多領(lǐng)域中都是不可接受的。結(jié)果是，在目前以尿素配合制備人類(lèi)食用的精制魚(yú)油為基礎(chǔ)的精制方法中，必須包括復(fù)雜和昂貴的凈化步驟，以將污染物的含量降低至可接受的值。
本發(fā)明的目的是提供一種改進(jìn)的方法，來(lái)增加油組合物中多不飽和脂肪酸的含量，特別是一種很好地適用于高產(chǎn)率地從魚(yú)油中回收EPA和/或DHA的工業(yè)用方法。
正如已知的，脂肪酶很適宜于在涉及海產(chǎn)油中高度不穩(wěn)定的n-3多不飽和脂肪酸的方法中用作催化劑。這是因?yàn)樗鼈冇械蜏叵伦饔玫哪芰?、中性pH值和作用溫和，這就幫助使諸如順-反異構(gòu)、雙鍵遷移、聚合、氧化等等不希望的副反應(yīng)的發(fā)生降至最低。因此，在海產(chǎn)油脂肪酸的水解中使用脂肪酶已有效果很好的記載。
例如，Lie和Lambertsen在Comp.Biochem.Physiol.80B No.3，第447-450頁(yè)，1985上報(bào)道了從鱈魚(yú)中獲得的腸道脂肪酶優(yōu)先水解細(xì)鱗胡瓜魚(yú)油中以甘油三酯的形式存在的多不飽和脂肪酸18∶4、20∶5、22∶6的事實(shí)。據(jù)他們報(bào)道，這一特定性在酸20∶5，即EPA中表現(xiàn)尤其突出。
另一方面，Lie和Lambertsen還發(fā)現(xiàn)，C14-C18飽和和單不飽和脂肪酸作為細(xì)鱗胡瓜魚(yú)中的甘油三酯，優(yōu)先被Candida cylindracea脂肪酶水解，而長(zhǎng)鏈單烯、C20∶1和C22∶1，特別是多不飽和脂肪酸C18∶4，以及從較小程度上來(lái)說(shuō)EPA、DHA，都抵制水解(Lie和Lambertsen，F(xiàn)ette，Seifen，Anstrichrmittel，88，365，1986)。
日本專(zhuān)利說(shuō)明No.59-14793-Noguchi等人敘述了以脂肪酶在飽和和不飽和酸之間作用的類(lèi)似差別為基礎(chǔ)，制備高度多不飽和脂肪酸的濃縮物的方法。從諸如沙丁魚(yú)和鯖魚(yú)油等各種海產(chǎn)油中得到的乙酯用各種脂肪酶(Candida Cylindracea，Aspergillus rhizopus和Mucormiehei)水解。被水解的脂肪酸分離出后，選擇性水解得到的乙酯濃縮物中含高達(dá)25％的EPA和17％的DHA。
另一日本專(zhuān)利172691-Nippon Oil and Fats，1990敘述了一種以用Candida sp.Lipase水解海產(chǎn)油為基礎(chǔ)的方法。EPA或其酯從游離脂肪酸組分中獲得，DHA或其酯從剩余甘油酯組分中獲得。方法的后續(xù)部分包括脂肪酸和甘油酯組分的分離、用低級(jí)烷基酯化、用尿素配合法濃縮多不飽和脂肪酸，以及進(jìn)一步用分子精餾法、超臨界CO2流體萃取法或液相色譜法凈化。Takagi(Am.Oil Chem.Soc.66，488，1988)敘述了一種以用固定Mucor miehei脂肪酶分離EPA和DHA的逆反法為基礎(chǔ)的方法。
用尿素加合法從日本沙丁魚(yú)油中得到的多不飽和脂肪酸濃縮物在室溫下的正已烷介質(zhì)中用甲醇酯化。在EPA和DHA之間作用不同的脂肪酶和選擇性的酯化反應(yīng)提供一種含51％EPA和6％DHA的富含EPA甲酯濃縮物，以及一種含52％DHA和12％EPA的富含DHA游離脂肪酸濃縮物，比例分別為59至41。
Yamane及其合作者最近已經(jīng)使用幾種脂肪酶選擇性地水解鱈魚(yú)肝油和精制沙丁魚(yú)油(Agric.Biol.Chem.54，1459，1990)。非區(qū)域?qū)Ｒ恍缘腃andida cylindracea和1，3-專(zhuān)一性Aspergillus niger脂肪酶得到的結(jié)果最好，但是沒(méi)有任何脂肪酶能夠顯著提高甘油酯產(chǎn)品的EPA含量。
從使用脂肪酶水解海產(chǎn)油脂肪酸酯的現(xiàn)有工作中明顯看出，不同脂肪酶的作用大不相同，同樣，脂肪酶展示出一種脂肪酸和另一種之間，或者一類(lèi)脂肪酸和另一類(lèi)之間十分明顯的選擇性。
某些脂肪酶的這一基質(zhì)選擇性為Zuyi和Ward所利用，他們敘述了鱈魚(yú)肝油的脂肪酶催化醇解，制備富含n-3多不飽和脂肪酶餾分(Zuyi和Ward，“Lipase-catalyzed alcoholysis to concentrate the n-3polyunsaturated fatty acid of cod liver oil”，Enzyme Microb.Technol.，1993，15，July，601-606)。作者研究了9種脂肪酶，他們發(fā)現(xiàn)，Pseudomonas sp.脂肪酶(Amano International Enzyme Co的CES)醇解魚(yú)油率比其它脂肪酶高，而且生產(chǎn)出的甘油單酯明顯富含EPA和DHA。在該現(xiàn)有方法中，醇(乙醇和異丙醇被使用)既是反應(yīng)物又是反應(yīng)的溶劑。
Zuyi和Ward研究了反應(yīng)介質(zhì)中水濃度的影響，他們發(fā)現(xiàn)，脂肪酶CES進(jìn)行的醇解(用異丙醇)隨水含量在0-7.5％v/v范圍內(nèi)增加而增加。提供的數(shù)據(jù)顯示，水含量為5％v/v時(shí)最佳，并且甚至在水含量為2.5％v/v時(shí)，油中超過(guò)40％的原始甘油三酯在12小時(shí)后仍不發(fā)生反應(yīng)(這些水含量指的是加入反應(yīng)體系的水的含量，不考慮不可避免地存在于魚(yú)油和“干”酶中的少量水。伴隨發(fā)生的是，相當(dāng)多的甘油三酯水解成游離脂肪酸(一般為30％以上)，例如水含量為5％v/v時(shí)，有18.9％水解(與僅有15.5％醇解對(duì)比)。
盡管Zuyi和Ward的方法具有科學(xué)意義，但不幸的是，它沒(méi)有提供一種改進(jìn)的工業(yè)用制備純凈EPA/DHA組合物的方法。具體地說(shuō)，顯著量的游離脂肪酸不可避免地存在于脂肪酶催化的產(chǎn)品中，使隨后的凈化所需n-3多不飽和脂肪酸變得難以進(jìn)行。例如，由于游離脂肪酸的低揮發(fā)性，使得用常規(guī)分子精餾技術(shù)不能將其從甘油酯中分離出來(lái)。另外，由于酯和游離脂肪酸的極性基本上不同，盡管單和二甘油酯是中等極性，但用萃取法不能將其從甘油酯中分離出來(lái)。正如下面所表現(xiàn)的，比較來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有利地采用分子精餾技術(shù)，不僅從飽和和單不飽和脂肪酸酯中分離出多不飽和脂肪酸甘油酯，而且同時(shí)實(shí)現(xiàn)諸如殺蟲(chóng)劑和多氯聯(lián)苯的環(huán)境污染物從所需的多不飽和脂肪酸甘油酯餾分中除去。
我們出乎意料地發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明，包括Zuyi和Ward所用的Pseudomonas sp.脂肪酶在內(nèi)的某些脂肪酶可以用于在基本上無(wú)水的反應(yīng)條件下選擇性地使海產(chǎn)油甘油三酯中的飽和和單不飽和脂肪酸的酯部分發(fā)生酯基轉(zhuǎn)移。我們發(fā)現(xiàn)，在基本上不伴隨發(fā)生水解的情況下，這一酯基轉(zhuǎn)移作用導(dǎo)致產(chǎn)生一種更為敏感的飽和脂肪酸的單酯混合物，剩余的n-3多飽和長(zhǎng)鏈脂肪酸仍連接在甘油部分，成為酯，主要是甘油單酯和甘油二酯，也有甘油三酯，取決于轉(zhuǎn)化的程度不同。
更具體地講，本發(fā)明提供處理含有以甘油三酯為形式的飽和和不飽和脂肪酸的油組合物的方法，以獲得含有較高濃度多不飽和脂肪酸的精制產(chǎn)品，該方法包括(a)在基本上無(wú)水的條件下，在脂肪酶的存在下，使油組合物經(jīng)歷用C1-C6醇進(jìn)行的酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，該脂肪酶具有優(yōu)先催化飽和和單不飽和脂肪酸酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的活性，所說(shuō)的C1-C6醇在反應(yīng)中的存在量不多于基于存在的甘油三酯的15摩爾當(dāng)量；和然后(b)將富含多不飽和脂肪酸甘油酯的殘余餾分從用所說(shuō)的脂肪酶催化的酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)法產(chǎn)生的含有飽和和單不飽和脂肪酸酯的餾分中分離出來(lái)。
正如所指出的，本發(fā)明方法采用一種脂肪酶，該脂肪酶具有優(yōu)先催化海產(chǎn)油中飽和和單不飽和脂肪酸酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的活性。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，許多脂肪酶不是在本發(fā)明的酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)中僅有相當(dāng)差的活性或沒(méi)有活性，就是在飽和和單不飽和脂肪酸與多不飽和脂肪酸之間的選擇性差。這種情況在下述酶上發(fā)生，如Ceotrichum candidum(GCL；Amano GC)，Aspergillus niger(ANL；Amano A)，Candeda rugosa(CRL；Amano AY)，Chromobacterium viscosum(CVL；Sigma)，Humicula lanuginosa(HLL；Amano CE)，Rhizopus delemar(RDL；Amano D)，Rhizopus oryzae(ROL；Amano F)，Penicillium camembertii(PCL；Amano G)，Candidalipolytica(CLL；Amano L)，Mucor javanicus(MJL；Amano M)andRhizopus niveus(RNL；Amano N)。我們發(fā)現(xiàn)，Candida antarctica(CAL；Novo SP435)在酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)中具有高度的活性，但不幸的是它在兩類(lèi)不同的脂肪酸間幾乎沒(méi)有或根本沒(méi)有選擇性，因此不適用于本發(fā)明。
我們已發(fā)現(xiàn)的可用于本發(fā)明方法的脂肪酶的實(shí)例包括Mucor miehei脂肪酶(MML；Novo Lipozyme)，它具有良好的酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)活性，具有在多不飽和脂肪酸與飽和和單不飽和脂肪酸之間合理的選擇性；Candida cvlindracea(CCL；Sigma)和Penicillium roquefortii(PRL；Amano R)脂肪酶，兩者均有滿(mǎn)意的選擇性，盡管其活性不如其它一些脂肪酶；以及Pseudomonas fluorescens(PFL；Amano PS)和Pseudomonassp.(PSL；Amano AK)脂肪酶，兩者均展示出良好的活性和選擇性，因此被本發(fā)明優(yōu)選使用。
將脂肪酶固定于載體材料上可能有一些好處。例如，可以使脂肪酶有較高的穩(wěn)定性，所以它們持續(xù)更長(zhǎng)的時(shí)間。這樣還可以使它們更易于回收，并有可能再利用，這就大大降低了它們的損耗。同時(shí)，采用固定酶可以使酯化反應(yīng)更易于進(jìn)行，而且脂肪酶易于連續(xù)作用，這對(duì)于酶的工業(yè)化方法同樣是極其重要的。有時(shí)，固定導(dǎo)致酶性能的改善。最后，脂肪酶分散在載體材料的表面時(shí)應(yīng)當(dāng)保證脂肪酶暴露于基質(zhì)中，導(dǎo)致每重量單位的酶的活性大大增加、酶的用量顯著減少，因此降低消耗。
如果需要制備富含EPA和DHA的精制魚(yú)油組合物，那么優(yōu)選使用對(duì)這兩種n-3多不飽和脂肪酸基本上無(wú)活性的一種脂肪酶，即它不顯著地區(qū)別作用于EPA和DHA。在這種情況下，優(yōu)選采用Pseudomonasfluorescens和Pseudomonas sp.脂肪酶，后者尤其優(yōu)選。從AmanoInternational Enzyme Co of Nagoya，Japan可以得到這些脂肪酶。
脂肪酶催化的酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)應(yīng)該在基本上無(wú)水的反應(yīng)條件下進(jìn)行，這是本發(fā)明的一個(gè)關(guān)鍵特點(diǎn)。優(yōu)選地，反應(yīng)體系中水的總量，包括海產(chǎn)油和脂肪酶中的所有水分，應(yīng)該低于1％w/w，優(yōu)選低于0.5％w/w，最優(yōu)選地0.01-0.25％w/w之間。(在典型情況下，海產(chǎn)油反應(yīng)原料中含有0.1-0.2％w/w的水，所用的無(wú)水乙醇中含有0.1-0.2％w/w的水，用作醇試劑的無(wú)水乙醇中含有0.2-0.5％w/w的水，脂肪酶制劑中含有2-2.5％w/w的水。)由于一般為脂肪酶重量的約1-2％的少量水的存在對(duì)于酶體系發(fā)揮活性總是必須的，所以采用完全無(wú)水的反應(yīng)條件是不可行的，但具體的水量很大程度上根據(jù)所使用的酶而確定(例如Candida cylindrica脂肪酶要在本發(fā)明的方法中展示最佳活性，必須加入約10％wt.的水)。正如下文實(shí)例所示，這些非常少的水量不會(huì)引起任何嚴(yán)重的水解反應(yīng)，而且據(jù)上文中Zuyi和Ward報(bào)道，有可能將酯基轉(zhuǎn)移產(chǎn)物中游離脂肪酸的濃度保持在低于3％wt的水平，即水解率僅為約10％。
本發(fā)明的另一關(guān)鍵特性是存在的醇量應(yīng)該限制在基于存在的甘油三酯不多于15摩爾當(dāng)量，優(yōu)選不多于9摩爾當(dāng)量(即醇的3摩爾當(dāng)量是化學(xué)計(jì)量量)。因此，醇主要作為反應(yīng)物，而不是作為溶劑。令人驚奇的是，海產(chǎn)油甘油三酯脂肪酶催化的選擇性酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)在這樣一種基本上無(wú)溶劑的反應(yīng)體系中進(jìn)行得相當(dāng)成功。優(yōu)選地，采用基本上是化學(xué)計(jì)量量的醇，即基于存在的甘油三酯的2至5摩爾當(dāng)量，因?yàn)榇剂砍^(guò)化學(xué)計(jì)量量過(guò)多導(dǎo)致所需的多不飽和脂肪酸的回收率較低。
雖然有可能使用任何的C1-C6醇，但是考慮到可得性和消耗，以及基本上無(wú)水這一反應(yīng)條件的要求，優(yōu)選使用無(wú)水乙醇(典型的水含量為0.1-0.5％wt)。
酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)進(jìn)行的溫度也不關(guān)鍵。但是我們發(fā)現(xiàn)，隨著溫度升高，雖然反應(yīng)速率增加，但反應(yīng)的選擇性降低。一般優(yōu)選反應(yīng)溫度不超過(guò)40℃-60℃，根據(jù)采用的脂肪酶而定，更優(yōu)選在室溫下(約20℃)反應(yīng)。
酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)可以用超臨界流體如超臨界CO2作反應(yīng)介質(zhì)。例如，魚(yú)油的醇解在250bar，40℃在超臨界CO2中進(jìn)行。超臨界CO2流體不僅能用作反應(yīng)介質(zhì)，而且能用于從殘余甘油酯中分離酯和游離脂肪酸。
根據(jù)本發(fā)明，海產(chǎn)油甘油三酯的脂肪酶催化酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)可以用下列簡(jiǎn)化的反應(yīng)方程示意地表示出，乙醇示意的代表C1-C6醇。步驟(a) 其中R1、R2、R3表示原組合物中存在的甘油三酯混合脂肪酸(飽和、單不飽和和多不飽和)R′表示n-3多不飽和脂肪酸和R″表示飽和和單不飽和脂肪酸(為簡(jiǎn)化起見(jiàn)，產(chǎn)物一邊僅有1，2-和2，3-甘油二酯和2-甘油單酯被表示出來(lái))，乙酯餾分從甘油酯餾分中分離出來(lái)適宜于用分子精餾技術(shù)完成，用這種方法，揮發(fā)度相當(dāng)大的乙酯可以容易地從揮發(fā)度較小的殘留甘油酯混合物中除去。由于酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)產(chǎn)物僅含少量游離脂肪酸，這是采用基本上無(wú)水的反應(yīng)條件的結(jié)果，分子精餾后可以得到基本上不含不需要的飽和和單不飽和脂肪酸的殘留餾分。即使分子精餾步驟造成少部分最有揮發(fā)性的甘油單酯出現(xiàn)在餾出物中，但其中絕大部分是鏈相當(dāng)短的脂肪酯的甘油單酯(即幾乎沒(méi)有或根本沒(méi)有EPA或DHA損失到餾出物中)。類(lèi)似地，少部分揮發(fā)度低的酯餾分可以與殘留甘油酯混合物即主要是諸如EPA和DHA的長(zhǎng)鏈脂肪酸一起存在。因此，參與酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的相當(dāng)少量的所需多不飽和脂肪酸中的一部分，在精餾后將仍然存在于殘留餾分中。因此，雖然分子精鎦通常不被認(rèn)為適用于難于實(shí)現(xiàn)的分離，在本發(fā)明方法中證明它令人驚奇地有利。
由于諸如殺蟲(chóng)劑和多氯聯(lián)苯(PCBs)的環(huán)境污染物比長(zhǎng)鏈脂肪酸甘油酯更易揮發(fā)，分子精餾將除去這些甘油酯餾分中的化合物，它們將在餾出物(酯餾分)中提濃。這是在本發(fā)明方法中采用分子精餾的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)。
確實(shí)，本發(fā)明的一個(gè)特定方面提供了從含有以甘油三酯為形式的飽和和不飽和脂肪酸的油組合物中除去環(huán)境污染物的方法，該方法包括下列步驟(a)在基本上無(wú)水的條件下，在具有優(yōu)選催化飽和和單不飽和脂肪酸的酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的活性的脂肪酶的存在下，使油組合物與C1-C6醇發(fā)生酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，所說(shuō)的C1-C6醇在反應(yīng)中的存在量不多于基于存在的甘油三酯的15摩爾當(dāng)量；和然后(b)步驟(a)中得到的產(chǎn)物進(jìn)行一次或多次分子精餾，以回收富含多不飽和脂肪酸的甘油酯的餾分，而且環(huán)境污染物已被優(yōu)先從其中除去。
本發(fā)明方法特別適用于從海洋資源中制備含有高濃度，高于40％wt，優(yōu)選高于70％wt的EPA和DHA的組合物。由于脂肪酶催化的酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)產(chǎn)物含有主要以其乙酯(如果使用乙醇)為形式而不是作為游離酸(多不飽和脂肪酸基本上作為甘油酯存在)存在的不需要的飽和和單不飽和脂肪酸，飽和脂肪酸餾分可以用相當(dāng)溫和的分子精餾法除去，而且所需的多不飽和脂肪酸組份的損失相當(dāng)?shù)?。同時(shí)，如上述討論的，諸如殺蟲(chóng)劑和PCBs的相對(duì)揮發(fā)的環(huán)境污染物隨乙酯餾分一起除去。與常規(guī)制造EPA/DHA濃縮物的方法相比，本發(fā)明，特別是其優(yōu)選實(shí)施方案，具有顯著的優(yōu)點(diǎn)，包括(i)不使用任何溶劑，使體積大大降低，這一效果由于僅使用化學(xué)計(jì)量濃度的醇的能力而得以增強(qiáng)，(ii)酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)可以在例如室溫下的溫和條件下進(jìn)行，將副反應(yīng)減至最小，而且不需投入高能量，(iii)EPA和DHA的回收率很高，回收的產(chǎn)物基本上沒(méi)有受環(huán)境污染物的污染，和(iv)所用的基本上無(wú)水的反應(yīng)條件意味著最低程度的水解反應(yīng)，這樣，酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)得到的甘油酯餾分的分子精餾很好地將所需多不飽和脂肪酸從不需要的飽和和單不飽和脂肪酸中分離出來(lái)。
因此，本發(fā)明方法的醇解過(guò)程可以是制備EPA＋DHA濃縮物的整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程中的最初步驟。在分子精餾或其它方法進(jìn)行后的整個(gè)工藝中，為了實(shí)現(xiàn)飽和脂肪酸乙酯餾分從多不飽和脂肪酸甘油酯餾分中的分離，含有所需多不飽和脂肪酸的后者餾分可以進(jìn)一步處理，以增加存在的特定酸的濃度。例如，如果需要得到含有高濃EPA＋DHA的乙酯組合物，分子精餾得到的甘油酯餾分可以用例如無(wú)水乙醇在催化量的諸如乙醇鈉或乙醇鉀的存在下進(jìn)行化學(xué)酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)得以酯化。這一過(guò)程用下列反應(yīng)方程圖解示意 (為簡(jiǎn)化起見(jiàn)，上面僅表示出1，2-和2，3-甘油二酯和2-甘油單酯)。
產(chǎn)生的甘油可以用已知技術(shù)除去。典型地，這會(huì)導(dǎo)致EPA＋DHA含量接近45-50％wt，與常規(guī)方法相比，多不飽和脂肪酸回收率較高。
更具體地說(shuō)，根據(jù)本發(fā)明獲得高濃度EPA＋DHA組合物的優(yōu)選的完整方法進(jìn)一步包括下列步驟(c)在基本上無(wú)水的條件下，或者例如采用其量?jī)H夠催化酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的諸如乙醇鈉或乙醇鉀的一種堿，在這一堿性環(huán)境中進(jìn)行化學(xué)催化，或者例如采用Candida antarctica脂肪酶進(jìn)行酶催化，用諸如乙醇的低級(jí)醇對(duì)甘油酯餾分進(jìn)行酯基轉(zhuǎn)移；(d)得到的烷基酯產(chǎn)物與烷醇中過(guò)量的尿素加熱至溫度55℃至99℃；(e)將步驟(d)的產(chǎn)物冷卻至例如約0℃-25℃，以沉淀尿素脂肪酸烷基酯加合物，然后分離出所說(shuō)的加合物，留下主要含有n-3脂肪酸酯的溶液；(f)從由步驟(e)得到的殘留溶液中分離出n-3脂肪酸烷基酯；和(g)從由步驟(f)得到的混合物中除去任何溶劑。
在該完整方法的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟(g)中得到的濃縮物經(jīng)一個(gè)或多個(gè)諸如九步驟分子精餾法進(jìn)一步濃縮，以將其中的EPA＋DHA濃度增加至85％wt或更高。
附

圖1示意性地說(shuō)明了根據(jù)本發(fā)明制備85％wt EPA＋DHA乙酯濃縮物的完整制備方法。
作為催化量乙醇鈉或乙醇鉀的存在下用諸如乙醇進(jìn)行甘油酯餾分的化學(xué)酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的替代，這一酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)可以用諸如Candidaantarctica脂肪酶的酶進(jìn)行催化實(shí)現(xiàn)。這一脂肪酶對(duì)n-3多不飽和脂肪酸和其它脂肪酸十分活躍，可以在溫和條件下和不存在溶劑的情況下用于高效地實(shí)現(xiàn)甘油酯餾分的酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，因此進(jìn)一步減少了反應(yīng)體積量。
在某些情形下，可能需要從起始海產(chǎn)油組合物中分離出基本上純凈的單一不飽和脂肪酸。這一分離地制備基本上100％EPA和100％DHA的方法在附圖2中示意表示出來(lái)。本發(fā)明的這一優(yōu)選實(shí)施方案不僅采用Pseudomonas脂肪酶(PSL)根據(jù)本發(fā)明達(dá)到飽和和不飽和脂肪酸的初步分離，而且在后續(xù)步驟中采用選擇性地幫助EPA酯化而不是DHA酯化的Mucormiehei脂肪酶(MML)，由此使此二酸很好地分離，以及采用Candidaantarctica脂肪酶(CAL)實(shí)現(xiàn)制得的富含DHA的甘油酯混合物的醇解。
更具體地講，制備基本上純凈的EPA和基本上純凈的DHA的本發(fā)明優(yōu)選完整方法包括下列步驟(i)在如上所述基本上無(wú)水的反應(yīng)條件下，用PSL催化，用乙醇使起始海產(chǎn)油發(fā)生酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)；(ii)對(duì)脂肪酶催化的酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分子精餾，以回收含有40-50％EPA＋DHA的甘油酯餾分；(iii)在與初步酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)相類(lèi)似的條件下(即基本上沒(méi)有溶劑和水，并使用基本上是化學(xué)計(jì)量量的乙醇)，用Mucormiehei脂肪酶(MML)催化，用乙醇使(ii)中得到的甘油酶餾分發(fā)生酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)；(iv)用與步驟(ii)類(lèi)似的方法進(jìn)行分子精餾，將得到的富含EPA的乙酯餾分與殘留富含DHA的甘油酯混合物分離；(v)用諸如分子精餾與尿素沉淀、色譜等組合的方法整理EPA-乙酯餾分，以將EPA餾分提濃至基本上為100％的純度；(vi)以Candida antarctica脂肪酶(CAL)為催化劑將從步驟(iii)回收的MML催化的酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)得到的富含DHA甘油酯混合物用乙醇進(jìn)行酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)；和(vii)用與步驟(v)使用的類(lèi)似技術(shù)整理得到的DHA乙酯濃縮物，以回收基本上100％純的DHA。
雖然很好地適用于制備含有高濃度EPA和/或DHA的組合物的完整方法是本發(fā)明的一個(gè)特殊優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)該注意到同樣通用的技術(shù)可以用于從海產(chǎn)油產(chǎn)物中分離其它不飽和脂肪酸，如184n-3，204n-3，215n-3和225n-3脂肪酸。本發(fā)明的方法可應(yīng)用于從其它來(lái)源，如發(fā)酵產(chǎn)物和蔬菜及植物油中制備含有多不飽和脂肪酸的油產(chǎn)物。n-6多不飽和脂肪酸是植物和蔬菜油類(lèi)的特征。該n-6脂肪酸包括廿碳四烯酸(AA，204n-6)，8，11，14-二十碳三烯酸(BHGLA203n-6)和γ-9，12，15-十八碳三烯酸(GLA，183n-6)。工業(yè)上采用Mortierella發(fā)酵法也已制得含有廿碳四烯酸的油產(chǎn)物。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，用本發(fā)明的方法從植物或蔬菜油中可能很容易制備含有至少40％wt的廿碳四烯酸的組合物。用于本方法的優(yōu)選脂肪酶是Pseudomonas sp.脂肪酶和Pseudomonas fluorescens脂肪酶。廿碳四烯酸餾分可以進(jìn)一步濃縮至基本上100％的純度。
一般地，用作本發(fā)明方法的反應(yīng)原料的海產(chǎn)油組合物可以是任何來(lái)源于魚(yú)或其它海洋資源的未經(jīng)處理或經(jīng)部分處理的油，該油中含有以甘油三酯為形式的脂肪酸，包括多不飽和脂肪酸。典型地，這一海產(chǎn)油中每一甘油三酯分子中隨機(jī)地或多或少地含有不同脂肪酸酯部分，它們或者是飽和的、單不飽和或者是多不飽和的，或者是長(zhǎng)鏈或者是短鏈。
本發(fā)明由下述實(shí)例得以說(shuō)明實(shí)施例1本實(shí)驗(yàn)的目的是試驗(yàn)在魚(yú)油組合物中將多不飽和脂肪酸，特別是EPA和DHA從飽和和單不飽和脂肪酸中分離出來(lái)的方法中幾種脂肪酶的使用。
受試的脂肪酶是名稱(chēng) 縮寫(xiě)狀態(tài)來(lái)源Mucor miehei MML固定NovoCandida antartica CAL固定NovoCandida cylindracea CCL粉末SigmaPseudomonas fluorescens PFL粉末AmanoPenicillium roguefortiPRL粉末AmanoPseudomonas sp. PSL粉末Amano在一個(gè)試驗(yàn)中，上述各脂肪酶在37C受試，結(jié)果示于表I。在另一個(gè)試驗(yàn)中，兩個(gè)Pseudomanas脂肪酶PFL和PSL在20℃受試，結(jié)果示于表II和III。
實(shí)驗(yàn)步驟如下魚(yú)油甘油三酯由Pronora Biocare a.s.，Norway提供，含有14.9％的EPA和9.8％的DHA。它們不經(jīng)任何處理直接使用。所有溶劑均為分析純，購(gòu)自德國(guó)Merck AG?；瘜W(xué)計(jì)量量的乙醇(無(wú)水)被使用，即基于甘油三酯的3摩爾當(dāng)量，除非另有說(shuō)明。除使用Candida cylindracea脂肪酶的情況外，反應(yīng)系統(tǒng)中不加水。經(jīng)計(jì)算，由于魚(yú)油甘油三酯反應(yīng)原料和脂肪酶的使用，水含量增加至0.3-0.4％wt數(shù)量級(jí)。在使用Candida cylindricea脂肪酶的情況下，加入脂肪酶重量的10％wt的水，得到的反應(yīng)體系的總含水量為約0.8％wt，即，即使在這種情況下，基本上無(wú)水的條件也得以保證。
按照前述步驟(G.G.Hara Ldsson和.Almarsson，Acta ChemicaScandinavica，1991，45723-730)，以氫氣為載體氣體，用30米長(zhǎng)毛細(xì)柱，DB-22530 N 0.25mm的Perkin-Elmer8140氣體色譜對(duì)甲酯進(jìn)行脂肪酸分析。如表II和表III所代表的，為分別詳細(xì)研究PSL和PFL，用制備薄層色譜以合適的時(shí)間間隔從反應(yīng)混合物中分離液體餾分，以監(jiān)控反應(yīng)進(jìn)程。購(gòu)自Merck(Art5721)的硅膠盤(pán)，在用50∶50的氯仿-甲醇洗滌并在110℃加熱30分鐘后使用。用80∶20∶1的石油醚-乙醚-乙酸混合物洗脫。若丹明6G(染料)(Merk)用于使隨后被刮去的脂肪甲基化的和按上法分析的樣條直觀(guān)化。購(gòu)自Digma的C19∶0或C21∶0甲酯在注射前被加入樣品中作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。
在表I所報(bào)告的實(shí)驗(yàn)中，乙酯和甘油酯的分離在Waters PrepLTMSystem500A儀器上進(jìn)行。購(gòu)自Millipore的PrepPak500/二氧化硅柱被10％乙醚在石油醚中以250ml/min的速率洗脫。按照折射檢測(cè)器的指數(shù)，每次操作產(chǎn)生兩個(gè)峰，第一個(gè)出現(xiàn)在約一個(gè)柱體積之后，并含有純乙酯，根據(jù)TLC第二個(gè)大約在含有純甘油三酯的兩個(gè)柱體積之后洗脫。用甲醇將柱中殘余的甘油單酯和甘油二酯洗滌掉。
在一個(gè)典型的步驟中，將脂肪酶(0.5g)加入魚(yú)油(5.0g，約5.67mmol(M.wt.appr.882g/mol))和無(wú)水乙醇(0.80g，17.4mmol)的混合物中。在氮氛圍中，在室溫下(對(duì)表I的實(shí)驗(yàn)，為37℃)緩沖攪拌得到的酶懸浮液。合適時(shí)間后，加入氯仿并過(guò)濾分離酶，終止反應(yīng)。真空(旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器和高真空泵處理)除去有機(jī)溶劑，得到定量產(chǎn)出的粗產(chǎn)品混合物。產(chǎn)品溶解于等體積的氯仿中，并按上文所述注入HPLC儀器中。收集每個(gè)餾分，真空蒸發(fā)掉溶劑，稱(chēng)重并用氣體色譜作最后分析。
當(dāng)采用制備TLC而代替制備HPLC時(shí)，在合適的時(shí)刻用Pasteur移液管從反應(yīng)混合物中移出小試樣(100-200mg)。經(jīng)位于第二個(gè)Pasteur移液管中的棉毛塞過(guò)濾分離掉酶顆粒。在導(dǎo)入TLC盤(pán)之前將每個(gè)試樣稀釋于氯仿(250mg/ml)中。
結(jié)果列于表I-III中第1表-表I，概括了所有受試脂肪酶在37℃(用3摩爾當(dāng)量乙醇)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)結(jié)果
表I
*百分比指基于甘油三酯的脂肪酶的劑量對(duì)于Candida cylindracea(CCL)的結(jié)果是在加入脂肪酶的10％水的情況下得到的，因?yàn)槿舨患尤胨?，該脂肪酶無(wú)活性。我們注意到Candidaantarctica脂肪酶(CAL)對(duì)EPA和DHA的選擇性不佳，因此該脂肪酶在本發(fā)明中沒(méi)有用處。相比之下，所有其它受試脂肪酶都顯示出令人滿(mǎn)意的活性和選擇性，在這一方面兩種Pseudomonas脂肪酶表現(xiàn)尤其突出。
表II在20℃PSL與3摩爾當(dāng)量的乙醇wt％類(lèi)脂類(lèi)
面積％EPA
面積％DHA
面積％EPA＋DHA
重量％EPA
重量％DHA
上表II表明，酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)中Pseudomonas sp.脂肪酶的效果優(yōu)良。因此，13個(gè)小時(shí)后轉(zhuǎn)化率達(dá)到48％，甘油酯中EPA＋DHA的含量為44.9％，EPA回收率91.9％，DHA回收率82.8％。反應(yīng)24小時(shí)后，轉(zhuǎn)化率達(dá)到52％，甘油酯中EPA＋DHA含量為45.8％，EPA和DHA回收率分別為89.5％和77.5％，建議實(shí)際應(yīng)用中在較早階段終止反應(yīng)。
反應(yīng)過(guò)程中，水解副反應(yīng)的程度恒定而且低，為2.5-2.9％。
表III在20℃PFL與3摩爾當(dāng)量的乙醇wt％類(lèi)脂類(lèi)
面積％EPA
面積％DHA
面積％EEA＋DHA
重量％EPA
重量％DHA
上表III表明，酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的良好結(jié)果還可以用Pseudomonasfluorescers脂肪酶獲得，盡管轉(zhuǎn)化速率遠(yuǎn)低于PSL的情況。因此，25小時(shí)后，轉(zhuǎn)化率達(dá)48％，49小時(shí)后這一值增加至60％。另一方面，水解程度有所降低。在25小時(shí)后，EPA和DHA回收率(分別為88.6％和84.1％)和EPA＋DHA組合物(40.5％)方面，該脂肪酶的性能也次于Pseudomonas sp.脂肪酶。
上表I-III中的縮寫(xiě)說(shuō)明如下MG 甘油單酯DG 甘油二酯TG 甘油三酯FFA游離脂肪酯EE 乙酯面積％ EPA面積％ DHA 面積％是基于相應(yīng)GC-色譜的整體作出的。
面積％ EPA＋DHA這些縮寫(xiě)在所有其余的實(shí)施例中也采用。
上述各表清楚地表明，兩種Psedomonas脂肪酶展示出獨(dú)特的對(duì)EPA和DHA的低度親和性以及對(duì)起始甘油三酯的高度親和性。
還注意到，兩種Pseudomonas脂肪酶從一定程度上幫助DHA而不是EPA的酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。這是十分不尋常的情況，因?yàn)槲覀冊(cè)囼?yàn)的所有其它脂肪酶顯示出相反的趨勢(shì)。
從表II和III中我們還注意到，一定時(shí)間之后，MG/DG/TG的比率開(kāi)始從最佳值下降。因此，通常需要在反應(yīng)完成之前結(jié)束酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。
實(shí)施例2該實(shí)驗(yàn)是為較大規(guī)模地試驗(yàn)兩個(gè)Pseudomonas脂肪酶PSL和PFL而設(shè)計(jì)的。
實(shí)施例2a-PSL將Pseudomonas sp.脂肪酶(100g，25 200活性單位/g)加入魚(yú)油(1000g，約1.13mol)和無(wú)水乙醇(170g，3.70mol)的混合物中。在室溫下氮?dú)夥諊校瑢⒌玫降拿笐腋∫悍旁诖帕嚢杵魃陷p緩攪拌。據(jù)計(jì)算，反應(yīng)混合物的水含量約為0.3-0.4％wt。
25小時(shí)后，按照實(shí)例1所述步驟采出試樣并分析。反應(yīng)再繼續(xù)24小時(shí)。采用離心法分離反應(yīng)混合物和脂肪酶(5000rpm，10分鐘)。50小時(shí)后反應(yīng)停止時(shí)，產(chǎn)品具有下列組成
表IV
部分產(chǎn)品(902.4g)在80℃下真空脫氣，以除去揮發(fā)份。將揮發(fā)份收集在用液氮冷凍的冷收集器中。脫氣后剩下844.1g甘油酯/乙酯混合物。在125℃、0.005mbar條件下的分子精餾釜中精餾756.3g這種混合物。得到餾出物358.6g(47.4％)和重388.3g(51.3％)的殘留物。餾份具有下列組成表V
該表顯示，殘留物中含有47.3％EPA＋DHA，即與分子精餾之前相比(見(jiàn)表IV)，這些所需要的n-3多不飽和脂肪酸的濃度提高了。它意味著，在分子精餾后采用已知技術(shù)，即尿素分餾法進(jìn)行進(jìn)一步濃縮，結(jié)果是理想的。
應(yīng)當(dāng)注意到，餾出物中含有可測(cè)量的甘油單酯(10.6％)，而殘余物中含有2.3％的乙酯。如上文所討論的，這些分別主要是相對(duì)短鏈的脂肪酸甘油單酯和長(zhǎng)鏈脂肪酸乙酯。
實(shí)施例2b用PFL酶催化，用乙醇使與實(shí)例2a同樣的1kg油發(fā)生酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。48小時(shí)后反應(yīng)停止。中間產(chǎn)物的組成示于表VI。
表VI
在與實(shí)例2a同樣的條件下將中間產(chǎn)物脫氣和分子精餾，結(jié)果列于下表。
實(shí)施例3分析從類(lèi)似實(shí)例2的3個(gè)中試裝置中得到的產(chǎn)物，確定環(huán)境的污染物的含量。結(jié)果示于下表VII
表VII三個(gè)實(shí)例的結(jié)果(mg/kg)
nd＝未檢測(cè)到HCH＝六氯環(huán)己烷HCB＝六氯苯DDT＝二氯二苯基三氯乙烷上述結(jié)果顯示，污染物在乙酯餾分中提濃。某些殺蟲(chóng)劑在反應(yīng)原料中的含量顯然是恰好低于該分析方法的檢測(cè)限，這就是為什么我們?cè)谝阴ヰs分中檢測(cè)出這些殺蟲(chóng)劑而在原始魚(yú)油中并未檢測(cè)出的原因。在分離乙酯和甘油酯(用分子精餾法)之前，我們采取了一個(gè)溫和的分子精餾步驟以除去反應(yīng)混合物中未反應(yīng)的乙醇。顯然，這一除去乙醇的步驟足以除去部分DDT。分析回收的乙醇(PSL實(shí)例)顯示，DDT總量為0.03mg/kg，但沒(méi)有能檢測(cè)出其它殺蟲(chóng)劑。
實(shí)施例4本實(shí)驗(yàn)的目的是比較固定脂肪酶的不同步驟，并研究本發(fā)明方法中采用固定態(tài)脂肪酶的效果。
A.固定步驟
(i)PSL和PFL固定在離子交換樹(shù)脂(Duolite)上在瓷漏斗中用30mM NaOH(250ml每次)洗滌離子交換樹(shù)脂(Duolite)A562(Duolite International；10.0g)3次，然后將其與水(40ml)和一個(gè)磁力跟蹤器一起放入150ml的燒杯中。用自動(dòng)滴定器(1.00M NaOH)將該溶液的pH值調(diào)節(jié)pH8。如果初始pH值低于5.0，可能需要相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間達(dá)到pH8的平衡。另一方面，如果pH值高于pH8，它不會(huì)減小，直至脂肪酶溶液加入。用Pasteur滴管將溶解于水(20ml)中的脂肪酶(2.0g，PSL/PFL)加入離子交換樹(shù)脂Duolite溶液中。添加期間，用自動(dòng)滴定器將pH值維持在pH8.0-8.4之間，溶液磁力攪拌1小時(shí)。之后95-99％的脂肪酶即被固定在離子交換樹(shù)脂Duolite上。攪拌后，用緩沖液(三羥甲基氨基甲烷鹽酸；pH8.0)洗滌脂肪酶制備液。最后將固定脂肪酶制備液真空(0.1-0.0lmmHg)干燥0.5-1小時(shí)?？梢杂谜羝?40℃)加速干燥過(guò)程。將固定脂肪酶制劑冷凍(4℃)貯存。
(ii)PSL固定在(苯酚甲醛)離子交換樹(shù)脂(Amberlite)上在pH7.0下，用0.1M磷酸鈉緩沖液徹底洗滌(用125ml洗兩次)(苯酚甲醛)離子交換樹(shù)脂(Amberlite XAD-7樹(shù)脂(50g；Rohm和Haas；70％含水量)。將PSL粉末(Amano AK；1.5g；20,000脂肪酶單位(LU，定義為基于三丁精水解的1分鐘內(nèi)產(chǎn)生的游離脂肪酸的μmol；17LU/mg粉末)溶解于0.1M pH7.0(200ml)的磷酸鈉緩沖劑中。pH降低時(shí)，將其調(diào)節(jié)至pH7.0。然后將脂肪酶溶液加入樹(shù)脂中，攪拌得到的懸浮液，直至95％的固定實(shí)現(xiàn)(約1小時(shí))，由三丁精水解的上層清液的活性測(cè)定得到。
(iii)固定脂肪酶制劑的活性測(cè)定固定樹(shù)脂(約40mg)精確稱(chēng)重，并被加入棕櫚酸正丁酯(310-315mg)中。向該混合物中加入95％乙醇(120μl)，混合物充分?jǐn)嚢?0分鐘。收集試樣并用GLC分析。脂肪酶醇單位(LAU)的量被定義為1分鐘內(nèi)產(chǎn)生的棕櫚酸乙酯的量(μmol)。
B.固定PSL的產(chǎn)率實(shí)驗(yàn)按下述方法進(jìn)行固定于離子交換樹(shù)脂(Duolite)和(苯酯甲醛)離子交換樹(shù)脂(Amberlite)的PSL的魚(yú)油醇解產(chǎn)率實(shí)驗(yàn)。
(i)固定PSL的產(chǎn)率實(shí)驗(yàn)魚(yú)油(100g)、無(wú)水乙醇(20ml)和水(1ml)混合在一起，劇烈攪拌得到的混合物，直至分散良好。將無(wú)水固定脂肪酶(10g)加入分散液，劇烈攪拌，直至得到澄清溶液。然后緩慢攪拌混合物，直至轉(zhuǎn)化率達(dá)到約50％(24小時(shí))。過(guò)濾分離出脂肪酶，并在連續(xù)步驟中使用，而脂肪的分析按上文所述進(jìn)行。
固定于離子交換樹(shù)脂(Duolite)的PSL的產(chǎn)率實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在表VIII中給出。
表VIII離子交換樹(shù)脂(Duolite)上的PSL產(chǎn)率實(shí)驗(yàn)類(lèi)別 運(yùn)行1 運(yùn)行2 運(yùn)行3 運(yùn)行4 運(yùn)行5 待續(xù)wt ％類(lèi)脂類(lèi)EE46.151.051.749.246.9FFA4.5 4.4 5.0 4.1 5.6MG15.916.817.316.517.0DG26.322.821.325.225.1TG 7.3 5.1 4.7 5.0 5.5MG/DGG49.544.743.346.747.6面積 ％EPAEE 1.6 1.9 1.9 1.8 1.8FFA7.6 8.9 9.8 6.8 6.9MG26.526.525.123.722.9DG42.037.637.135.335.7TG41.035.835.235.642.7MG/DG/TG 36.933.232.131.231.9面積 ％DHAEE 1.9 2.3 2.3 2.2 2.1FFA9.310.8 9.8 8.118.4MG20.220.019.818.018.5DG17.515.615.014.614.5TG15.512.513.212.713.9MG/DG/TG 18.116.916.715.615.9
表VIII續(xù)離子交換樹(shù)脂(Duolite)上的PSL產(chǎn)率實(shí)驗(yàn)面積 ％EPA＋DHAEE 3.5 4.2 4.2 4.0 3.9FFA 16.919.719.614.925.3MG 46.746.544.841.741.4DG 59.653.252.149.850.2TG 56.548.448.348.356.5MG/DG/TG55.050.148.846.847.8wt. ％EPAEE 3.8 6.1 6.4 5.7 5.1FFA 2.0 2.7 3.6 2.0 2.6MG 19.124.325.021.920.8DG 57.954.352.857.755.5TG 17.112.612.212.716.0MG/DG/TG94.291.290.092.392.3wt. ％DHAEE 8.713.214.112.710.6FFA 4.7 5.9 6.3 4.412.1MG 27.932.734.230.729.1DG 46.440.337.543.839.2TG 12.4 7.9 8.0 8.4 9.0MG/DG/TG86.780.879.682.977.3類(lèi)別運(yùn)行6 運(yùn)行7 運(yùn)行8 運(yùn)行9 運(yùn)行10wt％類(lèi)脂類(lèi)EE 55.453.754.948.348.9FFA 2.5 2.3 3.0 3.6 4.4MG 16.514.713.516.714.6DG 23.727.426.125.525.9TG 1.8 1.9 2.5 5.9 6.2MG/DG/TG42.044.042.148.146.7面積 ％EPAEE 1.7 1.9 1.6 1.4 1.4FFA 11.211.811.1 8.2 7.7MG 22.419.517.420.921.6DG 35.136.734.236.338.7TG 29.131.734.844.442.6MG/DG/TG29.930.730.032.033.9
表VIII續(xù)離子交換樹(shù)脂(Duolite)上的PSL產(chǎn)率實(shí)驗(yàn)面積 ％DEAEE 1.9 2.2 1.8 1.5 1.6FFA18.820.621.5 9.0 7.7MG 15.416.314.917.618.9DG 13.215.014.115.116.1TG 9.810.711.714.214.0MG/DG/TG 13.915.314.215.916.7面積 ％EPA＋DEAEE 3.6 4.1 3.4 2.9 3.0FFA30.032.432.617.215.4MG 37.835.732.138.540.5DG 48.351.748.351.454.7TG 38.942.446.658.756.6MG/DG/TG 43.845.844.247.950.6wt.％EPAEE 7.1 7.0 6.8 4.1 4.1FFA 2.3 2.1 2.8 2.0 2.2MG 23.917.015.318.716.4DG 62.469.367.957.460.0TG 4.4 4.6 7.317.717.4MG/DG/TG 90.690.990.593.893.7wt.％DHAEE 15.014.413.1 8.8 8.9FFA 7.3 6.5 9.6 4.2 4.2MG 30.725.423.430.327.7DG 44.250.949.745.748.1TG 2.8 2.8 4.410.911.1MG/DG/TG 77.779.277.487.086.8
表VIII表明，在10次連續(xù)運(yùn)行中得到始終如一高的轉(zhuǎn)化率(46-55％)因此得到固定脂肪酶的產(chǎn)率。與表II所示脂肪酶粉末相比，EPA和DHA的回收率自始至終至少是與之同樣的，或者比之更好，盡管脂肪酶的用量?jī)H有1/5。因此，甘油酯產(chǎn)品混合物的EPA＋DHA的含量確實(shí)很高，為44-55％。水解副反應(yīng)的程度比表II所示稍高，可能是固定脂肪酶所需的較高水含量所造成的，雖然反應(yīng)的水含量仍低于規(guī)定的1％限。
在與固定于Duolite情況相同的反應(yīng)條件下固定于Amberlite的PSL的產(chǎn)率實(shí)驗(yàn)結(jié)果在表IX中給出。
表IX(苯酚甲醛)離子交換樹(shù)脂(Amberlite)上的PSL產(chǎn)率實(shí)驗(yàn)運(yùn)行 ％轉(zhuǎn)化率 EPA DHA數(shù)次Ar. wt. Ar. Ar. wt. Ar.
％EE％EE％GL％EE％EE％GT1 48.2 2.3 6.630.1 3.115.016.32 48.6 2.5 7.529.6 3.116.215.23 49.2 2.4 7.429.4 3.216.616.44 47.6 2.6 7.130.8 3.215.615.75 45.7 2.6 6.531.6 3.414.217.36 48.8 2.7 7.830.7 3.516.816.87 48.5 2.6 7.430.4 3.416.815.78 50.1 2.8 8.630.1 3.016.715.3(縮寫(xiě)Ar.％＝面積％；GL＝甘油酯產(chǎn)物＝MG/DG/TG.)表IX清楚表明，固定于kmberlite比固定于Duolite實(shí)驗(yàn)更成功。固定脂肪酶的量?jī)H為固定于Duolite上的一半(起始脂肪酶粉末量的1/10)，而得到的結(jié)果相同。因此，24小時(shí)反應(yīng)時(shí)間后在連續(xù)8次的運(yùn)行中得到始終如一的轉(zhuǎn)化率(48-50％)，而甘油酯產(chǎn)品混合物的EPA＋DHA組合物始終保持在45和47％之間。與Duolite制劑相比，EPA和DHA的回收率與水解副反應(yīng)的程度均相同(水含量低于規(guī)定限度1％，但水解結(jié)果未包括在表中)。
實(shí)例5本實(shí)驗(yàn)的目的是評(píng)價(jià)如前所述在PSL存在下，魚(yú)油酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)制得的甘油酯混合物的乙醇解中Candida antarctica脂肪酶(CAL)和Mucormiehei脂肪酶(MML)的活性。
(a)甘油酯的CAL乙醇分解將固定CAL(Novo-Nordisk，sp435，1-2％水含量；0.5g)加入甘油酯混合物(2.5g，約8.5mmol酯當(dāng)量；初始組合物；25.0％的EPA和15.1％DHA，PSL催化的魚(yú)油酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)制得)和無(wú)水乙醇(0.80g；17.4mmol)中。室溫下氮?dú)夥諊休p緩攪拌得到的酶懸浮液。按前述方法在合適的時(shí)間收集試樣分析。22小時(shí)后過(guò)濾分離掉酶，從而中斷反應(yīng)。結(jié)果在下表X中給出。
表X20℃時(shí)用CAL催化(EE產(chǎn)物)的甘油酯混合物乙醇解的進(jìn)行。
續(xù)
表X表明，甘油酯混合物的CAL乙醇解在20℃進(jìn)行。以存在于初始甘油酯混合物中酯基摩爾當(dāng)量為基準(zhǔn)，使用約2倍過(guò)量的乙醇。表中僅表示出乙酯產(chǎn)物的組成?？梢钥闯觯磻?yīng)22小時(shí)后，反應(yīng)完成。另外，雖然脂肪酶顯示出對(duì)EPA和DHA均有高活性，顯然它對(duì)前者脂肪酸即EPA具有高得多的活性。(b)甘油酯的MML乙醇分解反應(yīng)條件與(a)中所述CAL醇解反應(yīng)完全相同。將固定MML(Novo-Nordisk，Lipozymetm，10％水含量；0.5g)加入甘油酯混合物(2.5g；約8.5mmol酯當(dāng)量；初始組合物25％EPA和15.1％DHA，PSL催化的魚(yú)油酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)制得)和無(wú)水乙醇(0.80g，17.4mmol)中。室溫下氮?dú)夥諊休p緩攪拌得到的酶懸浮液。按前述方法在合適的時(shí)間收集試樣分析。27小時(shí)后過(guò)濾分離掉酶，從而中斷反應(yīng)。
在20℃有MML進(jìn)行的與CAL反應(yīng)所用同樣的甘油酯試樣的乙醇分解表示在下表XI中。
表XI20℃時(shí)用MML催化的甘油酯混合物乙醇解的進(jìn)行。
表XI明顯表明，MML展示出在富含EPA/DHA的甘油酯乙醇分解反應(yīng)中對(duì)EPA和DHA的活性區(qū)別良好。反應(yīng)在27小時(shí)后，轉(zhuǎn)化率達(dá)50％，約80％含量的初始DHA存在于殘余甘油酯混合物中。EPA的分布不十分有利，55％在乙酯中，仍有45％在甘油酯殘余物中。這一情況在于類(lèi)似條件下對(duì)甘油酯再進(jìn)行一次醇解反應(yīng)后得以改善。還應(yīng)注意到，MML的這一活性提供了用此方法使用富含EPA魚(yú)油制備EPA和使用富含DHA魚(yú)油(如金槍魚(yú)油)制備DHA的可能性。實(shí)施例6本實(shí)驗(yàn)的目的是示范本發(fā)明方法對(duì)植物和蔬菜油的適用性。二十碳四烯酸萃取物(AA)的PSL催化的乙醇分解購(gòu)自Pronova Biocare、含有31.1％AA的二十碳四烯酸(AA，204n-6)按實(shí)例1所述魚(yú)油處理法處理，即，10％PSL粉末，20℃，50％轉(zhuǎn)化率，24小時(shí)。
結(jié)果示于下表XII中。
表XII類(lèi)別 wt.％類(lèi)別 面積AA wt.％AAEE50 7.612FFA2 22.2 1MG17 49.024DG24 57.447TG 8 58.916MG/DG/TG 49 54.287表XII顯示，甘油酯混合物中AA回收率非常高，87％，50％轉(zhuǎn)化率時(shí)，與相應(yīng)的魚(yú)油反應(yīng)相比，比DHA高，但比EPA低。水解副反應(yīng)的程度與魚(yú)油實(shí)驗(yàn)中相當(dāng)，為2％。甘油酯混合物中AA含量為54.2％。令人驚奇的是，AA含量在TG餾分中是最高的，在MG餾分中是最低的。
權(quán)利要求
1.處理含有甘油三酯為形式的飽和和不飽和脂肪酸的油組合物的方法，可獲得高濃度多不飽和脂肪酸的精制產(chǎn)物，該方法包括(a)在基本上無(wú)水的條件下，在脂肪酶的存在下，使油組合物用C1-C6醇進(jìn)行的酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，該脂肪酶具有優(yōu)先催化飽和和單不飽和脂肪酸酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的活性，所說(shuō)的C1-C6醇在反應(yīng)中的存在量不多于基于存在的甘油三酯的15摩爾當(dāng)量；和然后(b)將富含多不飽和脂肪酸甘油酯的殘余餾分從用所說(shuō)的脂肪酶催化的酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)法產(chǎn)生的含有飽和和單不飽和脂肪酸酯的餾分中分離出來(lái)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所說(shuō)的脂肪酶是固定形式的。
3.前述任一權(quán)利要求的方法，其中所說(shuō)的C1-C6醇是無(wú)水乙醇。
4.前述任一權(quán)利要求的方法，其中所說(shuō)的C1-C6醇為存在的甘油三酯的2至5摩爾當(dāng)量。
5.前述任一權(quán)利要求的方法，其中所說(shuō)的酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)在室溫下進(jìn)行。
6.前述任一權(quán)利要求的方法，其中所說(shuō)的分離步驟(b)包括1個(gè)或多個(gè)分子精餾步驟。
7.前述任一權(quán)利要求的方法，其中所說(shuō)的油組合物是含有n-3多不飽和脂肪酸的一種海產(chǎn)油組合物或發(fā)酵產(chǎn)物。
8.前述七項(xiàng)權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所說(shuō)的脂肪酶對(duì)EPA和DHA兩者基本上都無(wú)活性。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所說(shuō)的脂肪酶是Pseudomonas sp.脂肪酶或Pseuomonas fluorescens脂肪酶。
10.權(quán)利要求7至9中任一方法，制備含有至少40％wt EPA＋DHA的一種組合物，另外包括下列步驟(c)堿性環(huán)境中進(jìn)行化學(xué)催化，或者采用脂肪酶進(jìn)行酶催化，用低級(jí)醇對(duì)甘油酯餾分進(jìn)行酯基轉(zhuǎn)移；(d)得到的烷基酯產(chǎn)物與烷醇中過(guò)量的尿素加熱至溫度55℃至99℃；(e)將步驟(d)的產(chǎn)物冷卻，以沉淀尿素脂肪酸烷基酯加合物，然后分離出所說(shuō)的加合物，留下主要含有n-3脂肪酸酯的溶液；(f)從由步驟(e)得到的殘留溶液中分離出n-3脂肪酸烷基酯；和(g)從由步驟(f)得到的混合物中除去任何溶劑。
11.權(quán)利要求10的方法，其中從步驟(g)中得到的濃縮物經(jīng)一步或多步分子精餾進(jìn)一步濃縮，以使其中EPA＋DHA的濃度增加至85％或以上。
12.權(quán)利要求7至9的任一方法，以獲得基本上純凈的EPA和基本上純凈的DHA，另外包括下列步驟(i)在基本上無(wú)水的反應(yīng)條件下，以及在對(duì)優(yōu)先催化EPA酯化反應(yīng)有活性的脂肪酶存在下，用C1-C6醇使甘油酯餾分發(fā)生酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)；(ii)分離得到的富含EPA的C1-C6醇酯餾分和殘余的富含DHA的甘油酯混合物；(iii)整理EPA-C1-C6醇酯餾分，將EPA餾分濃縮至基本上100％的純度；(iv)在對(duì)優(yōu)先催化DHA酯化反應(yīng)有活性的脂肪酶的存在下，用C1-C6醇使富含DHA甘油酯混合物發(fā)生酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)；和(v)整理得到的DHA-C1-C6醇酯餾分，將DHA餾分濃縮至少基本上100％純度的DHA。
13.權(quán)利要求12的方法，其中步驟(i)中所用的脂肪酶為Mucormiehei脂肪酶。
14.權(quán)利要求12或13的方法，其中步驟(iv)所用脂肪酶是Candidaantarctica脂肪酶。
15.權(quán)利要求12至14中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(i)和/或(iv)中的C1-C6醇是乙醇。
16.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的方法，其中所說(shuō)的油組合物是含有n-6多不飽和脂肪酸的一種植物或蔬菜油組合物或發(fā)酵產(chǎn)物。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所說(shuō)的脂肪酶是對(duì)廿碳四烯酸(AA)基本上無(wú)活性的一種脂肪酶。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所說(shuō)的脂肪酶是Pseudomonas sp.脂肪酶或Pseudomonas fluorescens脂肪酶。
19.權(quán)利要求16至18中任一項(xiàng)的方法，制備含有至少40％wt廿碳四烯酸的組合物，另外包括下列步驟(c)在堿性環(huán)境中進(jìn)行化學(xué)催化，或者采用脂肪酶進(jìn)行酶催化，用低級(jí)醇對(duì)甘油酯餾分進(jìn)行酯基轉(zhuǎn)移；(d)得到的烷基酯產(chǎn)物與烷醇中過(guò)量的尿素加熱至溫度55℃至99℃；(e)將步驟(d)的產(chǎn)物冷卻，以沉淀尿素脂肪酸烷基酯加合物，然后分離出所說(shuō)的加合物，留下主要含有n-3脂肪酸酯的溶液；(f)從由步驟(e)得到的殘留溶液中分離出n-3脂肪酸烷基酯；和(g)從由步驟(f)得到的混合物中除去任何溶劑。
20.權(quán)利要求19的方法，其中從步驟(g)中得到的濃縮物經(jīng)一步或多步分子精餾進(jìn)一步濃縮，以使其中廿碳四烯酸的濃度增加至85％或以上。
21.權(quán)利要求20的方法，其中將廿碳四烯酸餾分濃縮至基本上100％的純度。
22.從含有以甘油三酯為形式的飽和和多不飽和脂肪酸的油組合物中除去環(huán)境污染物的方法，該方法包括下列步驟(a)在基本上無(wú)水的條件下，在具有優(yōu)選催化飽和和單不飽和脂肪酸的酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的活性的脂肪酶的存在下，使油組合物與C1-C6醇發(fā)生酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，該所說(shuō)的C1-C6醇在反應(yīng)中的存在量不多于基于存在的甘油三酯的15摩爾當(dāng)量；和然后(b)步驟(a)中得到的產(chǎn)物進(jìn)行一次或多次分子精餾，以回收富含多不飽和脂肪酸的甘油酯的餾分，而且環(huán)境污染物已被優(yōu)先從其中除去。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所說(shuō)的步驟(a)按權(quán)利要求2至5中任一方法進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明涉及處理含有以甘油三酯為形式、飽和與不飽和脂肪酸的一種油組合物的新型方法，以獲得較高濃度多不飽和脂肪酸的精制產(chǎn)品。
文檔編號(hào)C07C67/54GK1143384SQ95192022
公開(kāi)日1997年2月19日 申請(qǐng)日期1995年3月7日 優(yōu)先權(quán)日1994年3月8日
發(fā)明者H·布萊維克, G·G·哈拉森 申請(qǐng)人:挪威海德羅公司