專利名稱：自身免疫疾病的治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用來治療哺乳類動(dòng)物尤其是人類自身免疫疾病的治療劑。本發(fā)明還涉及作為所謂的“疫苗載體”用來治療T細(xì)胞起源的人類白血病的治療劑，和用來預(yù)防人類移植排斥反應(yīng)及移植物抗宿主疾病(GVHD)的治療劑。
Charles O.Elson等人在The Journal of Immunology，1995，154；1032-1040雜志上發(fā)表了題為“霍亂毒素及其B亞單位對(duì)粘膜T細(xì)胞形態(tài)及功能的改變”的文章，該研究發(fā)現(xiàn)霍亂毒素(Ctx)及CtxB亞單位能抑制CD8+及CD4+T細(xì)胞。
B.Yankelevich等人在The Journal of Immunology，1995，154；3611-3617雜志中還發(fā)表了題為“以新的免疫抑制制劑預(yù)防急性移植物抗宿主疾病”的文章。該研究發(fā)現(xiàn)CtxB可在骨髓移植中作為預(yù)防急性移植物抗宿主疾病(GVHD)的一種制劑。
WO 95/10301中發(fā)現(xiàn)了一種免疫耐受誘發(fā)制劑，該制劑含有結(jié)合有特異耐受原的粘膜結(jié)合分子。
在本文中術(shù)語(yǔ)“Ctx”是指霍亂毒素，而“CtxB”是指霍亂毒素的B亞單位。在其它的文章中也被相應(yīng)地表示為“CT”或者“Ct”及“CTB”或者“CtB”。文中的術(shù)語(yǔ)“Etx”是指大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素，而“EtxB”是指Etx的B亞單位。在其它的文章中有時(shí)也被相應(yīng)地表示為“LT”或者“Lt”及“LTB”或者“LtB”。
本發(fā)明的基礎(chǔ)是基于這樣一個(gè)發(fā)現(xiàn)，即EtxB(大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素的純B亞單位)可與存在于哺乳類動(dòng)物細(xì)胞表面的GM1-神經(jīng)節(jié)苷脂受體結(jié)合，而且此結(jié)合可引發(fā)淋巴細(xì)胞群不同的反應(yīng)，其中包括去除CD8+T細(xì)胞同時(shí)激活B細(xì)胞。但當(dāng)采用突變的沒有GM1結(jié)合活性的EtxB時(shí)則沒有上述的效應(yīng)。自身免疫疾病自身免疫是描述身體對(duì)自身抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的機(jī)理的術(shù)語(yǔ)。
根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面用來預(yù)防或者治療自身免疫疾病的下面制劑(i)除了Ctx或者Etx，或者Ctx及Etx的B亞單位，具有GM-1結(jié)合活性的制劑；或(ii)對(duì)具有GM-1介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)有作用而沒有GM-1結(jié)合活性的制劑。
本發(fā)明的制劑可調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞群，即引發(fā)CD8+T細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)CD4+細(xì)胞的活性并使B細(xì)胞多克隆激活。上述過程可使免疫反應(yīng)向誘導(dǎo)Th2相關(guān)的細(xì)胞因子方向移動(dòng)。對(duì)自身或者交叉反應(yīng)抗原所產(chǎn)生的這些反應(yīng)可調(diào)節(jié)一些自身免疫疾病的保護(hù)。
在本發(fā)明上述第一方面的第一個(gè)實(shí)施方案中，治療制劑用于治療正在進(jìn)展中的自身免疫疾病。在該實(shí)施方案中，給病人單獨(dú)服用制劑或者與自身或者交叉反應(yīng)抗原一起聯(lián)合給病人服用該制劑。根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面中的該實(shí)施方案，服用制劑能調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)使自身抗原不激活引起疾病的炎癥從而治療自身免疫疾病。
在本發(fā)明第一方面的第二個(gè)實(shí)施方案中，將制劑以“接種”的方法給哺乳類動(dòng)物使用，使其治療自身免疫疚病，其中制劑可與所述疾病有關(guān)的自身或者交叉反應(yīng)抗原決定簇物質(zhì)(或者為一種不同的自身或者交叉反應(yīng)抗原決定簇物質(zhì)的混合物)聯(lián)合給予。經(jīng)過上述的所謂接種后，可使對(duì)自身抗原或者交叉反應(yīng)抗原的宿主免疫反應(yīng)遠(yuǎn)離病理活化，從而保護(hù)對(duì)自身抗原的進(jìn)一步反應(yīng)。
在本發(fā)明的第一個(gè)方面中，可將治療制劑及自身或者交叉反應(yīng)抗原決定簇聯(lián)合給予病人。我們可以通過改變每種治療制劑及抗原決定簇給藥的給藥部位及時(shí)間來調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。所以，可將治療制劑及抗原決定簇同時(shí)并且同一個(gè)部位給予，但是如將治療制劑與抗原決定簇在不同的時(shí)間及不同的部位分別給予可能會(huì)有較好的效果。
給予單劑量的治療制劑及抗原決定簇可能會(huì)有較好的效果，但多劑量也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
在本發(fā)明第一個(gè)方面的第二個(gè)實(shí)施方案中，可將治療制劑及抗原決定簇連接在一起，如通過共價(jià)鍵結(jié)合從而形成單一的活性制劑，雖然分別給藥，其中治療制劑與抗原決定簇不是象上述的那樣連接在一起，是優(yōu)選的，因?yàn)檫@可使不同部分分別給藥。
根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面可以治療的特異自身免疫疾病是其病理與細(xì)胞介導(dǎo)免疫有關(guān)的自身免疫疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化癥及糖尿病。
另外，在本發(fā)明的第一個(gè)方面中，提供了用Ctx，Etx或者Ctx或者Etx的B亞單位制備用作預(yù)防自身免疫疾病的制劑的藥物。
本發(fā)明還提供了一種治療人類自身免疫疾病的藥物組合物，該組合物含有(i)一種具有GM-1結(jié)合活性的制劑；或(ii)一種對(duì)GM-1介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)有作用，但無GM-1結(jié)合活性制劑；及藥物可接受的載體或者稀釋劑。
本發(fā)明的藥物組合物可以配制成經(jīng)粘膜途徑給藥的劑型，如鼻腔噴霧劑，或者配制成注射給藥的劑型，如通過靜脈，肌肉內(nèi)或者皮下途徑給藥。
藥物組合物可與合適的自身或者交叉反應(yīng)抗原配制在一起。也可將其制成藥盒，其包括治療劑和抗原決定簇物質(zhì)的分開組分。
用于本發(fā)明的特異治療制劑是EtxB和CtxB或者是保留有其GM-1結(jié)合活性的突變物。
在本發(fā)明第一個(gè)方面中所用的制劑雖然在一些嚴(yán)重的治療情況下可以耐受一定程度的毒性，但以無毒為較好。
本發(fā)明中的第一個(gè)方面中可將其延伸，從而包括所有用于治療哺乳動(dòng)物自身免疫疾病的具有GM-1結(jié)合活性的制劑，具有GM-1介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)作用的制劑和模擬GM-1結(jié)合活性的制劑。
所以，本發(fā)明的第一個(gè)方面并不局限于使用EtxB蛋白作為治療制劑來治療人自身免疫疾病?？墒?，使用EtxB蛋白(其為有五個(gè)相同亞單位的五聚體)進(jìn)行上述治療是本發(fā)明中有較好代表性的一個(gè)實(shí)施例。除了野生型的EtxB，本發(fā)明也可延伸至一些突變型的EtxB，這些突變蛋白具有GM-1結(jié)合的活性，另外也可是其它一些類似的蛋白如具有GM-1結(jié)合活性的霍亂毒素B亞單位(CtxB)，和其突變體。
根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，治療自身免疫疾病的其它治療制劑是結(jié)合GM-1的人型單克隆抗體。識(shí)別及制備這些制劑的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。T-淋巴細(xì)胞白血病根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供了符合下面條件的制劑(i)除了Ctx或者Etx，或者Ctx及Etx的B亞單位，具有GM-1結(jié)合活性的制劑；或者(ii)可介導(dǎo)GM-1細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，但無GM-1結(jié)合活性的制劑；這些制劑用來治療人T細(xì)胞起源的白血病，如人CD8 T細(xì)胞起源的白血病。
在本發(fā)明第二個(gè)方面中所用的制劑雖然在一些嚴(yán)重的治療情況下可以有一定程度的毒性，但以無毒為較好。
另外，在本發(fā)明的第二個(gè)方面中，提供了用Ctx或Etx或Ctx和Etx的B亞單位制備用于治療人T細(xì)胞起源白血病如人CD8T細(xì)胞起源白血病的藥物。
本發(fā)明還提供了一種治療人T細(xì)胞起源白血病的藥物組合物，該組合物含有(i)一種具有GM-1結(jié)合活性的制劑；或者(ii)一種可介導(dǎo)GM-1細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，但無GM-1結(jié)合活性制劑；及藥物可接受的載體或者稀釋劑。
本發(fā)明的藥物組合物可以配制成經(jīng)粘膜途徑給藥的劑型，如鼻腔噴霧劑，或者配制成注射給藥的劑型，如通過靜脈，肌肉內(nèi)或者皮下途徑給藥。
本發(fā)明中的第二個(gè)方面可將其延伸，從而包括所有用于治療人T細(xì)胞起源白血病的，具有GM-1結(jié)合活性的制劑，具有GM-1介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)作用的制劑及模擬GM-1結(jié)合活性的制劑。
所以，本發(fā)明的第二個(gè)方面并不局限于使用EtxB蛋白作為治療制劑來治療人T細(xì)胞白血病?？墒?，使用EtxB蛋白進(jìn)行上述治療是本發(fā)明中有較好代表性的一個(gè)實(shí)施例。除了野生型的EtxB，本發(fā)明也可延伸至一些突變型的EtxB，這些突變蛋白具有GM-1結(jié)合的活性，另外也可是其它一些類似的蛋白如具有GM-1結(jié)合的活性的霍亂毒素B亞單位(CtxB)和其突變體。
根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，治療上述疾病的其它治療制劑是結(jié)合GM-1的人型單克隆抗體。識(shí)別及制備這些制劑的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。移植排斥反應(yīng)及GVHD
根據(jù)本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供了符合下面條件的制劑(i)除了Ctx或者Etx，或者Ctx及Etx的B亞單位，具有GM-1結(jié)合活性的制劑；或者(ii)可介導(dǎo)GM-1細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，但無GM-1結(jié)合活性的制劑；這些制劑用來預(yù)防/治療移植排斥反應(yīng)或者GVHD。另外，在本發(fā)明的第三個(gè)方面中，提供了用Ctx，Etx或者Ctx或者Etx的B亞單位制備用于預(yù)防移植排斥反應(yīng)或者GVHD的藥物。
在本發(fā)明這方面的優(yōu)選實(shí)施例中，所述的治療制劑可用來預(yù)防同種或者異種基因?qū)嶓w器官移植物的排斥反應(yīng)。它們也可用來預(yù)防急性移植物抗宿主反應(yīng)(GVHD)，如在骨髓移植中。
在本發(fā)明這方面的實(shí)施例中，如果在移植前對(duì)病人進(jìn)行治療，則治療制劑應(yīng)與同種或者異種抗原聯(lián)合服用。實(shí)施例中如果移植后對(duì)病人進(jìn)行治療，則治療制劑不與抗原聯(lián)合服用。
在本發(fā)明這方面的實(shí)施例中，可將治療制劑及同種或者異種抗原決定簇聯(lián)合給病人服用。我們可以通過改變每種治療制劑及抗原決定簇給藥的給藥部位及時(shí)間來調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。所以，可將治療制劑及抗原決定簇同時(shí)并且同一個(gè)部位給予，但是如將治療制劑與抗原決定簇在不同的時(shí)間及不同的部位分別給予可能會(huì)有較好的效果。另外可將治療制劑及抗原決定簇通過共價(jià)鍵結(jié)合從而形成單一的活性制劑，當(dāng)然如果是分別服用，其中治療制劑及抗原決定簇不是象上述的那樣連接在一起，則會(huì)更有利，因?yàn)檫@可不同部分分別給予。
給予單劑量的治療制劑及抗原決定簇可能會(huì)有較好的效果，但多劑量也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
在本發(fā)明的這方面中，如制劑是用來預(yù)防GVHD，則通常情況下制劑與要移植細(xì)胞直接接觸，如要被移植的骨髓細(xì)胞。
雖然在一些特殊治療情況下可耐受一定程度的毒性，但制劑最好是無毒的。
本發(fā)明還提供了一種治療移植排斥反應(yīng)的藥物組合物，該組合物含有(i)一種具有GM-1結(jié)合活性的制劑；或者(ii)一種可介導(dǎo)GM-1細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，但無GM-1結(jié)合活性制劑；及藥物可接受的載體或者稀釋劑。
本發(fā)明在該方面的藥物組合物可以配制成經(jīng)粘膜途徑給藥的劑型，如鼻腔噴霧劑，或者配制成注射給藥的劑型，如通過靜脈，肌肉內(nèi)或者皮下途徑給藥。
藥物組合物可與合適的同種或者異種抗原決定簇配制在一起。也可將其制成藥盒的形式，其包括治療制劑及抗原決定簇的各自組分。
本發(fā)明中的第三個(gè)方面可延伸到包括所有預(yù)防/治療排斥移植物反應(yīng)或者GVHD的具有GM-1結(jié)合活性制劑，具有GM-1介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)作用的制劑及模擬GM-1結(jié)合活性的制劑。
所以，本發(fā)明的第三個(gè)方面并不局限于使用EtxB蛋白作為治療制劑來治療排斥移植反應(yīng)。可是，使用EtxB蛋白(其為有五個(gè)相同亞單位的五聚體)進(jìn)行上述治療是本發(fā)明中有較好代表性的一個(gè)實(shí)施例。除了野生型的EtxB，本發(fā)明也可延伸至一些突變型的EtxB，這些突變蛋白具有GM-1結(jié)合的活性，另外也可是其它一些類似的蛋白如具有GM-1結(jié)合的活性的霍亂毒素B亞單位(CtxB)和其突變體。
根據(jù)本發(fā)明，治療移植物排斥反應(yīng)的其它治療制劑是結(jié)合GM-1的人型單克隆抗體。識(shí)別及制備這些制劑的方法，在本領(lǐng)域是眾所周知的。疫苗CtxB及EtxB已被認(rèn)為可作為所謂的“疫苗載體”。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)之所以有這種作用部分原因是因?yàn)镋txB可與GM-1受體結(jié)合從而調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞群的功能(如上所述)。
所以，根據(jù)本發(fā)明第四個(gè)方面提供用于哺乳類動(dòng)物疫苗的下面制劑(i)除了Ctx或者Etx，或者Ctx及Etx的B亞單位，具有GM-1結(jié)合活性的制劑；(ii)具有GM-1介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)作用而沒有GM-1結(jié)合活性的制劑。
當(dāng)該制劑與一種無關(guān)的外部抗原決定簇一起服用時(shí)，可以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。如果制劑是經(jīng)非口服途徑給予，可以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)使其按照特殊的需要來進(jìn)行。如果制劑是與一種無關(guān)的所謂的“粘膜佐劑”抗原一起經(jīng)粘膜給予，則可以有助于粘膜對(duì)無關(guān)抗原的反應(yīng)?？乖c制劑可以作為不同的成分一起服用，也可經(jīng)過如共價(jià)鍵的方式連接在一起給予。
制劑最好是無毒的。另外，如果制劑是通過胃腸道粘膜給予，需在經(jīng)胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)保持穩(wěn)定，例如不被蛋白酶水解，酸性pH條件下保持穩(wěn)定以及對(duì)膽汁的去污作用保持穩(wěn)定。
本發(fā)明還提供了一種用作為哺乳類動(dòng)物疫苗的藥物組合物，該組合物含有(i)一種具有GM-1結(jié)合活性的制劑；或者(ii)一種可介導(dǎo)GM-1細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，但無GM-1結(jié)合活性制劑；及藥物可接受的載體或者稀釋劑。
本發(fā)明在該方面的藥物組合物可以配制成經(jīng)粘膜途徑給藥的劑型，如鼻腔噴霧劑，或者配制成注射給藥的劑型，如通過靜脈，肌肉內(nèi)或者皮下途徑給藥。
藥物組合物可與合適的抗原決定簇配制在一起。也可將其制成藥盒的形式，其包括治療制劑及抗原決定簇的分別組分。
本發(fā)明中的第四個(gè)方面可延伸至包括所有作為免疫調(diào)節(jié)劑的具有GM-1結(jié)合活性的制劑，具有GM-1介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)作用的制劑和模以GM-1結(jié)合活性的制劑。
所以，本發(fā)明的第四個(gè)方面并不局限于使用EtxB蛋白作為免疫調(diào)節(jié)劑。可是，使用EtxB蛋白(其為有五個(gè)相同亞單位的五聚體)進(jìn)行上述治療是本發(fā)明中有代表性的一個(gè)實(shí)施例。除了野生型的EtxB，本發(fā)明也可延伸至一些突變型的EtxB，這些突變蛋白具有GM-1結(jié)合的活性，另外也可以是其它一些類似的蛋白如具有GM-1結(jié)合的活性的霍亂毒素B亞單位(CtxB)和其突變體。
根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面，用作為免疫調(diào)節(jié)劑的其它治療制劑是結(jié)合GM-1的人型單克隆抗體。識(shí)別及制備這些制劑的方法，在本領(lǐng)域是眾所周知的。
如果本發(fā)明中所用的治療制劑為蛋白質(zhì)，如EtxB亞單位或者CtxB亞單位，這些制劑可采用基因工程的方法來制備，即將編碼蛋白質(zhì)的特異多肽鏈(或者多個(gè)鏈)的基因或者多個(gè)基因插入到合適的載體中，然后再轉(zhuǎn)染合適的宿主。例如，將編碼EtxB組件的多肽鏈基因插入到如質(zhì)粒pMMB68，然后再將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞如Vibrio sp.60。用已知的方法純化并分離蛋白質(zhì)。表達(dá)活性突變EtxB蛋白的突變基因，可通過已知的方法從野生型的基因中制備。
如前所述，具有GM-1結(jié)合活性的制劑，如特殊設(shè)計(jì)的人型單克隆抗體可通過上述的方法來設(shè)計(jì)并制備。
在本發(fā)明中，具有GM-1結(jié)合活性的制劑也有可能交叉連接GM-1受體。EtxB就是這樣一種制劑，它可以其五聚體形式與GM-1受體交叉連接。
本發(fā)明現(xiàn)在將通過下面的圖示及實(shí)例進(jìn)行說明。


圖1為EtxB及突變型EtxB(EtxB(G33D))的理化性質(zhì)分析；圖2說明EtxB與受體的結(jié)合是其在體內(nèi)表現(xiàn)有很強(qiáng)的免疫原性的基礎(chǔ)；圖3為給小鼠注射EtxB后淋巴細(xì)胞增殖的動(dòng)力學(xué)變化情況；圖4說明EtxB使B細(xì)胞活性增加；圖5說明EtxB使CD4+T細(xì)胞活性增加，但使CD8+T細(xì)胞減少；圖6說明EtxB可選擇性地清除OVA一反應(yīng)活性的CD8+T細(xì)胞；圖7說明EtxB與受體結(jié)合后可引起細(xì)胞進(jìn)行性編程性細(xì)胞死亡的淋巴細(xì)胞核形態(tài)改變；圖8說明通過細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)EtxB受體可介導(dǎo)CD8+T細(xì)胞凋亡；圖9a和9b為在一個(gè)關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型中EtxB與GM-1結(jié)合后抑制膠原生成的結(jié)果；圖10為EtxB而非EtxB(G33D)引起正常人外周血中單核細(xì)胞編程性凋亡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖11為GM1交聯(lián)后引起小鼠CTLL細(xì)胞編程性凋亡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖1EtxB和EtxB(G33D)的理化性質(zhì)分析。
(A)EtxB或者EtxB(G33D)的SDS-PAGE分析在還原的條件下并且在β-巰基乙醇存在的情況下，預(yù)先加熱或者不加熱分析5μg各蛋白質(zhì)。1道，野生型EtxB，未加熱。2道，EtxB(G33D)，未加熱。3道，野生型EtxB，加熱至95℃。4道，EtxB(G33D)，加熱至95℃。標(biāo)準(zhǔn)分子量(BioRad)在道的左手邊。
(B)通過膠過濾色譜法測(cè)定EtxB及EtxB(G33D)的表觀分子量先從上到下制備出標(biāo)準(zhǔn)曲線小牛血清白蛋白(66kDa)，雞蛋白蛋白(45kDa)，牛紅細(xì)胞碳酸酐酶(29kDa)及馬心臟細(xì)胞色素c(12.4kDa)；洗脫的EtxB及EtxB(G33D)的表觀分子量分別為36kDa和38kDa；Ve-蛋白質(zhì)的洗脫體積，凝膠過濾柱的Vo-外水體積。
(C)用ELISA方法分析EtxB及EtxB(G33D)與神經(jīng)節(jié)苷酯GM1的結(jié)合情況將平板涂以GM1，封閉，并與1μg/ml開始系列稀釋(3倍)EtxB或者EtxB(G33D)一起孵育。圖2EtxB與受體的結(jié)合是其在體內(nèi)具有強(qiáng)烈免疫原性的基礎(chǔ)。
給BALB/c小鼠(每組4只)注射(s.c.)溶于PBS中的EtxB或者EtxB(G33D)，或者將溶于碳酸氫鹽緩沖液中的上述蛋白質(zhì)進(jìn)行口服。在二次s.c.注射(A)后10天或者三次口服(B)后1周分析血清，并在3次口服后(C)1周分析腸分泌物。在對(duì)照小鼠的標(biāo)本中未發(fā)現(xiàn)任何反應(yīng)(未示)。結(jié)果用血清中的IgG抗體滴度來表示，而腸分泌的IgA以下述的‘特異活性’來表示。圖3淋巴細(xì)胞增殖的動(dòng)力學(xué)給小鼠i.p.注射30μg溶于完全弗氏佐劑的EtxB(G33D)。10天后分離MLN細(xì)胞，并在下面的條件下培養(yǎng)細(xì)胞無抗原存在(空心方塊)，80μg/ml的EtxB(實(shí)心三角形)，80μg/ml的EtxB(G33D)(空心三角形)，或者經(jīng)過加熱至95℃產(chǎn)生的解離的單體形式的EtxB(實(shí)心圓圈)及EtxB(G33D)(空心圓圈)。每次取樣當(dāng)天以1μ Ci的(3H)Thd脈沖細(xì)胞并持續(xù)6小時(shí)。數(shù)據(jù)以三份孔的cpm及SEM的均值來表示。圖4EtxB使B細(xì)胞活性增加用溶于CFA的EtxB(G33D)免疫小鼠。10天后從MLN中分離細(xì)胞，并在80μg/ml EtxB或者EtxB(G33D)，或者每種蛋白40μg/ml的混合物存在的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。以生物素化的抗-CD25(7D4)及藻紅蛋白(PE)抗-B220(Ra3-6D2)標(biāo)記細(xì)胞。用鏈酶抗生物素蛋白FITC作為第二抗體結(jié)合物。另外還有抗體的對(duì)照組(未示)。在增殖的第4天用雙向流式細(xì)胞計(jì)進(jìn)行分析。圖5EtxB引發(fā)的CD4+T細(xì)胞活性增加及CD8+T細(xì)胞減少。
免疫過程，細(xì)胞分離及體外激發(fā)可見圖4的說明。使用生物素化的抗-CD25(7D4)及鏈酶抗生物素蛋白FITC檢測(cè)CD25。使用)FITC標(biāo)記抗-CD4(RNRM4-5及FITC標(biāo)記抗-CD8α(53-6.7)檢測(cè)CD4及CD8。另外還有適當(dāng)?shù)膶?duì)照抗體(未示)。圖6使用EtxB選擇性地去除OVA-反應(yīng)活性的CD8+T細(xì)胞用OVA致敏小鼠，然后分離出MLN細(xì)胞并在下面的條件下培養(yǎng)5天沒有抗原存在，OVA+EtxB，OVA+EtxB(G33D)，或者100μg的OVA與40μg/ml EtxB或者EtxB(G33D)，或者只有100μg的OVA。細(xì)胞用下面的大鼠抗體標(biāo)記FITC-抗-CD4或者FITC-抗-CD8α，和都帶有生物素-抗-CD25(IL-2Rα)，然后再用鏈酶抗生物素蛋白-藻紅蛋白。另外還包括對(duì)照組的未染色細(xì)胞及僅用第二抗體染色的細(xì)胞。使用FACS(Becton Dickinson)分析細(xì)胞。在含有EtxB培養(yǎng)物中的CD25+與經(jīng)其它處理的細(xì)胞相比在總細(xì)胞中占有較高的百分比，這是因?yàn)楸磉_(dá)該標(biāo)記物的B細(xì)胞比例較高(未示)。熒光的強(qiáng)度以log表示。圖7EtxB與受體結(jié)合引起細(xì)胞進(jìn)行性程序死亡的淋巴細(xì)胞核的形態(tài)特征性改變將含有＞90％CD3+T細(xì)胞及去除了巨噬細(xì)胞的mLNC在80μg/ml EtxB或者80μg/ml EtxB(G33D)存在的條件下培養(yǎng)18小時(shí)，并用吖啶橙進(jìn)行染色。采用常規(guī)或者同焦點(diǎn)熒光顯微鏡(Leica TCS 4D)觀察細(xì)胞。每個(gè)處理選擇一個(gè)代表性的顯微視野(x540)(EtxB，于左手道；EtxB(G33D)，于右手道)。在沒有抗原存在條件下培養(yǎng)的細(xì)胞與經(jīng)EtxB(G33D)處理過的所得結(jié)果類似(未示)。圖8采用細(xì)胞周期分析檢測(cè)EtxB受體介導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞程序性凋亡。
采用碘化丙錠染色并用流式細(xì)胞計(jì)分析DNA含量來測(cè)定在處于細(xì)胞周期亞G0/G1期中CD4+及CD8+SPLTC的比例。通過上述的陰性篩選法從脾臟中分離出SPLTC。細(xì)胞如下處理18小時(shí)(a)無抗原，(b)80μg/ml EtxB(G33D)或者(c)80μg/ml EtxB，然后用FITC-大鼠抗-CD4或者FITC-大鼠抗-CD8進(jìn)行染色。隨后細(xì)胞用碘化丙錠染色。通過測(cè)定經(jīng)抗-CD4或者抗-CD8染色的細(xì)胞得出與碘化丙錠共同染色細(xì)胞的比例。該實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平進(jìn)行，其結(jié)果見圖7或者表3。
實(shí)例實(shí)例1該實(shí)例主要說明進(jìn)行GM-1結(jié)合以引起淋巴細(xì)胞群不同反應(yīng)的需求。材料及方法制備與受體結(jié)合的突變型EtxB使用質(zhì)粒pTRH29，該質(zhì)粒為菌粒載體pBluescript IIKS+的衍生物，含有Etx的A-及B-亞單位基因，將Gly33到Asp替換片段插入人EtxB受體的結(jié)合位點(diǎn)(Yu，J.，Webb，H.&Hirst，T.R.(1992)，Molec.Microbiol.6，1949-1958)。使用單鏈pTRH29作為模板，并用一合成的寡核苷酸(5′-TCTCTTTTATCTGCCATCG-3′)(來自the Microanalytical Facility，IARGR，Cambridge Research Station，UK)作為突變引物，在體外用一寡核苷酸引導(dǎo)的突變盒(Amersham International)進(jìn)行致突變。使用測(cè)序酶II(UnitedStates Biochemical Corp.)用雙脫氧測(cè)序法證實(shí)正確的Gly到Asp替換片段，并將所得的質(zhì)粒命名為pTRH56。使用EcoRI及SpeI限制酶將突變的etxB基因從pTRH56中切下來，并且插入質(zhì)粒pMMB68(Sandkvist，M.，Hirst，T.R.& Bagdasarian，M.(1987)J.Bacteriol.169，4570-4576)從而得到一個(gè)大范圍的宿主表達(dá)載體，表達(dá)EtxB(G33D)的pTRH64。抗原使用Amin和Hirst報(bào)道的修正方法(Amin，T.，&Hirst，T.R.(1994)Prot.Express.and Purif.5，198-204)，分別從相應(yīng)的Vibrio sp.60(pMMB68)和Vibrio sp.60(pMMB64)的培養(yǎng)上清波中純化野生型的EtxB及EtxB(G33D)。簡(jiǎn)言之，用滲濾法和疏水反應(yīng)層析法純化蛋白質(zhì)，并用離子交換層析法進(jìn)行濃縮。用磷酸鹽緩沖液(PBS；10mM磷酸鈉，150mM NaCl，pH7.4)平衡過的PD10柱子(Pharmacia，UK)對(duì)蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行脫鹽并且在-30℃的條件下儲(chǔ)存。
EtxB和EtxB(G33D)的純度通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳來證實(shí)。各單體的分子量通過激光解吸質(zhì)譜來證實(shí)(Protein Science Facility，University of Kent)。
使用SMART系統(tǒng)(Pharmacia)采用凝膠過濾層析測(cè)定EtxB和EtxB(G33D)的表觀分子量。將蛋白質(zhì)從以PBS，pH7.5平衡過的Superdex 75 PC 3.2/30柱子中洗脫。
通過將蛋白質(zhì)在95℃條件下加熱5分鐘，使用于淋巴細(xì)胞增殖分析(見下)的B亞單位五聚體發(fā)生不可逆的變性。動(dòng)物，樣本收集和免疫步驟從Charles River實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買7-12周齡的BALB/c小鼠(H-2d；對(duì)EtxB高反應(yīng)性)，然后在Kent大學(xué)動(dòng)物房飼養(yǎng)。給小鼠經(jīng)s.c.注射溶于PBS中的30μg蛋白質(zhì)，10天后進(jìn)行增強(qiáng)注射，然后測(cè)定對(duì)EtxB或者EtxB(G33D)的抗體反應(yīng)。另一組小鼠分三次間隔一周口服溶于碳酸鈉中相同劑量的蛋白質(zhì)(50μg/ml)。給對(duì)照小鼠服用PBS。在最后一次s.c.注射后10天或者口服喂養(yǎng)后一周取血。在最后一次喂養(yǎng)一周后，通過前述的方法在蛋白酶抑制劑溶液中分離活小鼠的腸分泌物(Elson，C.O.，Ealding，W.&Lefkowitz，J.(1984)J Immunol.Meth.67，101-108)。然后將樣本進(jìn)行超聲并離心(13，226xg，10分鐘，于4℃)。
為了增殖分析實(shí)驗(yàn)，給小鼠i.p.注射溶于完全佛氏佐劑(CFA)的30μgEtxB或者EtxB(G33D)，并于10天后分離腸系膜淋巴結(jié)。另外還包括對(duì)照未被免疫的小鼠并以類似的方法分離其淋巴結(jié)。酶連免疫吸附分析(ELISAs)采用CM1-ELISA分析檢測(cè)EtxB或者EtxB與GM1的結(jié)合(G33D)(Amin，T.，& Hirst，T.R.(1994)Prot.Express.and Purif.5，198-204)。
將微型滴定板(Immulon I，Dynateck，USA)上涂以溶于PBS的EtxB或者EtxB(G33D)5μg/ml，然后采用ELISA方法檢測(cè)血清及腸分泌物中抗B亞單位IgG及IgA抗體。用溶于PBS的1μg/ml兔抗小鼠IgA(α鏈特異；Zymed Lab，USA)涂于每個(gè)微型板的2排孔，然后再加入1μg/ml的小鼠骨髓瘤IgA(MOPC315，Sigma，USA)制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過此標(biāo)準(zhǔn)曲線推斷出腸分泌物上清中抗-B亞單位IgA抗體。為了測(cè)定總的IgA，將孔內(nèi)涂以兔抗-小鼠IgA，然后再加入腸分泌物上清。系列稀釋所有樣本。稀釋山羊抗-小鼠IgG(Fc片段特異；Jackson Lab.，USA)或者山羊抗-小鼠IgA(鏈特異；Sigma)過氧化酶結(jié)合物。測(cè)定抗-B亞基IgG的滴定度，得A450nm＞＝0.2。腸分泌物中各個(gè)Etx和EtxB(G33D)對(duì)IgA抗-B亞單位的反應(yīng)以“IgA的特異活性”來表示[平均IgA抗-B亞單位(μg/ml)/總IgA(μg/ml)]。
如前所述，采用ELISA方法測(cè)定IL-2，IL-4，IL-5，IL-10及IFN-γ細(xì)胞因子的水平(Harper，H.M.，PhD thesis，University of Bristol(1995))。簡(jiǎn)言之，將微型滴定板上涂以對(duì)小鼠IL-2，IL-4，IL-5，IL-10及IFN-γ的大鼠抗體。將微型滴定板用2％(w/v)的小牛血清白蛋白進(jìn)行封閉。將培養(yǎng)液上清加入孔內(nèi)并且稀釋。細(xì)胞因子每個(gè)微型板中有一排含有一種標(biāo)準(zhǔn)劑量的重組細(xì)胞因子孔。將微型板與0.5μg/ml的生物素化的抗-細(xì)胞因子單克隆抗體一起孵育，隨后加入親和素-過氧化物酶及3，3′，5，5′-四甲基連苯胺(TMB)并在波長(zhǎng)A405nm處讀數(shù)。淋巴細(xì)胞增殖的測(cè)定使用頸椎脫臼法處死小鼠，在無菌條件下取出腸系膜淋巴結(jié)，碾碎并將其通過一不銹鋼網(wǎng)進(jìn)入Hank′s平衡鹽溶液中(HBSS)(FlowLaboratories，Irvine，UK)。用HBSS通過離心沖洗細(xì)胞(500xg，10分鐘，4℃)，再用改進(jìn)的Eagle′s培養(yǎng)液(Flow)重新懸浮細(xì)胞，然后向該懸浮液中加入20mM Hepes(Flow)，100IU青霉素，100μg/ml鏈霉素，4mM L-谷氨酸(Flow)及2-巰基乙醇(完全培養(yǎng)液)。加入未免疫新鮮小鼠自體正常血清使其濃度為0.5％(v/v)。使24-孔微型板2ml或者25cm3培養(yǎng)瓶(Nunc A/S，Roskide，Denmark)8ml體積的培養(yǎng)液中有2×106個(gè)活細(xì)胞/ml，并按圖示說明在抗原存在及缺乏的條件下建立細(xì)胞培養(yǎng)。將細(xì)胞在37℃，含有5％CO2及95％潮濕空氣的條件下培養(yǎng)6天。在設(shè)計(jì)好的時(shí)間點(diǎn)，從細(xì)胞培養(yǎng)液中取出0.1ml樣本并將其轉(zhuǎn)移至96孔U-形底板內(nèi)(Nunc)，在收集前6小時(shí)(Mach III harvesting 96 Tomtec，Orange，Conn.USA)用[3H]-Thd(Amersham，U.K.)以1μ Ci/孔進(jìn)行標(biāo)記并用標(biāo)準(zhǔn)的液閃爍計(jì)1450Micro β plus進(jìn)行計(jì)數(shù)(LKB-Wallac，Turku，F(xiàn)inland)。類似地，從細(xì)胞培養(yǎng)中取0.5ml上清進(jìn)行細(xì)胞因子分析。將細(xì)胞離心沉淀，并將上清在68℃條件下儲(chǔ)存待用。培養(yǎng)細(xì)胞的表型分析在培養(yǎng)的第4天收集細(xì)胞并且沖洗，在HBSS/18％甲泛萄胺(Nyegaardand Co.，Oslo，Norway)的交界處收集活細(xì)胞然后在20℃ 500xg的條件下梯度離心15分鐘。沖洗細(xì)胞二次并用含有0.2％疊氮化鈉(Sigma)和10％正常大鼠血清的HBSS將細(xì)胞再次懸浮。采用下面的大鼠抗體(Pharmingen，San Diego，USA)熒光素異硫氰酸酯(鹽)(FITC)標(biāo)記的抗-CD4(RNRM4-5)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗-CD8(53-6.7)，生物素標(biāo)記的抗-CD25(7D4)和藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的抗-B220(RA3-6D2)。另外還采用生物素-標(biāo)記的抗體鏈霉抗生物素蛋白-PE或者鏈霉抗生物素蛋白-FITC(Serotech，UK)。所有抗體用含有疊氮化物的HBSS來稀釋并配制成事先設(shè)計(jì)好的濃度。將200μL2×106個(gè)細(xì)胞和200μL的各種抗體混合，并且在冰上孵育30分鐘。如果需要鏈霉抗生物素蛋白-PE或者FITC第二抗體，應(yīng)將細(xì)胞與這些抗體再另外孵育30分鐘。另外還包括合適的FITC和PE對(duì)照抗體。用HBSS沖洗細(xì)胞，然后用2流式細(xì)胞計(jì)進(jìn)行分析。結(jié)果EtxB受體結(jié)合突變體的產(chǎn)生及特點(diǎn)為了產(chǎn)生一個(gè)有識(shí)別受體缺陷的突變的B亞單位，用寡核苷酸-引導(dǎo)的EtxB突變將Gly到Asp替換片段引入E.coli熱不穩(wěn)定腸毒素的B亞單位。將命名為EtxB(G33D)的突變蛋白和野生型EtxB純化至均一性(參見材料和方法)。采用激光解吸附質(zhì)譜測(cè)定純化的EtxB和EtxB(G33D)的分子量。所測(cè)得的分子量與相應(yīng)的EtxB和EtxB(G33D)單體理論分子量11702和11760Da誤差在20Da之內(nèi)。如果在進(jìn)行SDS-PAGE分析前不加熱，野生型EtxB和EtxB(G33D)均以各自穩(wěn)定的寡聚體進(jìn)行遷移，表觀分子量為42kDa和56kDa(圖1A，相應(yīng)地為1道和2道)。已觀察到的EtxB的泳動(dòng)速度及SDS-穩(wěn)定性是B亞單位五聚體的特性(見Sandkvist，M.，Hirst，T.R.&Bagdasarian，M.(1987)J.Bacteriol.169，4570-4576)。寡聚體EtxB(G33D)的泳動(dòng)速度較慢，但由于在進(jìn)行高分辨凝膠過濾層析分析時(shí)五聚體EtxB和EtxB(G33D)的保留時(shí)間類似，所以其不是因?yàn)闃?gòu)成B亞單位單聚體的數(shù)量不同所致。EtxB(G33D)與野生型EtxB泳動(dòng)速度的差異可能是因?yàn)橐霂ж?fù)電荷的Asp殘基使其與SDS的結(jié)合減少而使遷移速度減慢。
另外還就EtxB和EtxB(G33D)在低pH緩沖液中的穩(wěn)定性，對(duì)1.0mg/ml胰蛋白酶或者蛋白酶K的耐受性，以及對(duì)一系列抗-B亞單位的單克隆抗體及多克隆抗體的相應(yīng)的反應(yīng)性進(jìn)行了比較。在上述的每個(gè)實(shí)驗(yàn)中EtxB(G33D)顯示了與野生型EtxB相同的性質(zhì)。因此認(rèn)為在EtxB的33殘基引入Gly到Asp替換片段后與野生型EtxB比較并沒有改變寡聚體的構(gòu)形，SDS，pH或者蛋白酶的穩(wěn)定性，或者抗體的反應(yīng)性。
采用GM1-ELISA方法來評(píng)估EtxB(G33D)與其受體GM1的結(jié)合能力(圖1C)。與野生型蛋白質(zhì)比較，突變體與GM1的結(jié)合能力明顯減弱(在A450nm處讀數(shù)減少＞99％)。另外，與野生型EtxB比較，當(dāng)用免疫熒光進(jìn)行檢測(cè)時(shí)顯示EtxB(G33D)不與CHO細(xì)胞結(jié)合。因此認(rèn)為EtxB(G33D)在體外和原位與GM1神經(jīng)節(jié)甙酯結(jié)合能力上的缺陷。EtxB在體內(nèi)所具有的強(qiáng)烈免疫原性是依賴于其與受體結(jié)合通過給小鼠口服或者s.c.注射溶于PBS的EtxB或者EtxB(G33D)來評(píng)估受體結(jié)合對(duì)EtxB免疫原性的重要性?？诜﨓txB可使血清中IgG抗體的滴度升高，并使腸分泌物中IgA的活性升高(圖2)。但是相反的，類似的EtxB(G33D)口服免疫方案不產(chǎn)生可測(cè)定出的抗體活性。s.c.注射EtxB(G33D)后確可引起血清中的抗體反應(yīng)，但與野生型的EtxB比較反應(yīng)非常低，平均抗體滴度減少＞160倍，相應(yīng)地為1050和171000。因此認(rèn)為EtxB與受體結(jié)合是其在活體內(nèi)具有強(qiáng)烈免疫原性的基礎(chǔ)。在EtxB或者EtxB(G33D)存在的條件下受體結(jié)合不影響淋巴細(xì)胞增殖的程度在體外檢測(cè)了EtxB或者EtxB(G33D)對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響。從經(jīng)過EtxB或者EtxB(G33D)免疫小鼠的幗窩及腸系膜淋巴結(jié)(MLN)分離出淋巴細(xì)胞，并在體外用蛋白質(zhì)或者用經(jīng)加熱變性的EtxB或者EtxB(G33D)進(jìn)行刺激。來源于幗窩或者M(jìn)LN淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)是類似的。在上述的情況中，對(duì)蛋白增殖反應(yīng)的增加是隨著B亞單位濃度的增加而增加的。由MLN所進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的一組代表性數(shù)據(jù)見表1。對(duì)野生型和突變五聚體的反應(yīng)程度與對(duì)經(jīng)加熱后變性的野生型和突變單聚體的反應(yīng)類似。圖3所示的為在80μg/ml上述各種蛋白質(zhì)存在的條件下所得的增殖反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)變化。反應(yīng)性依賴于抗原的存在，且在各種蛋白質(zhì)存在下反應(yīng)的形式類似。摻入[3H]-Thd的培養(yǎng)在第3天出現(xiàn)反應(yīng)，在第4天反應(yīng)達(dá)到高峰，以后減弱。在圖3中可見經(jīng)過重復(fù)實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)峰值反應(yīng)的時(shí)間沒有不同，說明對(duì)EtxB及EtxB(G33)免疫反應(yīng)回憶能力的特點(diǎn)是類似的。因此認(rèn)為在天然蛋白質(zhì)存在的條件下，刺激的水平不會(huì)受受體結(jié)合或者引入的突變的影響。毒素與受體的結(jié)合可引起B(yǎng)細(xì)胞和T細(xì)胞亞群的免疫調(diào)節(jié)為了檢測(cè)EtxB與受體結(jié)合是否在體外對(duì)淋巴細(xì)胞群產(chǎn)生影響，分離經(jīng)i.p.注射EtxB(G33D)致敏小鼠的MLN淋巴細(xì)胞，然后用EtxB或者EtxB(G33D)或者兩者的混合物進(jìn)行刺激。此外還進(jìn)行一個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，即給小鼠注射EtxB并分離其MLN淋巴細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與用EtxB(G33D)致敏小鼠所得的結(jié)果基本一致。(i)EtxB引起B(yǎng)細(xì)胞活性增加通過與B細(xì)胞標(biāo)記物B220(CD45R)有關(guān)的激活標(biāo)記物CD25(IL-2Rα)表達(dá)來檢測(cè)EtxB對(duì)B細(xì)胞的作用。如圖4所示經(jīng)EtxB刺激的細(xì)胞培養(yǎng)中B細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的62.9％，其中表達(dá)細(xì)胞激活標(biāo)記物CD25的細(xì)胞占很高的比例(28.4％)。相反地，經(jīng)EtxB(G33D)刺激后的B細(xì)胞數(shù)與野生型比較少了一半(22.26％)，并且激活的細(xì)胞數(shù)也較少(5.6％)。為了證實(shí)EtxB所產(chǎn)生的作用是主要的，將細(xì)胞在等摩爾的EtxB和EtxB(G33D)中孵育。僅用EtxB刺激后，采用流式細(xì)胞計(jì)所得的結(jié)果是類似的(60.6％的B細(xì)胞，其中有26％被激活)。因此認(rèn)為在體外EtxB與受體結(jié)合可使B細(xì)胞激活增加。(ii)EtxB可使CD4+T細(xì)胞激活增加并完全去除CD8+T細(xì)胞為檢測(cè)B亞單位與受體結(jié)合對(duì)T細(xì)胞的影響，將淋巴細(xì)胞用與抗CD25的抗體有關(guān)的抗CD4或者CD8的抗體標(biāo)記淋巴細(xì)胞(圖5)。此外有些細(xì)胞可用CD3標(biāo)記物的抗體進(jìn)行標(biāo)記(未示)。用EtxB刺激后，表達(dá)CD4標(biāo)記物的T細(xì)胞比例為36.7％。其中有高比例的細(xì)胞被激活(32.7％)。相反的，在含有EtxB的細(xì)胞培養(yǎng)中未發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞。
為比較，在EtxB(G33D)刺激后的培養(yǎng)細(xì)胞中，CD4+及CD8+T細(xì)胞均存在。在CD4+T細(xì)胞占很大的比例(66.6％)的培養(yǎng)物中，其中只有12％被激活。在EtxB(G33D)存在的情況下，CD8+T細(xì)胞所占的比例為細(xì)胞總數(shù)的11.7％，并且CD25標(biāo)記物缺乏表明其中只有很少的細(xì)胞被激活。而在等摩爾濃度的EtxB和EtxB(G33D)混合物存在的情況下，細(xì)胞的反應(yīng)方式與單獨(dú)使用野生型EtxB的方式類似；CD4+T細(xì)胞占41.68％(其中CD25+占28.6％)，但未見CD8+T細(xì)胞(圖5)。在所有上述的分析中，被CD3染色的細(xì)胞比例與表達(dá)CD4和CD8標(biāo)記物細(xì)胞的總和相等。上述這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)毒素受體的結(jié)合可使B細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的激活增加，并選擇性地去除CD8+T細(xì)胞。細(xì)胞因子的產(chǎn)生為了評(píng)估EtxB對(duì)淋巴細(xì)胞群的作用是否依賴于細(xì)胞因子產(chǎn)生的變化，將細(xì)胞培養(yǎng)物與EtxB或者EtxB(G33D)一起孵育，并在培養(yǎng)的第2，3，4，5和6天取上清液進(jìn)行分析。表2所示在培養(yǎng)的第5天細(xì)胞因子的濃度達(dá)到最高。雖然這些細(xì)胞因子的相對(duì)濃度有所不同，但在在EtxB或者EtxB(G33D)存在下刺激的細(xì)胞培養(yǎng)液上清中可檢測(cè)出IFN-γ和IL-2。在與野生型EtxB一起孵育的細(xì)胞培養(yǎng)液中所含的IL-2濃度更較與EtxB(G33D)一起孵育的高3倍，而其所含的IFN-γ濃度要低1.5倍。盡管對(duì)其它抗原反應(yīng)而增殖的T細(xì)胞產(chǎn)生高濃度的IL-4，IL-5和IL-10，但在與EtxB或者EtxB(G33D)一起孵育的細(xì)胞培養(yǎng)液中并未發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞因子。與EtxB(G33D)比較，與EtxB一起孵育的細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-2濃度升高而IFN-γ降低，這可能是由于B和CD4+T細(xì)胞的激活狀態(tài)不同所致。上述這些結(jié)果說明野生型EtxB對(duì)CD8+T細(xì)胞的強(qiáng)烈作用不像是因?yàn)榕c受體結(jié)合而引起細(xì)胞因子的主要遷移所介導(dǎo)的。討論上述這些研究表明在EtxB與受體結(jié)合的位點(diǎn)引入一個(gè)點(diǎn)突變(G33D)可使其與GM1的結(jié)合能力明顯降低。重要的是，突變體EtxB(G33D)與野生型EtxB比較，其理化性質(zhì)完全相同，如經(jīng)膠層析分析其構(gòu)向相同，在SDS中，酸中和蛋白酶中的穩(wěn)定性也相同。在用EtxB或者EtxB(G33D)免疫后測(cè)定特異的抗體反應(yīng)會(huì)發(fā)現(xiàn)有很大不同。與野生型比較，給小鼠皮下注射EtxB(G33D)可導(dǎo)致抗體的滴度明顯降低(ca＞160倍)，而如果經(jīng)口服給予則檢測(cè)不到免疫反應(yīng)。出現(xiàn)這種差異可能是由于抗體識(shí)別分子的主要表位或者協(xié)助產(chǎn)生抗體的有效T細(xì)胞刺激的主要表位被破壞。然而，值得關(guān)注的是Gly到Asp的替換片段對(duì)于一系列的多克隆及單克隆抗體識(shí)別B亞單位并無影響。另外，在體內(nèi)無論用何種蛋白進(jìn)行致敏，將EtxB或者EtxB(G33D)加入到培養(yǎng)細(xì)胞中所得的增殖反應(yīng)是類似的；這說明T細(xì)胞對(duì)任何一種分子的反應(yīng)都不是特異的。因此認(rèn)為EtxB與受體的結(jié)合是其在體內(nèi)具有強(qiáng)烈免疫原性的基礎(chǔ)。
EtxB與受體結(jié)合所致的強(qiáng)烈的免疫原性的重要性可以通過許多方法來解釋。首先，Etx和Ctx的B亞單位與GM1的結(jié)合可以增加攝取這些蛋白的效率，提高免疫系統(tǒng)所需的局部蛋白質(zhì)的濃度。還發(fā)現(xiàn)可與粘膜結(jié)合的其它種類蛋白質(zhì)也是有效的免疫原(De Aizpura，H.J.& Russell-Jones，G.J.(1988)J.Exp.Med.167，440-451)。經(jīng)口服后所觀察到的EtxB及其突變體免疫原性上的差異可能是由于腸道可有效吸收EtxB所致。而經(jīng)非口服途徑免疫后(使局部抗原達(dá)到很高的濃度)所致的明顯差異提示還有其它作用。例如，EtxB與GM1結(jié)合后可影響抗原代表細(xì)胞活性的效力。這種結(jié)合可使II型細(xì)胞激活，尤其是可使其表達(dá)重要的聯(lián)合刺激分子如B7的表達(dá)，B7與它們需要的增強(qiáng)抗原代表活性有關(guān)(Jenkins，M.K.& Johnson，J.G.(1993)Curr.Opin.Immunol.5，361-367)。另外，受體結(jié)合可能還對(duì)淋巴細(xì)胞亞群有直接的作用。本研究的一系列觀察均非常明確地證實(shí)上述觀點(diǎn)。
體外的研究表明EtxB可使致敏的淋巴結(jié)細(xì)胞發(fā)生增殖。由于使用野生型EtxB，EtxB(G33D)還是這些蛋白質(zhì)加熱變性后不能與GM1結(jié)合的單聚體形式，所得到的反應(yīng)回憶能力的特點(diǎn)是類似的，所以說上述的特性與受體結(jié)合無關(guān)。因?yàn)橐延性S多報(bào)道認(rèn)為商業(yè)化制備的Ctx和CtxB或者是純化的重組CtxB在體外可強(qiáng)烈抑制淋巴細(xì)胞增殖，這就使得上述的研究非常有趣。這一明顯的差異可能是由于以往的實(shí)驗(yàn)使用純化的淋巴細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并多使用促分裂原刺激淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物(其不是克隆限制的反應(yīng))，這就可能引入其它不同的反應(yīng)機(jī)制。與我們實(shí)驗(yàn)觀察一致的是EtxB確可抑制Con A刺激的淋巴細(xì)胞增殖。對(duì)用EtxB或者EtxB(G33D)刺激的致敏的淋巴結(jié)細(xì)胞群分析揭示了B細(xì)胞及帶有CD4和CD8的T細(xì)胞間的重要不同。
在EtxB或者EtxB(G33D)存在的情況下，培養(yǎng)4天后可發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞。可是與EtxB(G33D)比較，加入EtxB培養(yǎng)物中B細(xì)胞的相應(yīng)的比例增加幾乎100％。該增加與CD25對(duì)有很高比例的B細(xì)胞的表達(dá)有關(guān)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)顯示反應(yīng)的淋巴細(xì)胞在體內(nèi)用EtxB(G33D)致敏。類似的，用EtxB免疫小鼠細(xì)胞揭示了相似結(jié)果。所以，在含高比例B細(xì)胞的EtxB存在下的培養(yǎng)物與用EtxB(G330)刺激的培養(yǎng)物比較，在體內(nèi)可不考慮與受體結(jié)合有關(guān)的效果。由于實(shí)驗(yàn)結(jié)果并未顯示所檢測(cè)細(xì)胞因子的主要位移，所以在體外對(duì)B細(xì)胞的作用至少部分與T細(xì)胞的調(diào)節(jié)無關(guān)。因此，在體外EtxB與受體結(jié)合可直接作用于B細(xì)胞，這不僅導(dǎo)致該細(xì)胞群激活也導(dǎo)致其按比例擴(kuò)張。還值得注意的是CtxB可使II型MHC對(duì)原始B細(xì)胞表達(dá)增加，而突變體CtxB(G33E)與GM1結(jié)合后并未顯示有該特性(Francis，M.L.，Ryan，J.，Jobling，M.G.，Holmes R.K.，Moss，J.&Mond J.J.(1992)J.Immunol.148，1999-2005)。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示EtxB對(duì)抗原致敏的B細(xì)胞有直接的促分裂作用，并證實(shí)這些作用是因?yàn)槭荏w結(jié)合介導(dǎo)所致。
此外除了EtxB對(duì)培養(yǎng)物中B細(xì)胞的作用外，流式細(xì)胞計(jì)分析顯示該類毒素可完全去除檢測(cè)到的CD8+細(xì)胞。由于該T細(xì)胞群在含有EtxB(G33D)培養(yǎng)物中并未被去除，所以再一次顯示該作用依賴于受體結(jié)合。另外從野生型EtxB免疫的小鼠可觀察到在含EtxB的培養(yǎng)物中的CD8+細(xì)胞被完全去除。有三種可能的機(jī)制可介導(dǎo)上面的作用。1)已知Ctx或者CtxB與大鼠MLN細(xì)胞上的GM1結(jié)合后可引起帽和斑的形成(Craig S.W.andCuatrecasas P.，(1975)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.72，pages3844-3848)。有可能在該過程中包括CD8的EtxB-GM1混合物和其它分子，被內(nèi)化。這一過程可能會(huì)妨礙流式細(xì)胞計(jì)發(fā)現(xiàn)采用CD8作為標(biāo)記物的細(xì)胞，并可因?yàn)閱适c表面TCR復(fù)合物的結(jié)合而導(dǎo)致其死亡。雖然后者可以說明培養(yǎng)細(xì)胞中CD8+細(xì)胞的缺失，但其它的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用CtxB時(shí)人Jarkat T細(xì)胞系的表面沒有發(fā)現(xiàn)TCR復(fù)合物缺失(Imboden，J.B.，Shoback，D.M.，Pattison，G，& Stobo，J.D.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83，5673-5677)。由于發(fā)現(xiàn)CD3和CD4標(biāo)記物不受影響，故提示加帽反應(yīng)可使反應(yīng)不發(fā)生。2)另一個(gè)機(jī)制可能是細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)胞因子所致。在該研究中，檢測(cè)到了IL-2和IFN-γ?？墒沁@個(gè)結(jié)果并不說明細(xì)胞因子的一系列變化可解釋對(duì)CD8+T細(xì)胞的強(qiáng)烈作用。3)CD8+T細(xì)胞的缺失可能是由于發(fā)生程序性細(xì)胞凋亡的活性誘導(dǎo)。程序性凋亡所致的淋巴細(xì)胞死亡可參與上述的加帽反應(yīng)，或者在沒有加帽反應(yīng)情況下由發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)來介導(dǎo)。激活所引起的程序死亡依賴于Ca2+并與磷酸酶和激酶有關(guān)。CtxB與淋巴細(xì)胞結(jié)合后可抑制蛋白激酶C依賴的增殖，并且可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的Ca2+明顯增加，而這一過程與CAMP水平的增加無關(guān)。EtxB去除CD8+而非CD4+T細(xì)胞的能力可能是由于CD4/CD8-TCR復(fù)合物與淋巴細(xì)胞亞群表面上的GM1發(fā)生交連后而產(chǎn)生的信號(hào)有所不同所致。上述作用可能是CtxB與膜上類毒素結(jié)合不同所致，或者也可能是CD4+和CD8+T細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制不同所致。
與突變體和受體結(jié)合比較，在可檢測(cè)的CD8+T細(xì)胞完全缺乏中，EtxB增加了激活的CD4+T細(xì)胞的比例。在體內(nèi)已證實(shí)在對(duì)Ctx反應(yīng)中CD4+T細(xì)胞是基本需求?？墒鞘乖揟細(xì)胞亞群激活增加的原因目前尚不清楚。CtxB有一個(gè)很明顯的特性是可使處于靜止期的小鼠未轉(zhuǎn)化3T3細(xì)胞的DNA合成增加并促使細(xì)胞分裂。另外還發(fā)現(xiàn)植物凝集素有選擇性地致CD4+T細(xì)胞分裂的作用，植物凝集素可與Ga1β-1-3-3Ga1NAc結(jié)合，而EtxB與GM1結(jié)合時(shí)也是與這一部分結(jié)合。不能除外EtxB介導(dǎo)了對(duì)CD4+T細(xì)胞的GM1結(jié)合依賴性直接作用并使它們激活的可能性。然而，在含有EtxB的培養(yǎng)物中CD4+T細(xì)胞激活增加也可能是由于上述的B細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞變化而導(dǎo)致的。已知B細(xì)胞的激活與它們作為代表CD4+T細(xì)胞的抗原的能力增加有關(guān)。而CD8+T細(xì)胞在體內(nèi)及體外均廣泛參與各種免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)。從增殖的T細(xì)胞培養(yǎng)中消去它們與CD4+T細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間高水平的分裂有關(guān)。
總之，在本研究中EtxB通過與GM1結(jié)合后的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)作用，使B細(xì)胞激活增加，從而EtxB在體內(nèi)具有很強(qiáng)的免疫原性。CD4+T細(xì)胞的激活以及EtxB在體外的細(xì)胞培養(yǎng)中可使IL-2產(chǎn)生增加，所有這些都可提供B細(xì)胞克隆進(jìn)一步增殖所需的信號(hào)。在本研究中EtxB在體外可去除CD8+T細(xì)胞，其在系統(tǒng)或者口服后，特別是根據(jù)該細(xì)胞亞群參與了免疫反應(yīng)抑制及口服耐受，故還提供了體內(nèi)免疫增強(qiáng)的另一機(jī)理。在這方面已有研究顯示Etx和Ctx可去除同時(shí)服用可溶性蛋白所產(chǎn)生的口服耐受，而其它一些研究提示Ctx和CtxB可去除對(duì)腸道上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞以及集合淋巴結(jié)的作用，這也可以解釋上述作用的發(fā)生機(jī)理。CtxB在體外對(duì)CD8+T細(xì)胞的抑制作用也表明其可預(yù)防移植物抗宿主反應(yīng)。
總之已經(jīng)證實(shí)EtxB在體內(nèi)對(duì)抗體反應(yīng)很強(qiáng)，而在體外對(duì)淋巴細(xì)胞群的作用存在著很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用。另外還證實(shí)這些作用是由于受體結(jié)合所介導(dǎo)。我們研究的發(fā)現(xiàn)還可說明Etx和Ctx有作為其它抗原有效的佐劑以及潛在的蛋白載體的能力，并且提示這些性質(zhì)有賴于這些類毒素與淋巴細(xì)胞表面的神經(jīng)節(jié)甙酯受體的結(jié)合能力。
實(shí)例2本實(shí)例說明對(duì)于CD8細(xì)胞的作用與抗原的識(shí)別無關(guān)，該作用是由程序性細(xì)胞死亡所介導(dǎo)的。
如實(shí)例1中所述制備重組的EtxB和EtxB(G33D)制劑。這兩種蛋白質(zhì)都與GM1結(jié)合，與一系列單克隆及多克隆抗體結(jié)合，并且具有其它各種理化性質(zhì)。卵白蛋白(OVA)由Sigma(Poole，UK)購(gòu)得。腸系膜淋巴結(jié)(MLN)從8-10周齡的BALB/c小鼠中分離得到[對(duì)EtxB高反應(yīng)的種系(Nashar，T.O.and Hirst，T.R.1995.Immunoregulatory role of H-2 and intra-H-2alleles on antibidy responses to recombinant prepatations of B-subunits of Escherichia coli heat-labile enteroroxin(rEtxB)andcholera toxin(rCtxB).Vaccine 13803.)]。給小鼠i.p.注射用不完全弗氏佐(Sigma)劑乳化的200μgOVA(Sigma)。注射10天后取出MLN，搗碎并通過一不銹鋼濾網(wǎng)濾入HBSS(Flow，Irvine，UK)。用HBSS通過離心沖洗回收的細(xì)胞(500xg，10分鐘，4℃)，再用含20mM Hepes(Flow)，100IU青霉素，100μg/ml鏈霉素，4mM L-谷氨酸(Flow)及2-巰基乙醇(完全培養(yǎng)液)改進(jìn)的Eagle′s培養(yǎng)液(Flow)重新懸浮細(xì)胞。向其中加入0.5％(v/v)新鮮小鼠自體正常血清。24-孔微型板(Nunc A/S，Roskide，Denmark)中2ml體積的培養(yǎng)液有2×106個(gè)活細(xì)胞/ml，并在100μg/mlOVA(經(jīng)完全細(xì)胞培養(yǎng)液充分透析過的)單獨(dú)或者與40μg/ml EtxB或者EtxB(G33D)一起存在的條件下建立細(xì)胞培養(yǎng)。將細(xì)胞在37℃，5％CO2及95％空氣的條件下培養(yǎng)5天。在設(shè)計(jì)好的時(shí)間點(diǎn)，從細(xì)胞培養(yǎng)液中取出0.1ml樣本并將其轉(zhuǎn)移至96孔U-形底板內(nèi)(Nunc)，在收集前(Mach III harvesting96 Tomtec，Orange，Conn.USA)用[3H]-胸苷(Amersham，U.K.)以1μCi/孔進(jìn)行脈沖6小時(shí)并用標(biāo)準(zhǔn)的液閃爍計(jì)進(jìn)行計(jì)數(shù)(1450 Micro β plus，LKB-Wallac，Turku，F(xiàn)inland)。采用流式細(xì)胞計(jì)(Becton Dickinson，Erenbodegem-Aalst，Belgium)分析T細(xì)胞，細(xì)胞用下面的大鼠抗體進(jìn)行染色(Pharmingen，Cambridge，UK)FITC標(biāo)記的抗-CD4(RNRM4-5)或者FITC-抗-CD8α(53-6.7)以及生物素標(biāo)記的抗-CD25(IL-2Rα)(7D4)，還有鏈霉抗生物素蛋白-藻紅蛋白。另外，對(duì)生物素標(biāo)記的抗體采用FITC標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白?；厥占?xì)胞的FACS在增殖高峰期(第4天)摻入[3H]胸苷進(jìn)行分析。
為了細(xì)胞程序性死亡分析，從8-10周齡的BALB/c小鼠體內(nèi)分離出新鮮的MLN細(xì)胞(MLNC)及脾T細(xì)胞(SPLTC)。以流式細(xì)胞計(jì)檢測(cè)MLNC含有＞90％CD3+T細(xì)胞，并將其在佩特里培養(yǎng)皿內(nèi)(Costar，Cambridge，MA)用含有10％FCS的完全培養(yǎng)液在37℃，5％CO2和95％空氣的條件下孵育2小時(shí)以去除粘附的細(xì)胞。未粘附的餾分用吸管去除，在使用前將其沉淀并用HBSS沖洗2次。按照已被描述過的方法(Wigzell，H.1976.Specific affinityfractionation of lymphocytes using glass or plastic bead columns.Scand.J.Immunol.5(suppl.5)23.)將玻璃珠表面涂以正常的小鼠血清，隨后再加入兔抗-小鼠-γ球蛋白，采用陰性篩選的方法純化SPLTC。流式細(xì)胞計(jì)檢測(cè)，所選出的T細(xì)胞群＞90％的為CD3+T細(xì)胞。
CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞用如下的方法進(jìn)行分離未粘附的MLNC用大鼠藻紅蛋白-抗-小鼠CD4(4708-02)或者FITC-抗-小鼠CD8α(53-6.7)(PharMingen)進(jìn)行標(biāo)記，按照廠家說明用山羊抗-大鼠IgG(H+L)F(ab′)2(PharMingen)與MACS膠態(tài)超順磁微型珠結(jié)合，然后將其與細(xì)胞一起孵育。再將其上微型-MACS柱(Miltenyi Biotech，Bergisch Gladbach，Germany)經(jīng)流式細(xì)胞計(jì)檢測(cè)分離出陽(yáng)性的(＞99％的純度)和陰性的(＞90％的純度)CD4和CD8+T細(xì)胞。
有兩種方法可給細(xì)胞程序性死亡定量i)用吖啶黃染色DNA以觀察核的形態(tài)，ii)用碘化丙錠和抗-CD4或者抗-CD8抗體染色DNA以觀察細(xì)胞周期。用含有10％FCS及含有或者不含有80μg/ml EtxB或者EtxB(G33D)的完全培養(yǎng)液建立2×106/ml MLNC，SPLTC和分好的MLNC的培養(yǎng)物，在4到18小時(shí)期間進(jìn)行觀察。孵育后沉淀細(xì)胞并用HBSS進(jìn)行沖洗，然后用5μg/ml吖啶黃染色(Sigma)。分離淋巴細(xì)胞并用含有或者不含有10-7M的地塞米松進(jìn)行處理，并用作正在經(jīng)歷凋亡的細(xì)胞的陽(yáng)性對(duì)照。使用常規(guī)或者差式熒光顯微鏡(Leica，TCS 4D)觀察淋巴細(xì)胞核形態(tài)的改變。如文獻(xiàn)所述(O′Connor，P.M.，Jackman，J.，Jondle，D.，Bhatia，K.，Magrath，I.andKohn，K.W.1993.Role of p53 tumor suppressor gene in cell cyclearrest and radiosensitivity of Burkitt′s lymphoma cell lines.Cancer.Res.534776.)以碘化丙錠染色后，用流式細(xì)胞計(jì)分析DNA含量從而測(cè)定出細(xì)胞周期中處于G0/G1亞期的CD4+和CD8+SPLTC的比例。將與含有或者不含有40μg/ml EtxB或者EtxB(G33D)孵育18小時(shí)的SPLTC培養(yǎng)細(xì)胞中分離的細(xì)胞用FITC大鼠抗-CD4或者FITC-抗-CD8α進(jìn)行染色。將染色的細(xì)胞用含有20mM HEPES和0.5mM EDTA的冰冷HBSS調(diào)整至1×106/ml，然后滴入冰冷的乙醇進(jìn)行固定。隨后加入50μg/ml的碘化丙錠和40μg/ml核酸酶(無DNase)并將細(xì)胞在室溫下孵育1小時(shí)。通過閘門控制用每種mAB共同染色的細(xì)胞，從而測(cè)定出CD4和CD8+T中碘化丙錠染色DNA的相對(duì)強(qiáng)度。
在實(shí)例1中，發(fā)現(xiàn)對(duì)EtxB反應(yīng)增殖的淋巴結(jié)細(xì)胞培養(yǎng)中CD8+T細(xì)胞完全消失，這說明EtxB對(duì)該T細(xì)胞亞群有多克隆作用。為了研究這一作用是否與EtxB反應(yīng)細(xì)胞的激活有關(guān)，取OVA致敏小鼠的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并用OVA或者OVA加EtxB或者突變體EtxB(G33D)刺激該培養(yǎng)細(xì)胞。在單獨(dú)使用OVA，OVA加EtxB或者EtxB(G33D)的情況下(分別為9734+347，12,031+135和9305+290c.p.m.)，細(xì)胞培養(yǎng)所得到的增殖峰值類似(每組均在培養(yǎng)的第4天)?？墒?天后在這些培養(yǎng)中T細(xì)胞亞群的分布卻出現(xiàn)了很大的差異(圖6)。所有培養(yǎng)中含有CD4+T細(xì)胞，其中共同表達(dá)激活標(biāo)記物CD25的比例類似。然而，與OVA加EtxB一起孵育的培養(yǎng)中未見CD8+T細(xì)胞，而與OVA加EtxB(G33D)或者單獨(dú)與OVA一起孵育的培養(yǎng)中可清楚的觀察到CD8+T細(xì)胞(雖沒有象CD25表達(dá)那樣被激活)。這說明EtxB可去除對(duì)除了EtxB以外的一種抗原反應(yīng)的CD8+T細(xì)胞。更具體講，對(duì)EtxB(G33D)無這種反應(yīng)說明上述細(xì)胞的去除是因?yàn)轭惗舅厥荏w相互反應(yīng)所致。正如以前在的對(duì)EtxB反應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)的(實(shí)例1)，還注意到在野生型EtxB存在的條件下可引起B(yǎng)細(xì)胞部分顯著增加，其中大部分是CD25+(未示)。因此認(rèn)為，EtxB與受體結(jié)合后可對(duì)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生很強(qiáng)的調(diào)節(jié)作用，而這與抗原的特異性無關(guān)。
另外還研究了在EtxB存在的條件下CD8+T細(xì)胞經(jīng)歷程序性細(xì)胞死亡的可能性。將從未致敏的小鼠中分離出的MLNC或者純化的SPLTC與EtxB或者EtxB(G33D)一起孵育，在4到18小時(shí)期間經(jīng)丫啶黃染色后觀察細(xì)胞核形態(tài)的改變(表3和圖7)。細(xì)胞形態(tài)變化的特點(diǎn)是由于核分葉所致的染色體濃縮表現(xiàn)(圖7)。另外還觀察到如細(xì)胞膜泡沫樣改變和凋亡體等其它細(xì)胞凋亡的特征。在用EtxB處理過的細(xì)胞培養(yǎng)中約有三分之一有上述這些形態(tài)變化，而用EtxB(G33D)或者無外源性抗原處理過的細(xì)胞培養(yǎng)中只有非常少部分的細(xì)胞觀察到上述改變(表3)。由于CDg+T細(xì)胞占MINC和SPLTC中的35-40％，故這些細(xì)胞的消失可計(jì)算觀察到的凋亡。為了證實(shí)這一想法，在抗原存在的條件下培養(yǎng)純化的CD+8和CD4+T細(xì)胞18h(表3)。用EtxB，EtxB(G33D)或者不用抗原處理經(jīng)陰性法選擇出的CD4+T細(xì)胞群(含有＞90％帶有CD4的細(xì)胞)，可引起類似百分比的形態(tài)變化，這說明EtxB與受體結(jié)合并不能引起該細(xì)胞亞群發(fā)生凋亡。相反地，用野生型EtxB處理的經(jīng)陰性法選擇出的CD8+T細(xì)胞(＞90％的純度)有＞70％的發(fā)生形態(tài)改變，但如果不用抗原或者只用EtxB(G33D)處理則該T細(xì)胞群中只有11-19％發(fā)生形態(tài)改變。另外，由于高純度的含有＞99％的CD8或者CD4+T細(xì)胞(用陽(yáng)性法篩選分離)對(duì)EtxB以類似的方式發(fā)生反應(yīng)(在EtxB存在的條件下60％出現(xiàn)凋亡，而不用抗原或者用EtxB(G33D)處理后只有7％出現(xiàn)凋亡)，所以所使用的純化細(xì)胞群中含有少量的污染細(xì)胞(約10％)并不影響結(jié)果(表3)。在地塞米松不存在或者存在的條件下孵育18小時(shí)，相應(yīng)地有40％和98％的胸腺細(xì)胞發(fā)生凋亡。
為了證實(shí)在我們的培養(yǎng)中所觀察到的形態(tài)變化與發(fā)生細(xì)胞凋亡時(shí)一致，本研究還評(píng)估了在經(jīng)EtxB處理18小時(shí)后，SPLTC培養(yǎng)中亞二倍體DNA出現(xiàn)的情況。在經(jīng)碘化丙錠及抗-CD8或者抗-CD4抗體供同染色后，采用流式細(xì)胞計(jì)分析細(xì)胞(圖8)。與EtxB孵育的CD8+T細(xì)胞培養(yǎng)中約有48％低于碘化丙錠染色二倍體G0/G1的峰值，這說明這些細(xì)胞正在經(jīng)歷凋亡(O′Connor，P.M.et al，supra)。在用EtxB處理的培養(yǎng)中，有一小部分表達(dá)CD4的細(xì)胞也顯示有亞-G0/G1DNA的水平(～11％；這可能是由于大部分CD8+T細(xì)胞死亡所致)。相反地，在不用抗原或者用EtxB(G33D)培養(yǎng)的大部分CD4或者CDg+T細(xì)胞處于G0/G1細(xì)胞周期，只有＜5％的細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。我們認(rèn)為用EtxB處理CD8+T細(xì)胞部分后所出現(xiàn)的核形態(tài)改變以及DNA亞G0/G1水平是由于霍亂樣腸類毒素引發(fā)的選擇性細(xì)胞凋亡所致。突變體EtxB(G33D)與受體結(jié)合后不能引發(fā)類似的反應(yīng)證實(shí)引發(fā)CD8+T細(xì)胞凋亡與其與GM1神經(jīng)節(jié)甙酯的結(jié)合能力有關(guān)。
實(shí)例3以8只雄性DBA/1小鼠為一組，其中一組為未致敏組(A組)，或者在實(shí)驗(yàn)前(0天)用CFA溶解的牛膠原100μg在小鼠側(cè)面皮內(nèi)注射(i.d.)。注射膠原的小鼠中有一部分未被保護(hù)(B組，陽(yáng)性對(duì)照組)，或者為了防止疾病的發(fā)生在膠原致敏部位的附近于0天i.d.給予用IFA溶解的100μg EtxB(C組)，在14天給予用IFA溶解的100μg EtxB(D組)，或在0天給予用IFA溶解的100μg EtxB(G33D)(E組)。除了A組，所有動(dòng)物在21天接受增強(qiáng)劑量的注射，在45天通過測(cè)量后肢踝處的厚度來評(píng)估疾病的嚴(yán)重性(實(shí)驗(yàn)A)，或者通過對(duì)后肢水腫的評(píng)分來評(píng)估(0-3級(jí)，其中0＝正常，而3＝最嚴(yán)重的水腫；實(shí)驗(yàn)B)。
圖9a和9b所示為所得的結(jié)果。這些結(jié)果說明是EtxB，而非EtxB(G33D)可非常有效地保護(hù)由膠原所致的關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。
實(shí)驗(yàn)4a兩種分開的人的附有淡黃色樣本(從正常人的血液中得到)作為單核細(xì)胞的來源。用菲可帕克試劑分離細(xì)胞，充分沖洗，然后按照說明不加抗原或者將80μg/ml的EtxB或者EtxB(G33D)加入培養(yǎng)液的情況下培養(yǎng)細(xì)胞。在進(jìn)行培養(yǎng)前每種樣本的細(xì)胞群相應(yīng)地含有24％CD8+，27％CD4+和27％CD8+，22.9％CD4+。在培養(yǎng)18小時(shí)后用吖啶黃染色細(xì)胞來評(píng)估凋亡細(xì)胞的出現(xiàn)(詳見實(shí)例2)。所得結(jié)果見圖10；這些結(jié)果說明是EtxB，而非EtxB(G33D)引起正常人外周血中單核細(xì)胞凋亡。
實(shí)驗(yàn)4b培養(yǎng)小鼠T細(xì)胞系，CTLL-2并使其長(zhǎng)滿，沖洗細(xì)胞，然后以1×106個(gè)細(xì)胞/ml的濃度接種，并按說明不加抗原或者加入80μg/ml EtxB或者EtxB(G33D)。18小時(shí)后取樣并采用吖啶黃染色來評(píng)估發(fā)生凋亡細(xì)胞的百分比(詳見實(shí)例2)。所得結(jié)果見圖11。這些結(jié)果說明GM1的交聯(lián)可致一部分小鼠CTLL細(xì)胞發(fā)生凋亡。表1-在加有EtxB或者EtxB(G33D)的情況下淋巴細(xì)胞的增殖劑量 μg/mlEtxB EtxB(G33D) EtxB*EtxB(G33D)*0 117.9146.8124.5 116.1(7.9)(3.5)(14.6) (6.35)5 4928 2860 2424 1431.5(98.7) (3.8)(88.3) (37.5)10 6978 3681 2518 4231(30.6) (4.6)(21.6) (96.4)20 7084 6912 4394 5075(100)(47.3) (42.1) (24.8)40 8844 8586 7431 4368.5(26) (143.7) (45.3) (118.9)80 10246125107986 7276(30.7) (121.8) (210.3)(369.5)160 1131113525----- -----(247)(352.7)給小鼠i.p.注射30μg的溶解于完全弗氏佐劑(CFA)的EtxB(G33D)。10天后分離腸系膜淋巴結(jié)。分離細(xì)胞并在EtxB，EtxB(G33D)或者經(jīng)95℃加熱后產(chǎn)生的這些蛋白分離的單體形式(*)存在的條件下孵育細(xì)胞4天。在第4天的后6個(gè)小時(shí)加入1μ Ci的(3H)dThd并測(cè)定細(xì)胞增殖。均值用3個(gè)孔樣本的平均cpm和SEM來表示。從未致敏小鼠中分離出的細(xì)胞給出＜1500cpm的數(shù)值(劑量160μg/ml)。表2-在EtxB或者EtxB(G33D)存在的條件下分析細(xì)胞因子蛋白質(zhì)IL-2(pg/ml)IFN-γ(pg/ml)EtxB 318 2700EtxB(G33D) 67 4068給小鼠注射溶解于CFA的EtxB(G33D)并在10天后分離腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞。然后在體外加入EtxB或者EtxB(G33D)孵育細(xì)胞并在細(xì)胞增殖第5天取上清分析細(xì)胞因子的含量。
表3-在分離的淋巴細(xì)胞中EtxB-受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡細(xì)胞時(shí)間(小時(shí)) 無抗原 EtxB(G33D)EtxBMUNC 40a(8)2(0)1(3)18 8(10) 5(18) 29(35)SPLTC 43(7) 2(6)3(5)18 17(5) 16.5(12)31(32)陰性法篩選CD418 5(37) 6(31) 9(35)CD818 18(11)19(15) 76(73)陽(yáng)性法篩選CD418 6 4 6CD818 7 7 60在無抗原或者加入80μg/ml EtxB或者EtxB(G33D)的情況下孵育4或者18小時(shí)后，以吖啶黃染色并用熒光顯微鏡觀察分類的CD4及CD8+T細(xì)胞中核的形態(tài)變化。去除MINC中的粘附細(xì)胞。在玻璃珠柱表面涂以小鼠γ-球蛋白，且兔抗-小鼠抗體作為第二抗體，采用陰性選擇法分離出SPLTC。用大鼠藻紅蛋白-抗-小鼠CD4或者FITC-抗-小鼠CD8α標(biāo)記，然后得到分出的SPLTC，與結(jié)合有山羊抗-大鼠IgG(H+L)F(ab′)2的MACS膠體超順磁微型珠一起孵育。采用微型-MACS柱分離這些細(xì)胞，從而得到陽(yáng)性的(＞99％純度)及陰性的(＞90％的純度)篩選出的CD4和CD8+T細(xì)胞部分。在4到18小時(shí)如圖7說明中所述的方法檢測(cè)200個(gè)細(xì)胞中隨機(jī)樣本的核形態(tài)變化。凋亡細(xì)胞的最大百分比發(fā)生在18小時(shí)以后。在括號(hào)中的數(shù)據(jù)為另一個(gè)不同實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。MLNC和SPLTC數(shù)據(jù)為四個(gè)實(shí)驗(yàn)的均值。a為凋亡細(xì)胞的百分比。
權(quán)利要求
1.用來治療或者預(yù)防自身免疫疾病的一種制劑(i)除了Ctx或者Etx，或者Ctx及Etx的B亞單位，具有結(jié)合GM1活性的一種制劑；(ii)對(duì)GM1介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)有作用，但無GM1結(jié)合活性的一種制劑。
2.使用Ctx或者Etx，或者Ctx及Etx的B亞單位制備用于治療或者預(yù)防自身免疫疾病的藥物。
3.一種治療自身免疫疾病的方法，其中選自下面有效量的制劑(i)具有結(jié)合GM1活性的一種制劑；(ii)對(duì)GM1介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)有作用，但無GM1結(jié)合活性的一種制劑，被給予哺乳類動(dòng)物。
4.按照權(quán)利要求3所述的方法，其中所述制劑單獨(dú)或者與交叉反應(yīng)的抗原一起給予。
5.用來治療哺乳類動(dòng)物自身免疫疾病的藥物組合物，其包括(i)具有結(jié)合GM1活性的一種制劑；(ii)對(duì)GM1介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)有作用，但無GM1結(jié)合活性的一種制劑；以及藥用載體或者其稀釋劑。
6.依據(jù)權(quán)利要求5的藥物組合物，還包括本身或者交叉反應(yīng)抗原決定簇。
7.含有權(quán)利要求5的藥物組合物的藥盒，并與含有本身或者交叉反應(yīng)抗原決定簇的藥物組合物分開。
8.用于治療人T細(xì)胞起源的白血病的(i)除了Ctx或者Etx，或者Ctx及Etx的B亞單位，具有結(jié)合GM1活性的一種制劑；(ii)對(duì)CM1介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)有作用，但無GM1結(jié)合活性的一種制劑。
9.使用Ctx或者Etx，或者Ctx及Etx的B亞單位制備治療T細(xì)胞起源白血病的藥物。
10.一種治療人T細(xì)胞起源白血病的方法，其中選自下面的有效劑量的制劑(i)具有結(jié)合GM1活性的一種制劑；(ii)對(duì)GM1介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)有作用，但無GM1結(jié)合活性的一種制劑，給藥于哺乳類動(dòng)物。
11.用來治療人T細(xì)胞起源白血病的藥物組合物包括(i)具有結(jié)合GM1活性的一種制劑；(ii)對(duì)GM1介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)有作用，但無GM1結(jié)合活性的一種制劑；以及藥用載體或者稀釋劑。
12.作為一種治療制劑用來預(yù)防/治療移植物排斥或者GVHD(i)除了Ctx或者Etx，或者Ctx及Etx的B亞單位，具有結(jié)合GM1活性的一種制劑；(ii)對(duì)GM1介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)有作用，但無GM1結(jié)合活性的一種制劑。
13.使用Ctx或者Etx，或者Ctx及Etx的B亞單位制備預(yù)防移植物排斥或者GVHD的藥物。
14.一種預(yù)防或者治療移植物排斥或者GVHD的方法，其中選自下面的有效劑量的制劑(i)具有結(jié)合GM1活性的一種制劑；(ii)對(duì)GM1介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)有作用，但無GM1結(jié)合活性的一種制劑，被給予哺乳類動(dòng)物。
15.用于哺乳類動(dòng)物的疫苗接種(i)除了Ctx或者Etx，或者Ctx及Etx的B亞單位，具有結(jié)合GM1活性的一種制劑；(ii)對(duì)GM1介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)有作用，但無GM1結(jié)合活性的一種制劑。
16.一種給哺乳類動(dòng)物的疫苗接種的方法，其中選自下面的有效劑量的制劑包括(i)具有結(jié)合GM1活性的一種制劑；(ii)具有GM1介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)功能，但無GM1結(jié)合活性的一種制劑；與一種有效劑量的無關(guān)外源抗原決定簇給哺乳類動(dòng)物聯(lián)合服用。
全文摘要
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)可使用一種制劑治療或者預(yù)防自身免疫疾病,該制劑為:(i)除了Ctx或者Etx,或者Ctx及Etx的B亞單位,具有結(jié)合GM1活性的一種制劑;(ii)對(duì)GM1介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)有作用,但無GM1結(jié)合活性的一種制劑。這些制劑還可用來治療人T細(xì)胞白血病,預(yù)防移植物排斥或者GVHD,或者用于哺乳類動(dòng)物疫苗接種。
文檔編號(hào)C07K14/245GK1192693SQ96196258
公開日1998年9月9日 申請(qǐng)日期1996年7月5日 優(yōu)先權(quán)日1995年7月5日
發(fā)明者N·A·威廉姆斯, T·R·黑爾斯特, T·O·納莎 申請(qǐng)人:奧拉托爾有限公司